CN104262489B - 一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用 - Google Patents
一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用；该抗原的制备首先由来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子抗原肽通过甘氨酸连接嵌合而成，再通过在嵌合肽的N端及C端插入的两个半胱氨酸以形成二硫键，合成了一条具有与蛋白质β‑转角结构相似的环状多肽。将该环状嵌合肽抗原包被在固相载体上，制成间接酶联免疫试剂盒，用于检测类风湿性关节炎（RA）血清中的多种抗瓜氨酸肽抗体亚型。本发明公布的环状多肽抗原及其ELISA试剂盒制备及实验操作过程简单，其对RA的检测敏感性和诊断价值较国际同类试剂盒显著提高，结果重复性好，并可定性或定量，具有广泛的临床应用和科学研究价值。
Description
技术领域
本发明属于临床免疫及医学实验诊断领域，具体涉及一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用，设计合成一种能被多数类风湿性关节炎血清特异识别的环状瓜氨酸嵌合多肽(cyclic chimeric citrullinated peptide， CCCP)及其应用于检测相关抗体的酶联免疫试剂盒。
背景技术
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种常见的慢性自身免疫性疾病。在全世界大约有1%的人罹患此病。RA能引起关节的疼痛、僵直及肿胀。在发病1-2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤，并可引起多种并发症。及早诊断RA及给予缓解病情的药物治疗，对控制病情时，改善预后非常重要（Gabriel SE. The epidemiology of rheumatoidarthritis. Rheum Dis Clin North Am 27 (2001) 269-281）。
目前诊断类风湿性关节炎是基于综合临床表现及实验检查的美国风湿病学会（ACR）的分类标准（The American Rheumatism Association 1987 revised criteria forthe classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1988;31:315 –24.）。临床医生上在应用该标准规定的指标时受主观因素影响较大，加上疾病本身在个体上临床表现的多样性，经常出现误诊或漏诊。而由于缺乏高度敏感性或特异性的原因，当前尚无很理想的实验室检测指标。
2000年，国外首次报道的抗环瓜氨酸肽（cyclic cirullinated peptide, CCP）抗体的检测，对RA具有很高的特异性（›93%），明显优于传统的类风湿因子（RF），是实验诊断RA很有前途的血清标志物。后续的研究表明，CCP抗体不仅是RA早期诊断指标，而且是鉴别侵蚀性、非侵蚀性RA的灵敏指标（Shankar S et al. Role of anti cyclic citrullinatedpeptide antibodies in erosive disease in patients with rheumatoid arthritis.Indian J Med Res. 2006 Dec;124(6):689-96.）。与CCP抗体阴性的患者相比，抗CCP抗体阳性的RA病人通常出现或易发展成更严重的关节骨质破坏。所以该血清标志物一经问世，就很受欢迎，现已在国际上得到广泛应用。但是，综合报道显示，抗CCP抗体对RA的敏感度仅在60%-72%，不及低特异性的RF（65%-85%），目前CCP仍无法完全替代RF及其它RA相关的自身抗体（Taylor P et al.A systematic review of serum biomarkers anti-cycliccitrullinated Peptide and rheumatoid factor as tests for rheumatoidarthritis. Autoimmune Dis. 2011:815038）(Bas S et al. Diagnostic tests forrheumatoid arthritis: comparison of anti-cyclic citrullinated peptideantibodies, anti-keratin antibodies and IgM rheumatoid factors. Rheumatology(Oxford) 2002;41:809 – 14.）。因此，为了减少漏诊率，临床医生仍需联合检测RF，抗 CCP抗体或其它血清标志物，从而增加了病人的医疗负担。这样，提高RA患者血清中CCP抗体的检测敏感性， 是摆在医学科研人员面前的一个重要任务。
