TWI744777B - 一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明係為關於一種能與類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽，係由SEQ ID NO：3-4、7-13或16-19中所組成之群組中任一段連續的10-25個胺基酸序列，該胜肽片段具有與類風溼關節炎的自體抗體結合的抗原決定位點。進一步將該類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽片段作為檢測類風溼性關節炎的用途，而根據此項用途，本發明提出一種類風溼性關節炎疾病的檢測方法以及檢驗套組用以判斷待測個體是否患有類風溼性關節炎疾病。
Description
本發明係為關於一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽片段及其作為檢測類風溼性關節炎的用途，而根據此項用途，本發明提出一種類風溼性關節炎疾病的檢測方法以及檢驗套組用以判斷待測個體是否患有類風溼性關節炎疾病。
類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性發炎的全身性自體免疫疾病，約影響全世界0.5-1%的人口數，而台灣人的盛行率約為0.4%，男女病患比例約為1：3，80%的RA患者發病於35-50歲之間。目前引發RA病情的原因還尚未清楚，不過現今研究指出主要跟基因及環境(感染、抽菸)有關。目前RA產生的機轉以分子模仿假說被最接受的一個理論，也就是病人擁有特定的基因，經細菌或病毒感染而引發的免疫反應，因對抗細菌的免疫反應誤認自體組織為外來病毒，而攻擊自體組織(如滑膜組織)進而產生病變。
在RA病患病灶處的關節裡常常可以觀察到滑膜組織(synovial membrane)不正常增生以及T細胞、B細胞、巨噬細胞和嗜中性白血球胞的浸潤。約有70%左右的RA病患血清中可以偵測得到類風溼性關節炎因子(rheumatoid factor，RF)，RF也被認為是啟動RA發病重要的因
素之一，它可以辨認到人體免疫球蛋白IgG的恆定端Fc區域並與此區域結合形成免疫複合物進而造成人體的傷害。在RA病人裡還可以發現許多種類的自體抗體像是尤其是抗瓜氨酸化胜肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)，對於類風溼關節炎病情的診斷上敏感性及特異性分別為可達到70%及90%左右，且常在類風溼性關節炎發病前7-10年就可偵測到抗體的存在，因此現今已被用在診斷RA疾病。RA初期發病時通常可以觀察到手指、足部或頸部小關節腫脹及疼痛的現象並伴隨著晨間僵硬超過一個小時的症狀，如果未經適當治療的話隨著病情的演進關節會逐漸損傷、變形而喪失運動能力最終可能導致殘廢。而除了關節炎的症狀外，RA也可能會影響其他器官像是肺臟、皮膚、腎臟或是造成心血管方面的疾病。
治療RA的藥物可分為三大類：非類固醇抗發炎藥(NSAIDs)、皮質類固醇(corticosteroids)、疾病調節抗風溼藥物(disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)。而隨著生物科技的發展有越來越多的生物製劑以及小分子藥物，主要用來抑制發炎，包含了Etanercept、Infliximab、Adalimumab及Anakinra。其中Etanercept、Infliximab及adalimumab主要抑制TNF-α所引發的免疫反應，干擾RA病人關節內的TNF和細胞表面受體結合而引發之發炎反應。Anakinra是IL-1的受體拮抗劑可抑制發炎關節內IL-1的作用。另外也有其他的藥物在發展，如：anti-IL-6等抗細胞激素的藥物或是Janus kinase-3(JAK-3)inhibitor、spleen tyrosine kinase(Syk)inhibitor等直接阻斷細胞內發炎訊號的抑制劑也逐漸被應用在RA的治療上來減緩病情嚴重程度。
