CN114836407B - 壳多糖酶3样蛋白1抗原及载体蛋白修饰多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及壳多糖酶3样蛋白1抗原及载体蛋白修饰多肽的方法。所述CHI3L1抗原通过使CHI3L1抗原表位肽(1)或CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成,CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的氨基酸序列为Tyr‑Arg‑Lys‑Ser‑Val‑Pro‑Pro‑Phe‑Leu‑Arg‑Thr或Tyr‑Arg‑Ser‑Ala‑Ala‑Leu‑Ser‑Ala‑Gly‑Lys‑Val‑Thr‑Ile‑Asp。使用本发明的CHI3L1抗原还可制备CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体用于制备CHI3L1体外诊断试剂盒。本发明的CHI3L1抗原表位肽具有良好的抗原性,用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,从而可应用于人CHI3L1的体外检测,例如用于肝病的检测和诊断。
Description
技术领域
本发明属于多肽化学和免疫学领域,涉及壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原表位肽。使用该抗原表位肽,通过使用载体蛋白KLH进行修饰,可以制备CHI3L1特异性抗原,进而制备相应的单克隆抗体或多克隆抗体,此外,此类抗体可用于制备人CHI3L1体外诊断试剂盒,此类试剂盒例如可以用于检测肝病患者血清样本中的CHI3L1浓度,为肝病诊断提供有效的科学依据。本发明由此涉及使用载体蛋白修饰壳多糖酶3样蛋白1抗原表位肽制备抗原的方法。
背景技术
壳多糖酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1,CHI3L1),即YKL-40蛋白,是壳质酶蛋白家族的一种糖蛋白,约40kDa大小。CHI3L1最早是在非泌乳期牛的乳汁分泌物中发现的,可由多种细胞分泌,主要包括:①关节炎患者的软骨细胞和成纤维样滑膜细胞;②活化的巨噬细胞和分化晚期的巨噬细胞;③中性粒细胞;④其他,人骨肉瘤细胞(MG-63)、分化型血管平滑肌细胞、乳腺上皮细胞、巨噬细胞的亚群、不同炎症组织的平滑肌细胞等多种细胞也可检测到CHI3L1表达。
CHI3L1蛋白是由CHI3L1基因编码,CHI3L1 mRNA在软骨细胞和肝脏中表达强烈,在脑、肾、心脏等表达较弱或不表达。
目前的研究资料表明,CHI3L1的生物学功能主要包括:①促进结缔组织细胞生长,在软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化方面发挥着重要作用;②调节血管内皮细胞形态,在新生血管形成中发挥重要作用;③调节基质重构;④可以帮助细胞去适应生长环境的变化以及缺氧等病理损伤的修复,促进细胞的增殖和生存使细胞免受凋亡;⑤可以启动结缔组织细胞中的信号级联反应,导致细胞增殖,促进组织纤维化。
在慢性肝病患者中,血清CHI3L1浓度增加,大多数有酒精性肝硬化或肝炎后肝硬化患者的血清C HI3L1升高,非肝硬化纤维化患者的血清CHI3L1含量范围由正常开始范围逐渐增加。血清CHI3L1与纤维化程度密切相关,由病理患者的中度至重度纤维化最高水平来确定。轻微纤维化患者血清CHI3L1升高到较小程度,但这种升高是仍然显著大于无纤维化患者。故CHI3L1水平可反映肝纤维化程度,能够作为肝纤维化的诊断性标志物。
检测血清中的CHI3L1水平的最理想的方法为免疫检测。因此,寻找合适的具有免疫原性的CHI3L1抗原表位肽、制备特异性的CHI3L1抗原及抗体即成为了重点。
CN111197040A(申请号2020100721960,亿彤生物)公开了壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒;该发明的CHI3L1抗原表位肽的氨基酸序列,所述CHI3L1抗原表位肽的氨基酸链片段为如下Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr和Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp两者之一;该发明的CHI3L1抗原由CHI3L1抗原表位肽与蛋白载体偶联制得;该发明的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体由该发明的CHI3L1抗原制得;该发明的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体用于制备CHI3L1体外诊断试剂盒;该发明的CHI3L1抗原表位肽呈现良好的抗原性,用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,从而可应用于人CHI3L1的体外检测。
然而,本领域仍然期待有制备上述壳多糖酶3样蛋白1抗原的方法,例如通过使用载体蛋白KLH进行修饰,从而制备CHI3L1特异性抗原。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种CHI3L1抗原表位肽,用该抗原表位肽制备的CHI3L1特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体,其在制备CHI3L1试剂盒上的用途,以及CHI3L1体外诊断试剂盒。例如,本发明的目的在于提供一种制备高纯度CHI3L1抗原表位肽的方法,例如本发明的目的在于提供一种高纯度CHI3L1抗原表位肽。已经出人意料地发现,通过本发明方法能够获得高纯度CHI3L1抗原表位肽。本发明基于此类发现而得以完成。
为此,本发明第一方面提供了一种CHI3L1抗原表位肽,其为选自如下肽(1)或肽(2)的氨基酸链片段:
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr,
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp。
在本发明中,上述氨基酸链片段(1)和(2)可称为肽(1)和肽(2),或者可称为抗原表位肽(1)和抗原表位肽(2),或者亦可称为CHI3L1抗原表位肽(1)和CHI3L1抗原表位肽(2)等类似称呼。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,在制备肽(1)或肽(2)时,是以如下方式接入Tyr的:
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂即保护的十一肽树脂;以及
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂即保护的十四肽树脂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,在制备肽(1)或肽(2)之接入Tyr的过程中,所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,在制备肽(1)或肽(2)之接入Tyr的过程中,氨丁三醇的量是DIEA的6%,以摩尔百分数计。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中肽(1)是通过如下方法制备得到的:
步骤1:Fmoc-Thr(tBu)-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中,加入二氯甲烷,振荡并浸泡,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,抽滤以除去溶剂,
向以上处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,
将30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Thr(tBu)-树脂;
步骤2:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤3:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤4:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Phe-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤5:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤6:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤7:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤8:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤9:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤10:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤11:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂即保护的十一肽树脂;
步骤12:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶,加入预冷切割液(例如95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水),室温搅拌反应,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂,合并滤液和洗涤液,加冰冻乙醚使沉淀,过滤得沉淀物,即为十一肽的粗品;
步骤13:依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化,得肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(1)。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤13之分离纯化照可以照本文实施例所记载的或者现有技术已知的方式进行。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤1~步骤11中,各步骤所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤1中,处理RinkAmide-MBHA树脂时,加入二氯甲烷80ml,振荡并浸泡60分钟,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,每次各80ml,抽滤以除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤1中,向处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤1中,将30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤2中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤2中,将30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤11中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液例如100ml,室温下振荡进行脱帽反应例如60分钟,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,例如每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤11中,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺例如100ml中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应例如1小时,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,例如每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(1)的步骤11中,氨丁三醇的量是DIEA的6%,以摩尔百分数计。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中肽(2)是通过如下方法制备得到的:
