CN113801215A - 一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用。为了解决现有技术中的环瓜氨酸肽的环状结构处的二硫键容易断开，导致瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基线性抗原表位暴露而被其他抗体识别，从而出现假阳性的问题，本发明提供的环瓜氨酸肽，瓜氨酸残基一端的肽段和瓜氨酸残基另一端的肽段之间通过碳‑硫键连接成环。碳‑硫键比天然环瓜氨酸中两个半胱氨酸C之间形成的二硫键键长更短，键能更大，不易断开，降低了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，降低了假阳性，提高了抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。

Description

一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病，全世界大约有1％的人罹患此病，其中75％为女性。类风湿关节炎多见于中年女性，在我国的患病率约为0.32％～0.36％。RA能引起关节的疼痛、僵直及肿胀，在发病2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤，最后将导致关节强直、畸形和功能丧失，并可引起多种并发症。
长期以来人们期望能找到一些检验方法以助诊断，也已取得了一定的进展。
检测类风湿因子(RF)是最常用的一种诊断方法，已被纳入1982年美国风湿病协会分类标准，分为IgG、IgA、IgM、IgE型RF四种亚型。用于RF检测的最常用的方法是乳胶凝集法，该法方便、易行、成本低，但仅能检出IgM型RF(见于70％以上RF患者)，缺乏疾病特异性，且因乳胶法仅能检测部分IgM型RF，其他类型RF及部分IgM型RF易逃脱检验导致假阴性。用ELISA法检测RF可分别检出IgG、IgA、IgM、IgE型，能弥补乳胶凝集法之不足。
近年来，逐步发现RA患者血清中的抗核周因子(Antiperipheral Factor，APF)、抗角蛋白抗体(Antikeratin Antibody，AKA)以及抗丝集蛋白抗体(AntifilaggrinAntibody，AFA)对RA的诊断具有高度的特异性。研究发现这些靶抗原在化学结构上具有相关性，他们识别的抗原决定簇中都含有瓜氨酸残基。瓜氨酸是一种稀有氨基酸，来源于翻译后酶修饰的精氨酸残基。
最初使用的环瓜氨酸肽(CCP)抗原是来源于丝聚蛋白的含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段，然而研究发现用直链线性瓜氨酸肽段为底物，用ELISA法来检测抗环瓜氨酸肽抗体常会导致失败，原因是由于此肽段不能吸附于聚苯乙烯上。后来，为了提高瓜氨酸肽链的抗原活性，1985年，荷兰学者Schellekens GA将上述由19个氨基酸残基组成的一条瓜氨酸肽链中的两个丝氨酸替换成半胱氨酸，并使半胱氨酸环化形成β-转角结构相似的二硫键，而成为环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)。2000年，Schellekens GA根据filaggrin的Cdna序列合成了一条含瓜氨酸的环肽(即环瓜氨酸肽)，可用于ELISA检测，并成功地在RA患者血清中检出了anti-CCP，而且发现采用环瓜氨酸肽为抗原，用ELISA法检测RA患者血清中的抗环瓜氨酸肽抗体，其敏感性和特异性比用直链线性的瓜氨酸肽作为抗原检测时有明显的提高。2001年，国内用已知cDNA序列(人工合成)的环瓜氨酸肽是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为：HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，通过两个天然的半光氨酸形成二硫键成环。
研究者在随后的研究中发现虽然CCP试剂具有较高的疾病诊断特异性，但是诊断敏感性不够，只在约40％的RA患者中出现。因抗环瓜氨酸肽抗体是一组针对含瓜氨酸表位的多种异质性抗体，而包被于固相载体的瓜氨酸抗原决定簇有限，没有包含所有的抗原决定簇表位，因此会导致一些漏检，从而阳性率较低。同时，研究发现RA患者的血清并不能识别游离的瓜氨酸，但能识别位于氨基酸序列里的瓜氨酸残基，而且根据瓜氨酸残基所处位置不同，RA患者血清与之反应的比例不同，说明瓜氨酸残基并不是决定其是否能与RA血清中抗体反应的唯一因素，瓜氨酸残基所处的周围氨基酸序列和结构特征也参与RA患者血清与含瓜氨酸序列的识别过程。实际应用中还发现，通过二硫键形成的环状结构不够稳定，二硫键断开后，瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位，容易被其他抗体识别，进而导致假阳性。基于上述现有序列开发的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，除临床检测敏感性较低外，同时也在其他一些非RA患者血清中检出。
因此，仍有必要对现有的CCP抗原进行改进，提高环瓜氨酸环形结构处的稳定性，降低瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种环状结构不易断开，从而能够降低瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而提高瓜氨酸抗体检测的特异性的环瓜氨酸肽。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供一种环瓜氨酸肽，与瓜氨酸残基的一端相连的肽段和与瓜氨酸残基的另一端相连的肽段之间通过碳-硫键连接成环。
具体地，与瓜氨酸残基的一端相连的肽段中存在卤代烷基修饰的非天然氨基酸的残基，与瓜氨酸残基的另一端相连的肽段中含有半胱氨酸残基，所述碳-硫键通过所述卤代烷基中的卤素原子与所述半胱氨酸残基上的巯基发生亲核取代反应形成。
更具体地，所述环瓜氨酸肽包含一个或多个含瓜氨酸残基的成环区，所述含瓜氨酸残基的成环区的结构为：
Figure BDA0003258949220000021
实线表示肽键，虚线表示碳-硫键，
其中，X为瓜氨酸残基，
S1和S2为侧翼氨基酸残基区，所述S1和S2之间没有连接关系，
C为半胱氨酸残基，
Z为非天然氨基酸的残基，所述C和所述Z之间形成碳-硫键连接。
优选地，所述含瓜氨酸的成环区的全长为7～20个氨基酸。
进一步优选地，所述含瓜氨酸的成环区的全长为11～15个氨基酸。
再进一步优选地，所述含瓜氨酸的成环区的全长为5～7个氨基酸。
优选地，所述S1和所述S2的氨基酸数量相差0～3个。
进一步优选地，所述S1和S2中氨基酸数量相等或仅差1，即X位于所述含瓜氨酸的成环区的中间。
优选地，所述S1和所述S2的氨基酸数量分别为4～9个。
