CN108929374A

CN108929374A - 人hbp抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒

Info

Publication number: CN108929374A
Application number: CN201710369003.6A
Authority: CN
Inventors: 朱建安; 朱仕杰
Original assignee: ANQUN BIOENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Current assignee: Fujian Yitong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN108929374B

Abstract

本发明涉及人HBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒。本发明的人HBP抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。本发明的人HBP抗原由人HBP抗原表位肽与蛋白载体偶联制得。本发明的人HBP单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的人HBP抗原制得。本发明的人HBP单克隆抗体或多克隆抗体用于制备人HBP体外诊断试剂盒。本发明的人HBP抗原表外肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人HBP的体外检测。

Description

人HBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人肝素结合蛋白(HBP)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的HBP特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人HBP体外诊断试剂盒上的应用、以及人HBP体外诊断试剂盒。

背景技术

HBP(人肝素结合蛋白)也被称为天青杀素或者阳离子抗菌蛋白37(CAP37)，是一种相对分子质量为37×10³的糖蛋白。是从251个氨基酸的前体中，在N末端去除26个氨基酸残基、C末端去除3个氨基酸残基而合成的一个单链糖蛋白。

HBP主要存在于中性粒细胞的分泌颗粒和嗜天青颗粒中，与人类中性粒细胞弹性蛋白酶序列有45％同源，但其没有蛋白酶活性。HBP具有带大量正电荷的氨基酸残基，且集中在该蛋白的一侧，使得其具有明显的电极性。最初的研究是为了其抗菌活性，但研究发现其对炎症反应和血管渗漏的调节可能起到重要的作用。正常情况下，HBP是储存形式，当受到一些刺激原(如化脓链球菌M蛋白刺激、链球菌溶血素O、A族链球菌等的刺激)后会释放至血液、脑脊液、骨髓体液中，因此，正常人血液中HBP的水平极低，一般不超过10ng/ml。而受到刺激原后，特别是有细菌、真菌刺激后，HBP在血液中的浓度会升高。

临床研究中HBP关于在疾病的诊断方面，除了诊断败血症、脓毒血症等疾病外，也用于脑细菌性脑膜炎、尿路感染、肾炎等诊断。HBP可以作为一种新型炎症标志物，具有较高的灵敏度和特异度，明显优于传统的标志物，在临床应用中具有对病情的早期评估、预后评价、疗效观察等价值，同时指导抗生素的应用，减少抗生素的滥用，减少耐药性的发生。

检测血液中的HBP最理想的方法是免疫测定。因此，寻找合适的具有免疫原性的HBP抗原表位肽、制备特异性的HBP抗原及抗体即成为了重点。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人HBP抗原表位肽，用该抗原表位肽制备的HBP特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备人HBP试剂盒上的应用，以及人HBP体外诊断试剂盒。

具体而言，本发明提供了：

一种人HBP抗原表位肽，其中所述HBP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Glu-Arg-Asp-Gly-Gly-Arg-lys-Ala-Arg-Pro-Arg；

(2)Tyr-Glu-Lys-Asp-Gly-Val-Leu-Asn-Asn-Pro-Gly-Pro。

本发明还提供了一种HBP抗原，其是通过使所述的人HBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种HBP抗原，其是通过使所述的人HBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人HBP抗体，其是由所述的HBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述HBP抗原是通过使所述的人ST2抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人HBP抗体，其是由所述的HBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述HBP抗原是通过使所述的人ST2抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了根据所述的人HBP抗体在制备人HBP体外诊断试剂盒上的应用。

本发明还提供了一种人HBP体外诊断试剂盒，其包含所述的人HBP抗体作为包被抗体。

优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的人HBP抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

优选地，所述包被抗体为单克隆抗体。

优选地，所述结合抗体为多克隆抗体。

优选地，所述HBP体外诊断试剂盒用于检测血清中的人HBP蛋白。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明的人HBP抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

