CN108084257B

CN108084257B - 人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108084257B
Application number: CN201611046574.8A
Authority: CN
Inventors: 朱建安; 朱仕杰
Original assignee: Shenzhen Anqun Bioengineering Co ltd
Current assignee: Shenzhen Anqun Bioengineering Co ltd
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2036-11-23
Also published as: CN108084257A

Abstract

本发明涉及人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒。本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列，为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。本发明的闭锁蛋白抗原由人闭锁蛋白抗原表位肽与载体蛋白偶联制得。本发明的闭锁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的闭锁蛋白抗原制得。本发明的闭锁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体用于制备闭锁蛋白体外诊断试剂盒。本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人闭锁蛋白的体外检测。

Description

人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人闭锁蛋白(Occludin)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的闭锁蛋白特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用、人闭锁蛋白体外诊断试剂盒、以及该试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。

背景技术

血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。BBB是由毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、部分神经元、管周细胞、血管内皮细胞间的紧密连接以及基底膜组成。在正常生理条件下，BBB为脑组织选择性通透营养物质，包括氧气，葡萄糖等，并将脑组织的代谢废物过滤到血液中，同时能有效阻止血液的其他成分由毛细血管自由进入脑实质。但一旦发生脑缺血及缺血后的再灌流，BBB的屏障功能会逐渐被破坏。当BBB损伤达到非常严重程度时，组成BBB的毛细血管将严重丧失其结构与功能的完整性，所有的血液成分包括各种血细胞将通过受损的BBB外流进入脑实质，发生脑出血。大多数脑卒中(约占80-85％)是缺血性脑卒中。它是由于急性血栓形成或其它部位的栓子转移，导致局部脑血管闭塞造成的。脑缺血30～90分钟后，不可逆的脑损伤即开始出现。

闭锁蛋白(Occludin，也称为咬合蛋白或封闭蛋白)是形成紧密连接结构的重要跨膜蛋白分子，它含有胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域。闭锁蛋白是构成细胞间屏障的重要结构，在维持细胞间的屏障功能发挥重要作用。细胞及动物实验发现，缺血2小时可导致BBB损伤以及BBB的重要结构蛋白闭锁蛋白降解。闭锁蛋白降解后，部分蛋白片段，尤其是包含胞外结构域的片段，可能进入血液循环。如果BBB损伤越严重，越多的闭锁蛋白将被降解，进入血循环的片段也可能随之增加。因此，通过检测血液中闭锁蛋白片段的含量可快速判断血脑屏障(BBB)的受损程度，评估脑出血的风险，对早期的脑卒中早检测早治疗，减少脑出血带来的严重后果。

检测血液中的闭锁蛋白最理想的方法是免疫测定。因此，寻找合适的具有免疫原性的闭锁蛋白抗原表位肽、制备特异性的闭锁蛋白抗原及抗体即成为了重点。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人闭锁蛋白抗原表位肽，用该抗原表位肽制备的闭锁蛋白特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用，人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，以及该试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。

具体而言，本发明提供了：

一种人闭锁蛋白抗原表位肽，其中所述闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr。

(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-T yr。

本发明还提供了一种闭锁蛋白抗原，其是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种闭锁蛋白抗原，其是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人闭锁蛋白抗体，其是由所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述闭锁蛋白抗原是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了另一种人闭锁蛋白抗体，其是由所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述闭锁蛋白抗原是通过使所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了根据所述的人闭锁蛋白抗体在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用。

本发明还提供了一种人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其包含所述的人闭锁蛋白抗体作为包被抗体。

优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的人闭锁蛋白抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

优选地，所述包被抗体为单克隆抗体。

优选地，所述结合抗体为多克隆抗体。

优选地，所述试剂盒用于定量检测血清中的人闭锁蛋白。

本发明还提供了根据所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

2.用本发明制备的闭锁蛋白单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的闭锁蛋白结合。

3.本发明的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒可以有效地检测血液中闭锁蛋白的水平，从而评估血脑屏障的受损程度，监测脑出血发生状况，减少脑卒中发生带来的严重后果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、人闭锁蛋白抗原表位肽