优选地，所述卤代烷基的碳原子数为2～10个。
进一步优选地，所述卤代烷基的碳原子数为2～8个。
再进一步优选地，所述卤代烷基的碳原子数为2～5个。
其中卤素的数量为≥1的自然数，并且卤素的种类为≥1的自然数。
优选地，所述卤素原子选自F、Cl、Br、I中的一个或多个。
优选地，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为卤代烷基修饰的芳香族氨基酸衍生物。
进一步优选地，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为具有卤代烷基修饰的苯丙氨酸，所述卤代烷基取代苯丙氨酸的苯环氢。
再进一步优选地，所述卤代烷基取代苯丙氨酸的苯环上4位氢。
进一步优选地，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为具有卤代烷基修饰的酪氨酸，所述卤代烷基取代酪氨酸的羟基氢。
根据一些实施方式，所述Z为：
Figure BDA0003258949220000031
根据一些实施方式，所述的环瓜氨酸肽的氨基酸序列为NH2-S3-C-S1-X-S2-Z-S4-COOH或NH2-S3-Z-S1-X-S2-C-S4-COOH，所述环瓜氨酸肽的结构为：
Figure BDA0003258949220000032
Figure BDA0003258949220000041
其中，S3和S4为延伸区，所述S3和S4之间没有连接关系。
优选地，所述S3和所述S4的氨基酸残基的数量分别为1～5个。
优选地，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列的总长为14～28个氨基酸。
进一步优选地，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列的总长为16～25个氨基酸。
再进一步优选地，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列的总长为16～21个氨基酸。
根据一些具体且优选地实施方式，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为：HQCHGQESTXGRSRGRZGRSG；或，HQZHGQESTXGRSRGRCGRSG；或，HQCHQESXGRSRZGRS；或，HQZHQESXGRSRCGRS。
本发明还提供一种环瓜氨酸肽抗原，所述环瓜氨酸肽抗原包括所述的环瓜氨酸肽。
本发明中，将所述环瓜氨酸肽也称为非天然氨基酸修饰CCP肽段。
优选地，所述非天然氨基酸修饰CCP肽段是在体外通过固相法进行化学合成。
优选地，所述环瓜氨酸肽与载体蛋白、生物素或异硫氰荧光素种的一种或多种偶联形成偶联物。
所述非天然氨基酸修饰CCP抗原以非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物、非天然氨基酸修饰CCP抗原-生物素或非天然氨基酸修饰CCP抗原-异硫氰荧光素的形式存在。
具体地，非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白。
优选地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛γ球蛋白及人γ球蛋白中的一种或多种。
本发明还提供一种含所述的环瓜氨酸肽或含所述的环瓜氨酸肽抗原的试剂。
优选地，所述环瓜氨酸肽或所述环瓜氨酸肽抗原包被于固相载体上。
具体地，非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物、非天然氨基酸修饰CCP抗原-生物素或非天然氨基酸修饰CCP抗原-异硫氰荧光素包被于固相载体上。
优选地，固相载体为磁性微球。
进一步优选地，所述磁性微球为表面带有修饰基团的磁性微球。
更优选地，所述修饰基团选自环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基以及羟基中的一种或多种。
本发明还提供方一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的环瓜氨酸肽或所述的环瓜氨酸肽抗原或所述的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括发光标记物标记的二抗。
进一步优选地，所述发光标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、吖啶酯、辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶中的一种或多种。
本发明还提供所述的环瓜氨酸肽或所述的环瓜氨酸肽抗原或所述的试剂或所述的试剂盒在检测抗瓜氨酸抗体中的应用。
本发明还提供一种血清中抗瓜氨酸抗体的检测方法，该检测方法包括：将至少一个上述任一种非天然氨基酸修饰CCP肽段与待检测的血清进行反应；或者上述任一种非天然氨基酸修饰CCP抗原与待检测的血清进行反应。
进一步地，上述反应在半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪中进行。
本发明的环瓜氨酸肽或环瓜氨酸肽抗原或试剂或试剂盒可用于类风湿关节炎的临床检测。
应用本发明的技术方案，本发明的非天然氨基酸修饰CCP肽段中，含瓜氨酸的抗原表位区为抗体识别关键区，而Z为具有至少一个卤素原子侧基的非天然氨基酸来构成，卤素原子与半胱氨酸C上的-SH发生亲核取代反应，生成的碳-硫键键长为182pm，键能为272kJ/mol；而现有CCP肽段中形成的二硫键键长为207pm，键能为268kJ/mol。所以本发明形成的环状CCP不易断开，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
本发明进一步优化了非天然氨基酸修饰CCP肽段的氨基酸序列结构，使所提供的非天然氨基酸修饰CCP肽段能够在保证临床检测敏感性的同时，降低背景和非特异性吸附，提高灵敏度和信噪比，进一步优化检测试剂的性能，同时，降低在非RA患者或正常人中的检出率，从而提高临床检测特异性。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明使用非天然氨基酸修饰的CCP肽段，通过至少一个卤素原子侧基的非天然氨基酸中的卤素原子与半胱氨酸C上的-SH发生亲核取代反应形成比二硫键更稳定的碳-硫键，使环瓜氨酸肽的环状结构更加稳定，进而降低瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体检测特异性，降低假阳性。进一步，本发明对环瓜氨酸肽的氨基酸序列结构进行优化，使所提供的环瓜氨酸肽具有更高的敏感度，进一步提高检测灵敏度和特异性。
附图说明