步骤1:Fmoc-Asp(OtBu)-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中,加入二氯甲烷,振荡并浸泡,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,抽滤以除去溶剂,
向以上处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,
将30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Asp(OtBu)-树脂;
步骤2:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤3:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤4:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤5:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤6:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤7:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤8:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤9:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤10:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤11:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤12:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤13:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤14:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂即保护的十四肽树脂;
步骤15:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶,加入预冷切割液(例如95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水),室温搅拌反应,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂2次,合并滤液和洗涤液,加冰冻乙醚例如1200ml使沉淀例如5小时,过滤得沉淀物,即为十四肽的粗品;
步骤16:依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化,得到肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(2)。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤16之分离纯化照可以照本文实施例所记载的或者现有技术已知的方式进行。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤1~步骤14中,各步骤所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤1中,处理RinkAmide-MBHA树脂时,加入二氯甲烷例如80ml,振荡并浸泡例如60分钟,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,例如每次各80ml,抽滤以除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤1中,向处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤1中,将30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤2中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤2中,将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤14中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液例如100ml,室温下振荡进行脱帽反应例如60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,例如每次各80ml,并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤14中,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺例如100ml中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应例如1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,例如每次各80ml,抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的CHI3L1抗原表位肽,其中制备肽(2)的步骤14中,氨丁三醇的量是DIEA的6%,以摩尔百分数计。
进一步的,本发明第二方面提供了制备CHI3L1抗原表位肽(1)或肽(2)的方法,所述肽(1)或(2)具有如下氨基酸序列:
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr,
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp;
其中,该方法是以如下方式接入Tyr的:
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂即保护的十一肽树脂;以及
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂即保护的十四肽树脂。
根据本发明第二方面的方法,在制备肽(1)或肽(2)之接入Tyr的过程中,所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
根据本发明第二方面的方法,在制备肽(1)或肽(2)之接入Tyr的过程中,氨丁三醇的量是DIEA的6%,以摩尔百分数计。
根据本发明第二方面的方法,其中制备肽(1)或肽(2)的操作步骤如本发明第一方面任一项所述。
进一步的,本发明第三方面提供了一种CHI3L1抗原,其通过使CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成,或通过使CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。
如上下文所述,所述CHI3L1抗原表位肽(1)和CHI3L1抗原表位肽(2)的氨基酸链片段分别为:
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr;
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其通过使用双重氮化联苯胺二氯化物法,使CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白KLH偶联制备而成,或使CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白KLH偶联制备而成。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其是通过使用如下方法制备得到的:将CHI3L1肽(1)或(2)用PBS缓冲液溶解,将KLH用硼酸盐缓冲液溶解,然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的双重氮化联苯胺二氯化物,室温下反应1.5h,透析12~15小时,即得。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其中所述PBS缓冲液的配方为:0.2mol/L的Na2HPO4 81ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合而成。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其中所述硼酸盐缓冲液的配方为:0.05mol/L硼砂80ml,加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其是通过使用如下方法制备得到的:取CHI3L1肽(1)或(2)10.0mg,用1ml的0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解;将10mg的KLH用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解;然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的BDBCl2,室温下反应1.5h,透析12~15小时,即得。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其中所述硼酸盐缓冲液用等体积的碳酸盐缓冲液替代,所述碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵、0.12g亚硝酸钠,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。
根据本发明第三方面的CHI3L1抗原,其中所述CHI3L1肽(1)或(2)是本发明第一方面任一项所述的CHI3L1抗原表位肽(1)或CHI3L1抗原表位肽(2)。
进一步的,本发明第四方面提供了制备CHI3L1抗原的方法,该方法通过使用双重氮化联苯胺二氯化物法,使CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白KLH偶联制备而成,或使CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白KLH偶联制备而成。
