CN105669835B - 人ApoE-ε4抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人ApoE‑ε4抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒。本发明的人ApoE‑ε4抗原表位肽的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。本发明的ApoE‑ε4抗原由人ApoE‑ε4抗原表位肽与蛋白载体偶联制得。本发明的人ApoE‑ε4单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的ApoE‑ε4抗原制得。本发明的人ApoE‑ε4单克隆抗体或多克隆抗体用于制备人ApoE‑ε4体外诊断试剂盒。本发明的人ApoE‑ε4抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人ApoE‑ε4的体外检测。

Description

人ApoE-ε4抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人载脂蛋白E-ε4(ApoE-ε4)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的ApoE-ε4特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人ApoE-ε4体外诊断试剂盒上的应用，人ApoE-ε4体外诊断试剂盒，以及一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)是一种原发性大脑退行性疾病，已经成为人类继心血管病、癌症、中风之后的第四大杀手。按目前的医疗水平，对于AD的治疗，只能延缓早期患者的病情发展，对中晚期的患者尚无有效的治疗方法。因此，早期诊断、早期干预、延缓病情发展成为AD治疗的关键。近年来，对老年性痴呆早期诊断的研究已经引起许多研究者的注意，寻找一种有效的、可靠的、非侵入式的、生化检测手段是众多研究者的共同心愿。ApoE-ε4就是这样的一种生化标志物。

ApoE是研究较多的基因，也是影响老化途径的最重要的遗传因素之一，ApoE-ε4基因携带者是公认的AD致病因素。研究发现，19号染色体上的载脂蛋白E(ApoE)基因的ε4等位基因是AD的准风险因子,且二者之间存在着剂量依赖效应。因此，通过在血清中检测载脂蛋白E，可以判断AD。因此，ApoE-ε4有希望作为AD诊断的标志物。

检测血清中的ApoE水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具有免疫原性的ApoE抗原表位肽、制备特异性的ApoE抗原及抗体即成了重点。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人ApoE-ε4抗原表位肽，用该抗原表位肽制备的ApoE-ε4特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备人ApoE-ε4试剂盒上的应用，以及人ApoE-ε4体外诊断试剂盒。

具体而言，本发明提供了：

一种人ApoE-ε4抗原表位肽，其中所述ApoE-ε4抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg；

(2)Tyr-Ser-Arg-Thr-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Lys。

本发明还提供了一种ApoE-ε4抗原，其是通过使所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种ApoE-ε4抗原，其是通过使所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人ApoE-ε4抗体，其是由所述的ApoE-ε4抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述ApoE-ε4抗原是通过使所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人ApoE-ε4抗体，其是由所述的ApoE-ε4抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述ApoE-ε4抗原是通过使所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了所述的人ApoE-ε4抗体在制备人ApoE-ε4体外诊断试剂盒上的应用。

本发明还提供了一种人ApoE-ε4体外诊断试剂盒，其包含所述的人ApoE-ε4抗体作为包被抗体，其中所述包被抗体优选为单克隆抗体。

优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的人ApoE-ε4抗体，并且该结合抗体优选为多克隆抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

优选地，所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明的人ApoE-ε4抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

2.用本发明制备的ApoE-ε4单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的ApoE-ε4结合。

3.本发明的人ApoE-ε4体外诊断试剂盒可以有效地检测血清中的ApoE-ε4的水平，可用来判断老年性痴呆。

4.本发明将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人ApoE-ε4蛋白，操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

5.本发明在制备所述人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸的过程中，通过大量的试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的荧光免疫层析试纸进行检测时，荧光信背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测区与质控区的荧光强度比值的变化来反应样品中ApoE-ε4的含量，这与传统的层析技术只考查检测区的绝对荧光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高了检测结果可信度。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、人ApoE-ε4抗原表位肽

本文中所述的人ApoE-ε4蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到。

本发明提供了人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQID No.1和SEQ ID No.2所示，为：

(1)Y-K-V-E-Q-A-V-E-T-E-P-E-P-E-L-R；和

(2)Y-S-R-T-R-D-R-L-D-E-V-K-E-Q-V-A-E-V-R-A-K。

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。

ApoE-ε4抗原表位肽(1)包含人ApoE-ε4蛋白(NCBI登录号AAB59546.1)N端第19位至第33位肽段，并且在该肽段的N段加上一个Y，从而构成ApoE-ε4抗原表位肽(1)。