附图1为实施例的非天然氨基酸修饰CCP与现有天然氨基酸CCP的稳定性对比，(A)为非天然氨基酸修饰的环状CCP的质谱分析；(B)为两种环状CCP中同时加入0.05％β-巯基乙醇后的质谱分析；(C)为两种环状CCP在碱性环境加热到70-80℃后的质谱分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中，环瓜氨酸肽也可称之为非天然氨基酸修饰CCP肽段。
目前，抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒使用的抗原主要是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为：HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，其中的两个半胱氨酸形成二硫键成环。多肽序列太短，难以形成环状结构，序列太长又容易失去环状结构的构像优势，同时还容易引入其他非必须结合位点。抗体既可以识别由序列上相连接的一些氨基酸残基通过共价键所形成的线性表位结构，也可以识别由序列上不相连的氨基酸残基通过折叠所形成的空间结构的构像表位结构。CCP多肽上除瓜氨酸位点外的其他氨基酸序列可能存在的抗原决定簇表位为线性表位，且CCP多肽约为15-21个AA左右的序列，除半胱氨酸形成的环状结构外无其他空间结构。通常CCP肽段是通过两个半胱氨酸C上的-SH形成二硫键成环，二硫键的键长为207pm，键能为268kJ/mol，并且二价硫具有极化特性，容易被极性试剂(包括亲电试剂和亲核试剂，特别是亲核试剂)切断，暴露出CCP的线性表位HQES及SRGR残基序列，它们是抗瓜氨酸肽抗体的非识别位点，而有很大可能被其他自身抗体识别，从而造成假阳性的检测结果。
现有的CCP抗原除含瓜氨酸部分可作为抗原决定簇外，多肽上的其他氨基酸序列也可能因为环状结构破坏而被识别，从而导致假阳性的检测结果。因此，通过一些方法增加CCP肽段成环的强度就显得格外重要和必要。也就是说，需要对现有的CCP抗原进行改进，以使CCP抗原中使用键长更短，键能更高的共价键，进而在保证临床检测敏感性的同时，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA临床诊断中的特异性，减少假阳性结果，降低医生对患者错误诊断和错误治疗的风险。
因此，发明人对现有的CCP抗原肽进行了深入研究。本申请从原理上提出了提高检测特异性的改进手段：要使CCP肽段成环的强度增加，将CCP肽段上的一个半胱氨酸，修饰或替换成具有卤代烷基修饰的非天然氨基酸，通过卤素原子与半胱氨酸C上的-SH发生亲核取代反应，生成的碳-硫键键长为182pm，键能为272kJ/mol，与二硫键相比，键长更短，键能更高，所以碳-硫键形成的环状CCP不易断开，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
目前，非天然氨基酸方面的研究比较深入，为本发明提供了便利和可实施性。
非天然氨基酸(Unnatural Amino Acids，UAAs)，指不由现有的64种遗传密码子编码的氨基酸。20种天然氨基酸携有的功能基团数量有限，无法满足现在化学、生物科学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。目前，通过化学修饰、基因定点突变和计算机辅助蛋白质设计，虽然对蛋白质的结构改造赋予了天然蛋白质新的功能，但这些方法都依赖于20种天然氨基酸本身；其用于修饰改造的功能基团仅有巯基、羟基、羧基、氨基等几种有限基团，功能化方式十分有限。与此相反，可人为赋予多样性功能基团的非天然氨基酸在蛋白质修饰中表现突出，这些UAAs含有烷基、酮基、醛基、叠氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团，可进行多种修饰反应，如：点击化学、光化学、糖基化、荧光显色等反应。通过UAAs对蛋白质进行修饰给其结构和功能的理论研究与应用带来了新的契机。现今报道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物、赖氨酸衍生物等。
迄今为止，已经探索出了多种UAA的修饰方法。由空白密码子，正交氨酰tRNA合成酶(aaRS)，tRNA，及目标非天然氨基酸组成的体内非天然氨基酸插入系统，具有高保真、高效和可操作性强的特点，但是反应周期长，过程不可控，无法实现UAA的定点插入。体外生物合成法是将缩短了的tRNAs酶法连接到化学氨酰化的核苷酸上，这些目的tRNA从连接的天然氨基酸上去耦掉，同时与非天然氨基酸结合；随后细胞翻译系统在相应的空白密码子或者编码密码子下，使用这些带有非天然氨基酸的氨酰化的tRNAs合成蛋白质，但含有非天然氨基酸的氨酰化tRNA加合物稳定性很差。在体内，通过显微注射技术对蛋白质进行位点特异性修饰来自于体外生物合成方法的拓展。如非洲爪蟾蜍卵母细胞被显微注射进2种RNA：一种是编码蛋白质的mRNA，其目标位点含有UAG终止密码子；一种是合成的氨酰化较正tRNA(suppressor tRNA)，它能装载相应的UAA。在体内，通过UAG终止密码子对蛋白质进行位点特异性修饰，其中UAAs有酪氨酸同系物、α－羟基氨基酸等.但它继承了体外生物合成方法的缺点，即校正tRNA必须在体外化学氨酰化带上UAAs，氨酰化的tRNA不能被重复利用，只能应用于能进行显微注射的细胞。2007年，Carrico等通过在麦芽糖结合蛋白、人类生长激素和分枝杆菌磺基转移酶蛋白中，引入一个含6个氨基酸的共有序列(LCTPSR)，它能被甲酰甘氨酸生成酶识别并修饰，从而生成醛基基团，新生成的醛基基团能进一步引入生物物理探针和抗原表位标签到蛋白质中。Ohno等用叠氮基酪氨酸(3-azidoty-rosine)对钙调蛋白进行修饰，再用三芳膦同系物对其进行选择性的生物酰化修饰，从而开创了一种新的蛋白质位点选择性翻译后修饰方法。2010年，Holzberger等用大肠杆菌营养缺陷型菌株对DNA聚合酶中32个脯氨酸替换成4(R)－氟脯氨酸(4(R)－fluoroproline，(4(R)-F)Pro)，完成了(4(R)-F)Pro对DNA聚合酶的修饰，而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未发生变化。但运用营养缺陷性菌株来进行UAAs对蛋白质的修饰，没有位点特异性、细胞不能持续生长，且UAAs仅是天然氨基酸的同系物。固相肽合成方法已经能合成出含UAAs的大片段蛋白质，并且能实现UAAs的定点插入。目前使用的环瓜氨酸肽(CCP)也是通过人工合成的含有21个氨基酸的多肽，只要在合成过程中将插入的氨基酸原料替换为非天然氨基酸，就能够轻松实现非天然氨基酸修饰CCP的合成。
本申请进一步通过实验验证，体外合成经上述改进后的非天然氨基酸修饰CCP抗原在进行检测时，试剂灵敏度和信噪比进一步改进，临床检测特异性大幅提高。本文中的“试剂灵敏度”“灵敏度”及“信噪比”均是从CCP抗原本身作为试剂使用时的性能，而“特异性”和“敏感性”是指该试剂应用于临床检测时的性能。