抗CCP抗体是风湿病自身抗体系统的一种，以IgG型为主。该抗体针对的抗原为丝聚合蛋白/中间丝蛋白（filaggrin）的多肽片段。应用基于filaggrin的cDNA序列而合成的多肽， Schellekens和Girbal Neuhause于1998年首先证实了瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗filaggrin抗体识别抗原表位的必需组成部分（Schellekens GA et al.Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognizedby rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1998; 101:273– 81.）。他们通过对各个序列号的filggrin氨基酸序列进行分析，合成了一条以瓜氨酸代替精氨酸的小分子肽链。并试验证明了该瓜氨酸小分子肽链能被一部分RA血清所高度特异识别。两年后，Schellekens的研究团队通过将一条瓜氨酸短肽中的丝氨酸替换为半胱氨酸，合成了环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide,CCP），并将其应用于检测RA患者血清中的抗环瓜氨酸肽抗体，敏感性得到了进一步的提高（Schellekens GA et al. Thediagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cycliccitrullinated peptide. Arthritis Rheum 2000;43:155 – 63.）。该技术一出现，立即备受关注，现已被多家国际主要的商品化的CCP试剂盒所采用。然而，临床评价实验表明，虽然这些CCP试剂盒对RA的特异性较高（90%-97%），但其敏感性（62-72%） 仍待提高，综合诊断价值还不很理想(Nishimura K et al. Meta-analysis: diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoidarthritis. Ann Intern Med. 2007 Jun 5;146(11):797-808）。目前商品化的CCP试剂盒的共同缺点是用于检测环瓜氨酸肽抗体的多肽抗原一般只含有单一的抗原表位，只能检出一部分瓜氨酸肽抗体亚型， 而且不同厂家采用合成肽抗原的氨基酸序列不同，经常造成检测结果的差异，给临床医生对RA的诊断 造成困扰。
基于以上背景，我们的研究采用创新的思路，首先应用RA病人血清筛查出针对该病高度特异的几个优势抗原表位（瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2，瓜氨酸肽3），并发现不同RA病人的血清对这些抗原多肽的识别存在明显差异。如有些RA患者的血清只识别瓜氨酸肽1，部分血清只识别瓜氨酸肽2或瓜氨酸肽3，而有些类风湿性关节炎血清则能同时识别多种抗原决定簇（瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2，瓜氨酸肽3）。 这样，如果与当前的商业化试剂盒一样，只采用含单一抗原表位的合成肽，必将漏检相当一部分瓜氨酸肽抗体亚型，客观上限制了检测敏感性的提高。而同时包被以上三条合成肽于ELISA板，由于短肽之间对有限包被位点的相互竞争，也对敏感性的提高造成技术上的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用，设计合成一种对类风湿性关节炎具有高度特异并含有多个丝聚合蛋白/中间丝蛋白（filaggrin）优势抗原表位的环状瓜氨酸嵌合肽（CCCP），并将其应用于制备检测相关抗体的酶联免疫试剂盒，以克服目前商品化CCP试剂盒只能检测一种瓜氨酸肽抗体亚型的局限性，从而提高检测CCP抗体的敏感性，改善类风湿性关节炎的实验诊断水平。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，该抗原由瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子合成肽通过甘氨酸连接嵌合，再通过在嵌合肽的N端及C 端插入的半胱氨酸产生的二硫键， 从而形成了具有与蛋白质β-转角相似结构的环状嵌合肽，其氨基酸序列如下：
CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC
其中X 为瓜氨酸。
所述多肽具有环状结构，其富含瓜氨酸残基的氨基酸序列包含了来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白中能被类风湿性关节炎特异识别的多个抗原表位。
线性瓜氨酸嵌合肽，瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3的氨基酸序列如下（其中X为瓜氨酸）：
线性瓜氨酸嵌合肽：
XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX；
瓜氨酸肽1(CP1)：XGGXQGSYHEQSVDX；
瓜氨酸肽2(CP2)：HGQSGPXSASXQTX；
瓜氨酸肽3(CP3)：GXXQDSSVVGX。
