KR101758354B1 - 신규한 시클릭 시트룰리네이티드 펩티드, 이를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법, 및 류마티스 관절염 마커 스크리닝 방법 - Google Patents

신규한 시클릭 시트룰리네이티드 펩티드, 이를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법, 및 류마티스 관절염 마커 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

CCP를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 류마티스 관절염 진단방법 및 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 얻는 방법, 새로운 류마티스 관절염 진단 마커 스크리닝 방법을 이용하면 류마티스 관절염을 효율적으로 진단하고, 환자의 편의성을 향상시킬 수 있다.

Description

신규한 시클릭 시트룰리네이티드 펩티드, 이를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법, 및 류마티스 관절염 마커 스크리닝 방법 {Novel cyclic citrullinated peptides, composition for diagnosing a rheumatoid arthritis including novel cyclic citrullinated peptides and method for diagnosing rheumatoid arthritis using thereof, and method for screening markers for rheumatoid arthritis}
시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(Cyclic Citrullinated peptide: CCP), 이를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물, 및 키트, 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단하는 방법, 및 류마티스 관절염 진단 마커를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis: RA)은 만성 염증성 질환으로 원인 불명의 자가면역 현상에 의해 발병한다. RA가 발병하면 관절 안의 활막(synovium)에 염증과 통증이 생기게 되고, 이러한 염증이 지속되면 염증성 활막 조직이 자라나면서 뼈와 연골까지 파고들어 관절의 변형이 초래되어 활동에 장애가 발생한다. RA를 완치할 수 있는 약물은 현재 개발되지 않았으며, 상기와 같이 발병 후 오랜 기간 방치하게 되면 관절의 변형 및 장기로의 침범에 의한 손상까지 초래하기 때문에 조기에 RA를 진단하여 치료를 하는 것이 매우 중요하다.
현재 RA를 확실하게 진단할 수 있는 검사법이 존재하지 않기 때문에 특징적인 증상, 검사 결과 등을 종합하여 RA의 진단을 내리고 있다. 그러나, RA와 유사한 증세를 보이는 전신홍반성 루푸스(systemic lupus erythemathode: SLE) 관절통 환자 또는 골 관절염 (osteoarthritis: OA) 환자 등의 경우에는 초기 RA와 혼돈되는 경우가 많아 RA 진단에 많은 어려움이 있다.
또한, RA 검사 마커로서 류마티스 인자(rheumatoid factor, RF)와 항-CCP 항체가 이용되고 있다. 그러나 이 경우 RA가 아닌 다른 관절염 환자에 대한 특이도가 정상인에 대한 특이도보다 낮기 때문에, 더욱 높은 민감도뿐만 아니라 다른 관절염에 대한 RA 특이도가 높은 RA 진단 마커를 발굴 및, 이를 활용한 RA 진단법의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 신규한 CCP를 제공한다.
다른 양상은 CCP를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 개체의 류마티스 관절염을 진단하기 위한 항-CCP 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 류마티스 관절염 진단용 마커를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함할 수 있다.
상기 변형된 아미노산은 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산일 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화, 당화, 아실화 (예컨대, 아세틸화, 미리스토일화 및 팔미토일화를 포함), 알킬화, 카르복실화, 케톤화, 히드록실화, 당화반응, 비오티닐화, 유비퀴티닐화, 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함할 수 있다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 측쇄에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함할 수 있다.
일 양상은 CCP를 제공한다.
용어 "CCP"는 펩티드 내부에 위치한 두 개의 시스테인이 이황화 결합으로 연결되어 고리형 구조를 가지고, 상기 고리형 구조에는 시트룰린이 포함되는 펩티드를 의미할 수 있다.
상기 시트룰린은 펩티딜아르기닌 데이미나제(peptidylarginine deiminase: PAD) 효소에 의해 아르기닌의 케티민 그룹이 케톤 그룹으로 번역 후 변형(post-translational modification)된 아미노산일 수 있다.
상기 펩티딜아르기닌 데이미나제는 가수분해 효소의 일종으로 아미딘 그룹의 C-N 결합을 가수분해하는 효소일 수 있다.
상기 펩티딜아르기닌 데이미나제는 PADI1, PADI2, PADI3, 또는 PADI4 일 수 있다. 상기 펩티딜아르기닌 데이미나제는 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나의 서열로 표시되는 단백질일 수 있다.
상기 CCP는 각각 서열번호 1, 및 3 내지 10 중 어느 하나와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 CCP는 상기 서열번호 1, 및 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 서열을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 펩티드 또는 아미노산 서열의 "서열 동일성(sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열간의 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로써, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 염기가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 백분율은 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램은 일례로 BLASTN(NCBI), CLC MAIN WORKBENCH(CLC BIO), MegAlignTM(DNASTAR INC.) 등일 수 있다.