基于上述研究结果，在本发明的一种典型的实施方式中，提供了一种环瓜氨酸肽(本发明中也称之为非天然氨基酸修饰CCP肽段)，该具有式I或式II所示的结构：
NH2-S3-C-S1-X-S2-Z-S4-COOH(式I)；
NH2-S3-Z-S1-X-S2-C-S4-COOH(式II)；
其中，X为瓜氨酸残基，是抗体识别的关键位点，
S1和S2为侧翼氨基酸残基区，所述S1和S2之间没有连接关系，而S1和S2形成的线性表位，是抗瓜氨酸肽抗体的非识别位点，而有很大可能被其他自身抗体识别，从而造成假阳性的检测结果。
C为半胱氨酸残基。
Z为非天然氨基酸的残基，所述C和所述Z之间形成碳-硫键连接。
S3和S4为延伸区，所述S3和S4之间没有连接关系。
本发明所改进的非天然氨基酸修饰CCP肽段中卤族元素能够与半胱氨酸C上的-SH发生亲核取代反应，使肽段连接成环。并且形成的碳-硫键比两个C之间形成的二硫键键长更短，键能更大，不易断开。减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
在一些优选的实施例中，Z为带苯环的芳香族氨基酸残基。芳香族氨基酸上的苯环对于连接其上的卤代烷基中的卤素和-SH发生有效识别、取代反应是优选的，并且苯环能减少分子间作用力或避免形成抗原表位，进而减少被其他抗体识别的概率，从而进一步提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸，是非极性的、疏水的氨基酸。
在一些更优选的实施例中，在芳香族氨基酸中选择结构相近的苯丙氨酸和酪氨酸，并且现在对这两种非天然氨基酸的衍生物研究较多，且很多已经商品化，便于后续的结构与功能分析；进一步优选地，苯丙氨酸和酪氨酸上的卤族元素并非直接连在苯环上，而是通过≥2个碳的卤代烷基连接，结构式为：
Figure BDA0003258949220000081
这样卤族元素就能避免苯环上巨大的空间位阻，结构更为柔性，能够更好地与-SH接触反应，形成的非天然氨基酸修饰CCP肽段成环的效率更高，因而抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性更好。
引入具有卤代烷基侧基的芳香族氨基酸后，卤族元素能够自发地与半胱氨酸上的-SH发生亲核取代反应，生成碳-硫键，并且键长为182pm，键能为272kJ/mol；而改造前两个半胱氨酸之间形成的二硫键键长为207pm，键能为268kJ/mol。由于改造后键长更短，键能更大，并且不易受到极性试剂的影响，所以形成的环状CCP更加不易断开，过程如图1所示，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率。
含瓜氨酸的多肽的序列长度一般为12～28个氨基酸，由于多肽序列太短，难以形成环状结构，序列太长又容易失去环状结构的构像优势，同时还容易引入其他非必须结合位点。因而，在一种优选的实施例中，上述式I和式II结构中，CCP肽段全长为16～21个氨基酸。本申请中的非天然氨基酸修饰CCP肽段也采用16～21个氨基酸，有助于在保留现有CCP抗原的构象优势及较高的临床检测敏感性的基础上，进一步提高检测的特异性。
本发明的上述非天然氨基酸修饰CCP肽段中，含瓜氨酸残基的成环区，即C-S1-X-S2-Z区的氨基酸的总个数为7～20个，序列太短反应位点难以接近成环，序列太长则容易失去环状结构的构像优势。优选地，含瓜氨酸残基的成环区有11～15个氨基酸，具有完整的抗原决定簇位点，基本能保证临床检测敏感性，同时，具有更优的临床检测特异性。其中X在其中的位置也无特殊限定，任意位置均可。更优选，X位于最中心的位置，在该位置上具有更优异的临床检测敏感性，同时提高了信噪比这一试剂性能。因此，在本申请一种优选的实施例中，所述S1和S2中氨基酸残基的数量相等或仅差1，即X位于成环序列的中间。
上述非天然氨基酸修饰CCP肽段中，S1和S2的侧翼氨基酸残基区为CCP抗体识别关键区之外的序列区，其修饰或改进减少了形成抗原表位的结构特征及被其他抗体识别的概率。其具体的氨基酸残基的数量并无特殊限定，在本申请中优选的实施例中，S1和S2中含有5～7个氨基酸。
本申请上述改进的非天然氨基酸修饰CCP肽段具有较低的被非CCP抗体识别的概率，因而，任何按照本申请的改进方法而得到的改进的非天然氨基酸修饰CCP肽段均在本申请的保护范围内。在一种优选的实施例中，非天然氨基酸修饰CCP肽段选自如下氨基酸序列中的一个：HQCHGQESTXGRSRGRZGRSG、HQZHGQESTXGRSRGRCGRSG、HQCHQESXGRSRZGRS、HQZHQESXGRSRCGRS。
目前使用的环瓜氨酸肽(CCP)也是通过人工合成的含有21个氨基酸的多肽，只要在合成过程中将插入的氨基酸原料替换为非天然氨基酸，就能够轻松实现非天然氨基酸修饰CCP的合成。所以本发明的上述改进的非天然氨基酸修饰CCP肽段全部由体外固相法化学合成。
在实施例中，还提供了一种CCP抗原，该CCP抗原包括一个或多个上述任一种非天然氨基酸修饰CCP肽段。由于上述改进的非天然氨基酸修饰CCP肽段，不仅具有现有CCP抗原较高的临床检测敏感性，而且具有较低的被非CCP抗体识别的概率，因而采用其中的一种或几种的组合形成的CCP抗原，在用于检测RA患者血清时，不仅具有较高的检测敏感性，而且具有较高的检测特异性。
在实施例中，还提供了一种类风湿关节炎检测试剂，该试剂包括CCP抗原，CCP抗原为上述任一种抗原。本发明的CCP抗原在保持现有检测敏感性的前提下，具有更高的临床检测特异性，减少了假阳性造成错误诊断的风险。
本发明的上述CCP抗原在具有较高检测特异性的优势基础上，为进一步提高试剂灵敏度等性能，在一种优选实施例中，非天然氨基酸修饰CCP抗原以CCP抗原-载体蛋白偶联物或CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素的形式存在；优选地，非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白；优选地，载体蛋白选自如下任意一种：牛血清白蛋白(BSA)、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、牛γ球蛋白及人γ球蛋白；更优选地，CCP抗原以非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物的形式存在，试剂灵敏度等性能进一步放大。
由于非天然氨基酸修饰CCP多肽仅由20个左右AA组成，相对于微米级的磁性微球太小，包被非天然氨基酸修饰CCP多肽的磁性微球在与血清中的抗环瓜氨酸肽抗体共孵育时可能会存在较大空间位阻，不太容易被抗体所识别，而当将其与载体蛋白偶联后，载体蛋白的存在会在一定程度上降低抗原抗体识别的空间位阻，带有抗原表位的非天然氨基酸修饰CCP多肽更容易被抗体分子识别，从而保证试剂较高的灵敏度。