根据本发明第四方面的方法,包括如下步骤:将CHI3L1肽(1)或(2)用PBS缓冲液溶解,将KLH用硼酸盐缓冲液溶解,然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的双重氮化联苯胺二氯化物,室温下反应1.5h,透析12~15小时,即得CHI3L1抗原。
根据本发明第四方面的方法,其中所述PBS缓冲液的配方为:0.2mol/L的Na2HPO481ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合而成。
根据本发明第四方面的方法,其中所述硼酸盐缓冲液的配方为:0.05mol/L硼砂80ml,加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。
根据本发明第四方面的方法,包括如下步骤:取CHI3L1肽(1)或(2)10.0mg,用1ml的0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解;将10mg的KLH用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解;然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的BDBCl2,室温下反应1.5h,透析12~15小时,即得CHI3L1抗原。
根据本发明第四方面的方法,其中所述硼酸盐缓冲液用等体积的碳酸盐缓冲液替代,所述碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵、0.12g亚硝酸钠,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。
根据本发明第四方面的方法,其中所述CHI3L1肽(1)或(2)是照本发明第一方面任一项所述的CHI3L1抗原表位肽(1)或CHI3L1抗原表位肽(2)的制备方法获得的,或者是照本发明第二方面任一项所述方法制备得到的。
本发明还提供了一种CHI3L1抗体,其是由所述的CHI3L1抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还提供了所述CHI3L1抗体在制备CHI3L1体外诊断试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种CHI3L1体外诊断试剂盒,其包含所述CHI3L1抗体作为包被抗体。
优选的,一种CHI3L1体外诊断试剂盒还包含结合抗体,所述结合抗体为所述的CHI3L1抗体,并且当所述结合抗体来源于CHI3L1抗原表位肽(1)或(2)中的一者时,所述包被抗体来源于CHI3L1抗原表位肽(1)或(2)中的另一者。
优选的,所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。
优选的,所述包被抗体为单克隆抗体。
优选的,所述结合抗体为多克隆抗体。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果:
1.本发明的CHI3L1抗原表位肽具有良好的抗原性,用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
2.用本发明制备的CHI3L1单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的CHI3L1结合。
3.本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒可以有效地检测血液中的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的水平,可用来判断肝纤维化程度。
在本发明上述制备方法的步骤中,虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别,然而,本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案,可以与其它实施方案进行组合,只要它们不会出现矛盾。此外,在本发明任一方面的任一实施方案中,任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征,只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献,它们的全部内容通过引用并入本文,并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时,以本发明的表述为准。此外,本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义,即便如此,本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释,提及的术语和短语如有与公知含义不一致的,以本发明所表述的含义为准。
发明详述
一、CHI3L1抗原表位肽
本发明中所述的CHI3L1蛋白是本领域已知的,其氨基酸序列是本领域已知的,可以在NCBI等专业数据库中查到。
本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索,最终从CHI3L1蛋白的氨基酸序列中筛选得到两种具有良好的抗原性的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2),CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的氨基酸链片段如下所示:
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr;
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp;
其中,CHI3L1抗原表位肽(1)是CHI3L1蛋白N端第121至129位的一段含9个氨基酸的肽段加Y(即Tyr)、R(即Arg)两个亲水氨基酸而成;CHI3L1抗原表位肽(2)是CHI3L1蛋白N端第175至186位的一段含12个氨基酸的肽段加Y、R两个亲水氨基酸而成;上述两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。
目前,本发明研究发现,本发明的CHI3L1抗原表位肽具有如下功能:
1.具有抗原性;2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体;3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与CHI3L1结合。
本发明的CHI3L1抗原表位肽的制备方法可用化学合成法:利用美国ABI431A型多肽自动合成仪,通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1363.61、1451.62,并可用质谱进行确定,可通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度用高效液相色谱进行评定,并测定抗原表位肽的浓度。
二、CHI3L1抗原
本发明还提供了一种CHI3L1抗原,通过使用CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成,或通过使用CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。
具体而言,本发明提供了CHI3L1抗原(1)和(2);所述CHI3L1抗原(1)通过使本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成;所述CHI3L1抗原(2)通过使本发明的CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成;本发明的CHI3L1抗原(1)和CHI3L1抗原(2)具有免疫原性和特异性,是一种免疫原,可用来免疫动物从而制备特异性的CHI3L1抗体;在本发明中,可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等;由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强,结合位点多,免疫效果较好,并且与免疫动物亲缘关系较远,用其作为载体蛋白不易引起交叉反应,因此是优选的。
三、CHI3L1单克隆抗体、CHI3L1多克隆抗体和CHI3L1体外诊断试剂盒
本发明还提供了CHI3L1单克隆抗体和CHI3L1多克隆抗体,其是由所述的CHI3L1抗原(1)或CHI3L1抗原(2)(免疫原)制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。这些单克隆抗体和多克隆抗体可采用本领域的常规技术方法来制备,示例性的方法可参见实施例2。
本发明的CHI3L1抗体可以用于制备CHI3L1体外诊断试剂盒,该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的CHI3L1进行检测,优选对血液标本中的CHI3L1进行检测。
因此,本发明提供了一种CHI3L1体外诊断试剂盒,其包含所述的CHI3L1单克隆抗体或多克隆抗体。
目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种:ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。
而ELISA法包括以下几种类型:双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测CHI3L1蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。
优选的是,所述CHI3L1体外诊断试剂盒采用本发明的CHI3L1单克隆抗体作为包被抗体。在此,术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体;此外,所述CHI3L1体外诊断试剂盒还优选包含CHI3L1多克隆抗体以作为结合抗体,其中,当所述结合抗体来源于本发明的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)中的一者时,所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者;在此,术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体;所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体,该第二抗体可以为羊抗兔IgG抗体,所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
在本发明的试剂盒中,还可以包含检测所需的任何试剂或工具,例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。
用本发明的CHI3L1体外诊断试剂盒对血清标本进行检测,结果显示,肝病患者和健康对照组相比,血清CHI3L1浓度有显著差异;而肝纤维化、肝硬化、肝癌患者之间血清CHI3L1浓度也有明显差异。说明血清CHI3L1水平可用于肝病诊断,并和肝病严重程度呈正相关。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而,本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明,而不是限制本发明。
以下通过各实施例进一步解释或说明本发明的内容:除非另有说明,以下所述溶液均为水溶液;在涉及百分数时,以液体/液体配制的混合物料百分数均为体积/体积百分数,以固体/液体配制的混合物料的百分数均为质量/体积百分数,以固体/固体配制的混合物料的百分数均为质量/质量百分数。
