CN110161247A - 检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。该试剂盒基于双抗原夹心反应模式，采用高灵敏度和特异性的环瓜氨酸肽偶联载体蛋白作为抗原原料制成，其不仅能够检测出所有类型的抗瓜氨酸抗体，而且具有特异性强、信号放大效果好、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、稳定性好和精密度高的优点。

Description

检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体均相免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术
抗环瓜氨酸肽(Anticycliccitrullinated peptide antibodies，抗CCP)抗体是一种新型的血清标志物，临床检验实践表明，抗CCP抗体的滴度通常和疾病的活动度相关，70-80％患者在疾病很早期就在血清和滑膜液中检测出抗CCP抗体，此抗体具有高度的特异性和一定的预后价值。
目前研究用或商品化抗瓜氨酸抗体试剂盒均采用间接法检测，尤其是采用ELISA间接法检测。人体内抗瓜氨酸抗体类型既有IgG，还有IgA、IgM，使用传统间接法反应模式只能检测IgG类型的抗体。而采用ELISA间接法检测模式，不仅只能检测IgG类型的抗体，而且灵敏度较低，特异性也较差，操作也较为繁琐。
因此，目前亟需研究开发一种灵敏度高、特异性好、操作方法简便，且能够检测所有类型抗体的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。该试剂盒不仅能够检测出所有类型的抗瓜氨酸抗体，而且具有特异性强、信号放大效果好、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、稳定性好和精密度高的优点。
为此，本发明第一方面提供了一种制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法，其包括：
制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；
制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；
制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。
本发明中，所述第一抗原和所述第二抗原相同或不同，二者独立地选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。
在本发明的一些优选的实施例中，第一抗原和所述第二抗原分别独立地选自合成的含环瓜氨酸的环形肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述含瓜氨酸的肽段选自SEQ ID No.1-4。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。
在本发明的一些实施例中，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
在本发明的另一些实施例中，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第二抗原与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述组分a在第一组合物中的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述组分b在第二组合物中的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。
本发明中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法制备得到的用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。
本发明第三方面提供了一种检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测方法，其包括使用如本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒来检测待测样本中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
根据本发明，该方法包括：
步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合后反应得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合后反应得到第二混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在步骤R1之前的制作抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些具体实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于所述抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线来确定待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，检测发射光的信号强度，从而判断待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒或如本发明第三方面所述的方法在检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的存在和/或含量中的应用，其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液。
本发明第五方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法在制备用于检测怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品中的抗环瓜氨酸肽抗体，由此确定所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的水平，并将因此确定的水平与受治疗者的类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果如下：