상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 소수성 아미노산, 방향족 아미노산, 및 작은 아미노산의 군의 범위 내에 있다. 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘일 수 있다. 상기 산성 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산일 수 있다. 상기 극성 아미노산은 글루타민 및 아스파라긴일 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌일 수 있다. 상기 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신일 수 있다. 상기 작은 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 및 트레오닌일 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다.
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것일 수 있다. 상기 "변화"는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및/또는 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미할 수 있다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것일 수 있다. 상기 N-연결은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 의미할 수 있다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성될 수 있다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 세린, 트레오닌, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신에 부착시키는 것을 의미할 수 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는, N-연결된 글리코실화 부위의 경우 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 수행될 수 있다. O-연결된 글리코실화 부위의 경우에는, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다.
상기 CCP는 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다. 상기 효소 표지는 기질을 발색 물질로 전환하는 것일 수 있다.
다른 양상은 CCP를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물을 제공한다. CCP에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 조성물은 표적 물질을 검출, 정량 등의 분석을 수행하는데 필요한 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 필요한 물질은 항체 또는 항원 결합 단편, 세포 염색 시약, 버퍼 등일 수 있다.
상기 조성물은 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질, 또는 이들의 측정수단을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 다른 류마티스 관절염 마커는 RF, 항-CCP 항체, CRP, 이외에 염증반응과 관련된 물질 또는 그 조합인 것일 수 있다.
용어 "마커"는 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 그리고 치료방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 모든 생물학적 지표를 의미할 수 있다. 상기 마커에는 혈압, 체온, 및 혈당 수치, 및 유전자, 유전자 변이의 존재, 및 핵산, 단백질, 펩티드, 세균, 또는 바이러스의 수준 등이 포함될 수 있다.
류마티스 인자(Rheumatoid Factor: RF)는 류마티스 관절염 환자에서 관찰되는 자가면역항체를 의미할 수 있다.
C-반응성 단백질(C-reactive protein: CRP)은 염증반응시 그 수치가 높아져 염증의 예후의 판정에 이용되는 단백질을 의미할 수 있다.
염증반응과 관련된 물질을 측정하기 위하여 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate: ESR)를 측정할 수 있다. 적혈구 침강 속도는 항응고제로 혼합된 정맥혈에서 적혈구가 혈장으로부터 분리되어 침강하는 속도를 의미할 수 있으며, 염증 질환 발병시 적혈구와 결합할 수 있는 피브리노겐 등의 수준이 증가하여 적혈구 침강 속도가 증가하므로, 류마티스 관절염 등의 염증질환의 마커로 이용될 수 있다.
상기 조성물은 임의의 상을 가질 수 있다. 상기 조성물은 액체, 고체, 또는 그 조합을 갖는 조성물일 수 있다.
상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 마우스, 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.
다른 양상은 CCP를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 키트를 제공한다. CCP에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 조성물에 포함되는 물질은 상기 키트에도 또한 포함될 수 있다. 상기 키트는 그에 포함된 성분을 류마티스 관절염 진단용으로 사용하는데 필요한 과정을 설명한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 개체의 류마티스 관절염 진단에 사용하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 버퍼, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료와 상기 CCP를 접촉시켜 시료 중에 포함된 항-CCP 항체와 상기 CCP를 결합시켜 항-CCP 항체-CCP 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 항-CCP 항체 검출 방법을 제공한다.
상기 항체는 서열번호 1, 및 3 내지 10의 서열 중 어느 하나와 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 결합하는 항체일 수 있다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료와 상기 CCP를 접촉시켜 시료 중의 항-CCP 항체와 상기 CCP를 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 액체 시료 자체, 물, 버퍼, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 접촉은 상기 시료와 상기 물질을 혼합함으로써 수행될 수 있다. 상기 접촉은 상기 시료와 상기 물질을 용기 중에서 교반함으로써 수행되는 것일 수 있다.
상기 개체는 상기 검출 방법에 대한 설명에서 기술한 바와 같다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)과 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 상기 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다.
CCP는 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, "CCP", 및 "검출가능한 표지"에 대하여는 상기 조성물 및 키트에 대한 설명에서 기술한 바와 같다.
상기 방법은 시료 중 상기 항-CCP 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 측정은 상기 CCP, 및/또는 항-CCP 항체-CCP의 복합체의 존재 또는 그 양을 측정함으로써 항-CCP 항체의 수준을 직간접적으로 측정하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 CCP는 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있으며, 상기 표지로부터 신호를 측정함으로써 상기 항-CCP 항체의 수준을 측정할 수 있다.