除了測量血清中ACPA及RF外，還可以透過Disease Activity Score of 28 joints(DAS28)指數、erythrocyte sedimentation rate(ESR)及C-reactive protein(CRP)來評估病情的嚴重程度，並可觀察用藥前後DAS28指數是否下降判斷治療是否有效。根據目前美國風溼病醫學會和歐洲風溼病聯盟提出了2010年新的分類標準(ACR/EULAR 2010 rheumatoid arthritis classification criteria)，類風溼性關節炎主要評估受侵犯的關節、急性發炎指標、血清學及症狀出現的時間來獲得綜合分數，只要超過6分則定義類風溼性關節炎，其評估內容如表1。
表1中的血清學目前常規檢測有RF(rheumatoid factor)及ACPA
(Anti-citrullinated protein antibodies)，RF並非只存在類風溼性關節炎的患者身上，因此特異性不佳，而ACPA的敏感度及特異度高於RF，故於2010年類風溼關節炎分類標準把ACPA檢測結果納入評分，因此不管是RF或ACPA呈現陽性則可得2分，若指數超過正常三倍則可得3分。
由於類風溼性關節炎無法預防或治癒，類風溼性關節炎必須愈早診斷，愈早開始治療才能有效控制。臨床顯示，類風溼性關節炎發病的前兩年，最容易對關節造成損害，發病前兩年是治療的黃金時期，須積極治療以維持關節的正常功能、以減少關節變形的機會。目前臨床上檢測對於RF或ACPA都有超過30%的患者無法透過血清學來獲得分數，因此需要能開發更精準的血清學檢測項目來輔助診斷類風溼性關節炎。
類風溼性關節炎(RA)與牙周病(PD)關係密切，兩者的病徵很類似都是慢性發炎造成關節或是齒槽骨的損傷，先前研究指出類風溼性關節炎的病患罹患牙周病的比率比起其他人約高出兩倍。目前感染與類風溼性關節炎的關係的病原菌有牙齦卟啉單孢菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)、EB virus、Parvol virus B19等。P.gingivalis為革蘭氏陰性、厭氧、不具運動能力的桿狀細菌，大小約為0.3-0.5μm，在血液培養基上呈現黑色菌落。P.gingivalis也是目前造成牙周病的主要致病菌，也是已知微生物中唯一會製造peptidyl arginine deiminase(PAD)的細菌，PAD能夠將宿主蛋白質像是fibrinogen、α-enolase等蛋白質中的arginine後修飾成citrulline，藉由此機制可能參與類風溼性關節炎的發病機轉。
P.gingivalis具有許多毒理因子，這些因子不但可以引起發炎反
應，甚至可以幫助細菌躲避免疫系統的攻擊，其中一重要的毒理因子：Arg-gingipainA(RgpA)已經被證實可以分解宿主的免疫球蛋白、補體、以及細胞激素等，並且會造成血管通透性增加進而加劇發炎反應。在動物模式研究指出如果把RgpA基因剔除的話P.gingivalis感染宿主能力就會受到抑制。RgpA蛋白可分成三個區域：Propeptide、catalytic domain及hemagglutinin domain。Propeptide在蛋白質成熟的過程中會被切割掉並與RgpA在細菌內的運送有關；而catalytic doamin具有酵素活性能夠切割胜肽中含有Arg-Xaa的構造；hemagglutinin domain又可分成4個sub-domain，具有血球凝集的活性並且參與RgpA結合固定於細菌外膜上來幫助細菌靠近紅血球獲得其生長所必須的鐵離子。ACPA可於血清學上用來當作診斷類風溼性關節炎的分子，ACPA目前產生的機轉可能有三個來源，除了基因及抽菸之外，P.gingivalis的感染也可能是其中原因。因此，本發明透過測試牙周致病菌P.gingivalis的RgpA蛋白質中的胺基酸片段開發出一個新穎的胜肽片段，以及該胜肽片段用來診斷類風溼性關節炎之用途，此新穎的血清檢查方法可增加診斷的敏感度及特異度。
本發明係為關於一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽片段及其作為檢測類風溼性關節炎的用途，而根據此項用途，本發明提出一種類風溼性關節炎疾病的檢測方法以及檢驗套組用以判斷待測個體是否患有類風溼性關節炎疾病。根據本發明之一方面，於此提供一種能與類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽，係由SEQ ID NO：3-4、7-13或16-19中所組成之群組中任一段連續的10-25個胺基酸序列，該胜肽片段具有與類風溼關節炎的自