1)该试剂盒所采用的检测技术为一种均相反应体系，相较于现有的非均相反应体系检测方法，存在着免清洗、高通量、包被/标记工艺对抗原抗体的活性无影响、特异性高、灵敏度好、线性范围宽、背景干扰小、反应速度快、操作简便、技术要求不高等优点，并可实现全自动化高通量测试。
2)本发明提供的检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒，采用高灵敏度和特异性的环瓜氨酸肽作为抗原原料，具备以下性能优点：信号值范围宽，达到定量测试标准；灵敏度高，对早期RA(Rheumatoid arthritis，类风湿性关节炎)与确定RA患者的敏感度高；稳定性好，精密度好。
附图说明
为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。
图1显示了序列为SEQ ID No.1的单独肽段与RA组阳性反应结果。
图2显示了串联肽段与RA组阳性反应结果。
图3显示了抗原偶联BSA蛋白产物的电泳检测结果。
图4显示了抗原偶联BSA蛋白产物与RA组阳性反应结果。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
“待测主体”、“受治疗者”和“患者”可互换使用，在没有特别说明或限定的情况下，是指哺乳动物，诸如人和非人灵长类、以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其它哺动物物种。
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待测样本”是指可能含有被分析物的一种混合物，被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样本包括体液，如血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液等。待测样本可以是在使用前根据需要利用稀释液或缓冲溶液对可能含有被分析物的样本进行稀释后的溶液。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用样本稀释液将被分析物进行稀释后再在检测仪器上进行检测，此时可能含有被分析物的稀释后的溶液均统称为待测样本。
本发明所述用语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性配对物，例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性配对物中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“特异性配对物”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性配对物的例子是生物素-链霉亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体、受体或供体，可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性配对物中的任一员。
本发明所述用语“供体”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体是光敏剂，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性配对物的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。在本发明另一些具体实施例中，所述供体是化学活化的其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。
本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的物质。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获，从而传递能量以激活所述受体。在本发明的一些具体实施例中，所述受体是这样的物质，其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于：烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑或光泽精。在本发明的另一些具体实施例中，所述受体是能够与单线态氧反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷的烯烃类；可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类，诸如鲁米诺；和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。可以根据本公开和要求保护的发明利用的受体的具体的、非限制性实例记载于美国专利号US5340716(该专利文献在此全文引为参考)。在本发明另一些具体实施例中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其是非粒子化的并且在含水介质中可溶，这种受体的情况可参见专利PCT/US2010/025433(该专利文献在此全文引为参考)。
在本发明中，所述供体可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧，此时供体也可以称为感光微球或感光微粒，包含这种感光微球或感光微粒的溶液可以称为感光液或的液；和/或，所述受体可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，此时可以称为发光微球或发光微粒。在本申请中，系统基于包被在基体表面的发光物质经光激发和能量传递诱导发光信号，能量传递依赖于抗原-抗体结合导致感光微球和发光微球相互靠近而实现。因此无需分离过程。纳米微球的直径更小，其悬浮性能更强，同时采用了三级放大发光系统，因而具有更高的分析灵敏度；整个检测过程无需清洗，即无需分离结合标记和结合标记物，因此反应时间更短；示踪物质(感光剂和发光剂)标记在基体上，而不是标记在生物分子上，对生物分子的活性没有影响，同时，因基体存在较大的比表面积，故其表面上能够包被更多的示踪物质及生物分子，致其在试剂的有效浓度和灵敏度及检测背景等方面的表现会更优。