本文中所述的人闭锁蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到，NCBI登录号AAL47094.1。

本发明提供了人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQID No.1和SEQ ID No.2所示，为：

(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr。

(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-T yr。

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。

闭锁蛋白抗原表位肽(1)以人闭锁蛋白N端第357位至365位的一段含9个氨基酸残基的肽段为抗原决定簇，并且在其C端添加由5个氨基酸构成的亲水性肽段Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr，从而构成由14个氨基酸组成的闭锁蛋白抗原表位肽(1)。

闭锁蛋白抗原表位肽(2)以人闭锁蛋白C端第501至512位的一段含12个氨基酸残基的肽段为抗原决定簇，并且在其C端添加Asp-Arg-Tyr，从而构成了具有15个氨基酸的闭锁蛋白抗原表位肽(2)。

本发明的构思和设计使这两个肽段具有良好的亲水性，具有抗原性强并且易于合成的特点。

目前，本发明研究发现，本发明的闭锁蛋白抗原表位肽具有如下功能：

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人闭锁蛋白结合。

本发明的闭锁蛋白抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1971.13和2124.44，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

二、闭锁蛋白抗原

本发明还提供了一种闭锁蛋白抗原，其通过使本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了闭锁蛋白抗原(1)和(2)，所述闭锁蛋白抗原(1)通过使本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述闭锁蛋白抗原(2)通过使本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的闭锁蛋白抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的闭锁蛋白抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

三、闭锁蛋白单克隆抗体、闭锁蛋白多克隆抗体和人闭锁蛋白体外诊断试剂盒

本发明还提供了人闭锁蛋白单克隆抗体和人闭锁蛋白多克隆抗体，所述抗体可以分别利用本发明的闭锁蛋白抗原(1)和(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。

本发明的闭锁蛋白单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞、体液中的闭锁蛋白进行检测，优选对血液标本，特别是血清中的闭锁蛋白进行检测。

因此，本发明提供了一种人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其包含本发明的人闭锁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。

目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。

而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。

本发明的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测闭锁蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的抗抗体和/或必要的工具和试剂等。

优选的是，所述人闭锁蛋白体外诊断试剂盒采用本发明的人闭锁蛋白单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人闭锁蛋白体外诊断试剂盒还优选包含人闭锁蛋白多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于本发明的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记抗抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的抗抗体，该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。

本发明的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒优选对血清中的闭锁蛋白进行检测。

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。

本发明还提供了所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒在定量检测血清中的人闭锁蛋白中的应用。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。

实施例1：闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1971.13、2124.44，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。

本发明的闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，可购自中原化工公司)

MeoH(甲醇，可购自中原化工公司)

Piperidine(哌啶，可购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司)

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，可购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

(2)连接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

新的偶联的肽－树脂

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。

分别得到闭锁蛋白肽段(1)的肽树脂142mg和闭锁蛋白肽段(2)的肽树脂125mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到闭锁蛋白肽段(1)和(2)的粗品。

二、闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C8 10×100mm，可购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速：4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱：C18 4.6×150mm，可购自美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95％以上。

三、闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的分子量。

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司)

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。

结果，测得所得闭锁蛋白抗原表位肽(1)的分子量为1970.9，闭锁蛋白抗原表位肽(2)的分子量为2124.7，与理论分子量1971.13、2124.44一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：①偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。②环化裂解：PTC-肽环化裂解。③转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，可购自sigma公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定

按仪器说明书进行。

结果：经鉴定，所得闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为：

(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr；和

(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-T yr。

该结果与目标合成肽段一致。

实施例2：分别将实施例1所得的闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备闭锁蛋白抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将闭锁蛋白肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)(得自sigma公司)连接制备成闭锁蛋白抗原(1)和(2)。

取闭锁蛋白肽段(1)或(2)10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解；KLH10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂ 110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。

在各实施例中，PBS缓冲液(如果使用)的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄ 81ml加0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19ml混合而成。

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.取上述制备的闭锁蛋白抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，每次间隔2-3周，融合前另外连续加强免疫两次，每次间隔1-2周，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自晶园化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用闭锁蛋白抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用闭锁蛋白抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的闭锁蛋白抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，加强免疫6次，抗原与不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血,分离血清。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用闭锁蛋白抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上。