CN111197040A(申请号2020100721960,亿彤生物)案使用到的一些如下典型原材
料必要时亦可用于本发明:
HMP树脂(HMP resin,P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂,购自Sigma-Aldrich公司),
Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸,根据多肽合成的需要提供,购自Merck公司),
NMP(氮甲基吡咯烷酮,购自Sigma-Aldrich公司),
DCM(二氯甲烷,购自中原化工公司),
MeOH(甲醇,购自中原化工公司),
Piperidine(哌啶,购自Sigma-Aldrich公司),
DMAP(二甲基氨基吡啶,购自Sigma-Aldrich公司),
HOBT(羟基苯并三唑,购自Sigma-Aldrich公司),
DCC(二环已基碳二亚胺,购自Sigma-Aldrich公司),
TFA(三氟乙酸,购自Sigma-Aldrich公司),
EDT(1,2-乙二硫醇,购自Sigma-Aldrich公司),
硫代苯甲醚,购自广州伟伯化工有限公司,
结晶苯酚,购自国药集团化学试剂有限公司,
乙腈,购自国药集团化学试剂有限公司。
未提及的原材料亦均是容易从市场购得的。
CN111197040A(申请号2020100721960,亿彤生物)案使用到的一些如下典型仪器
必要时亦可用于本发明:
多肽自动合成仪,型号431A,购自ABI公司,
旋转蒸发仪,型号R-201,购自上海申顺公司,
高效液相色谱仪,Waters600,购自美国Waters公司,
冷冻干燥机,型号VFD-2000,购自北京博医康公司。
本发明未提及的仪器设备亦均是容易从市场购得的。
实施例1:CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的制备
如CN111197040A(申请号2020100721960,亿彤生物)之实施例1所述,记载了制备CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的过程,并得到了相应纯度的两种目标肽。
实施例11:CHI3L1抗原表位肽(1)的制备
本发明尤其是实施例11和实施例12等使用的Rink Amide-MBHA树脂和Fmoc-AA-OH均购自吉尔生化公司,HBTU、HOBT、DIEA等试剂购自阿拉丁试剂公司,其它试剂亦可容易的通过市售途径获得,例如CN111197040A(申请号2020100721960,亿彤生物)之实施例1所述。
本实施例11使用经典的方法制备本发明以下CHI3L1抗原表位肽(1):
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr。
在以下各制备步骤中,使用氨基酸(Fmoc-AA-OH):肽偶联剂HBTU:酰胺键形成促进剂HOBT:有机碱DIEA四者的摩尔比均为1:1:1:4;
溶剂用量根据经验和具体操作掌握,例如10g树脂中清洗、脱帽反应、偶联反应中溶剂用量为50~150ml,特别是在清洗时每次用尽量少的溶剂。
步骤1:Fmoc-Thr(tBu)-树脂的制备
本步骤中,取Rink Amide-MBHA树脂(0.79mmol/g)10g和30mmol(11.93g)的Fmoc-Thr(tBu)-OH投料。
将Rink Amide-MBHA树脂置反应器中,加入二氯甲烷80ml,振荡并浸泡60分钟,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,每次各80ml,抽滤以除去溶剂。
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。(上述茚三酮检测亦称为KT检测,取微量的1~2mg树脂检测即可,下同)。将规定比例的Fmoc-Thr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤1所得标题树脂即Fmoc-Thr(tBu)-树脂经检测偶联率为0.91。该树脂全部用于后续的反应步骤(下同)。
步骤2:Fmoc-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
参考步骤1的操作方法,取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料;
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤3:Fmoc-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.92。
步骤4:Fmoc-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Phe-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤5:Fmoc-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤6:Fmoc-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.91。
步骤7:Fmoc-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤8:Fmoc-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.92。
步骤9:Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤10:Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤11:Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂的制备
参考步骤2的操作方法,取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH投料;
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇(其量是DIEA的6%,以摩尔百分数计),搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂,经检测其偶联率为0.91。
至上述步骤11接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥过夜,称重,得保护的十一肽树脂。
步骤12:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至500ml的圆底烧瓶,加入100ml预冷切割液(95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水),室温搅拌反应2小时,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂2次,每次20ml,合并滤液和洗涤液;加冰冻乙醚1200ml使沉淀4小时,过滤得沉淀物,即为十一肽的粗品。
步骤13:分离纯化
(1)将上一步骤所得肽粗品溶于70%乙腈(含0.1%三氟乙酸),用离子交换色谱系统Shodex IEC SP-420N(北京谱朋)以70%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为溶剂进行洗脱,收集肽主峰流分;
(2)使用如下高效液相色谱法,对上述肽主峰进行分离纯化:
色谱柱:C8,10×100mm,购自美国Waters公司;
色谱仪:YMC工业制备液相色谱;
流动相:流动相A为0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液,流动相B为添加0.1%TFA(三氟乙酸)的70%乙腈,洗脱梯度为0~45分钟期间15%B-60%B;
流速:4ml/分钟;
检测波长:214nm;
(3)将收集所得主峰流动相,浓缩,用冷冻干燥机冻干,得到肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(1),或称为肽(1)。
经【HPLC纯度测定法】纯度和含量测定,从步骤1之10g树脂起始投料至终产物肽精制品的13个步骤,经计算,总收率为31.1%,该肽精制品纯度为98.3%。
根据上述结果可见,与CN111197040A使用多肽自动合成仪只能一次合成小批量肽相比,本实施例11可以一次性大批量制备多肽,并且其收率满意、多肽纯度高、分子量与理论值相同、序列与目标值相同。
【HPLC纯度测定法】:
本法使用HPLC测定CHI3L1肽的纯度,主要测定条件如下:
色谱柱:C18,4.6×150mm,Waters公司,
色谱仪:Agilent 1260型高效液相色谱仪,安捷伦,
流动相:0.1%TFA水溶液为流动相A,含0.1%TFA的乙腈为流动相B,洗脱梯度为30分钟期间0-60%B,
流速:1ml/分钟,
检测波长:214nm。
【多肽分子量的质谱测定法】:
本法使用质谱测定本发明所得多肽的分子量,主要测定条件如下:
(1)试剂原料:TFA(三氟乙酸,购自Sigma-Aldrich公司),HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸,购自Sigma-Aldrich公司),乙腈(购自国药集团化学试剂有限公司);
(2)仪器:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号:REFLEXIII,德国Bruker公司);
(3)基质液:将α-CCA溶于含0.1%TFA的50%ACN溶液中,制成饱和溶液,离心,取上清;
(4)仪器检测条件:反射检测方式;飞行管长3m;氮激光器:波长337nm,加速电压20KV;反射电压23KV;
(5)操作步骤:取10μL纯化多肽样品(用乙腈溶解制成50mg/ml浓度),与10μL基质液混合,取1μL点在样品靶上,送入离子源中进行检测。
结果:实施例11所得CHI3L1抗原表位肽(1)的分子量1361.34,实施例12所和CHI3L1抗原表位肽(2)的分子量为1451.93,与它们的理论分子量1361.76、1451.62均一致,证明合成多肽即为目的产物。
【多肽序列测定法】:
本法使用多肽氨基酸序列分析仪,测定本发明所得多肽的氨基酸序列,主要测定条件/操作如下:
(1)原理:多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,是一个循环式的化学反应过程,包括三个主要的化学步骤:
偶联:异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽;
环化裂解:PTC-肽环化裂解;
转化:噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸),留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程,整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行;
(2)仪器:美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪;
(3)试剂原料:异硫氰酸苯酯PITC(Sigma-Aldrich公司),正庚烷(国药集团化学试剂有限公司),三甲胺TMA水溶液(国药集团化学试剂有限公司),三氟乙酸(TFA,Sigma-Aldrich公司),乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司),氯丁烷(Sigma-Aldrich公司),乙腈(国药集团化学试剂有限公司);