상기 CCP, 및/또는 항-CCP 항체-CCP의 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 CCP를 항-CCP 항체-CCP의 복합체로부터 분리하여 양을 측정하는 것, 또는 상기 CCP를 분리하지 않고 그 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 상기 CCP에 부착된 검출가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 CCP를 분리하는 것은 원심분리, 침전, 염석, 투석, 여과, 크로마토그래피, 전기영동, 또는 그 조합에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 치환성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS , 단백질 칩(protein chip), 스펙트로메트리, 분광기, 또는 이들의 조합을 이용할 수 있다.
상기 CCP, 항-CCP 항체, 또는 항-CCP 항체-CCP의 복합체의 수준 측정은 예를 들면, ELISA 법에 의할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함할 수 있다.
예를 들면, 샌드위치 ELISA 방법을 이용하는 경우, 일차 항체로서의 상기 CCP를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; 개체로부터 분리된 시료를 상기 일차 항체에 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; 상기 항원-항체 반응 유도 단계의 결과물을 효소가 결합된 이차 항체와 반응시키는 단계; 및 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고체 기질로 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔이 이용될 수 있으며, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450 일 수 있다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
상기 방법은 대조군 대비 상기 CCP, 항-CCP 항체, 및/또는 항-CCP 항체-CCP 복합체의 수준이 높은 경우, 상기 개체는 류마티스 관절염에 걸릴 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군 시료는 류마티스 관절염 환자가 아닌 개체, 또는 류마티스 관절염에 걸릴 위험이 없는 개체로부터 수득된 시료일 수 있다.
상기 결정하는 단계는 분리된 시료에 함유된 항-CCP 항체의 양과 대조군 시료로부터 측정된 항-CCP 항체 양을 비교하는 단계; 및 항-CCP 항체의 양이 대조군 시료로부터 측정된 항-CCP 항체 양보다 증가한 경우, 상기 개체를 류마티스 관절염 환자 또는 류마티스 관절염에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커의 존재, 수치, 및/또는 수준의 측정, 또는 마커, 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 다른 류마티스 관절염 마커는 RF, 항-CCP 항체, CRP, ESR 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 (element) 중 청구된 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 CCP의 아미노산 서열을 변경시키는 단계 및 상기 아미노산이 서열이 변경된 CCP를 분리된 시료에 접촉시켜 항-CCP 항체-CCP 복합체를 형성시키는 단계 및 항-CCP 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 마커 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 아미노산 서열을 변경시키는 단계는 아미노산의 첨가, 결실, 치환, 및 번역 후 변형을 포함할 수 있다.
상기 아미노산의 첨가는 CCP 펩티드 서열 중간, N 말단, C 말단 또는 양쪽 말단 모두에 아미노산을 첨가하는 것일 수 있으며, 아미노카프로산(ε-aminocaproic acid)이 첨가될 수 있다.
상기 아미노산의 치환은 CCP 펩티드의 N 말단, C 말단, 및 그 사이에 존재하는 아미노산을 포함하는 모든 아미노산 중 어느 하나 이상이 치환되는 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 염기성, 산성, 극성, 소수성, 방향족 아미노산, 또는 번역 후 변형된 아미노산이 다른 성질의 아미노산으로 치환되거나 같은 성질의 아미노산으로 치환되는 것을 포함할 수 있다.
상기 아미노산 서열을 변경시키는 단계는 CCP의 시트룰린을 기준으로 C 말단 방향에 위치한 이황화 결합을 형성하는 시스테인 사이에 위치한 아미노산 중 어느 하나 이상의 서열을 변경시키는 단계일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에는 상기 아미노산이 변경된 CCP를 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 시료 및 대조군 시료에 접촉시키는 단계가 더 포함될 수 있다
상기 스크리닝 방법에는 관절염 환자로부터 분리된 시료 중에서 검출된 항-CCP 항체의 수준이 대조군 시료 중에서 검출된 항-CCP 항체의 수준보다 높을 경우, 상기 CCP를 류마티스 관절염 진단용 마커 후보물질로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 CCP의 고리를 형성하는 아미노산의 개수는 상기 CCP가 항-CCP 항체와 결합할 수 있는 한 제한되지 않으며, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에는 상기 측정된 항-CCP 항체의 수준을 기초로 하여 류마티스 진단에 대한 민감도 및/또는 특이도를 측정하는 단계가 더 포함될 수 있다. 상기 스크리닝 방법에는 수신자 조작 특성 곡선(ROC)을 그려 최적의 민감도 및/또는 특이도를 가지는 측정기준을 설정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
수신자 조작 특성 곡선은 특정 진단 방법의 민감도 및 특이도가 어떤 관계를 가지고 있는지 표현한 그래프로, 특정 진단 모델의 정확도를 나타내는 그래프일 수 있다. 상기 ROC는 X축을 1-특이도, Y축을 민감도로 하여 모든 진단 모델의 그래프상 위치를 표시하는 점을 연결한 그래프일 수 있다. 상기 진단 모델은 항-CCP 항체의 특정 수준을 질병 유무의 양성 및/또는 음성의 기준으로 정한 류마티스 관절염의 진단모델일 수 있다. 상기 그래프는 선 아래의 면적(Area under the curve: AUC)이 클수록 해당 진단 모델이 정확도가 높다고 판단할 수 있으며, 전체 면적이 1이라 할 때, AUC가 0.5이상, 0.6이상, 0.7이상, 0.8이상, 또는 0.9이상일 때 정확도가 더 높다고 판단할 수 있다. 상기 ROC는 그래프의 곡선이 왼쪽 상단 꼭지점에 가까울 수록 정확도가 더 높다고 판단할 수 있다.