ApoE-ε4抗原表位肽(2)包含人ApoE-ε4蛋白(NCBI登录号AAB59546.1)C端第241位至第260位的肽段，并且在该肽段的N段加上一个Y，从而构成ApoE-ε4抗原表位肽(2)。

这两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。

目前，本发明研究发现，本发明的ApoE-ε4抗原表位肽具有如下功能：

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人ApoE-ε4结合。

本发明的ApoE-ε4抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为2187.32、2909.12，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

二、ApoE-ε4抗原

本发明还提供了ApoE-ε4抗原，其通过使本发明的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了ApoE-ε4抗原(1)和(2)，所述ApoE-ε4抗原(1)通过使本发明的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述ApoE-ε4抗原(2)通过使本发明的人ApoE-ε4抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的ApoE-ε4抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的ApoE-ε4抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

三、ApoE-ε4单克隆抗体、ApoE-ε4多克隆抗体和人ApoE-ε4体外诊断试剂盒

本发明还提供了人ApoE-ε4单克隆抗体和人ApoE-ε4多克隆抗体，所述抗体可以各自利用本发明的ApoE-ε4抗原(1)或(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。

本发明的ApoE-ε4单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人ApoE-ε4体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的ApoE-ε4进行检测，优选对血液标本中的ApoE-ε4进行检测。

因此，本发明提供了一种人ApoE-ε4体外诊断试剂盒，其包含本发明的人ApoE-ε4单克隆抗体或多克隆抗体。

目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。

而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。

本发明的人ApoE-ε4体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测ApoE-ε4蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。

优选的是，所述人ApoE-ε4体外诊断试剂盒采用本发明的人ApoE-ε4单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人ApoE-ε4体外诊断试剂盒还优选包含人ApoE-ε4多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于本发明的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。

四、用于定量检测人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸

本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人ApoE-ε4蛋白，其中：

所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ApoE-ε4单克隆抗体来源于人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗体夹心法还采用第二ApoE-ε4单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ApoE-ε4单克隆抗体来源于人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg；

(2)Tyr-Ser-Arg-Thr-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Lys。

在本发明中，在双抗体夹心法荧光免疫层析试纸中，“捕获抗体”是指能够首先特异性识别待测抗原的抗体，其通常设置在结合垫上；“检测抗体”是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别识别待测抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固定在反应膜的检测区上。

在本发明中，所述第一ApoE-ε4单克隆抗体可以由第一ApoE-ε4抗原制备而成，该第一ApoE-ε4抗原可以通过使所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成；并且所述第二ApoE-ε4单克隆抗体可以由第二ApoE-ε4抗原制备而成，该第二ApoE-ε4抗原可以通过使所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。

在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

优选地，本发明的荧光免疫层析试纸中所用的荧光微球的粒径为320nm至400nm，优选为360nm，荧光微球上的荧光物质可为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明(可购自上海晶纯公司)。荧光微球的微球材料可以为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或由甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物，其它单体的例子为苯乙烯等。荧光微球的激发波长可以为350～600nm，优选为390nm；发射波长可以为500～700nm，优选为615nm。

在本发明中，荧光微球的最大激发波长与发射波长差值较大，说明荧光微球有较大的斯托克斯(Stokes)位移，这样，荧光试纸的背景干扰较低，以该微球做免疫层析标记物有较强的优势。

在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述样品垫用于在使用时加载待测样品，所述结合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二ApoE-ε4单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体特异性结合的抗抗体。

优选地，本发明的荧光免疫层析试纸的样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸可以沿使用时的层析方向依次搭接设置在底板上。反应膜上间隔设置的检测区和质控区可以为，但不限于，线、带、块等形式，检测区和质控区优选间隔3mm至8mm。

在本发明中，反应膜优选为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜(例如可购自上海杰一，型号GFCP203000)。在本文中，“基本上不发荧光”的含义是指在相应波长(例如大于550nm的波长)的光照下不发射荧光，或者仅发射微量的、不实质上影响检测结果的荧光。此外，底板优选基本上不具有荧光性质，例如为基本上不具有荧光性质的PVC背板(例如可购自上海杰一，型号HF000MC100)。在本文中，“基本上不具有荧光性质”是指不具有荧光性质，或者仅具有低的、不实质上影响检测结果的荧光性质。

通常，常规的层析试纸组件(反应膜、底板等)在550nm波长下具有较明显的荧光背景，这对荧光信号的检测产生很大干扰。本发明通过采用在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜和低荧光性质的底板，从而克服了常规荧光试纸的缺陷。此外，本发明所用的荧光物质X-罗丹明可产生较强的荧光信号，从而进一步大大提高了荧光信背比，使得能够很好地区分信号和背景，进而提高检测灵敏度。