本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，但优选纳米级尺寸，其可以是有机的或是无机的；其可以是可膨胀或不可膨胀的；其可以是多孔的或非多孔的；其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度；优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。基体通常具有多功能性，或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到供体或受体上。有许多官能团是可用的或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。适用于本发明的基体的一个非限制性的例子是羧基改性的乳胶颗粒。这种基体的详细情况可参见美国专利US5709994与US5780646(这两篇专利文献在此全文引为参考)。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
本发明中所述用语“瓜氨酸肽”是指能与RA血清有阳性反应的特异性抗原：丝集蛋白片段、前丝集蛋白前体、合成多肽及重组多肽、偶联有标示物的多肽等各种修饰后肽段，其特点是含有瓜氨酸，瓜氨酸残基是抗CCP抗体识别的底物必须成分。
本发明所述用语“瓜氨酸表位”是指抗原表面能够被抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的区域，包括瓜氨酸残基及其所处的周围氨基酸序列。
本发明所述用语“抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位识别位点”亦称为“识别抗原表位的位点”是指抗环瓜氨酸肽抗体所具有的识别和结合“瓜氨酸表位”区域，例如，抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点和抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点不相重叠，也就是说二者属于具有相同结合特性的不同位置的抗原表位识别位点。
本发明所述用语“所述瓜氨酸肽段混合物”是指由至少2个单一含瓜氨酸的肽段混合后形成的混合物，其中所述含瓜氨酸的肽段可以是含瓜氨酸的环型肽段，也可以是含瓜氨酸的线型肽段。
本发明所述用语“均相免疫检测试剂盒”是指均相免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂的组合。
Ⅱ.实施方案
如前所述，目前研究用或商品化抗瓜氨酸抗体试剂盒均采用间接法检测，尤其是采用ELISA间接法检测。人体内抗瓜氨酸抗体类型既有IgG，还有IgA、IgM，使用传统间接法反应模式只能检测IgG类型的抗体。而采用ELISA间接法检测模式，不仅只能检测IgG类型的抗体，而且灵敏度较低，特异性也较差，操作也较为繁琐。为此，本发明人针对抗瓜氨酸抗体检测试剂盒进行了大量的理论和实验研究。
本发明人研究发现，通过本发明所述的制备方法得到的抗原能够被待检的抗瓜氨酸抗体特异性识别并结合，形成夹心式(固相化抗原-抗体-标记物抗原)免疫复合物，可以完成对所有类型抗体的测定。本发明人进一步研究发现，采用高灵敏度和特异性的瓜氨酸肽作为抗原原料可以制成一种抗环瓜氨酸肽抗体均相免疫检测试剂盒，该试剂盒具有信号值范围宽、灵敏度高、稳定性好和精密度高的优点。本发明正是基于上述发现做出的。
因此，本发明第一方面所涉及的制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法包括：
(1)制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；
(2)制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；
(3)制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。
所述抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点和抗原表位第二识别位点是具有相同结合特性的不同位置的抗原表位识别位点。
在本发明的一些实施方式中，所述第一抗原和所述第二抗原相同或不同，二者独立地选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白；优选地，所述第一抗原和/或第二抗原中多个不同肽段相互之间的摩尔比相同。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一抗原和第二抗原分别独立地选自合成的含环瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，例如，所述第一抗原或第二抗原包含氨基酸序列如SEQ ID No.1-4所示的肽段中的2-4个。
表1
序列号 序列
SEQ ID No.1 环-(HQCHQEST-Cit-GRSRGRCGRSGS)
SEQ ID No.2 ARGGSRERARGRGRG-Cit-GEKR
SEQ ID No.3 GGSKTSLYNLR-Cit-GTALAIPQ
SEQ ID No.4 APPPISGGGY-cit-A-cit-PAKAAAT
在本发明的一些实施例中，对于由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽，所述第一抗原和/或第二抗原中多个不同肽段相互之间的摩尔比相同。
在本发明的另一些实施例中，对于含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物，所述第一抗原和/或第二抗原中多个不同肽段相互之间的质量比相同。
本领域技术人员应该了解的是，对于选自合成的含环瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物的第一抗原，为减少空间位阻，所述第一抗原可以通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。
在本发明的一些实施例中，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
在本发明的另一些实施例中，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第二抗原与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。