體抗體結合的抗原決定位點。根據本發明之一實施例中，該胜肽片段係由擇自於SEQ ID NO：8，10，11，12，17，18或19所組成之群組之胺基酸序列所組成。在另一實施例中，該胜肽片段係由擇自於SEQ ID NO：11，12，17，18或19所組成之群組之胺基酸序列所組成。在另一實施例中，該胜肽片段係由擇自於SEQ ID NO：12，17，18或19所組成之群組之胺基酸序列所組成。
根據本發明另一方面，本發明於此提供一種檢測類風溼性關節炎之方法，係包括：檢測一待測個體之血液中一具有抗如請求項1所述之胜肽的抗體的含量：以及比較該待測個體之血液檢體中該抗體的含量與一健康個體血液檢體中同一抗體的含量，該待測個體之血液檢體中該抗體的含量為該健康個體之血液檢體中同一抗體的含量1.5倍以上時，該待測個體有罹患類風溼性關節炎的可能；且進一步給予該待測個體服用有效量的治療類風溼性關節炎藥物。
在另一實施例中，其中該待測個體之血液檢體中該抗體的含量為該健康個體之血液檢體中同一抗體的含量2倍以上時，該待測個體有罹患類風溼性關節炎的可能。
在另一實施例中，其中該待測個體之血液檢體中該抗體的含量為該健康個體之血液檢體中同一抗體的含量3倍以上時，該待測個體有罹患類風溼性關節炎的可能。
根據本發明之一實施例中，其中該檢測方法為一免疫分析方法。在另一實施例中，其中該免疫分析方法係選自酵素連結免疫吸附分析、西方墨點分析、免疫沉澱分析、放射免疫分析、以及免疫色層分析所組成之群組。
在一實施例中，其中該免疫分析方法可結合層析原理，在另一實施例中將胜肽固定在硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)上並待作用後以膠體金顆粒(colloidal gold)呈色劑呈色，以檢測檢體中是否有欲偵測之抗體或抗原存在，來開發出快速檢驗試劑。在一實施例中，本發明之檢測類風溼性關節炎之方法，可進一步結合偵測類風溼性關節炎因子(rheumatoid factor，RF)和抗瓜氨酸化胜肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)的診斷方法。
根據本發明另一方面，本發明於此提供一種類風溼性關節炎檢測試劑組，其中該試劑組包含一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽片段胜肽，其中該胜肽片段係由擇自於SEQ ID NO：3-4、7-13或16-19中所組成之群組中任一段連續的10-25個胺基酸序列所組成、與該胜肽結合的一固相支持基質、和能辨識類風溼性關節炎自體抗體的一具有探針標記或未標記的二級抗體。在一實施例中，該試劑組中的一具有探針標記的二級抗體可以為螢光修飾或非螢光修飾。在一實施例中，其中該試劑組中該基質的表面具有一蛋白質交聯劑包覆。在另一實施例中其中該蛋白質交聯劑為辛二酸二琥珀酰亞胺(disuccinimidyl suberate,DSS)。在另一實施例中，其中該基質係可選自微盤(ELISA plate)、磁珠(magnetic beads)、薄聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)、樹脂(agarose beads)、聚苯乙烯，polystyene)或硝化纖維膜(Nitrocellulose membrane)所組成之群組。
圖1為一示意圖，說明本發明之檢測方法。
圖2A為牙齦卟啉單胞菌的RgpA蛋白質不同功能區域示意圖。
圖2B為RgpA蛋白質中HA4功能區的氨基酸序列，並且以HA4序列當模板依序合成胜肽編號1-15，底線標示的序列區域為每段序列的重疊序列。
圖3為以RgpA不同蛋白質功能區域的重組蛋白(Hema或Cata)為抗原，與待測個體血清進行免疫結合作用，再分別以IgG或IgA為二級抗體進行抗原抗體反應訊號值之圖，其中(A)為抗IgG-Hema、(B)為抗IgA-Hema、(C)抗IgG-Cata，(D)抗IgA-Cata(Normal：健康受試者，PD：牙周病病患，RA：類風溼性關節炎病患)。