在本发明中，样品垫和结合垫的材料可采用本领域通常使用的材料，例如，样品垫和结合垫可以为玻璃纤维。

本发明所采用的能与标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体特异性结合的抗抗体可以为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单克隆抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体特异性更高。

在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸在使用时，在样品垫上滴加样品液(如含有ApoE-ε4的血样)，在毛细管作用下，样品液向吸水滤纸一端移动，在结合垫处与所述的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体形成免疫复合物，该免疫复合物进一步移动，在检测线上与所述第二ApoE-ε4单克隆抗体结合形成双抗体夹心的免疫复合物，而未形成免疫复合物的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体则与质控线上的抗抗体结合。此过程需要10分钟至15分钟，之后，用荧光检测仪进行检测，如果质控线处未出现条带，则说明试纸失效；如果质控线处出现条带，而检测线处未出现条带，则说明样品中不含人ApoE-ε4蛋白；如果在质控线和检测线上均出现条带，则说明样品中含有人ApoE-ε4蛋白。

在另一个方面，本发明提供了一种制备用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：

1)提供标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体；

2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体；

3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二ApoE-ε4单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；

4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。

本发明的方法还可以包括将制成的荧光免疫层析试纸切割成适当宽度的步骤5)。

本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸的方法的各个步骤的条件，从而使得本发明的荧光免疫层析试纸能够针对人ApoE-ε4蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。

因此，优选的是，在本发明的方法中，所述步骤1)包括：

a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；

b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；

c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一ApoE-ε4单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获得的荧光微球与第一ApoE-ε4单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体。

在本发明的一个具体的实施方案中，所述步骤1)包括：

a)取1(w/v)％的荧光微球水分散液，10000rpm至15000rpm低温(例如10℃)离心5至10分钟，去上清，将沉淀物分散到500μl的蒸馏水或初洗缓冲液(0.1M的MES水溶液)中，超声波(240W)处理1至2分钟，重复以上过程三次，加入碳二亚胺10mg至50mg，搅拌10～15分钟，从而活化所述荧光微球；

b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球在1000rpm至15000rpm下离心5至10分钟，将沉淀物分散到1ml偶联缓冲液(20～100mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液))中，超声波(240W)处理1至2分钟，重复以上过程三次；

c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一ApoE-ε4单克隆抗体，优选地，按照1μl至3μl抗体(8mg/ml)/100μl所述活化的荧光微球的比例，将步骤b)所获得的荧光微球与第一ApoE-ε4单克隆抗体混合，室温(25℃)下搅拌1.5～3小时(优选2小时)，加入1ml封闭缓冲液(1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺)，继续搅拌1小时，在10000rpm至15000rpm下离心5至10分钟，重复离心3次，将沉淀物分散到500μl终洗缓冲液(0.5(w/v)％BSA-0.11(v/v)％吐温水溶液)中，超声波(240W)处理1至2分钟，用所述终洗缓冲液定容至500μl。

优选地，在本发明的方法中，所述步骤2)包括：将标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体用抗体稀释液(1％(w/v)BSA-0.01MPBS(pH7.2)缓冲液)进行稀释，以稀释至0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml，然后用微量移液器均匀喷涂在结合垫上，之后烘干或真空冷冻干燥。在本发明的方法的步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体的包被浓度为0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml。

优选地，所述步骤3)包括：用喷金机将所述第二ApoE-ε4单克隆抗体和抗抗体划到硝酸纤维素膜(固相载体)上以作为检测区和质控区，使检测区和质控区的间隔为3mm至8mm，所述第二ApoE-ε4单克隆抗体和所述抗抗体的浓度分别为0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml。

优选地，结果检测利用专用的荧光检测仪(可购自深圳市安群生物工程有限公司，型号AQ-3000)对质控区和检测区进行检测，检测区与质控区荧光强度的比值和待测样品中的ApoE-ε4的含量成正比。采用检测区与质控区荧光强度的比值而不是直接采用检测区的绝对荧光值可尽可能地减少反应条件、基质等的影响，并尽量避免背景干扰。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。

实施例1：ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为2187.32、2909.12，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。

本发明的ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP树脂(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，可购自中原化工公司)

MeoH(甲醇，可购自中原化工公司)

哌啶(Piperidine，可购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司)

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，可购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