2.用本发明制备的HBP单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液(特别是血清)样本中的HBP结合。

3.本发明的人HBP体外诊断试剂盒可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的HBP的水平，可用于脓毒症、败血症、脑细菌性脑膜炎、尿路感染、肾炎等的早期筛查，以及用于治疗疗效监控以及预后与复发风险评估。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、人HBP抗原表位肽

本文中所述的人HBP蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到。

本发明提供了人HBP抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，为：

(1)Y-E-R-D-G-G-R-K-A-R-P-R；和

(2)Y-E-K-D-G-V-L-N-N-P-G-P。

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。

HBP抗原表位肽(1)是HBP蛋白(NCBI登录号PDB:1AE5_A)N端第3至10位的肽段，并且在N端加上Y-E-R-D，从而构成含12个氨基酸的HBP抗原表位肽(1)。

HBP抗原表位肽(2)包含HBP蛋白(NCBI登录号PDB:1AE5_A)C端第214至第222位的肽段，并且在N端加上Y-E-K，从而构成含12个氨基酸的HBP抗原表位肽(2)。

本发明的构思和设计使这两个肽段均具有亲水性良好、抗原性强并且易于合成的特点。

目前，本发明研究发现，本发明的HBP抗原表位肽具有如下功能：

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人HBP结合。

本发明的HBP抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1658.77、1500.57，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

二、HBP抗原

本发明还提供了HBP抗原，其通过使本发明的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了HBP抗原(1)和(2)，所述HBP抗原(1)通过使本发明的人HBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述HBP抗原(2)通过使本发明的人HBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的HBP抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的HBP抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

三、HBP单克隆抗体、HBP多克隆抗体和人HBP体外诊断试剂盒

本发明还提供了人HBP抗体，包括人HBP单克隆抗体和人HBP多克隆抗体，它们可以各自利用本发明的HBP抗原(1)或(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。

在本文中，术语“另一种HBP抗原”即为HBP抗原(2)。当本发明的人HBP抗体由HBP抗原(2)(即，另一种HBP抗原)制备而得时，该抗体可以称为“人HBP抗体(2)”(或简称抗体(2))或“另一种人HBP抗体”。

本发明的HBP单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人HBP体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞、体液中的HBP进行检测，优选对血液标本，特别是血清中的HBP进行检测。

因此，本发明提供了一种人HBP体外诊断试剂盒，其包含本发明的人HBP单克隆抗体或多克隆抗体。

目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。

而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。

本发明的人HBP体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测HBP蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的抗抗体和/或必要的工具和试剂等。

优选的是，所述人HBP体外诊断试剂盒采用本发明的人HBP单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人HBP体外诊断试剂盒还优选包含人HBP多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于本发明的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记的抗抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的抗抗体，该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。

本发明的人HBP体外诊断试剂盒优选对血清中的HBP进行检测。

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。

本发明还提供了所述的人HBP体外诊断试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。

实施例1：HBP抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成HBP抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1658.77、1500.57，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、HBP抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。

本发明的HBP抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP树脂(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，可购自晶园化工公司)

MeoH(甲醇，可购自晶园化工公司)

哌啶(Piperidine，可购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司)

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，可购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(2)连接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。

分别得到HBP肽段(1)的肽树脂152mg和HBP肽段(2)的肽树脂139mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到HBP肽段(1)和(2)的粗品。

二、HBP抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C8 10×100mm，可购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速：4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱：C18 4.6×150mm，可购自美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的HBP抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95％以上。

三、HBP抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的HBP抗原表位肽(1)和(2)的分子量。

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司)

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。

结果，测得所得HBP抗原表位肽(1)的分子量为1658.90，HBP抗原表位肽(2)的分子量为1501.01，与理论分子量1658.77、1500.57一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得HBP抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：(1)偶联：异硫氰酸苯酯与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。(2)环化裂解：PTC-肽环化裂解。(3)转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，可购自sigma公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定