本发明中对于含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物的第一抗原偶联中间体的方式没有特别的限制，既可以是单一含瓜氨酸的肽段的分别先偶联中间体，然后混合形成偶联中间体的瓜氨酸肽段混合物；也可以是单一含瓜氨酸的肽段混合后形成瓜氨酸肽段混合物，然后再偶联中间体形成偶联中间体的瓜氨酸肽段混合物；优选地，单一含瓜氨酸的肽段混合后形成瓜氨酸肽段混合物，然后再偶联中间体形成偶联中间体的瓜氨酸肽段混合物。
在本发明的一些实施例中，所述组分a在第一组合物中的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL。在一些例子中，例如，所述组分a在第一组合物中的总浓度包括但不限于：20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL或90μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述组分b在第二组合物中的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。在一些例子中，例如，所述组分b在第二组合物中的浓度包括但不限于：0.5μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、1.2μg/mL、1.5μg/mL、1.7μg/mL、1.9μg/mL、2μg/mL、2.2μg/mL、2.5μg/mL或2.8μg/mL。
在本发明的一些实施例中，组分c中所述供体的浓度为50-400μg/mL，优选为80-300μg/mL，进一步优选为100-200μg/mL。
本发明中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
在本发明的一些优选的实施例中，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。
在本发明的一些优选的实施例中，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒还包括作为校准品的抗环瓜氨酸肽抗体纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
本发明第二方面所涉及的用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒是采用本发明第一方面所述的方法制备得到的。所述试剂盒包括：
试剂I，其由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；
试剂Ⅱ，其由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；
试剂Ⅲ，其由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。
本发明第三方面所涉及的检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测方法包括使用如本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒来检测待测样本中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
根据本发明的一些具体实施方式，该方法包括：
步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合后反应得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合后反应得到第二混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在步骤R1之前的制作抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些具体实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于所述抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线来确定待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
本发明中对步骤R1中待测样本与第一组合物和第二组合物混合的方式或顺序没有特别的限制，例如，在本发明的一些实施例中，步骤R1中，可以将中待测样本与第一组合物和第二组合物同时混合后反应得到第一混合物；而在本发明的另一些实施例中，步骤R1中，可以首先将待测样品与第一组合物混合得到第三混合物，然后再将第三混合物与第二组合物混合得到第一混合物。
在本发明的一些优选的实施例中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，检测发射光的信号强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
在本发明的一个具体优选的实施例中，利用680nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成612nm的发射光，检测发射光的信号强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
本发明中，步骤R1和R2之间以及步骤R2和R3之间没有分离和/或洗涤的步骤。
本发明所述方法中，所有试剂组合后，均可以根据需要进行混匀和/或温育(孵育)。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是5-30min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃；温育的时间可以选自10min、12min、15min、16min、18min、20min或25min。
在此，需要特别说明的是，本发明所述的方法为非疾病诊断目的的方法。
本发明第四方面涉及的如本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒在检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的存在和/或含量中的应用，可以理解为利用本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒来检测待测样本中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量的方法；其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