圖4為以RgpA不同蛋白質功能區域的重組蛋白(HA1、HA2/3或HA4)為抗原，與待測個體血清進行免疫結合作用，再分別以IgG或IgA為二級抗體進行抗原抗體反應訊號值之圖，其中(A)為抗IgG-HA1、(B)為抗IgA-HA1、(C)抗IgG-HA2/3，(D)抗IgA-HA2/3，(E)抗IgG-HA4，(F)抗IgA-HA4(Normal：健康受試者，PD：牙周病病患，RA：類風溼性關節炎病患)。
圖5為以RgpA蛋白質的HA4功能區域的胜肽片段為抗原，與待測個體血清進行免疫結合作用，再以IgG為二級抗體進行抗原抗體反應訊號值之圖，其中(A)為胜肽序列p1，(B)胜肽序列p2，(C)胜肽序列p3，(D)胜肽序列p4，(E)胜肽序列p5，(F)胜肽序列p6，(G)胜肽序列p7，(H)胜肽序列p8，(I)胜肽序列p9，(J)胜肽序列p10，(K)胜肽序列p11，(L)胜肽序列p12，(M)胜肽序列p13，(N)胜肽序列p14，(O)胜肽序列p15(Normal：健康受試者，RA：類風溼性關節炎病患)。
圖6為以RgpA蛋白質的HA4功能區域的胜肽片段p11或其衍生片
段為抗原，與待測個體血清進行免疫結合作用，再以IgG為二級抗體進行抗原抗體反應訊號值之圖，其中(A)為胜肽序列p11，(B)胜肽序列p11M1，(C)胜肽序列p11M2，(D)胜肽序列p11M3(Normal：健康受試者，RA：類風溼性關節炎病患)。
圖7為測試不同的塗層方法對於以用來偵測胜肽片段p11與待測個體血清進行免疫結合作用的反應，其中(A)微盤以DSS進行處理，(B)微盤未做任何處理，(C)市售表面具有特殊處理微盤(主要針對可加強胜肽結合)。
以下實施例僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
本發明所使用之檢體係由中國醫藥大學附設醫院所取得。類風溼性關節炎患者經風溼病學家診斷並遵照適當的分類標準(ACR/EULAR 2010 rheumatoid arthritis classification criteria)經中國醫藥大學附設醫烷人體研究倫理委員會審核通過且所有參予者均同意參加，檢體存於-80℃中直到分析。其中發明中定義的該健康個體為一未罹患類風溼性關節炎的個體。
酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA)為本研究主要的偵測抗原抗體結合的實驗方法，其偵測的主要原理如圖1所示且主要實驗流程如下說明：將重組蛋白或是胜肽片段的抗原以包覆溶液(coating bufffer)進行稀釋，將稀釋過後的抗原以5ng的蛋白(100μl/well)加入預先表面處理
過的一微盤中的孔洞，並置於4℃過夜進行包覆作用。其中該微盤的表面先以蛋白質交聯劑進行表面處理，以增加蛋白與微盤表面的連結。接著加入以含有2% BSA的PBS溶液(blocking buffer)並置於室溫一小時以進行非特異性的阻斷(blocking)。將待測個體的血清以blocking buffer進行100倍的稀釋並二重複的加入上述blocking後的孔洞中並置於4℃過夜以進行抗原抗體的結合作用。接著，以含有0.1% of Tween 20的PBS溶液(washing buffer)進行三次的清洗步驟後，加入以blocking buffer進行2500倍稀釋的過氧化物酶偶聯的山羊抗人IgA或IgG的二級抗體進行室溫一小時的作用。以washing buffer進行五次的清洗步驟後，加入含有過氧化物受質溶液的呈色劑(ABTS peroxidase substrate solution)，作用15分鐘後加入含有5% sodium dodecyl sulfate溶液進行終止反應並讀取其OD405的吸光值。進一步比對作為檢測RA疾病的陽性率，其中判定該檢測個體為陽性的標準為所有健康受試者平均數值的三倍，即為臨界點數值(如圖3-6中虛線指出的數值)。
實施例一、