为了进一步提高上述CCP抗原利用的便利性或提高检测的自动化程度，在一种优选实施例中，非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物或非天然氨基酸修饰CCP抗原-生物素或非天然氨基酸修饰CCP抗原-异硫氰荧光素包被于固相载体上；优选地，固相载体为磁性微球，磁性微球可以为现有市售的任意一种磁性微球。更优选地，磁性微球为表面带有修饰基团的磁性微球，修饰基团选自如下至少一种：环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基以及羟基。带有上述修饰基团的磁性微球通过相应的修饰基团与活性基团反应，从而将非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物或非天然氨基酸修饰CCP抗原-生物素或非天然氨基酸修饰CCP抗原-异硫氰荧光素连接到磁性微球表面上。
在实施例中，还提供了一种类风湿关节炎检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种试剂。本发明的试剂盒因所含的非天然氨基酸修饰CCP抗原具有较低的被血清中的非CCP抗体识别的概率，因而在保证临床检测敏感性的同时，提高抗CCP抗体试剂在RA临床诊断中的特异性，降低假阳性结果造成医生对患者做出错误诊断和错误治疗的风险。
相应地，当上述试剂盒包含包被于磁性微球上的非天然氨基酸修饰CCP抗原时，优选该试剂盒还包括发光标记物标记的二抗，更优选发光标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的任一种，更优选异鲁米诺衍生物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
在第五种典型的实施方式中，本申请还提供了一个或多个上述任一种非天然氨基酸修饰CCP肽段在制备用于诊断类风湿关节炎检测试剂或试剂盒中的用途。
在实施例中，还提供了一种类风湿关节炎的检测方法，该检测方法包括：将至少一个上述任一种非天然氨基酸修饰CCP肽段与患者的血清进行反应；或者上述任一种非天然氨基酸修饰CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂中的非天然氨基酸修饰CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的非天然氨基酸修饰CCP抗原与患者的血清进行反应。该检测方法能显著提高临床检测特异性。
进一步地，采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的非天然氨基酸修饰CCP抗原与患者的血清进行反应，反应在半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪中进行，能提高检测的自动化程度。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
以下实施例中使用的非天然氨基酸为：N-Fmoc-4-2-溴乙基-L-苯丙氨酸，结构式为
Figure BDA0003258949220000111
通过市售获得。
实验一：提供了一种非天然氨基酸修饰CCP肽段固相合成及纯化方法，包括：
(1)非天然氨基酸修饰CCP肽段的合成。肽链的合成在CSl36多肽合成仪上完成。多肽固相合成是一个从C端向N端添加氨基酸的过程，合成包括去保护、活化耦合、洗涤三个步骤。
a)称取0.33g取代度为0.6meq/gm的Fmoc-L-Thr(tbu)-Wang-resin置于反应瓶中，加入适量DMF溶胀1～2小时。在对应的氨基酸储瓶中加入0.6mmol Fmoc-L-氨基酸，0.6mmolHBTU和1.2mmol DIEA的DMF溶液。按照肽链从C端向N端的顺序(氨基酸序列见表1)依次加入Fmoc基团保护的天然及非天然氨基酸，运行设定好的程序。
b)经去保护和活化耦合延长肽链，每次耦合反应之后用茚三酮显色法检测反应是否完全，如果树脂无色或淡黄色则证明反应完全，如果树脂呈蓝紫色需重新耦合。耦合反应完成后，用无水甲醇洗涤树脂，真空干燥。
(2)非天然氨基酸修饰CCP肽段的切割。在干燥的肽树脂中，加入10mL切割液(95％TFA+2.5％H2O+2.5％TIS)，常温下避光切割3小时，抽滤，滤液保留待用。树脂用少量TFA洗涤2次，洗涤液与前次滤液合并，经旋转蒸发浓缩除去TFA，加入5～10倍量冰冷的无水乙醚，于-20℃静置过夜，析出白色絮状沉淀，离心收集沉淀，用少量无水乙醚洗涤，真空干燥，称重计算产率。
(3)非天然氨基酸修饰CCP肽段的纯化。Chromatorex C18色谱柱，进样量5mL，流动相为：A：0.1％TFA，B：90％乙腈+0.1％TFA，流速为4.7mL/min，进行线性梯度洗脱，检测波长为214nm。收集主峰流出液，旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻干燥得到纯品，经HPLC分析纯度。
(4)非天然氨基酸修饰CCP肽段的环化与纯化。
a)在甲醇作为溶剂的反应体系中，加入2:1氢氧化钠与线性CCP肽段，升温回流之后，得到环化的非天然氨基酸CCP。
b)用SDS-PAGE分离环化与线性肽段。从凝胶上切下蛋白带，转移至微量离心管。加入1ml 50％甲醇，室温下孵育20min，弃上清。加入1ml 10％甲醇，室温下孵育20min，弃上清。旋转浓缩器中干燥2min，加10ul Achromobacter蛋白酶I。加入刚好淹没凝胶碎片的含0.1％Tween-20的0.1mol/LTris-HCl(pH9.0)，30℃孵育24小时。12000r/min离心2min。保留滤液。加入刚好淹没凝胶碎片的含0.1％TFA的50％乙腈溶液，4℃孵育30min。
c)旋转浓缩器中旋转浓缩至体积小于100ml。加适量HPLC平衡液，制成供HPLC分析用的样品。用反相HPLC C18柱分离消化液中的肽段。用含0.09％TFA的乙腈/2-丙醇(3:1)梯度洗脱肽段。收集洗脱峰蛋白，即为环化的非天然氨基酸CCP。
实验二：提供了一种试剂盒，包括：
(1)组分A：包被磁性微球的非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物溶液，由非天然氨基酸修饰CCP抗原与载体蛋白偶联而成，其中：
a)CCP抗原的结构序列为如下SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12的非天然氨基酸修饰CCP肽段的任一种(各CCP序列的抗原由上述化学合成法获得，序列表1)。
序列表1
Figure BDA0003258949220000121
Figure BDA0003258949220000131