类似地，本发明第四方面涉及的如本发明第三方面所述的方法在检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的存在和/或含量中的应用，可以理解为利用本发明第二方面所述的均相免疫检测试剂盒，并采用本发明第三方面所述的均相免疫检测方法来判断待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量的方法；其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
本发明第五方面所涉及的如本发明第一方面所述的方法在制备用于检测怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品中的抗环瓜氨酸肽抗体，由此确定所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的水平，并将因此确定的水平与受治疗者的类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联的试剂盒中的应用，其包括：
步骤M1，提供来自待测主体的待测样品；
步骤M2，采用本发明第三方面所述的均相免疫检测方法来判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量；
步骤M3，将其与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品、或来自同一待测主体的治疗前的样品中所述抗环瓜氨酸肽抗体的含量比较；
其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
本发明中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的存在是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
本发明中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量的增加是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
在一些优选的实施例中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量增加15-20U/ml是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
本发明中，与类风湿性关节炎对照样品相比，所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的相对含量是所述待测主体中类风湿性关节炎的预后性指示物。
本发明中，与来自同一待测主体的治疗前的样品相比，所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的相对含量指示治疗方案的效力。
本发明提供了一种抗瓜氨酸肽抗体均相化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，此试剂盒可以用于光激化学发光免疫分析仪。与间接法相比，本试剂盒能检测所有类型的抗体。同时，本发明的检测方法与现有免疫分析方法有以下优点：1、灵敏度高；2、免清洗、高通量；3、全自动，稳定性好。本发明的双抗原夹心法反应模式不局限于应用于光激化学发光检测技术，也可以是化学活化的化学发光检测技术。应用本发明所述的制备方法得到的抗原能够被待检的抗瓜氨酸抗体特异性识别并结合，形成夹心式(固相化抗原-抗体-标记物抗原)免疫复合物。
Ⅲ.实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。
1、制备抗原(第一抗原和第二抗原)
(1)按照多肽合成常规操作合成单独环型肽，氨基酸序列为SEQ ID No.1，合成来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，HPLC检测纯度为90％以上。
(2)按照多肽合成常规操作合成串联的多肽，其为序列为SEQ ID No.2(见表1)与SEQ ID No.1(见表1)合成在一条肽段上形成连续的氨基酸序列。
2、受体和供体的制备
用作本发明的受体和供体的制备方法、组成结构及其组分含量可以参见中国专利CN100429197C(该专利文献在此全文引为参考)中的实施例1。
3、试剂I(第一抗原包被的受体)的制备
(1)预处理
取待处理0.2mg多肽原料装入透析袋(截留分子量为3KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.05M pH9.6CB透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(2)包被过程
取2mg发光微粒(受体)加入离心管，加入0.05M pH9.6CB交联缓冲液，离心7500rpm，15min，弃上清，向离心管中加入400μL交联缓冲液，进行超声清洗微粒，再次离心。
加入200μL交联缓冲液将微粒重悬，使微粒浓度为10mg/mL，再加入0.1mg多肽原料，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25-40rpm混匀过夜。
将离心管放入2-8℃冷却10min，取4μL的8mg/mL NaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温，垂直旋转混合器上25-40rpm反应2小时。
在离心管中加入32μL的75mg/mL Gly溶液混匀，垂直旋转混合器上25-40rpm反应1小时。
(3)清洗
离心管称重配平后，离心7500rpm，15min，弃上清，加入0.1M pH7.4PBST清洗缓冲液，进行超声清洗微粒。重复两次，再用微粒保存缓冲液清洗一次。
(4)配制
加入工作稀释液，使其工作浓度为25μg/mL，完成试剂I的制备，备用。
4、试剂II(生物素标记的第二抗原)的制备
(1)预处理
取待处理0.2mg多肽原料装入透析袋(截留分子量为3KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH8.0NaHCO3透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(2)标记过程