(4)测定:按仪器说明书进行。
结果,经鉴定,实施例11和实施例12所得CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为:
(1)Y-R-K-S-V-P-P-F-L-R-T;
(2)Y-R-S-A-A-L-S-A-G-K-V-T-I-D。
上述结果与两个实施例制备的目标合成肽段一致。
实施例11a:参照本文实施例11之步骤1~步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,未添加氨丁三醇,制得11种标题树脂;经检测,步骤1~步骤10标题树脂的偶联率均在0.88~0.92范围内例如步骤10标题树脂偶联率=0.89,而步骤11标题树脂偶联率=0.65。
实施例11b:参照本文实施例11之步骤1~步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(PO3H2)-OH,制得11种标题树脂;经检测,步骤1~步骤10标题树脂的偶联率均在0.88~0.91范围内例如步骤10标题树脂偶联率=0.90,而步骤11标题树脂偶联率=0.61。
实施例11c:参照本文实施例11之步骤1~步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,制得11种标题树脂;经检测,步骤1~步骤10标题树脂的偶联率均在0.89~0.92范围内例如步骤10标题树脂偶联率=0.90,而步骤11标题树脂偶联率=0.70。
实施例11d:参照本文实施例11之步骤1~步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr-OH,制得11种标题树脂;经检测,步骤1~步骤10标题树脂的偶联率均在0.88~0.91范围内例如步骤10标题树脂偶联率=0.88,而步骤11标题树脂偶联率=0.73。
实施例11e:参照本文实施例11之步骤1~步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Me)-OH,制得11种标题树脂;经检测,步骤1~步骤10标题树脂的偶联率均在0.89~0.92范围内例如步骤10标题树脂偶联率=0.89,而步骤11标题树脂偶联率=0.64。
实施例11f:参照本文实施例11b、实施例11c、实施例11d、实施例11e之步骤11的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤11中,未添加氨丁三醇,制得4种标题树脂;经检测,此步骤11所得4种标题树脂的偶联率均在0.64~0.69范围内例如参照实施例11b时所得步骤11标题树脂偶联率=0.67。
根据上述实施例11a~11f的结果以及实施例11的结果,出人意料的发现,在肽链中接入氨基酸Tyr时,使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH并且在反应溶剂中同时添加6%的氨丁三醇可以显著提高偶联率,而不使用氨丁三醇或者改用其它保护形式的Tyr则偶联率显著更低。
实施例12:CHI3L1抗原表位肽(2)的制备
本实施例12使用经典的方法制备本发明以下CHI3L1抗原表位肽(2):
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp。
在以下各制备步骤中,使用氨基酸(Fmoc-AA-OH):肽偶联剂HBTU:酰胺键形成促进剂HOBT:有机碱DIEA四者的摩尔比均为1:1:1:4;
溶剂用量根据经验和具体操作掌握,例如10g树脂中清洗、脱帽反应、偶联反应中溶剂用量为50~150ml,特别是在清洗时每次用尽量少的溶剂。
步骤1:Fmoc-Asp(OtBu)-树脂的制备
本步骤中,取Rink Amide-MBHA树脂(0.79mmol/g)10g和30mmol(12.34g)的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料。
将Rink Amide-MBHA树脂置反应器中,加入二氯甲烷80ml,振荡并浸泡60分钟,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,每次各80ml,抽滤以除去溶剂。
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。(上述茚三酮检测亦称为KT检测,取微量的1~2mg树脂检测即可,下同)。将规定比例的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤1所得标题树脂即Fmoc-Asp(OtBu)-树脂经检测偶联率为0.90。该树脂全部用于后续的反应步骤(下同)。
步骤2:Fmoc-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
参考步骤1的操作方法,取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ile-OH投料;
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂,经检测其偶联率为0.91。
步骤3:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤4:Fmoc-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.88。
步骤5:Fmoc-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.91。
步骤6:Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤7:Fmoc-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤8:Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤9:Fmoc-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤10:Fmoc-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.92。
步骤11:Fmoc-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤12:Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
步骤13:Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(Ot Bu)-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得标题树脂,经检测其偶联率为0.89。
步骤14:Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂的制备
参考步骤2的操作方法,取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH投料;
向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml),室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色,若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇(其量是DIEA的6%,以摩尔百分数计),搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;KT检测应显黄色,若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂,经检测其偶联率为0.90。
至上述步骤14接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥过夜,称重,得保护的十四肽树脂。
步骤15:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至500ml的圆底烧瓶,加入120ml预冷切割液(95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水),室温搅拌反应2小时,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂2次,每次20ml,合并滤液和洗涤液;加冰冻乙醚1200ml使沉淀5小时,过滤得沉淀物,即为十四肽的粗品。
步骤16:分离纯化
(1)将上一步骤所得肽粗品溶于70%乙腈(含0.1%三氟乙酸),用离子交换色谱系统Shodex IEC SP-420N(北京谱朋)以70%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为溶剂进行洗脱,收集肽主峰流分;
(2)使用如下高效液相色谱法,对上述肽主峰进行分离纯化:
色谱柱:C8,10×100mm,购自美国Waters公司;
色谱仪:YMC工业制备液相色谱;
流动相:流动相A为0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液,流动相B为0.1%TFA(三氟乙酸)于70%乙腈,洗脱梯度为0~45分钟期间15%B-60%B;
流速:4ml/分钟;
检测波长:214nm;
(3)将收集所得主峰流动相,浓缩,用冷冻干燥机冻干,得到肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(2),或称为肽(2)。
经【HPLC纯度测定法】纯度和含量测定,从步骤1之10g树脂起始投料至终产物肽精制品的16个步骤,经计算,总收率为28.3%,该肽精制品纯度为98.7%。
实施例12a:参照本文实施例12之步骤1~步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,未添加氨丁三醇,制得14种标题树脂;经检测,步骤1~步骤13标题树脂的偶联率均在0.89~0.91范围内例如步骤13标题树脂偶联率=0.90,而步骤14标题树脂偶联率=0.67。
实施例12b:参照本文实施例12之步骤1~步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(PO3H2)-OH,制得14种标题树脂;经检测,步骤1~步骤13标题树脂的偶联率均在0.88~0.92范围内例如步骤13标题树脂偶联率=0.91,而步骤14标题树脂偶联率=0.60。
实施例12c:参照本文实施例12之步骤1~步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,制得14种标题树脂;经检测,步骤1~步骤13标题树脂的偶联率均在0.88~0.90范围内例如步骤13标题树脂偶联率=0.90,而步骤14标题树脂偶联率=0.65。
实施例12d:参照本文实施例12之步骤1~步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr-OH,制得14种标题树脂;经检测,步骤1~步骤13标题树脂的偶联率均在0.89~0.92范围内例如步骤13标题树脂偶联率=0.91,而步骤14标题树脂偶联率=0.69。
实施例12e:参照本文实施例12之步骤1~步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Me)-OH,制得14种标题树脂;经检测,步骤1~步骤13标题树脂的偶联率均在0.89~0.91范围内例如步骤13标题树脂偶联率=0.90,而步骤14标题树脂偶联率=0.62。