其中，各瓜氨酸化的合成肽序列来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白（filaggrin），由FMOC固相合成方法合成，经高效液相色谱法（HPLC）分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。
所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原（CCCP）在抗体检测中的应用，是将CCCP抗原包被在固相载体上，用于抗瓜氨酸肽抗体的检测。
其中，所述的固相载体包括聚乙烯微孔板、硝酸纤维素膜（NC）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）或微球（beads）等。
所述的抗瓜氨酸肽抗体的检测方法包括间接ELISA法，具体为：将环状瓜氨酸嵌合肽抗原(CCCP)抗原包被在酶标板上，制成间接酶联免疫检测试剂盒，其组成如下：
（1）包被CCCP抗原的ELISA 板；
（2）辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG 抗体；
（3）TMB 底物显色液；
（4）1M硫酸反应终止液；
（5）磷酸盐-Tween 20 洗涤液（PBST）；
（6）标本稀释液：含1%的小牛血清白蛋白的磷酸盐吐温缓冲液（PBST）；
（7）CCCP抗体校准品；
（8）阴性及阳性对照血清。
进一步的，所述的包被CCCP抗原的ELISA 板的制备过程为：
（1）将CCCP抗原用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释至20μg／ml，每ELISA板孔加100ul，4℃过夜；
（2）次日用PBST洗涤2次；
（3）每孔加入100ul含1%的牛血清白蛋白的封闭液，放置37℃孵育2小时封闭ELISA板，后用PBST洗涤3次，拍干；（4）该ELISA 板可立即用于检测抗瓜氨酸肽抗体或密封防潮避光保存于4℃。
本发明的优点：
本发明原创性设计合成的环状瓜氨酸嵌合肽抗原，包含了来源于filaggrin 蛋白，能被类风湿性关节炎血清特异识别的多个优势抗原表位。这种新型的抗原具有如下的多个结构优点：（1）嵌合了多个代表优势抗原表位的短肽，增加了检出各类抗瓜氨酸肽抗体亚型的机率，从而提高了检测敏感性；（2）环状的多肽结构不仅可以增加多肽结构的稳定性， 还便于暴露抗原表位，增加了多肽的抗原性，进一步提高了敏感性；；（3）与Schellekens采用的替换源序列的丝氨酸为半胱氨酸的方法不同，本发明的环状多肽的结构合成是通过在嵌合肽的N端及C 端直接插入额外的两个半胱氨酸而形成的二硫键，这样有助于保持源序列的完整性；（4）通过在各小分子瓜氨酸肽间插入甘氨酸， 可以避免因不同抗瓜氨酸肽抗体亚型与该嵌合肽抗原结合时所产生的空间位阻现象；（5）该嵌合肽抗原既利用了环状合成肽易与抗体结合的特点，还能避免多条短肽同时包被于ELISA板而产生的位点竞争现象；（6）由于环状嵌合肽抗原（“大环肽”）含有的氨基酸数量较只含单一抗原表位的环状短肽（“小环肽”）明显增多，其较大的分子量使之更易于包被于固相载体如ELISA板，纤维素膜上；（7）与化学提纯的天然抗原和重组多肽抗原相比，该嵌合肽具有制备简单，质量稳定等特点，且不含与待检抗体无关的氨基酸序列，有助于避免与其他自身抗体的交叉反应，从而保证了高特异性。
由于嵌合了多个对RA特异的抗原表位，以纯化的环状瓜氨酸嵌合肽为检测抗原的酶联免疫（ELISA）试剂盒具有同时检测多种抗瓜氨酸肽抗体亚型的能力，因此能够在保证高特异性（94.7%）的前提下，将其对RA的检测敏感性提高到82.7%，显著领先于目前国际上同类瓜氨酸肽抗体检测试剂盒70%以下的敏感性，在诊断价值上明显优于其他的CCP商业化试剂盒。本发明的ELISA试剂盒制备过程简单，其检测抗瓜氨酸肽抗体的准确性高，重复性好，操作简便，并可定性或定量，可广泛应用于临床常规检测及科学研究，具有很好的应用价值。
附图说明
图1 含多种抗原表位的环状瓜氨酸嵌合肽(CCCP)与线性瓜氨酸嵌合肽(LCCP)，以及与含单一抗原表位的三种瓜氨酸合成肽(CP1,CP2,CP3)在检测类风湿性关节炎病人血清中相关抗体的敏感性(sensitivity)比较。
图2 本发明的ELISA检测试剂盒（CCCP）在类风湿性关节炎患者及其对照组血清的结果分布。图中虚线（24Au/ml）为阳性界值，受检者包括类风湿性关节炎(RA) 150例，疾病对照组168例：其中硬皮病(Scleroderma， Scl)15例，混合结缔组织病(MCTD) 15例，系统性红斑狼疮（SLE）27例，银屑病（Psoriasis）10 例，干燥综合征（SS）13例，其它疾病（otherdiseases） 88例，以及健康对照（Healthy）60例。
图3 本发明的ELISA检测试剂盒（CCCP）与两种国际同类试剂盒的诊断价值对比（受试者工作特征曲线，receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线）。AUC: ROC曲线下方区域面积；RA：类风湿性关节炎；Controls：疾病及健康对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明不仅限于此。
实施例1：
1.瓜氨酸肽序列的合成及应用