按仪器说明书进行。

结果：经鉴定，所得HBP抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为：

(1)Y-E-R-D-G-G-R-K-A-R-P-R和

(2)Y-E-K-D-G-V-L-N-N-P-G-P。

该结果与目标合成肽段一致。

实施例2：分别将实施例1所得的HBP抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备HBP抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将HBP肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)(得自sigma公司)连接制备成HBP抗原(1)和(2)。

取HBP肽段(1)或(2)10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解；KLH 10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 8.6)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂ 110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。

在各实施例中，PBS缓冲液(如果使用)的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄ 81ml加0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19ml混合而成。

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.取上述制备的HBP抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，每次间隔2-3周，融合前另外连续加强免疫两次，每次间隔1-2周，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自晶园化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用HBP抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用HBP抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的HBP抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，加强免疫6次，抗原与不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用HBP抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上。

利用HBP抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人HBP单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人HBP蛋白、CRP(C反应蛋白)蛋白(购自深圳雅为公司)、PCT(降钙素原)蛋白(购自杭州启泰公司)为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的HBP单克隆抗体(1)和(2)与该人HBP蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：HBP单克隆抗体(1)和(2)分别只与HBP反应为阳性(P/N>2.1)，而与CRP蛋白、PCT蛋白反应为阴性，说明本发明的HBP单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4：人HBP多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。

结果显示：HBP多克隆抗体(1)和(2)分别与HBP反应为阳性(P/N>2.1)，而与CRP蛋白、PCT蛋白反应为阴性，说明本发明的HBP多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5：利用HBP单克隆抗体和HBP多克隆抗体制备HBP体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用HBP抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用HBP抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。

HBP体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(可购自sigma公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将HBP单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(HBP多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

HBP校准品(原料购自Abnova公司)：6个：6×1.0ml(浓度分别为50μg/L、20μg/L、11μg/L、8μg/L、4μg/L、0μg/L)

HBP结合抗体：1×10ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×10ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血清以及校准品100μl/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入HBP结合抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度μg/L	0	4	8	11	20	50
							平均OD值	0.068	0.131	0.235	0.414	0.865	1.466

以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.975。

根据标准曲线计算所检测的标本中的HBP浓度结果。

对24例败血症、脓毒性休克症病人和63例健康者按上述方式进行血清HBP检测，患有感染性疾病的病人血清中的HBP含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2：两组样本HBP浓度比较

由以上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的HBP含量，从而检测出患有感染性疾病的病人和正常人之间的HBP含量差异，由此可判断感染性疾病的发生。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市安群生物工程有限公司

<120> 人HBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒

<130> FI-171794-59:52/C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Glu Arg Asp Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Glu Lys Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro

1 5 10

Claims

1.一种人HBP抗原表位肽，其中所述HBP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Glu-Arg-Asp-Gly-Gly-Arg-lys-Ala-Arg-Pro-Arg；

(2)Tyr-Glu-Lys-Asp-Gly-Val-Leu-Asn-Asn-Pro-Gly-Pro。

2.一种HBP抗原，其是通过使权利要求1所述的人HBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

3.一种HBP抗原，其是通过使权利要求1所述的人HBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

4.一种人HBP抗体，其是由权利要求2所述的HBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

5.一种人HBP抗体，其是由权利要求3所述的HBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求4或5所述的人HBP抗体在制备人HBP体外诊断试剂盒上的应用。

7.一种人HBP体外诊断试剂盒，其包含权利要求4或5所述的人HBP抗体作为包被抗体。

8.根据权利要求7所述的人HBP体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为权利要求4或5所述的人HBP抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人HBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

9.根据权利要求7所述的HBP体外诊断试剂盒，其中所述包被抗体为单克隆抗体。

10.根据权利要求8所述的HBP体外诊断试剂盒，其中所述结合抗体为多克隆抗体。

11.根据权利要求7所述的HBP体外诊断试剂盒，其中所述HBP体外诊断试剂盒用于检测血清中的人HBP蛋白。