注：表1中黑体加粗的X为瓜氨酸，C为半胱氨酸，Z为优选的p(氯乙酰氨基)-L-苯丙氨酸(caa-Phe)，Z和C之间的常规字体序列为用于成环的氨基酸残基区域。
b)载体蛋白：牛血清白蛋白(BSA)、阳离子牛血清白蛋白(cBSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白HSA、牛γ球蛋白或人γ球蛋白。
c)磁性微球为以下任意一种磁性微球：表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基或羟基修饰的磁性微球。
其中，磁性微球的工作浓度为：1～10mg/ml，非天然氨基酸修饰CCP抗原的工作浓度为50～100ng/ml，载体蛋白的浓度为10～40ng/mL；
(2)组分B：标志发光标志物的鼠抗人IgG二抗溶液，其中，发光标志物的工作浓度为10～30ng/ml，鼠抗人IgG二抗的工作浓度为100～300ng/ml。
发光标记物选自如下任一种：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
(3)校准品溶液：浓度20U/mL的低浓度校准品溶液和浓度200U/mL的高浓度校准品溶液。各组分均含有BSA和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％～0.5％，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。
实验三：用于检测Anti-CCP抗体的检测试剂盒的制备方法
步骤1：将非天然氨基酸修饰CCP抗原与载体蛋白形成偶联物
1)将非天然氨基酸修饰CCP抗原与交联剂在催化剂条件下进行反应，得到非天然氨基酸修饰CCP抗原反应液；其中，交联剂包括但不限于戊二醛、BS(PEG)5、BS(PEG)8、PEG400、PEG800、丁二酸酐等，其用量为1eq至4eq；催化剂包括但不限于三乙胺、吡啶、氢氧化钾、碳酸钾，其用量为1eq至4eq。
2)向步骤1)的非天然氨基酸修饰CCP抗原反应液中加入载体蛋白进行反应，经纯化，得到非天然氨基酸修饰CCP抗原与载体蛋白形成的偶联物。其中，非天然氨基酸修饰CCP抗原与载体蛋白的摩尔比为20:1-80:1。
步骤2：非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球悬浮液的制备
采用上述步骤2)获得的偶联物包被磁性微球(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1～5μm，磁化强度为4000，浓度为100mg/mL，羟基数为95的纳米磁性微球)。具体步骤如下：
1)将磁珠置于醋酸缓冲液溶液中超声搅拌清洗，通过磁分离除去上层清液，重复三次此步骤，得到醋酸缓冲液悬浮磁珠；
2)采用磁珠连接CDC法(磁珠-CDC-抗原/抗体)，向醋酸缓冲液悬浮磁珠中加入CDC和非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物，置于恒温震荡水浴箱中反应，得到非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球反应液；其中磁性微球与非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物的比例为1mg：10μg至1mg：40μg；
3)将步骤2)得到的反应液通过磁分离除去上层清液，并加入磁珠清洗液搅拌清洗，重复此步骤清洗四次；其中磁珠清洗液为0.1M的pH7.4的PBS缓冲液，加入混匀后，称量0.5％(w/v)的BSA(Roche生产)，自溶混匀；
4)清洗完毕后，加入磁珠悬浮液进行悬浮，得到非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球悬浮液；其中磁珠悬浮液为0.1M的pH7.4的PBS缓冲液。
步骤3：鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物ABEI的制备
1)将鼠抗人IgG二抗碳酸缓冲液装入合适截留量的透析袋中置于透析液中进行透析，其中，透析液为碳酸缓冲液；
2)往步骤1)透析好的溶液中加入发光标记物进行反应；其中，温育的温度25～37℃，温育的时间：8～12h；
3)将步骤2)得到的反应液通过G-25凝胶柱进行纯化，收集出现峰值的溶液，得到鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液；
4)将步骤3)得到的鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液加入BSA保护液，待用。
实验四：一种用于检测Anti-CCP抗体的化学发光免疫学方法，包括以下步骤：
1)将待测样本溶液、高点校准品和低点校准品分别加入到不同反应杯孔中；
2)分别向步骤1)中加入上述制备的非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球，使与待测物质结合；
3)分别向步骤2)中加入发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗进行温育，使发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗与非天然氨基酸修饰CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球和待测物质结合；其中，温育的温度25～37℃，温育的时间：10～20min。
4)磁分离，得到发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗与非天然氨基酸修饰CCP抗原包被的磁性微球和待测物质的结合物；
5)向步骤4)得到的结合物加入发光激发底物，检测光信号强度；其中发光激发底物包括但不限于NaOH和H2O2。
6)通过校准品修正后的工作曲线，根据样本检测光强度自动计算，得出待测样本的Anti-CCP抗体浓度。
实验五、实施例及结果分析
1)待测样本：为通过临床诊断及其他商业试剂筛查已经确诊的RA患者血清、正常人血清、非RA患者血清。
2)待测样本的收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血2mL。分离血清，置于-20℃冰箱保存。
3)各实施例的设置：各实施例所使用的试剂盒中，除非天然氨基酸修饰CCP肽段序列不同外，其余组分均相同(具体如表1)。检测方法也都相同，具体步骤同实验四。
4)对各实施例的如下检测性能进行评估，检测结果分别见表2、表3-1、表3-2、表4-1和表4-2。
a.特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)，临床特异性评估样本：健康体检样本、非RA样本(如：系统性红斑狼疮患者、干燥综合征患者、原发性胆汁性硬化患者或I型自身免疫性肝炎患者的血清)。