取200μL 0.1M pH8.0NaHCO3标记缓冲液加入离心管，加入0.1mg多肽原料，混匀。再加入配制好的5mg/mL生物素溶液8μL，迅速混匀。2-8℃垂直旋转混合器上25-40rpm反应过夜。
(3)透析
取待处理生物素标记溶液装入透析袋(截留分子量为3KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH7.4 PBS透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。
(4)配制
加入工作稀释液，使其工作浓度为1μg/mL，完成试剂II的制备，备用。
5、试剂Ⅲ(链霉亲和素标记的供体)的制备
(1)感光微球(供体)混悬液处理
吸取一定量的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微球浓度至100mg/ml。
(2)链霉亲和素溶液配制
称量一定量链霉亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
(3)混合
将处理好的感光微球(供体)混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2∶5∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。
(4)反应
MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
(5)封闭
MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。
(6)清洗
向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节工作浓度至100μg/mL，作为通用液使用。
6、Anti-CCP校准品的制备
6.1校准品稀释液的配制：
称取HEPES 4.77g、NaCl 1.7g，添加纯化水160g混匀30min，使用1M的浓盐酸和1M的NaOH溶液调PH值至7.4±0.2，继续添加Proclin300 0.1g、BSA 30g、1M MgCl2 0.5mL、0.1M MgCl2 0.1mL，搅拌30min后添加纯化水定重至200g，复测pH值后，2-8℃备用。
6.2校准品的配制：
校准品原料用校准品稀释液按照比例梯度稀释成以下浓度：5U/mL、20U/mL、50U/ml、100U/mL、200U/mL，完成线性校准品的制备。
7、实验操作
将上述组份组装成抗瓜氨酸肽抗体测定试剂盒后，装载在博阳生物科技(上海)有限公司生产的LiCA均相发光免疫分析仪上，设置检测步骤：
1)加样Tip头吸取20μL校准品至反应微孔板中；
2)加样Tip头吸取25μL试剂1至反应微孔板中；
3)加样Tip头吸取25μL试剂2至反应微孔板中；
4)水平振荡混匀20秒后37℃孵育17min；
5)加样Tip头吸取175μL感光液至反应微孔板中；
6)水平振荡混匀20秒后37℃孵育15min；；
7)在仪器产生激发光照射下，受体被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子，该高能态的活性氧离子在近距离被发光微粒俘获，从而传递能量以激活供体中的发光化合物，数微秒后，受体中的发光化合物将释放出高能级红光，用单光子计数器测定这些高能级光子；
8)根据校准品的信号值，按照四参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与Anti-CCP浓度之间的方程式；
9)同样再按照步骤1)-7)检测待测样本，由8)中的方程式计算得出待测样本中Anti-CCP浓度。
8、实验结果
(1)SEQ ID No.1肽段作为抗原原料检测线性校准品，根据校准品信号值及浓度值，按照四参数拟合方法得到剂量曲线，见表2。
表2
浓度(U/mL) 信号值
200 101496
100 46148
50 20864
20 11048
5 6104
0 1024
(2)SEQ ID No.1肽段作为抗原原料检测样本，分别为类风湿阳性组18例和健康正常对照组6例，由表2中的剂量曲线计算出待测样本中的Anti-CCP浓度，见图1。
(3)串联肽段作为抗原原料检测线性校准品，根据校准品信号值及浓度值，按照四参数拟合方法得到剂量曲线，见表3。
表3
浓度(U/mL) 信号值
200 50248
100 22574
50 9932
20 6024
5 1552
0 852
(4)串联肽段作为抗原原料检测样本，分别为类风湿阳性组18例和健康正常对照组6例，由表3中的剂量曲线计算出待测样本中的Anti-CCP浓度，见图2。
由上述结果可以看出，不同型式的瓜氨酸肽段作为抗原原料，均能与阳性样本中的抗环瓜氨酸抗体发生特异性阳性组与健康正常对照组抗体水平表现出差异，认为本均相免疫测定方法可行。肽段型式不限制于本实施例所采用的方式，还应包括：不同单独肽段的混合物作为抗原，不同肽段的连接成串联的多肽作为抗原等。
通过对串联形成多肽的单一含瓜氨酸的肽段的量进行考察实验，结果表明，对于由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽，多个不同肽段相互之间的摩尔比相同时，所制得的多肽的活性最高。
实施例2
1、制备抗原(第一抗原和第二抗原)
用作本实施例的抗原包含4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物，4个单一肽段的序列分别如SEQ ID No.1-4所示。合成多肽来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，HPLC检测纯度为90％以上。
2、试剂I(第一抗原包被的受体)的制备：
用作本实施例的第一抗原包被的受体的制备方法是按照专利PCT/US2010/025433中记载的实施例来制备的，第一抗原包被的受体的结构为第一抗原-BSA-(二甲基噻吩)-(BHHCT)，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶。其中，多肽原料中4种抗原的摩尔比为1:1:1:1，其工作浓度为100μg/mL。
3、试剂II(生物素标记的第二抗原)的制备：
参照实施例1，区别在于多肽原料中4种抗原的摩尔比为1:1:1:1，其工作浓度为3μg/mL。