首先应用类风湿性关节炎患者血清筛选出三个针对类风湿性关节炎特异识别，来源于filaggrin蛋白富含瓜氨酸的优势抗原表位(瓜氨酸肽1, 瓜氨酸肽2和 瓜氨酸肽3)，然后经甘氨酸(G)连接嵌合而成，并通过在嵌合肽的N端及C 端各插入一个半胱氨酸(C)而形成的二硫键，最终设计合成出一条包含上述三个抗原表位，具有蛋白β-转角相似结构的环状嵌合肽抗原（CCCP）。
该多肽由多肽生化公司采用FMOC固相合成方法自动或人工合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。其相关的氨基酸序列如下(X 为瓜氨酸)：
（1）含多抗原表位的瓜氨酸嵌合肽氨基酸序列
环状瓜氨酸嵌合肽(CCCP)：
CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC
线性瓜氨酸嵌合肽(LCCP)：
XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX
（2）含单个抗原表位的瓜氨酸肽氨基酸序列
瓜氨酸肽1(CP1) XGGXQGSYHEQSVDX
瓜氨酸肽2(CP2) HGQSGPXSASXQTX
瓜氨酸肽3(CP3) GXXQDSSVVGX
2.包被瓜氨酸肽抗原于ELISA 板
以纯化的瓜氨酸肽抗原包被酶标板，发展出一种间接酶联免疫（ELISA）试剂盒，用于检测类风湿性关节炎病人血清中的抗瓜氨酸肽 IgG抗体。
将瓜氨酸嵌合肽抗原用碳酸盐包被缓冲液（PH 9.6）稀释至20μg／ml，每ELISA板孔加100ul，4℃过夜。次日用磷酸盐TWEEN 20缓冲液（PBST）洗涤2次。然后每孔加入100ul含1%的牛血清白蛋白的封闭液（PBST），放置37℃孵育2小时封闭ELISA板，后用PBST洗涤3次，拍干，该ELISA 板可立即用于检测抗瓜氨酸肽抗体或密封防潮避光保存于4℃。
3. 间接法ELISA 检测抗环状瓜氨酸嵌合肽抗体 （1） 加样： 将1:100稀释的患者血清(含待检抗体) 100ul 加入上述已包被环状瓜氨酸嵌合肽（CCCP）的ELISA反应孔中,同时做空白（样本稀释液）、瓜氨酸肽抗体校准品，阴性对照(健康人血清)及阳性对照（瓜氨酸肽抗体阳性的类风湿性关节炎患者血清）。然后将ELISA板置37℃孵育1小时后，PBST洗涤3次。
（2） 添加酶标二抗：于反应孔中，加入HRP酶标记的第二抗体(羊抗人IgG抗体)100ul，37℃孵育45 分钟，PBST 洗涤3次。 （3）加底物液显色：于各反应孔中加入TMB显色液100ul ，室温避光孵育30分钟。 （4）终止反应：于各反应孔中加入1M硫酸100ul，混匀10秒。
（5）结果检测及判定：在ELISA检测仪上，选择主波长450nm，副波长620nm读取光密度（OD）值，并以空白对照孔调零。
4. 结果判定
样本结果= (样本孔OD /校准孔OD) ×参考值 (30 Au/ml))。
阳性临界值为24Au/ml（从ROC曲线上选择），样本结果高于或等于阳性界值为抗CCCP抗体阳性，反之为阴性。
实施例2：
分别包被含多抗原表位的环状瓜氨酸嵌合肽（CCCP）和线性瓜氨酸嵌合肽（LCCP）以及含单一抗原表位的瓜氨酸肽1（CP1），瓜氨酸肽2 （CP2），瓜氨酸肽3（CP3）短肽于ELISA板，同时检测50例类风湿性关节炎血清。如图1所示，以ELISA 光密度（OD） 0.2作为阳性的界值，环状瓜氨酸嵌合肽对RA血清的检测敏感性达83%，远优于线性瓜氨酸嵌合肽（72%），瓜氨酸肽1（45%），瓜氨酸肽2（29%）和 瓜氨酸肽3（31%）。
实施例3：
对本发明的ELISA试剂盒进行临床验证，分别检测了150例类风湿性关节炎(RA)病人，疾病对照组168例：其中硬皮病(Scleroderma， Scl)15例，混合结缔组织病(MCTD) 15例，系统性红斑狼疮（SLE）27例，银屑病（Psoriasis）10 例，干燥综合征（SS）13例，其它疾病（other diseases） 88例，以及健康对照（Healthy）60例。
结果见图2。以24AU/ml作为阳性的界值（图中虚线），发现绝大部分（82.7%）RA显示阳性结果，而疾病对照阳性率极低（7.1%），健康对照则100%为阴性。统计表明本发明的试剂盒对类风湿性关节炎患者的检测敏感性达到82.7%，特异性达94.7%(表1)。而同时检测上述血清的两种目前国际上常用的商业化ELISA试剂盒 EuroimmunCCP 和Quanta Lite CCP2，按照其说明书提供的阳性界值计算，敏感性分别只有65.9% 和67.1%，特异性分别为94.9%和 94.5% (表2)。说明本发明的ELISA试剂盒在维持高特异性的同时，敏感性较国际上常用的商业化CCP ELISA试剂盒有显著的提高。
表1 本发明的ELISA检测试剂盒（CCCP）在类风湿性关节炎患者及其对照组的结果统计
表2 本发明的ELISA检测试剂盒（CCCP）与两种国际同类试剂盒在类风湿性关节炎的诊断敏感性和特异性的比较