实施例12f:参照本文实施例12b、实施例12c、实施例12d、实施例12e之步骤14的操作制备各种肽树脂,不同的仅是,步骤14中,未添加氨丁三醇,制得4种标题树脂;经检测,此步骤14所得4种标题树脂的偶联率均在0.61~0.68范围内例如参照实施例12b时所得步骤14标题树脂偶联率=0.65。
根据上述实施例12a~12f的结果以及实施例12的结果,出人意料的发现,在肽链中接入氨基酸Tyr时,使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH并且在反应溶剂中同时添加6%的氨丁三醇可以显著提高偶联率,而不使用氨丁三醇或者改用其它保护形式的Tyr则偶联率显著更低。
下文的具体实验中,若未另外说明,所使用的抗原表位肽(1)和(2)分别是由实施例11和实施例12制得。
实施例21:制备CHI3L1抗原(1)和(2)
本实施例分别将实施例11和实施例12所得的CHI3L1抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备CHI3L1抗原(1)和(2),制备过程如下:
用BDB(Bis-diazotized benzidine dichloride,双重氮化联苯胺二氯化物)法将CHI3L1肽(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白,keyhole limpet haemocyanin)连接制备成CHI3L1抗原(1)和(2);
取CHI3L1肽(1)或(2)10.0mg,用1ml的0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解;将10mg的KLH用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解;然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的BDBCl2,室温下反应1.5h,透析过夜(12~15小时)后分装,-20℃保存(必要时可以冷冻干燥),由此制得肽(1)-KLH偶联蛋白和肽(2)-KLH偶联蛋白,分别为CHI3L1抗原(1)和CHI3L1抗原(2)。
在本实施例中,PBS缓冲液的配方为:0.2mol/L的Na2HPO4 81ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合而成;硼酸盐缓冲液的配方为:0.05mol/L硼砂80ml,加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。
【Bradford法】:将偶联后的抗原稀释成不同浓度(根据预试验使得A595吸光度在落在标准曲线系列浓度的吸光度范围内);在每个样本和KLH标准蛋白溶液中取0.1ml加5ml的Bradford染液,室温反应5-30min,测定A595值;CHI3L1抗原表位肽为小肽,其连接在KLH上成为蛋白质之一部分增加了蛋白浓度;A595超出部分为CHI3L1抗原表位肽的浓度,由此计算偶联蛋白结合比(肽/KLH值)。上述方法中,Bradford染液:取100mg考马斯亮兰G-250溶于50ml的96%乙醇溶液中,加入100ml磷酸,加水至200ml定容;KLH标准曲线:精密称取适量KLH使其溶于PBS(10mM,pH7.4)中,用PBS稀释制成最终浓度分别为50、100、200、300、400、500、600g/L的系列溶液。本发明所述【Bradford法】可用于测定偶联蛋白结合比。已知KLH的相对分子量不易确定,本发明使用Bradford法测定并计算上述两种偶联蛋白的结合比;Bradford法(考马斯亮蓝法)是本领域经典的蛋白质定量方法,该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,最小可测2.5μg/mL蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法;Bradford法的原理是,考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红色的溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。
使用【Bradford法】,测得本实施例所得之肽(1)/KLH的偶联蛋白结合比=4.73、肽(2)/KLH的偶联蛋白结合比=4.58。
实施例21a:制备CHI3L1抗原(1)和(2)
参照实施例21,不同的仅是将所用的硼酸盐缓冲液改为等体积的碳酸盐缓冲液,制得肽(1)-KLH偶联蛋白和肽(2)-KLH偶联蛋白,分别为CHI3L1抗原(1)和(2);所用碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵、0.12g亚硝酸钠,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。使用【Bradford法】,测得本实施例所得之肽(1)/KL H的偶联蛋白结合比=8.37、肽(2)/KLH的偶联蛋白结合比=8.17。
实施例21b:制备CHI3L1抗原(1)和(2)
参照实施例21,不同的仅是将所用的硼酸盐缓冲液改为等体积的碳酸盐缓冲液,制得肽(1)-KLH偶联蛋白和肽(2)-KLH偶联蛋白,分别为CHI3L1抗原(1)和(2);所用碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。使用【Bradford法】,测得本实施例所得之肽(1)/KLH的偶联蛋白结合比=4.93、肽(2)/KLH的偶联蛋白结合比=4.74。
实施例21c:制备CHI3L1抗原(1)和(2)
参照实施例21,不同的仅是将所用的硼酸盐缓冲液改为等体积的碳酸盐缓冲液,制得肽(1)-KLH偶联蛋白和肽(2)-KLH偶联蛋白,分别为CHI3L1抗原(1)和(2);所用碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.12g亚硝酸钠,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。使用【Bradford法】,测得本实施例所得之肽(1)/KLH的偶联蛋白结合比=4.82、肽(2)/KLH的偶联蛋白结合比=4.66。
根据上述实施例21以及实施例21a、实施例21b、实施例21c的结果,出人预料的发现,使用包含丙酮酸铵和亚硝酸钠的50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液,能够显著提高肽/KLH的偶联蛋白结合比。
实施例22:制备单克隆抗体、多克隆抗体
本实施例利用实施例21所得抗原(1)和(2)分别免疫动物,从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体;
1.免疫动物制备单克隆抗体:
1.1.取上述实施例21制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后,免疫Balb/c小鼠(福建医科大学实验动物中心),50μg抗原/只,皮下多点注射;4周后测血清效价,选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫:取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后,抗原剂量25μg/只,皮下多点注射,加强免疫的次数为6次,融合前连续加强免疫两次,之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合,并用HAT条件培养基(购自Sigma-Aldrich公司)选择培养;融合后放入CO2培养箱中37℃培养9~11天后,孔内出现较大的细胞克隆;11天开始用间接ELISA进行筛选;对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖),之后扩增细胞、冻存、制备腹水。
1.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自Sigma-Aldrich公司)0.5ml/只处理,一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只,10天后收集腹水。
1.3.测定抗体效价:用间接ELISA方法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价,结果显示单抗的效价达到1:33500。
利用CHI3L1抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:32400。
2.免疫动物制备多克隆抗体:
2.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物;基础免疫中,将1-2mg上述实施例21制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射;每隔4周加强免疫一次,抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后,以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。
2.2.测定抗体效价:
用间接ELISA法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价,结果显示抗体效价达到1:33600;
利用CHI3L1抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:32800。
2.3.取血及分离血清:颈动脉插管取血,分离血清。
3.分离纯化抗体:腹水或血清经硫酸铵沉淀后,再经Protein G(购自Sigma-Aldrich公司)亲和纯化。
4.抗体分装后冻干,低温保存。
实施例22a:制备单克隆抗体、多克隆抗体
本实施例利用实施例21a所得抗原(1)和(2)分别免疫动物,从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体;
1.免疫动物制备单克隆抗体:
1.1.取上述实施例21a制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后,免疫Balb/c小鼠(福建医科大学实验动物中心),30μg抗原/只,皮下多点注射;4周后测血清效价,选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫:取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后,抗原剂量15μg/只,皮下多点注射,加强免疫的次数为6次,融合前连续加强免疫两次,之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合,并用HAT条件培养基(购自Sigma-Aldrich公司)选择培养;融合后放入CO2培养箱中37℃培养9~11天后,孔内出现较大的细胞克隆;11天开始用间接ELISA进行筛选;对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖),之后扩增细胞、冻存、制备腹水。
1.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自Sigma-Aldrich公司)0.5ml/只处理,一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只,10天后收集腹水。