용어 "민감도"는 특정 진단 모델을 이용할 때, 실제 질환을 가지고 있는 개체를 양성으로 판정하는 비율을 의미할 수 있다.
용어 "특이도"는 특정 진단 모델을 이용할 때, 실제 질환을 가지고 있지 않은 개체를 음성으로 판정하는 비율을 의미할 수 있다.
상기 아미노산이 치환된 CCP의 류마티스 관절염에 대한 민감도 및/또는 특이도를 측정하여, 류마티스 관절염 진단에 대한 민감도 및/또는 특이도가 다른 CCP에 비하여 상대적으로 더 높은 CCP를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 (element) 중 청구된 조성물, 키트, 또는 검출 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 조성물, 키트, 또는 검출 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 CCP 펩티드는 류마티스 관절염을 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 류마티스 관절염 진단용 조성물 또는 키트는 류마티스 관절염을 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 항-CCP 항체 검출 방법에 의하면 개체의 류마티스 관절염을 진단하는데 필요한 정보를 효율적으로 얻을 수 있다.
다른 양상에 따른 류마티스 관절염 진단 마커 스크리닝 방법에 의하면 개체의 류마티스 관절염을 진단할 수 있는 신규한 마커를 효율적으로 선별할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 CCP 및 CCP의 아미노카프로산 변형 펩티드를 이용한 관절염 환자의 혈중 자가면역(autoimmune) 항체 수준 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도 1a는 CCP, 1b는 RF, 그리고 1c 내지 1f는 아미노카프로산 변형 CCP를 이용한 경우를 나타낸다.
도 2a는 CCP의 아미노산 서열 변형 펩티드를 이용한 관절염 민감도를 분석한 그래프이고, 도 2b는 특이도를 분석한 그래프이다.
도 3은 CCP의 C 말단 서열 변형 펩티드들을 이용하여, 관절염 환자의 혈중 자가면역 항체의 검출수준을 ELISA 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a, 4b, 및 4c는 정상인에 대한 RA 환자의 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristic: ROC) 곡선을 분석한 결과이다. 도 4d, 4e, 및 4f는 골 관절염(OA) 환자에 대한 RA 환자의 ROC 곡선을 분석한 결과이다.
도 5a는 정상인에 대한 RA 환자의 민감도와 특이도를 분석한 그래프이다. 도 5b는 골 관절염(OA) 환자에 대한 RA 환자의 민감도와 특이도를 분석한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩티드 및 환자 혈청 시료의 준비 및 어세이 방법
사용된 시료 및 기구는 다음과 같이 준비되었다.
인산완충식염수 (phosphate buffered saline: PBS)(Cat. No: LB201-02)는 WelGene (대전, Korea)에서 구입하였으며, 세척을 위한 Tween-20 (Cat. No: 274348)와 소 알부민 (bovine serum albumin: BSA)(Cat. No: A1253)은 sigma-aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 항-CCP 항체의 검출을 위한 2차 항체로서 HRP가 접합 되어 있는 항-인간 IgG 항체 (anti-human IgG antibody)(Cat. No: ab6858)는 abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. 96-웰 마이크로플레이트 (Cat. No: 439454)와 TMB 기질 (TMB substrate)(Cat. No: 34021)은 Thermo (Rockford, USA)에서 구입하였다. 펩티드들은 펩트론(peptron, 대전, Korea)에서 합성하였다. ELISA 분석 결과는 마이크로플레이트 리더기(bio-rad, Hercules, USA)를 통해 측정하였다.
표 1은 사용된 펩티드들의 서열 정보를 나타낸 것이다. 일반적으로 사용되는 아미노산 서열 외에 시트룰린과 아미노카프로산이 사용되었다.
서열번호 이름 서열 정보
1 CCP HCHQESTXGRSRGCG
2 RF EGLHNHY
3 HSH15 HSHQESTXGRSRGSG
4 ZZH17 ZZHSHQESTXGRSRGSG
5 HSH17 HSHQESTXGRSRGSGZZ
6 ZZH19 ZZHSHQESTXGRSRGSGZZ
7 CCP10P HCHQESTXGPSRGCG
8 CCP11A HCHQESTXGRARGCG
9 CCP12P HCHQESTXGRSPGCG
10 CCPPAP HCHQESTXGPAPGCG
* X는 시트룰린, Z는 아미노카프로산을 의미한다.