利用闭锁蛋白抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人闭锁蛋白单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人闭锁蛋白、人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE(均购自上海联硕公司)为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的闭锁蛋白单克隆抗体(1)和(2)与该人闭锁蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：闭锁蛋白单克隆抗体(1)和(2)分别只与闭锁蛋白反应为阳性(P/N>2.1)，而与人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明本发明的闭锁蛋白单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4：人闭锁蛋白多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。

结果显示：闭锁蛋白多克隆抗体(1)和(2)分别与闭锁蛋白反应为阳性(P/N>2.1)，而与人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明本发明的闭锁蛋白多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5：利用闭锁蛋白单克隆抗体和闭锁蛋白多克隆抗体制备闭锁蛋白体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用闭锁蛋白抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用闭锁蛋白抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。

闭锁蛋白体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液：

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(可购自上海西宝公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将闭锁蛋白单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(闭锁蛋白多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

闭锁蛋白校准品(原料购自SIGMA公司)：6个：6×1.0ml(浓度分别为10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.156ng/ml、0ng/ml)

闭锁蛋白结合抗体：1×2.5ml/1×5ml(经1:5000稀释)

酶联物：2×5ml/2×5ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×5.0ml

显色剂B：1×5.0ml

终止液：1×5.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血样以及校准品50μl/孔，均为双孔，37℃孵育30分钟，每孔用1×洗涤缓冲液200-300ul洗涤5次，拍干。在各孔内加入闭锁蛋白结合抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，每孔用1×洗涤缓冲液200-300ul洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，每孔用1×洗涤缓冲液200-300ul洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：标准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ng/ml	0	0.156	1	2.5	5	10
							平均OD值	0.007	0.041	0.258	0.623	1.345	2.672

以校准品浓度和对应吸光度绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.987。

根据标准曲线计算所检测的标本中的闭锁蛋白浓度结果。

对126例脑出血患者和87例健康者按上述方式进行血清闭锁蛋白检测，脑出血患者血清中的闭锁蛋白含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2：两组样本闭锁蛋白浓度比较

以0.156ng/ml为界值区分阴阳性，对上述对126例脑出血患者和87例健康者检测血清闭锁蛋白的结果进行统计，结果显示，本发明试剂盒的检测灵敏度(118/126)为93.6％，特异度(82/87)为94.2％，准确性((118+82)/213)为93.8％。结果见表3。

表3：本发明试剂盒的性能评价

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市安群生物工程有限公司

<120> 人闭锁蛋白抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用

<130> FI-164061-59:52/C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Ser Pro Val Asp Asp Phe Arg Gln Lys Pro Lys Arg Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Gln Leu Lys Ser Lys Leu Ser His Ile Lys Lys Asp Arg Tyr

1 5 10 15

Claims

1.一种人闭锁蛋白抗原表位肽，其中所述闭锁蛋白抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Thr-Ser-Pro-Val-Asp-Asp-Phe-Arg-Gln-Lys-Pro-Lys-Arg-Tyr；

(2)Lys-Gln-Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Ser-His-Ile-Lys-Lys-Asp-Arg-Tyr。

2.一种闭锁蛋白抗原，其是通过使权利要求1所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

3.一种闭锁蛋白抗原，其是通过使权利要求1所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

4.一种人闭锁蛋白抗体，其是由权利要求2所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

5.一种人闭锁蛋白抗体，其是由权利要求3所述的闭锁蛋白抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求4或5所述的人闭锁蛋白抗体在制备人闭锁蛋白体外诊断试剂盒上的应用。

7.一种人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其包含权利要求4或5所述的人闭锁蛋白抗体作为包被抗体。

8.根据权利要求7所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为权利要求4或5所述的人闭锁蛋白抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人闭锁蛋白抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

9.根据权利要求7或8所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其用于定量检测血清中的人闭锁蛋白。

10.根据权利要求7所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其中所述包被抗体为单克隆抗体。

11.根据权利要求8所述的人闭锁蛋白体外诊断试剂盒，其中所述结合抗体为多克隆抗体。