1.3.测定抗体效价:用间接ELISA方法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价,结果显示单抗的效价达到1:33800。
利用CHI3L1抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:32100。
2.免疫动物制备多克隆抗体:
2.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物;基础免疫中,将1-2mg上述实施例21a制备的CHI3L1抗原(1)和(2)(免疫原)分别与弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射;每隔4周加强免疫一次,抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后,以60μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。
2.2.测定抗体效价:
用间接ELISA法测定利用CHI3L1抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价,结果显示抗体效价达到1:33300;
利用CHI3L1抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定,其效价也达到1:33100。
2.3.取血及分离血清:颈动脉插管取血,分离血清。
3.分离纯化抗体:腹水或血清经硫酸铵沉淀后,再经Protein G(购自Sigma-Aldrich公司)亲和纯化。
4.抗体分装后冻干,低温保存。
实施例3:人CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定
以ELISA进行检测,分别以层粘蛋白LN、壳三糖酶Chit1、透明质酸HA、Ⅲ型前胶原PCⅢ、Ⅳ胶原CⅣ(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被ELISA板,通过ELISA分别检测实施例22所制备的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)与该人CHI3L1蛋白的特异性反应,以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照,PBS液作空白对照;结果:CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)分别只与CHI3L1反应为阳性(P/N>2.1),而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性,说明本发明的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)均具有特异性。
实施例3a:参照实施例3的方法,通过ELISA分别检测实施例22a所制备的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)与该人CHI3L1蛋白的特异性反应,以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照,PBS液作空白对照;结果:CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)分别只与CHI3L1反应为阳性(P/N>2.1),而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性,说明本发明的CHI3L1单克隆抗体(1)和(2)均具有特异性。
实施例4:人CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定
利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法对实施例22所制备的CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)进行鉴定;结果显示:CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别与CHI3L1反应为阳性(P/N>2.1),而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性,说明本发明的CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。
实施例4a:参照实施例4的方法,对实施例22a所制备的CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)进行鉴定;结果显示:CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别与CHI3L1反应为阳性(P/N>2.1),而与LN、酶Chit1、HA、PCⅢ、CⅣ反应均为阴性,说明本发明的CHI3L1多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。
实施例5:利用CHI3L1单克隆抗体和CHI3L1多克隆抗体制备CHI3L1体外诊断试剂
盒
在本实施例中,将实施例22中利用CHI3L1抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体,
将实施例22中利用CHI3L1抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为本试剂盒中的结合抗体。
1、CHI3L1体外诊断试剂盒的组成如下:
(A)预包被板,每孔预包被有0.1μg的CHI3L1单克隆抗体(1)[48/96孔板,其制法是:将CHI3L1单克隆抗体(1)溶于pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液中,制成预包被液;在酶标板上每孔按0.1μg/孔加入100μl预包被液,置4℃放置18-24小时,取出,甩掉包被液,洗涤,经BSA封闭16小时、干燥,置铝箔袋中抽真空密封,即得预包被板;此板通常置于4℃保存;所述pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液亦称为包被缓冲液,其制法/配方是:16.0克Na2CO3、29.0克NaHCO3、蒸馏水溶至1000ml];
(B)CHI3L1校准品,其为系列浓度的重组人YKL-40/CHI3L1蛋白溶液[购自abcam公司,7个系列浓度,每个1.0ml的校准品溶液,浓度分别为25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml];
(C)结合抗体,为CHI3L1多克隆抗体(2)的溶液[其是0.5μg/100μl的浓度,用酶标记物稀释液作为溶剂溶解和/或稀释,每个试剂盒中提供结合抗体的溶液10ml;所述酶标记物稀释液的制法/配方是:10ml的10×PBS-吐温20溶液、20ml的FCS(小牛血清)、1克酶稳定剂(DCE0061A,上海西宝)、1ml生物防腐剂(Proclin 300,上海西宝)、蒸馏水溶至1000ml];
(D)酶联物,为辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体溶液[ZB-2301(80μg/200μl,中杉金桥)辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体经用酶标记物稀释液以1:5000稀释制成,10ml];
(E)10×洗涤缓冲液,为10×PBS-吐温20溶液[其制法/配方是:58克Na2HPO4·12H2O、4克KH2PO4、100克NaCl、4克KCl、20ml吐温20、蒸馏水溶至1000ml,其pH7.2;其在使用时用蒸馏水稀释10倍,每个试剂盒中提供10×洗涤缓冲液20ml];
(F)显色剂A[其制法/配方是:35.5克柠檬酸、10克过氧化脲、10ml吐温20、蒸馏水溶至1000ml,每个试剂盒中提供显色剂A为6ml];
(G)显色剂B[其制法/配方是:120克柠檬酸、1克EDTA-2Na、2克TMB·2HCl、蒸馏水溶至1000ml,每个试剂盒中提供显色剂B为6ml];
(H)终止液,为2M硫酸溶液[其制法/配方是:22.2ml浓硫酸(96%)、177.3ml蒸馏水,配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中,边加边摇匀,每个试剂盒中提供终止液为6ml]。
以上显色剂B中的TMB·2HCl为3,3'5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐,其是一种常用的过氧化物酶的敏感显色底物。
2、试剂盒的操作步骤:
(a)在预包被板的各孔中分别加入待检血样以及CHI3L1校准品100μl/孔,均为双孔,37℃孵育60分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干;
(b)在各孔内加入CHI3L1结合抗体100μl/孔,37℃孵育30分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干;
(c)再在各孔内加入酶联物100μl/孔,37℃孵育30分钟,用1×洗涤缓冲液洗涤5次,拍干;
(d)加入显色剂A、B液,每孔各50μl,混匀,37℃孵育15分钟;
(e)加终止液50μl/孔终止反应,用酶联检测仪在双波长450nm和620nm处检测吸光度。
3、结果:
使用各浓度校准品测定其平均吸光度(n=6),以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线,根据标准曲线计算所检测的样本中的CHI3L1浓度。
对取自33例健康志愿者血清、46例肝病患者血清(某医院提供的确诊/治疗患者的样品)进行血清CHI3L1检测,肝病患者血清中的CHI3L1水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01),肝病不同组之间CHI3L1水平也有明显差异,见下表。
表:四组血清样本中的CHI3L1浓度
组别 | 人数 | CHI3L1浓度(ng/ml) |
肝纤维化 | 19 | 92.3±13.8 |
肝硬化 | 14 | 127.1±27.3 |
肝癌 | 13 | 294.3±34.7 |
对照组 | 33 | 35.8±8.7 |
上表数据是校准品和样品在步骤(e)加终止液后立即于2分钟之内测定吸光度并经计算所得结果。本实施例显色剂B中的TMB·2HCl为3,3'5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐,其是一种常用的过氧化物酶的敏感显色底物;本实施例所用酶联检测仪的型号为RT-6000(雷杜公司)。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.制备CHI3L1抗原的方法,该抗原通过使CHI3L1抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成,或通过使CHI3L1抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成;所述CHI3L1抗原表位肽(1)和CHI3L1抗原表位肽(2)的氨基酸链片段分别为:
(1)Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg-Thr,
(2)Tyr-Arg-Ser-Ala-Ala-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-Val-Thr-Ile-Asp;