* 서열번호 1, 및 7 내지 10의 펩티드는 각각의 2번, 및 14번 시스테인이 이황화 결합을 형성하여 고리화된 형태로 존재할 수 있다.
표 1의 펩티드를 이용한 샌드위치 ELISA 어세이 실험은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 총 네 개 그룹의 시료에 대해 수행하였다. 구체적으로는 RA 환자(30명), OA 환자(15명), SLE 환자(25명), 및 대조군 시료로서 정상인(25명)의 혈청 시료를 준비하였다.
질병 환자 수 나이 성별
(여성/남성)
류마티스 관절염 (RA) 30 51.21 (25-74) 22/8
골 관절염 (OA) 15 47.27 (20-75) 13/2
전신홍반성 루프스 (SLE) 25 38.32 (22-83) 24/1
정상 대조군 25 52.56 (29-76) 15/10
준비된 표 1의 펩티드는 10 μg/ml의 농도로 인산완충식염수에 희석하여, 100 μl씩 마이크로 플레이트에 첨가하여 4℃에서 밤새 두어 코팅하였다. 펩티드가 코팅된 마이크로 플레이트의 각 웰에 10 mg/ml의 소 알부민을 200 μl 첨가하여 상온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후 마이크로 플레이트를 0.1 % Tween-20가 포함된 인산완충식염수로 3회 세척하여 어세이에 사용하였다. 펩티드가 코팅된 마이크로 플레이트의 각 웰에 환자 시료와 정상 대조군 시료를 200배 희석하여 3 중(triplet)으로 100 μl씩 첨가하였다. 한 시간 동안 실온에서 배양 후, 상기 세척과 동일하게 세 번 세척하였다. 이후, 시료 내의 자가면역 항체의 검출을 위하여 500 ng/ml의 항-인간 IgG 항체를 100 μl 첨가하여 한 시간 동안 실온에서 배양하였다. 이후, 상기 세척과 동일하게 세번 세척한 다음, TMB 기질 용액 100 μl를 첨가하여 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 마지막으로 정지액으로 2M 황산 100 μl를 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 450 nm의 파장에서 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 흡광 값을 측정하였다.
실시예 2. CCP 말단에 아미노카프로산을 첨가한 변형 펩티드를 이용한 CCP 의 항체 결합 부위 확인
상기 표 1의 서열번호 1 내지 6번 펩티드를 시료와 접촉시켜 ELISA 분석법을 통해 정상인과 관절염 환자의 혈액 시료내 자가면역 항체의 검출 수준을 분석하였다.
아미노카프로산은 폴리스티렌 수지로 합성된 기질과 결합하는 특이성을 가진다. 이러한 아미노카프로산의 특성을 이용하여 CCP 펩티드 서열 중 RA 환자 혈액 내의 자가면역 항체와의 주요 결합 부위를 확인할 수 있다. 예를 들어, CCP의 이황화 결합을 형성하는 시스테인을 세린으로 치환하여 이황화 결합을 없앤 선형화(linearized)된 펩티드를 제작하고, 선형화(linearized)된 펩티드의 N 말단이나 C 말단, 혹은 양쪽 말단에 아미노카프로산을 덧붙여서 한쪽 혹은 양쪽 말단이 마이크로플레이트와 결합하는 구조를 가진 펩티드를 제조할 수 있다. 만약, N 말단이 고정되고 C 말단이 노출된 펩티드가 C 말단이 고정되고 N 말단이 노출된 펩티드보다 RA 환자 시료 검사 결과 높은 수치를 보이면, CCP의 C 말단 부분이 자가면역 항체와의 결합력이 높은 부위인 것을 확인할 수 있다.
(1) CCP의 자가면역 항체와의 결합시 순환형 구조의 역할 확인
도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 및 1f는 정상인과 관절염 환자로부터 분리된 혈액 시료내의 자가면역 항체의 상대적 검출 수준을 비교한 결과를 나타내는 도면이다. X축은 시료, Y축은 흡광도를 나타낸다. 도 1a는 CCP, 도 1b는 RF, 그리고 도 1c는 CCP의 이황화 결합을 형성하는 시스테인을 세린으로 치환하여 이황화 결합을 없앤 HSH15 펩티드를 이용한 분석 결과이다. 도 1d 는 HSH15 펩티드의 N 말단, 도 1e는 C 말단, 도 1f는 N, 및 C 말단에 2개의 아미노카프로산을 추가한 ZZH17, HSH17, 및 ZZH19 펩티드를 이용한 분석 결과이다.