b.敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)，临床敏感性评估样本：类风湿性关节炎患者的血清。
c.灵敏度(空白限)：重复测定零浓度校准品20次，记录20次测试的相对发光强度(RLU)。计算20次测试的相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，代入试剂盒工作曲线，对应的浓度值即空白限。
d.信噪比：测定正常阴性血清样本20次，计算平均相对发光强度(RLU)。
信噪比＝Cut-off值(RLU)/样本平均相对发光强度(RLU)。
下表2为各实施例对应的诊断敏感性及特异性。
表2：实施例1-13对应的诊断敏感性及特异性
Figure BDA0003258949220000151
Figure BDA0003258949220000161
下表3-1和表3-2为各实施例对应的灵敏度(空白限)检测结果。
表3-1：实施例1-6对应的灵敏度(空白限)
Figure BDA0003258949220000162
Figure BDA0003258949220000171
表3-2：实施例7-13对应的灵敏度(空白限)
Figure BDA0003258949220000172
Figure BDA0003258949220000181
下表4-1和表4-2为各实施例对应的信噪比检测结果。
表4-1：实施例1-6对应的检测信噪比
Figure BDA0003258949220000182
表4-2：实施例7-13对应的检测信噪比
Figure BDA0003258949220000191
5)结果分析：
实施例1，3，5，7，9，11与2，4，6，8，10，12为一一对应的序列，它们只有C和Z的位置进行了交换，每组的诊断敏感性及特异性、灵敏度(空白限)和信噪比并无明显差异，说明C和Z在CCP肽段的氮端或碳端的位置对于CCP成环并无较大影响。
实施例1，2和3，4与实施例13对比后发现，将CCP肽段上的一个半胱氨酸C，修饰或替换成具有卤族元素的非天然氨基酸Z，通过卤素原子与半胱氨酸C上的-SH发生亲核取代反应，生成的碳-硫键键长更短，键能更高，所以碳-硫键形成的环状CCP不易断开，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的特异性，从95％增加到98％以上，序列1，2的诊断敏感性也从60％增加到63％以上。并且试剂盒的灵敏度(空白限)和信噪比也有大幅提升。序列1，2的灵敏度提升了25倍以上(从0.164提高到0.006)，信噪比提升了3倍以上(从7.05提高到25.21)；序列3，4的灵敏度提升了4倍以上(从0.164提高到0.035)，信噪比提升了3倍以上(从7.05提高到24.01)。
实施例1～8对比，它们的序列只有成环氨基酸数量不同，1和2为15aa、3和4为11aa、5和6为23aa、7和8为9aa。通过结果分析发现，当成环数量为11～15aa时，能保证临床检测敏感性，同时具有更优的临床检测特异性，并且试剂盒的灵敏度和信噪比也更高。因为成环序列太短，反应位点难以接近连接成环；序列太长则容易失去环状结构的构像优势。而含瓜氨酸的成环区有11～15个氨基酸时，具有完整的抗原决定簇位点的同时能够保证环形结构的优势。
实施例1～4与实施例9～12对比，它们的瓜氨酸X位置不同。实施例1～4的瓜氨酸位于成环序列中间，而实施例9～12的瓜氨酸位于序列的两端。通过结果分析发现，当瓜氨酸位于最中心的位置时，具有更优异的临床检测敏感性和特异性，同时提高了空白限和信噪比这些试剂性能。
通过上述结果可知，本发明通过对CCP肽段成环的关键氨基酸位点进行非天然氨基酸修饰，使得CCP抗原能够在保持临床检测敏感性无明显改变的同时，大大降低背景和非特异性吸附，使试剂的灵敏度提高25倍、信噪比提高3倍以上，进一步优化了试剂性能。同时，临床检测特异性也从95％左右提高到98％以上。
综上，本发明的非天然氨基酸修饰CCP肽段的结构为：
Figure BDA0003258949220000201
实线表示肽键，虚线表示碳-硫键，X为瓜氨酸残基，S1和S2为侧翼氨基酸残基区，S3和S4为延伸区，所述S3和S4之间没有连接关系，C为半胱氨酸残基，Z为非天然氨基酸的残基，所述C和所述Z之间形成碳-硫键连接。碳-硫键比两个半胱氨酸之间形成的二硫键键长更短，键能更大，不易断开。减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州携创生物技术有限公司
<120> 一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
His Gln Cys His Gly Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Glx Gly Arg Ser Gly
20
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
His Gln Glx His Gly Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Cys Gly Arg Ser Gly
20
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
His Gln Cys His Gln Glu Ser Xaa Gly Arg Ser Arg Glx Gly Arg Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
His Gln Glx His Gln Glu Ser Xaa Gly Arg Ser Arg Cys Gly Arg Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
His Gln Cys Gly Gly Gly Gly His Gly Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg
1 5 10 15
Ser Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Glx Gly Arg Ser Gly
20 25
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
His Gln Glx Gly Gly Gly Gly His Gly Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg
1 5 10 15
Ser Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Cys Gly Arg Ser Gly