(2)连接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

新的偶联的肽－树脂

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。

分别得到ApoE-ε4肽段(1)的肽树脂214mg和ApoE-ε4肽段(2)的肽树脂178mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到ApoE-ε4肽段(1)和(2)的粗品。

二、ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C810×100mm，可购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速：4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱：C184.6×150mm，可购自美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95％以上。

三、ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的分子量。

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司)

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。

结果，测得所得ApoE-ε4抗原表位肽(1)的分子量为2187.6，ApoE-ε4抗原表位肽(2)的分子量为2909.4，与理论分子量2187.32、2909.12一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：(1)偶联：异硫氰酸苯酯与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。(2)环化裂解：PTC-肽环化裂解。(3)转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，可购自sigma公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定

按仪器说明书进行。

结果：经鉴定，所得ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为：

(1)Y-K-V-E-Q-A-V-E-T-E-P-E-P-E-L-R；和

(2)Y-S-R-T-R-D-R-L-D-E-V-K-E-Q-V-A-E-V-R-A-K。

该结果与目标合成肽段一致。

实施例2：分别将实施例1所得的ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备ApoE-ε4抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将ApoE-ε4肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)(得自sigma公司)连接制备成ApoE-ε4抗原(1)和(2)。

取ApoE-ε4肽段(1)或(2)10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解；KLH 10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。

在本实施例中，PBS缓冲液的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄81ml加0.2mol/L的NaH₂PO₄19ml混合而成。

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.取上述制备的ApoE-ε4抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，每次间隔2-3周，融合前另外连续加强免疫两次，每次间隔1-2周，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用ApoE-ε4抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用ApoE-ε4抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的ApoE-ε4抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自上海源聚生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，加强免疫6次，抗原与不完全弗氏佐剂(购自上海源聚生物公司)充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用ApoE-ε4抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上。

利用ApoE-ε4抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人ApoE-ε4单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人ApoE-ε4蛋白、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的ApoE-ε4单克隆抗体(1)和(2)与该人ApoE-ε4蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：ApoE-ε4单克隆抗体(1)和(2)分别只与ApoE-ε4反应为阳性(P/N>2.1)，而与S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明本发明的ApoE-ε4单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4：人ApoE-ε4多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。

结果显示：ApoE-ε4多克隆抗体(1)和(2)分别与ApoE-ε4反应为阳性(P/N>2.1)，而与S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明本发明的ApoE-ε4多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5：利用ApoE-ε4单克隆抗体和ApoE-ε4多克隆抗体制备ApoE-ε4体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用ApoE-ε4抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用ApoE-ε4抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。

ApoE-ε4体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液：

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(可购自上海西宝公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将ApoE-ε4单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(ApoE-ε4多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

ApoE-ε4校准品(原料购自上海联硕公司)：7个：7×1.0ml(浓度分别为25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml)

ApoE-ε4结合抗体：1×10ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×10ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血样以及标准品100μl/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入ApoE-ε4结合抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：标准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ng/ml	0.25	0.5	1	2	5	10	25
								平均OD值	0.070	0.125	0.215	0.385	0.714	1.238	2.157

以标准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.978。

根据标准曲线计算所检测的标本中的ApoE-ε4浓度结果。

对30例老年痴呆病人和81例健康者按上述方式进行血清ApoE-ε4检测，老年痴呆病人血清中的ApoE-ε4含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2：两组样本ApoE-ε4浓度比较

由以上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的ApoE-ε4含量，从而检测出老年痴呆病人和正常人之间的ApoE-ε4含量差异，由此可判断老年痴呆的发生。

实施例六：用于检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸的制备。

一、标记有荧光微球的单克隆抗体的制备及包被结合垫

1、标记有荧光微球的单克隆抗体的制备

1.1、荧光微球的活化：

取500μl、含量1(w/v)％的荧光微球(购自广州格瑞林公司)水分散液，在10℃下，以12000rpm离心10分钟，去上清，将沉淀物分散到500μl的蒸馏水或初洗缓冲液(0.1M的MES水溶液)中，超声波(240W)处理2分钟，重复以上过程三次，加入碳二亚胺(购自上海晶纯公司)50mg，搅拌15分钟，从而活化所述荧光微球。