상기 결과를 바탕으로, 각 시료의 흡광도의 평균값 및 통계적으로 t-test를 통하여 계산된 정상인에 대한 유의성(p, %)을 하기 표 3에 나타내었다.
펩티드 RA OA SLE 정상인
평균
(흡광도)		 P value 평균
(흡광도)		 P value 평균
(흡광도)		 P value 평균 (흡광도)
CCP 0.2522 <0.0001 0.2314 <0.0001 0.2347 <0.0001 0.0874
RF 0.2534 0.0002 0.2791 0.0003 0.3417 <0.0001 0.1484
HSH15 0.1942 <0.0001 0.2277 0.0001 0.2704 <0.0001 0.1067
ZZH17 0.2667 <0.0001 0.2344 <0.0001 0.2738 <0.0001 0.1102
HSH17 0.2681 <0.0001 0.2916 <0.0001 0.3569 <0.0001 0.1412
ZZH19 0.4008 <0.0001 0.3069 <0.0001 0.3693 <0.0001 0.1609
모든 분석결과에서 관절염 환자시료의 흡광도 값이 정상 대조군 시료의 흡광도 값에 비하여 통계적으로 유의미하게 높게 나타났다. ZZH19는 마이크로 플레이트에 코팅시 CCP와 유사하게 시트룰린 부분을 노출시키는 변형 펩티드이다. 상기 ZZH19의 RA 시료에 대한 흡광도의 평균값은 0.4008로, OA 시료의 평균값 0.3069나 SLE 시료의 평균값 0.3693보다 크게 나왔다.
ZZH19는 CCP의 아미노카프로산 변형 펩티드 중 유일하게 RA 시료에 대한 흡광도의 평균값이 가장 높은 펩티드였으므로, 고리형을 이루고 시트룰린이 밖으로 도출되는 구조가 RA 진단에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
(2) CCP의 자가면역 항체와의 결합시 C 말단 부위의 역할 확인
표 3에 나타난 바와 같이, N 말단이 노출된 HSH17의 경우 RA의 평균값이 0.2681로 OA의 0.2916, SLE의 0.3569보다 낮은 수치를 보였으나 C 말단이 노출된 ZZH17의 경우 RA의 평균값 0.2667로 OA의 평균값 0.2344 보다 큰 수치를 보였다.
도 2a, 및 2b는 상기 결과를 바탕으로 ROC 곡선을 계산하여 얻은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 나타낸 도면이다. CCP를 이용한 관절염 환자 시료의 자가항체 검출 분석 결과, RA, OA, 및 SLE에 대하여 93.3, 93.3, 및 100 %의 민감도를, 88.5, 88.5, 및 84.6의 특이도를 보였다. RF의 경우는 CCP보다 낮은 민감도와 특이도를 보였다. HSH17는 RA, OA, 및 SLE에 대하여 100%로 가장 큰 민감도를 보였다. 그러나 HSH17을 포함한 아미노카프릭산 변형 펩티드들은 CCP에 비하여 낮은 RA 특이도를 보였다. 가장 민감도가 높았던 HSH17이 RA, OA, 및 SLE에 대하여 각각 69.2, 69.2, 73.1, 69.2 %의 낮은 특이도를 보이는 반면, CCP와 유사한 형태로 플레이트에 고정되는 ZZH19와 N 말단이 플레이트에 고정된 ZZH17이 RA에 대하여 84.6, 80.8 %로 상대적으로 높은 특이도를 보였다. 따라서, CCP의 아미노산 서열 중 C 말단 부분이 자가면역 항체와의 결합에 더 중대한 역할을 함을 확인하였다.
실시예 3. C 말단 서열 변형 CCP를 이용한 관절염 환자의 자가항체 검출 수준 확인 및 그 결과의 통계적 유의성 판단
상기 표 1의 서열번호 7 내지 10의 펩티드를 사용하여 상기의 ELISA 방법을 통해 정상인과 관절염 환자의 혈액 시료로부터 자가면역 항체 수준을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 확인된 C 말단의 친수성 아미노산 서열을 소수성 아미노산으로 변형하여 새로운 류마티스 관절염 진단 마커 후보군을 준비하였다. CCP의 8번 아미노산인 시트룰린을 기준으로 C 말단 방향의 10, 및 12번 아미노산인 아르기닌을 프롤린으로 각각 치환한 CCP10P, 및 CCP12P, 11번 세린을 알라닌으로 치환한 펩티드인 CCP11A, 상기 10, 11, 및 12번 아미노산을 각각 프롤린, 알라닌, 및 프롤린으로 치환한 CCPPAP를 제작하여 관절염 환자의 자가면역 항체 검출 능력을 분석하였다.