20 25
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
His Gln Cys Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Glx Gly Arg Ser Gly
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
His Gln Glx Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Cys Gly Arg Ser Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
His Gln Cys Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg Gly Gly Gly Glx
1 5 10 15
Gly Arg Ser
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 10
His Gln Glx Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg Gly Gly Gly Cys
1 5 10 15
Gly Arg Ser
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 11
His Gln Cys Gly Gly Gly Gly His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Glx
1 5 10 15
Gly Arg Ser
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 12
His Gln Glx Gly Gly Gly Gly His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Cys
1 5 10 15
Gly Arg Ser
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 13
His Gln Cys His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg Cys
1 5 10 15
Gly Arg Ser Gly Ser
20

Claims (15)

1.一种环瓜氨酸肽，其特征在于，瓜氨酸残基的一端的肽段和瓜氨酸残基的另一端的肽段之间通过碳-硫键连接成环。
2.根据权利要求1所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，与瓜氨酸残基的一端相连的肽段中存在卤代烷基修饰的非天然氨基酸的残基，与瓜氨酸残基的另一端相连的肽段中含有半胱氨酸残基，所述碳-硫键通过所述卤代烷基中的卤素原子与所述半胱氨酸残基上的巯基发生亲核取代反应形成。
3.根据权利要求1或2所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述环瓜氨酸肽包含一个或多个含瓜氨酸残基的成环区，所述含瓜氨酸残基的成环区的结构为：
Figure FDA0003258949210000011
Figure FDA0003258949210000012
实线表示肽键，虚线表示碳-硫键，
其中，X为瓜氨酸残基，
S1和S2为侧翼氨基酸残基区，所述S1和S2之间没有连接关系，
C为半胱氨酸残基，
Z为非天然氨基酸的残基，所述C和所述Z之间形成碳-硫键连接。
4.根据权利要求3所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述含瓜氨酸残基的成环区的全长为7～20个氨基酸残基；
和/或，所述S1和所述S2氨基酸残基数量相差0～3个；
和/或，所述S1和所述S2的氨基酸残基数量分别为4～9个。
5.根据权利要求2所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为卤代烷基修饰的芳香族氨基酸衍生物，和/或，所述卤代烷基的碳原子数为2～10个。
6.根据权利要求2所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为具有卤代烷基修饰的苯丙氨酸，所述卤代烷基取代苯丙氨酸的苯环氢，
或，所述卤代烷基修饰的非天然氨基酸为具有卤代烷基修饰的酪氨酸，所述卤代烷基取代酪氨酸的羟基氢。
7.根据权利要求3所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为NH2-S3-C-S1-X-S2-Z-S4-COOH或NH2-S3-Z-S1-X-S2-C-S4-COOH，所述环瓜氨酸肽的结构为：
Figure FDA0003258949210000021
其中，S3和S4为延伸区，所述S3和S4之间没有连接关系；
所述S3和所述S4的氨基酸残基的数量分别为1～5个，
和/或，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列的总长为14～28个氨基酸残基。
8.根据权利要求7所述的环瓜氨酸肽，其特征在于，所述环瓜氨酸肽的氨基酸序列为：HQCHGQESTXGRSRGRZGRSG；或，HQZHGQESTXGRSRGRCGRSG；或，HQCHQESXGRSRZGRS；或，HQZHQESXGRSRCGRS。
9.一种环瓜氨酸肽抗原，其特征在于，所述环瓜氨酸肽抗原包括权利要求1至8中任一项所述的环瓜氨酸肽。
10.根据权利要求9所述的环瓜氨酸肽抗原，其特征在于，所述环瓜氨酸肽与载体蛋白、生物素或异硫氰荧光素种的一种或多种偶联形成偶联物。
11.一种含权利要求1至8中任一项所述的环瓜氨酸肽或含权利要求9或10所述的环瓜氨酸肽抗原的试剂。
12.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述环瓜氨酸肽或所述环瓜氨酸肽抗原包被于固相载体上。
13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至8中任一项所述的环瓜氨酸肽或权利要求9或10所述的环瓜氨酸肽抗原或权利要求11或12所述的试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括发光标记物标记的二抗。
15.如权利要求1至8中任一项所述的环瓜氨酸肽或权利要求9或10所述的环瓜氨酸肽抗原或权利要求11或12所述的试剂或权利要求13或14所述的试剂盒在检测抗瓜氨酸抗体中的应用。
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