1.2、用活化好的荧光微球标记抗体：

将活化好的荧光微球在12000rpm下离心10分钟，去上清，将沉淀物分散到1ml偶联缓冲液(50mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的柠檬酸缓冲液)中，超声波(240W)处理2分钟，重复以上过程三次，获得分散有荧光微球的缓冲液1ml。按照3μl抗体(8mg/ml)/100μl活化好的荧光微球的比例，向其中加入按实施例2制备的ApoE-ε4单克隆抗体(1)，在常温下搅拌2小时，加入1ml封闭缓冲液(1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺)，继续搅拌1小时，之后，在12000rpm下离心10分钟，重复离心3次，将沉淀物分散到500μl终洗缓冲液(0.5(w/v)％BSA-0.11(v/v)％吐温水溶液)中，超声波(240W)处理2分钟，用上述终洗缓冲液定容至500μl。

2、包被结合垫

将上述制备的标记有荧光微球的ApoE-ε4单克隆抗体(1)用抗体稀释液(1％(w/v)BSA-0.01M PBS(pH7.2)缓冲液)稀释至1mg/ml，获得工作液，然后用微量移液器(购自labsystems公司)按4μl/cm的量均匀喷涂在结合垫(购自上海杰一，货号CFSP223000)上，之后用37℃烘箱烘干，在45％湿度下保存备用。

二、反应膜的制备

按照实施例2制备的ApoE-ε4单克隆抗体(2)和羊抗鼠IgG单克隆抗体(购自北京中杉金桥公司)用50mM pH7.2的PBS缓冲液分别稀释至1mg/ml，将喷金机(购自杭州峰杭公司)的检测线和质控线间隔参数设置为6mm，将包被量分别设置为1.0μl/cm，用喷金机在硝酸纤维素膜(购自上海杰一，货号GFCP203000)上划上ApoE-ε4单克隆抗体(2)和羊抗鼠IgG单克隆抗体，常温晾干备用。

三、试纸的组装和切割

在底板(购自上海杰一，货号HF000MC100)上依次相互搭接粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸水滤纸，得到试纸板，将其切割成宽度为5mm的试纸条。

四、ApoE-ε4荧光免疫检测卡的制备：

将上述切割好的试纸固定在塑料底卡上，试纸表面用面卡压紧，面卡在试纸条的样品垫和反应膜的位置上开有加样孔和观察窗。检测卡组装好后装入铝箔袋中，加入干燥剂封口保存，室温干燥条件下可以保存一年以上。

五、样品的检测

ApoE-ε4标准品(购自上海联硕公司)用样品稀释液(1％(w/v)BSA-0.01M PBS(pH7.2)缓冲液)配制成如下系列浓度的校准品：100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml，将50μl以上校准品分别滴加到加样孔上，10分钟后用荧光检测仪(购自深圳市安群生物工程有限公司，型号AQ-3000)检测，可在检测线和质控线位置上采集到荧光。以样品浓度为横坐标，检测线与质控线处的荧光强度的比值为纵坐标绘制校准曲线，R²为0.995。质控线用于试纸有效性判断以及对检测线信号作相应校正，如质控线未出现条带，则说明试纸失效。

取50μl的待检血样，滴加到加样孔上，10分钟后用荧光检测仪检测，如果检测线出现条带，说明样品中含ApoE-ε4，其浓度可依据校准曲线获得。

六、ApoE-ε4荧光免疫试纸性能评价

1.评价试纸性能的指标

1)线性范围：各浓度校准品重复检测3次，绘制校准曲线，经数据拟合和统计分析，本发明试纸线性检测范围为0.2ng/ml-100ng/ml。

2)最低检出限：将ApoE-ε4零值血样(无ApoE-ε4成份)(购自上海联硕公司)分成20份进行检测，计算浓度平均值和2倍标准差之和，得本发明试纸最低检测限为0.04ng/ml。

3)精密度：用本发明的ApoE-ε4荧光免疫试纸分别检测ApoE-ε4浓度分别为50ng/ml、12.5ng/ml、2.50ng/ml的血样，重复检测10次，进行批内精密度测定。每天对上述3个浓度的样本进行测定，1天1

次，连续测20天，进行批间精密度测定，结果如下表3所示：

表3

批内CV(变异系数)和批间CV均小于8％，说明该试剂精密性良好。

此外，由上表可知，本试纸检测ApoE-ε4的线性范围宽、灵敏度好。

Claims (3)

1.一种人ApoE-ε4抗原表位肽，其中所述ApoE-ε4抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg；

(2)Tyr-Ser-Arg-Thr-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Lys。

2.一种ApoE-ε4抗原，其是通过使权利要求1所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

3.一种ApoE-ε4抗原，其是通过使权利要求1所述的人ApoE-ε4抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。