도 3a, 3b, 3c, 3d, 및 3e는 상기 서열번호 7 내지 10의 펩티드를 사용하여 검출한 정상인과 관절염 환자의 혈액 시료내 자가면역 항체의 상대적 양을 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 상기 결과를 바탕으로 각 시료의 흡광도의 평균값 및 통계적으로 t-test를 통하여 계산된 정상인에 대한 유의성(p, %)을 하기 표 4에 나타내었다.
펩티드 RA OA SLE 정상인
평균
(흡광도)		 P value 평균
(흡광도)		 P value 평균
(흡광도)		 P value 평균 (흡광도)
CCP 0.2522 <0.0001 0.2314 <0.0001 0.2347 <0.0001 0.0874
CCP10P 0.1870 <0.0001 0.1875 0.0002 0.2777 <0.0001 0.0994
CCP11A 0.3091 <0.0001 0.2689 <0.0001 0.3321 <0.0001 0.1125
CCP12P 0.2445 <0.0001 0.2847 <0.0001 0.3619 <0.0001 0.1250
CCPPAP 0.2549 <0.0001 0.2591 <0.0001 0.3287 <0.0001 0.1140
모든 분석결과에서 정상 대조군 시료보다 관절염 환자 시료의 흡광도 값들이 통계적으로 유의미하게 높게 나타났다. CCP10P의 경우 RA의 평균값이 0.1870으로 OA의 0.1875, SLE의 0.2777보다 낮은 수치를 보인다. 또한 CCP12P, CCPPAP 모두 RA의 평균값이 OA, SLE의 평균값보다 낮은 수치를 보인다. 하지만 CCP11A의 경우 RA의 평균값이 0.3094으로, OA의 수치인 0.2689보다 큰 값을 보인다.
또한, CCP11A, CCP12P, 및 CCPPAP의 경우, RA에 대한 특이도가 100%로 높게 나타났고, 특히 11번 서열을 치환한 CCP11A의 경우 CCP보다 특이도가 11.5 % 포인트 상승하였다. 그러나, CCP의 10번 아미노산을 치환한 CCP10P의 경우 특이도가 76.9 %로 CCP보다 11.6 % 포인트 낮게 나왔다. 따라서, CCP의 10번 아미노산인 아르기닌은 류마티스 관절염 진단에 있어서 중요한 서열임을 확인하였다.
도 4a, 4b, 및 4c는 CCP의 신호 치환 펩티드 중 CCP11A, CCP, 및 CCP10A의 정상인에 대한 RA 환자 시료의 ROC 곡선을 나타내고, 도 4d, 4e, 및 4f는 OA에 대한 RA환자 시료의 ROC 곡선을 나타낸다. 상기 AUC와 양성 예측율(positive prediction rate: PPR, %), 음성 예측율(negative prediction rate: NPR, %)을 하기 표 5에 나타내었다.
펩티드 대조군 민감도 (%) 특이도 (%) AUC PPR (%) NPR (%)
CCP 정상인 93.3 88.5 0.9718 93.3 88
OA 70.0 60.0 0.6133 70 60
CCP10P 정상인 83.3 76.9 0.8370 83.3 76
OA 30.0 93.3 0.5030 30 93.3
CCP11A 정상인 86.7 100.0 0.9756 86.7 100
OA 63.3 80.0 0.6930 63.3 80
CCP11A의 경우, 정상인에 대한 RA의 AUC가 0.9756으로 CCP보다 0.0038 더 높았고, OA에 대한 AUC는 0.6930으로 CCP의 0.6133에 비하여 0.0797 높았다. 또한 질병 진단시 검사의 정확도나 신뢰도에 핵심 요소인 특이도와 NPR이 정상인에 대한 경우나 OA에 대한 경우 모두 CCP 보다 높은 수치를 보임을 확인하였다.
도 5는 정상인 또는 OA 환자 시료를 대조군으로 하여 측정한 CCP, CCP10P, 및 CCP11A의 RA 진단에 대한 민감도, 특이도, 및 유의성을 나타낸다.