根據牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)之RgpA蛋白功能區可分成：酵素活性區(catalytic domain，Cata)和血球凝集區(hemagglutinin domain，Hema)，進一步將血球凝集區分為HA1、HA2/3以及HA4(圖2A)，將上述蛋白質的基因片段克隆至細菌蛋白質表現載體，並且進一步以大腸桿菌表現系統表現重組蛋白並以親和性管柱將上述重組蛋白進行純化和蛋白質鑑定。以純化出來的牙齦卟啉單胞菌RgpA各個蛋白片段當作抗原進行檢測
健康受試者、RA病人和PD病人血清內是否含有抗RgpA-catalytic domain(Cata)、抗RgpA-hemagglutinin domain(Hema)之抗體。圖3結果顯示出RA和PD病人血清中都可以偵測抗Hema抗體(圖3A和3B)和抗RgpA-Cata抗體(圖3C和3D)。進一步將Hema蛋白質功能區分為HA1、HA2/3和HA4進行檢驗，圖4結果顯示出RA病人血清中同時具有較高的抗HA4 IgG抗體(圖4E)和IgA抗體和(圖4F)。
實施例二
進一步針對HA4的氨基酸序列進行抗原的位點分析，圖2B為HA4的氨基酸序列並且將全段序列分成15段具有重疊序列的胜肽片段，進一步針對p10-p11序列在分為3段具有重疊序列的胜肽片段，其詳細序列如表2所示。
以p1-p15胜肽片段當作抗原進行檢測健康受試者、RA病人血清內是否含有抗各個胜肽片段之抗體，圖5結果顯示出相對健康受試者來說，RA病人血清中含有針對抗胜肽片段的抗體有不同程度的增加。進一步以臨界點數值(健康受試者平均數值的三倍)來檢測RA疾病的陽性率(如圖5中虛線指出的數值)，可以計算出其分別的檢測陽性率(表3)。
實施例三
進一步針對HA4中p10-p11序列，在此連續序列中切分為3段具有重疊序列的胜肽片段並命名為p11M1、p11M2和p11M3，其詳細序列如表4所示。
以p11以及其衍生胜肽片段(p11M1、p11M2和p11M3)當作抗原進行檢測健康受試者、RA病人血清內是否含有抗各個胜肽片段之抗體，圖6結果顯示出相對健康受試者來說，RA病人血清中皆可顯著的偵測到含有針對抗胜肽片段p11和及其衍生胜肽的抗體。進一步以臨界點數值(健康受試者平均數值的三倍)來檢測RA疾病的陽性率(如圖6中虛線指出的數值)，可以計算出其分別的檢測陽性率(表5)。
進一步將此實驗數具製作出ROC曲線，並且取得AUC(area under the curve)數值。AUC數值常被用來評估試驗的診斷價值，若數值越高則診
斷價值就越高。一般而言，若AUC為0.7-0.9之間則為準確性高的檢驗方法。如表6中顯示以偵測抗胜肽片段p11和及其衍生胜肽的抗體所得到的AUC數值皆介於0.8-0.9之間。
先前研究報導中，血清學所使用檢測項目為以酵素結合免疫吸附分析法偵測RF及ACPA的表現，而體外檢測試劑廠商有Menarini、Thermo Fisher、Inova、Roche、Abbott及Euroimmun等，2018年由Van Hoovels學者比較市售檢測RF及ACPA陽性率之比較結果為：類風溼性關節炎的病人其RF血清學診斷之陽性率為35-60%、ACPA之陽性率為35-41%。進一步計算出的RF和ACPA的AUC數值分別為0.68-0.71和0.67-0.77之間(Ann Rheum Dis.2018,77(5)：667-67)。因此，不論以診斷的陽性率或是以AUC數值來比較，以偵測抗胜肽11及其衍生胜肽的抗體用來作為RA診斷的方法都比目前以偵測RF和ACPA來得更加敏感與準確。
實施例四
121位類風溼性關節炎之病人，同時使用市售檢驗套組(廠牌：Inova)進行檢測RF及ACPA，其結果如表8可以得知其RF陽性率為44.6
%、ACPA陽性率53.7%，若同時具備RF和ACPA的陽性率為54.5%，因此仍有45.5%的患者呈現RF和ACPA雙陰性(RF-/ACPA-)，即無法以現行的血清學檢驗方法檢測出RA疾病。然而，本發明以偵測抗胜肽11的抗體用來作為RA診斷的方法其陽性率為65.3%，其敏感度已經高於RF或ACPA或兩者合併的數值。
進一步針對RF和ACPA雙陰性中的55人(45.5%)進行抗胜肽p11的抗體的偵測，結果顯示出其中31人可以被檢驗出具有RA。因此若合併抗胜肽p11的抗體的偵測結果可將RF及ACPA其陽性率能提升為80.2%(表7-9)。因此本發明中對於目前市售所檢測之套組對於RF及ACPA檢測結果呈現陰性的類風溼性關節炎患者更精確的提升血清診斷的靈敏度，使醫師能夠更早期介入治療，來緩解關節疼痛及發炎反應，並減緩類風溼性關節炎所引起侵蝕骨頭的狀況。