4、试剂Ⅲ(链霉亲和素标记的供体)的制备
参照实施例1，区别在于制备的试剂Ⅲ工作浓度为200μg/mL。
5、Anti-CCP校准品的制备：
参照实施例1。
6、Anti-CCP校准品的制备：
参照实施例1。
7、实验操作：
参照实施例1。
8、实验结果
检测10例病例组样本与10例正常组样本，结果见表4。
表4
8.1线性范围检测
将RA病例组高值样本47#梯度稀释，检测各个浓度的样本，用最小二乘法拟合线性。
表5
结论：浓度与信号值拟合方程R2＞0.97。满足临床定量检测需求。
8.2精密度检测
检测低、中、高三个浓度样本，分别检测10次，验证系统的重复性。
表6
结论：精密度均在4.4％，远高于文献报道及现有市场的检测情况。
实施例3：
1、抗原偶联BSA蛋白的制备
1.1合成多肽
按照表1中所列的序列(Sequence No.1-4)分别合成4个单一的多肽，编号分别为1#(SEQ ID No.1)、2#(SEQ ID No.2)、3#(SEQ ID No.3)、4#(SEQ ID No.4)，合成多肽来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，HPLC检测纯度为95％以上，呈干粉状，分装后-20℃保存。
1.2制备抗原偶联BSA蛋白
(1)活化BSA
取10mL离心管，称量10mgBSA，加入4.9mL 0.02M PBS pH 7.4的缓冲液，旋转混匀，获得BSA溶液2mg/mL。
称取一定量的Sulfo-SMCC，用纯化水配制成5mg/mL水溶液。按照1:20摩尔比例向2mg/mL的BSA溶液中快速滴加400μL。室温30rpm搅拌1h。
透析除去游离sulfo-SMCC，得到活化BSA溶液体积为4mL。
(2)活化肽
称取一定量的Traut's reagent，溶于纯化水，得到2mg/mL Traut's reagent浓溶液。取2mL离心管，称取1#、2#、3#、4#肽各1mg，溶于2mL纯化水中。向多肽水溶液中按照1:2摩尔比例加入120μL的Traut's reagent，室温30rpm搅拌1h。
(3)偶联
取1.2mL活化的BSA加入活化后的肽400μL(偶联比例BSA:抗原＝1:5)，4℃搅拌过夜。
(4)透析纯化
将偶联物透析于0.02M pH 7.4PBS缓冲液中。透析换液三次，每次透析时间不小于4h。纯化后BCA检测试剂盒测得抗原偶联BSA蛋白浓度为1.34mg/mL。
2、抗原偶联BSA蛋白的鉴定
2.1抗原偶联BSA蛋白的波长扫描鉴定
用超微量蛋白检测仪扫描透析后的偶联反应产物，按照超微量蛋白检测仪标准操作程序进行测定，检测时每次加样4.5uL，观察并比较偶联后产物与BSA吸收峰的变化情况。因抗原内不含有色氨酸及芳香族氨基酸，本身在280nm处没有特殊吸收峰，故偶联前后曲线差异较小。
2.2抗原偶联BSA蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定
(1)电泳槽及凝胶的准备
1)将玻璃板清水冲洗后浸泡在20％乙醇中，去除表面油渍，清洁干净；
2)玻璃板凹槽向内合并，用夹子固定于电泳槽，加去离子水验漏，直至调整为密封不漏液；
3)去除玻璃槽中去离子水，吸水纸吸干缝隙，用移液器将15％分离胶沿玻璃板内壁缓慢加入，整个过程避免气泡产生，加至距玻璃板上端2-3cm处停止，向玻璃板槽加去离子水至漫出，液封；
4)室温放置30min，分离胶凝固后去除上层去离子水，并吸干玻璃槽中水分；
5)向玻璃槽中加5％浓缩胶，将梳子垂直缓慢插入，避免气泡产生，室温放30min，凝固后使用；
6)垂直缓慢拔出梳子，将凝胶板固定于电泳装置，向板槽及底槽中加入1×电泳缓冲液。
(2)电泳检测
1)使用专用移液枪枪头加样，每孔20μL；
2)安装正负极连接器，接通电源，开始电泳，当溴酚蓝迁移于分离胶下沿停止电泳；
3)分开玻璃板，标识后取下凝胶，去离子水冲洗后完全浸入考马斯亮蓝R-250染色液中，染色60min；
4)染色后用去离子水冲洗，浸入脱色液中，放于脱色摇床上脱色60min左右，其间更换4次脱色液，背景蓝色脱去后，将凝胶放入去离子水中终止反应；
5)去除凝胶，洁净背景下拍照，结果如图3所示。
从图3可以看出，电泳跑出6条条带，从左到右样本依次是BSA-抗原、抗原、BSA，每个样本两次重复。可以看到不同样本的分子量大小明显差异，根据图3的条带结果，可定性判断BSA确实和抗原偶联上。
3、抗原偶联BSA蛋白的生物学活性鉴定
应用间接ELISA法对BSA偶联抗原进行鉴定；阳性对照及阴性对照均为已定值的CCP血清；及分别50倍稀释、100倍稀释、200倍稀释。
1)包被：按照50ng/孔的包被浓度包被BSA偶联抗原4条，抗原用包被稀释液CB稀释，每孔100μL，4℃过夜；
2)封闭：用洗液洗板1次，拍干，每孔加入150μL封闭液，37℃放置2小时，拍干，检测备用；
3)加样，除空白对照外，每孔加样100μL，37℃，30min；
4)洗板5遍，在洁净滤纸上拍干；
5)加入酶标二抗(用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人Ig G)，每孔100μL，37℃，30min。
6)洗板5遍，在洁净滤纸上拍干；
7)每孔分别加入底物A液和底物B液各50μL，混匀，37℃，20min；
8)加入终止液每孔50μL，混匀后，使用酶标仪双波长(450nm、630nm)测定各孔的OD值，结果见表7。
表7
包被物为BSA偶联抗原产物，样品为含有抗CCP抗体的血清。从酶标仪检测结果可以看出，样品浓度不同，检测OD值发生变化，证明偶联产物BSA-多肽与抗CCP抗体可以发生特异性结合，偶联产物具有生物活性，可以与抗CCP抗体发生特异性反应。
4、试剂I(第一抗原包被的受体，用抗原偶联BSA蛋白产物包被受体)的制备
4.1包被
(1)取2mg发光微粒(受体)加入离心管，加入交联缓冲液，离心8000rpm，15min，弃上清，向离心管中加入交联缓冲液，进行超声10min清洗微粒，再次离心。
(2)加入200μL交联缓冲液将微粒重悬，使微粒浓度为10mg/mL，在发光微粒溶液中加入77μL的偶联产物BSA-抗原(相当于0.1mg)蛋白原料，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25-40rpm混匀过夜。
(3)将离心管放入2-8度冷却10min，取4μL的8mg/mL NaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温，垂直旋转混合器上25-40rpm反应2小时。