상기 유의성은 McNemer test를 이용해 계산되었다. McNemer test는 2X2 테이블 상에서 두 검사의 통계적 유의성과 상이도(difference)를 계산하는 방법이다. 도 5의 결과에 따르면, CCP와 CCP10P 사이의 정상인에 대한 RA 검사 결과에 대한 P값은 1, 상이도(difference)는 0.0 %으로 두 검사가 통계적으로 매우 유사한 결과를 보인다. OA를 대조군으로 사용하여 RA 검사를 하였을 때에는, CCP와 CCP10P 사이의 P값은 0.004, 상이도는 37.78 %이고 CCP10P와 CCP11A사이의 p값은 0.04, 상이도는 26.67%이었다. 따라서, CCP10P의 검사결과는 통계적으로 유의미하게 CCP, CCP11A의 검사결과와 다름을 확인하였다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Novel cyclic citrullinated peptides, composition for diagnosing a rheumatoid arthritis including novel cyclic citrullinated peptides and method for diagnosing rheumatoid arthritis using thereof, and method for screening markers for rheumatoid arthritis <130> pn108680 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic citrullinated peptide <400> 1 His Cys His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Cys Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Gly Leu His Asn His Tyr 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> citrullinated peptide <400> 3 His Ser His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic citrullinated peptide <400> 4 Glx Glx His Ser His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Ser 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 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Pro Val Val 355 360 365 Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu 370 375 380 Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu 385 390 395 400 Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro 405 410 415 Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly 420 425 430 Ser Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gly Arg Arg Met Thr Lys Val Val Arg 435 440 445 Asp Phe Leu Lys Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Tyr Ser 450 455 460 Asp Trp Leu Thr Val Gly His Val Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Pro 465 470 475 480 Ile Pro Gly Thr Lys Lys Phe Leu Leu Leu Met Ala Ser Thr Ser Ala 485 490 495 Cys Tyr Lys Leu Phe Arg Glu Lys Gln Lys Asp Gly His Gly Glu Ala 500 505 510 Ile Met Phe Lys Gly Leu Gly Gly Met Ser Ser Lys Arg Ile Thr Ile 515 520 525 Asn Lys Ile Leu Ser Asn Glu Ser Leu Val Gln Glu Asn Leu Tyr Phe 530 535 540 Gln Arg Cys Leu Asp Trp Asn Arg Asp Ile Leu Lys Lys Glu Leu Gly 545 550 555 560 Leu Thr Glu Gln Asp Ile Ile Asp Leu Pro Ala Leu Phe 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Claims (15)

  1. 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고, 서열번호 1의 10번 내지 12번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 펩티드 세트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드 또는 펩티드 세트는 검출 가능한 표지가 부착된 것인 펩티드 또는 펩티드 세트.
  3. 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고, 서열번호 1의 10번 내지 12번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 펩티드 세트를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 물질을 더 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커는 류마티스 인자(RF), 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(CCP) 항체, C-반응성 단백질(CRP), 또는 그 조합인 것인 조성물.
  6. 개체로부터 분리된 시료와, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 1의 10번 내지 12번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 접촉시켜 시료 중에 포함된 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(CCP) 항체를 상기 펩티드와 결합시켜 항-CCP 항체-펩티드 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 시료 중 형성된 항-CCP 항체-펩티드 복합체의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 항-CCP 항체를 검출하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 대조군 시료 중 항-CCP 항체-펩티드 복합체 수준에 대비하여 상기 시료 중 항-CCP 항체-펩티드 복합체의 수준이 높은 경우, 상기 개체는 류마티스 관절염에 걸린 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 다른 하나 이상의 류마티스 관절염 마커의 수준을 측정하는 단계는 류마티스 인자, 항-CCP 항체 또는 C-반응성 단백질의 수준을 측정, 또는 적혈구 침강 속도를 측정하는 단계인 것인 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 항-CCP 항체-펩티드 복합체의 수준을 검출하는 단계는 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법 FACS, 단백질 칩 또는 이들의 조합을 수행하는 단계인 것인 방법.
  11. 시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(CCP)의 시트룰린 및 시트룰린으로부터 C 말단 방향에 위치한 이황화 결합을 형성하는 시스테인 사이에 위치한 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변경시키는 단계;
    상기 변경된 CCP를 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 시료 및 대조군 시료에 접촉시켜 상기 분리된 시료 및 대조군 시료 중에 포함된 항-CCP 항체를 CCP와 결합시켜 항-CCP 항체-펩티드 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 분리된 시료 및 대조군 시료 중에 포함된 상기 복합체를 형성하는 항-CCP 항체의 수준을 측정하는 단계;
    상기 분리된 시료 중에 포함된 상기 복합체를 형성하는 항-CCP 항체의 수준이 대조군에 포함된 항-CCP 항체의 수준에 비하여 높을 경우, 상기 시클릭 시트룰리네이티드 펩티드를 류마티스 관절염 진단용 마커 후보물질로 결정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 마커를 스크리닝하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 CCP의 고리를 형성하는 아미노산은 5개 내지 25개인 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 복합체를 형성시키는 단계 전에 상기 CCP의 시트룰린 및 시트룰린으로부터 C 말단 방향에 위치한 시스테인 사이의 친수성 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 분리된 시료 및 대조군 시료에서 측정된 각각의 항-CCP 항체의 수준을 류마티스 관절염 질환의 진단 기준으로 설정할 때의 X축은 1-특이도, 및 Y축은 민감도로 하는 모든 시료의 점을 연결한 그래프(ROC)를 그릴 때, 상기 그래프의 면적(AUC)이 0.7이상인 CCP를 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 민감도 및/또는 특이도가 0.7 이상인 CCP를 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
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