實施例五
由於微盤進行表面處理可增加胜肽片段對於微盤的結合以提升偵測RA病人血清抗體的精準度。本實施例以蛋白質交聯劑-辛二酸二琥珀酰亞胺(disuccinimidyl suberate,DSS)進行表面處理，同時以一市售能增加胜肽結合能力的微盤進行比對分析，實驗結果係透過偵測健康受試者和RA病人血清中的抗胜肽p11抗體來作為RA診斷的陽性率，並且進一步根據其陽性率來判斷本測試結果。圖7和表10顯示出利用DSS進行表面處理能增加RA病人的陽性率(圖7A為未處理DSS的微盤，圖7B為處理DSS的微盤)。另一方面，市售微盤雖可提升胜肽與微盤結合，但卻無法提供可辨識的具有專一性的抗原決定位點，如圖7C的結果顯示出吸光值相對於處理捍未處理DSS的微盤可明顯的提升，但卻無具有可區分健康受試者和RA病人血清中抗體的特異性(圖7C)。
<110> 中國醫藥大學
<120> 一種類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽及其應用
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Claims (9)
- 一種能與類風溼關節炎自體抗體結合的胜肽，係由SEQ ID NO：8、10、11、12、17、18或19中所組成之群組中任一段連續的10-25個胺基酸序列，該胜肽片段具有與類風溼關節炎的自體抗體結合的抗原決定位點。
- 一種檢測類風溼性關節炎之方法，係包括：檢測一待測個體之血液中一具有抗如請求項1所述之胜肽的抗體的含量；以及比較該待測個體之血液檢體中該抗體的含量與一健康個體血液檢體中同一抗體的含量，該待測個體之血液檢體中該抗體的含量為該健康個體之血液檢體中同一抗體的含量1.5倍以上時，該待測個體有罹患類風溼性關節炎的可能。
- 如請求項第2項所述之方法，其中該待測個體之血液檢體中該抗體的含量為該健康個體之血液檢體中同一抗體的含量3倍以上時，該待測個體有罹患類風溼性關節炎的可能。
- 如請求項第2項所述之方法，其中該方法為酵素連結免疫吸附分析、西方墨點分析、免疫沉澱分析、放射免疫分析或免疫色層分析。
- 如請求項第4項所述之方法，其進一步結合偵測類風溼性關節炎因子(rheumatoid factor，RF)和抗瓜氨酸化胜肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)的診斷方法。
- 一種檢測類風溼性關節炎之試劑組，其包含請求項第1項所述之一胜肽、與該胜肽結合的一固相支持基質和能辨識類風溼性關節炎自體抗體的一具有探針標記或未標記的二級抗體。
- 如請求項第6項所述之試劑組，其中該固相支持基質的表面具有一蛋白質交聯劑包覆。
- 如請求項第7項所述之試劑組，其中該蛋白質交聯劑為辛二酸二琥珀酰亞胺(disuccinimidyl suberate,DSS)。
- 如請求項第6項所述之試劑組，其中該固相支持基質為微盤(ELISA plate)、磁珠(magnetic beads)、薄聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)、樹脂(agarose beads)、聚苯乙烯(polystyene)或硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)。
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| 2017年10月30日 蔡嘉哲, 研究類風濕性關節炎及牙周病病人血清中P.gingivalis抗體之抗原接會點及研究P.gingivalis之hemagglutinin區域在動物模式之免疫應用-科技部補助專題研究計畫成果報告 * |
| 2017年10月30日 蔡嘉哲, 研究類風濕性關節炎及牙周病病人血清中P.gingivalis抗體之抗原接會點及研究P.gingivalis之hemagglutinin區域在動物模式之免疫應用-科技部補助專題研究計畫成果報告。 |
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