制备该CHI3L1抗原的方法包括如下步骤:取CHI3L1抗原表位肽(1)或CHI3L1抗原表位肽(2)10.0mg,用1ml的0.1M的pH7.4的PBS缓冲液溶解;将10mg的KLH用碳酸盐缓冲液20ml溶解;然后将两者混合,冷却至0℃,加入110μL的双重氮化联苯胺二氯化物,室温下反应1.5h,透析12~15小时,即得CHI3L1抗原;
其中,
所述碳酸盐缓冲液以如下方式配制:称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵、0.12g亚硝酸钠,加水溶解,并用水定容至1000ml,得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液;
所述抗原表位肽(1)和抗原表位肽(2)是以如下方式接入Tyr的:
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂即保护的十一肽树脂;以及
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂即保护的十四肽树脂;
在制备肽(1)或肽(2)之接入Tyr的过程中,所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4,氨丁三醇的量是DIEA的6%,以摩尔百分数计。
2.根据权利要求1的方法,其中所述PBS缓冲液是由0.2mol/L的Na2HPO4 81ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合制成。
3.根据权利要求1的方法,其中肽(1)是通过如下方法制备得到的:
步骤1:Fmoc-Thr(tBu)-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中,加入二氯甲烷,振荡并浸泡,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,抽滤以除去溶剂,
向以上处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,
将30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Thr(tBu)-树脂;
步骤2:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤3:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤4:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Phe-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤5:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤6:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤7:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤8:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤9:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤10:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂;
步骤11:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Arg(Tos)-Thr(tBu)-树脂即保护的十一肽树脂;所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4,氨丁三醇的量以摩尔百分数计是DIEA的6%;
步骤12:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶,加入预冷切割液,室温搅拌反应,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂,合并滤液和洗涤液,加冰冻乙醚使沉淀,过滤得沉淀物,即为十一肽的粗品;
步骤13:依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化,得肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(1)。
4.根据权利要求3的方法,步骤12所述预冷切割液的组成为:95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水。
5.根据权利要求3的方法,步骤1~步骤11中,各步骤所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
6.根据权利要求1的方法,其中肽(2)是通过如下方法制备得到的:
步骤1:Fmoc-Asp(OtBu)-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中,加入二氯甲烷,振荡并浸泡,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,抽滤以除去溶剂,
向以上处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,
将30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Asp(OtBu)-树脂;
步骤2:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,制得Fmoc-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤3:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤4:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤5:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤6:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤7:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤8:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂,
步骤9:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Leu-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤10:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤11:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤12:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤13:取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料,参考步骤2的操作方法,制得Fmoc-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂;
步骤14:向上一步骤所得树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液,室温下振荡进行脱帽反应,去掉氮端Fmoc保护基,抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,并抽滤除去溶剂,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应,抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,抽滤除去溶剂,接肽反应结束后,滤取树脂,放入真空干燥器内干燥,得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Ser(tBu)-Ala-Ala-Leu-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Val-Thr(tBu)-Ile-Asp(OtBu)-树脂即保护的十四肽树脂;所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4,氨丁三醇的量以摩尔百分数计是DIEA的6%;
步骤15:肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶,加入预冷切割液,室温搅拌反应,抽滤使分取滤液,用三氟乙酸洗涤树脂2次,合并滤液和洗涤液,加冰冻乙醚1200ml使沉淀5小时,过滤得沉淀物,即为十四肽的粗品;
步骤16:依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化,得到肽精制品,即为CHI3L1抗原表位肽(2)。
7.根据权利要求6的方法,其中步骤15所述预冷切割液的组成为:95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水。
8.根据权利要求6的方法,步骤1~步骤14中,各步骤所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4。
9.根据权利要求6的方法,其中:
步骤1中,处理Rink Amide-MBHA树脂时,加入二氯甲烷80ml,振荡并浸泡60分钟,用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次,每次各80ml,抽滤以除去溶剂;
步骤1中,向处理的树脂中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂;
步骤1中,将30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;
步骤2中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂;
步骤2中,将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;
步骤14中,加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml,室温下振荡进行脱帽反应60分钟,去掉氮端Fmoc保护基;抽滤除去溶剂后,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,并抽滤除去溶剂;或者,
步骤14中,将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解,加入DIEA和氨丁三醇,搅匀,移入包含上述经处理树脂的反应器中,室温振荡反应1小时;抽滤除去反应液,再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次,每次各80ml,抽滤除去溶剂;所用的Fmoc保护氨基酸:HBTU:HOBT:DIEA的摩尔比=1:1:1:4,氨丁三醇的量以摩尔百分数计是DIEA的6%。
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