进一步对比本发明（CCCP）和Euroimmun CCP 及Quanta Lite CCP2 ELISA试剂盒的诊断价值， 采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）作为标准，结果见图3（A，B，C）。本发明的试剂盒在ROC曲线下方区域面积（AUC）达到0.94 (95%可信区间：0.91-0.97)，显著优于Euroimmun CCP的0.80 （95%可信区间：0.74-0.85） 和Quanta Lite CCP2 的 0.82 （95%可信区间：0.77-0.87）。可见本发明的试剂盒在综合诊断价值上明显优于当前国际上同类商业化试剂盒，具有很好的临床应用和科研价值，将显著提高类风湿性关节炎的实验诊断水平。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈仁奋
<120> 一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原及其应用
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (8)
1.一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：该抗原由来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三个小分子合成肽通过甘氨酸连接嵌合，再通过在嵌合肽的N端及C 端插入的半胱氨酸产生的二硫键， 从而形成了具有与蛋白质β-转角相似结构的环状嵌合肽，其线性结构及氨基酸序列如下：
CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC
其中X 为瓜氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：所述多肽具有环状结构，其富含瓜氨酸残基的氨基酸序列包含了来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白中能被类风湿性关节炎特异识别的多个抗原表位。
3.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：线性瓜氨酸嵌合肽，瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3的氨基酸序列如下：
线性瓜氨酸嵌合肽：
XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX；
瓜氨酸肽1：XGGXQGSYHEQSVDX；
瓜氨酸肽2：HGQSGPXSASXQTX；
瓜氨酸肽3：GXXQDSSVVGX。
4.根据权利要求1所述的一种环状瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：各瓜氨酸合成肽段序列来源于丝聚合蛋白/中间丝蛋白，由FMOC固相合成方法自动或人工合成，经高效液相色谱法分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。
5.一种如权利要求1所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原在抗体检测试剂中的应用，其特征在于：将环状瓜氨酸嵌合肽抗原包被在固相载体上，用于抗瓜氨酸肽抗体的检测。
6.根据权利要求5所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原在抗体检测试剂中的应用，其特征在于：所述的固相载体包括聚乙烯微孔板、硝酸纤维素膜（NC）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）或微球。
7.如权利要求5所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原在抗体检测试剂中的应用，其特征在于：所述的抗瓜氨酸肽抗体的检测方法包括间接ELISA法，具体为：将环状瓜氨酸嵌合肽包被在酶标板上，制成间接酶联免疫检测试剂盒，其组成如下：
（1）包被环状瓜氨酸嵌合肽抗原的酶标板；
（2）辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG 抗体；
（3）TMB 底物显色液；
（4）1M硫酸反应终止液；
（5）磷酸盐-Tween 20 洗涤液；
（6）标本稀释液：含1wt.%的小牛血清白蛋白的磷酸盐吐温缓冲液；
（7）抗瓜氨酸肽抗体校准品；
（8）阴性及阳性对照血清。
8.如权利要求7所述的环状瓜氨酸嵌合肽抗原在抗体检测试剂中的应用，其特征在于：所述的包被环状瓜氨酸嵌合肽抗原的酶标板的制备过程为：
（1）将环状瓜氨酸嵌合肽抗原用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释至20μg／ml，每个酶标板孔加100μl，4℃过夜；
（2）次日用磷酸盐吐温缓冲液洗涤2次；
（3）每孔加入100ul含1wt.%的牛血清白蛋白的封闭液即磷酸盐吐温缓冲液，放置37℃孵育2小时封闭酶标板，后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，拍干；
（4）该酶标板可立即用于检测抗瓜氨酸肽抗体或密封防潮避光保存于4℃。
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