(4)在离心管中加入32μL的75mg/mL Gly溶液混匀，垂直旋转混合器上25-40rpm反应1小时。
4.2保存
(1)清洗：加入清洗缓冲液后称重配平，离心8000rpm，15min，弃上清，向离心管中加入清洗缓冲液，进行超声15min清洗微粒。重复二次，再用微粒保存缓冲液清洗一次。
(2)加入微粒保存缓冲液，其工作浓度为100μg/mL。
5、试剂II(生物素标记的第二抗原)的制备
参照实施例1。
6、试剂Ⅲ(链霉亲和素标记的供体)的制备
参照实施例1。
7、Anti-CCP校准品的制备
参照实施例1。
8、实验操作
参照实施例1。
9、实验结果
(1)抗原偶联BSA蛋白产物作为抗原原料检测线性校准品，根据校准品信号值及浓度值，按照四参数拟合方法得到标准曲线，见表8。
表8
(2)抗原偶联BSA蛋白产物作为抗原原料检测样本，分别为类风湿阳性样本组(简称为RA样本组)和健康正常对照组(简称为对照组)，由表8中的标准曲线计算出待测样本中的Anti-CCP浓度，见表9和图4。
表9
由上述结果可以看出，多肽混合物偶联BSA蛋白产物作为抗原原料，能与阳性样本中的抗环瓜氨酸抗体发生特异性阳性组与健康正常对照组抗体水平表现出差异，病例组与正常组区分明显，原因是偶联中间体BSA增大了抗原的分子量，扩大了抗原抗体结合空间，同时两个肽各自保持不变，瓜氨酸位置不发生改变，抗原活性保持不变。
通过对形成瓜氨酸肽段混合物的单一含瓜氨酸的肽段的量进行考察实验，结果表明，对于含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物，多个不同肽段相互之间的质量比相同时，所制得的瓜氨酸肽段混合物的活性最高。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (19)

1.一种制备用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒的方法，其包括：
制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a，所述组分a由能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗原构成，其中所述第一抗原能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点特异性结合；
制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b，所述组分b由能够与抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点特异性结合的第二抗原以及与之结合的特异性配对物中的一个成员构成；
制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c，所述组分c由能够在激发状态产生单线态氧的供体以及与之结合的特异性配对物中的另一个成员构成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原相同或不同，二者独立地选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地选自合成的含环瓜氨酸的环形肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原分别独立地为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述含瓜氨酸的肽段选自SEQ ID No.1-4。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二抗原与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述组分a在第一组合物中的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL；和/或，所述组分b在第二组合物中的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。
12.一种如权利要求1-11中任意一项所述的方法制备得到的用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测试剂盒。
13.一种检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的均相免疫检测方法，其包括使用如权利要求12所述的试剂盒来检测待测样本中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该方法包括：
步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合后反应得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合后反应得到第二混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤R1之前的制作抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于所述抗环瓜氨酸肽抗体标准工作曲线来确定待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的方法，其特征在于，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，检测发射光的信号强度，从而判断待测样品中是否存在抗环瓜氨酸肽抗体和/或确定抗环瓜氨酸肽抗体的含量。
18.一种如权利要求12所述的均相免疫检测试剂盒或如权利要求13-17中任意一项所述的方法在检测待测样本中抗环瓜氨酸肽抗体的存在与否和/或含量中的应用，其中，所述待测样本选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、唾液、滑液和肺气肿积液。
19.一种如权利要求1-11中任意一项所述的方法在制备用于检测怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品中的抗环瓜氨酸肽抗体，由此确定所述待测样品中抗环瓜氨酸肽抗体的水平，并将因此确定的水平与受治疗者的类风湿性关节炎的存在、风险、潜在性或倾向性相关联的试剂盒中的应用。
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