CN110470847B

CN110470847B - 一种定量检测谷胱甘肽还原酶的elisa试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN110470847B
Application number: CN201910785476.3A
Authority: CN
Inventors: 余旭亮
Original assignee: Anhui Enhe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Enhe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110470847A

Abstract

本发明涉及多肽化学和免疫学领域技术领域，具体是公开了一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，所述试剂盒通过双抗体夹心法检测所述人GR的含量，所述试剂盒包括包被板、校准品、结合抗体、酶结合物、质控品、显色剂A、显色剂B、终止液和浓缩洗涤液；所述包被板包被有GR包被抗体，所述GR包被抗体来源于GR抗原，所述GR抗原是通过使所述人GR抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的，所述结合抗体是由GR抗原制备而成的。本发明克服了现有技术的不足，该试剂盒操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

Description

一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及多肽化学和免疫学领域技术领域，具体属于一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒。

背景技术

谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素酶，每分子酶蛋白含有一分子的FAD，广泛存在于人体红细胞、单核巨噬细胞、心、肝、肾等组织细胞中，定位于微粒体及细胞液部分。是维持细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量的主要黄素酶，它可及时地清除人体代谢过程中产生的氧自由基(OFR)，通过酶学过程或直接化学反应解毒OFR，防止它们对血红蛋白膜蛋白和众多酶蛋白上的巯基进行氧化,维持细胞的正常功能及寿命。GR由辅酶NADPH供氢，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)，还原成还原型谷胱甘肽(GSH)。

谷胱甘肽(glutathione)是一种由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸组成的多肽，分子中半胱氨酸的-SH是主要的功能性基团。谷胱甘肽存在于所有动物细胞中，在正常情况下，以其硫醇还原性存在，是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物，在许多生命活动中，起着直接或间接的作用包括基因表达调控、酶活性和代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节等。氧化应激或亲电化合物攻击可使细胞内的GSH含量降低，或使其转变为双硫氧化型(GSSG)。谷胱甘肽除具有抗氧化和调节机体巯基平衡的作用外，在中枢神经系统中也有神经递质或神经调质样作用。GSH不是一种典型的三肽，其结构中含有非α-肽键，由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2脱水形成。GSH是一种抗氧化剂，可保护蛋白质分子中的-SH免遭氧化，保护巯基蛋白和酶的活性。在谷胱甘肽过氧化酶的作用下，GSH可以还原细胞内产生的H2O2，生成H2O，同时，GSH被氧化为GSSG，后者在谷胱甘肽还原酶的催化下，又生成GSH。GSH是机体主要的抗氧化剂之一，主要作用有：维护红细胞内含巯基的膜蛋白和酶蛋白的完整性及其正常代谢功能：它与谷胱甘肽过氧化酶共同作用，使双氧水还原成水。通过上述作用维持红细胞膜的完整性和保护红细胞免受氧化剂的损害。GSH水平的高低主要取决于糖代谢中的己糖磷酸旁路的红细胞酶(G6PD)及GSH生物合成酶。GSH合成酶缺乏可导致GSH水平极度低下，而缺乏G6PD时，红细胞NADPH生成减少，致使GSSG还原为GSH减少，导致红细胞GSH含量降低及GSSG含量升高。

目前国内测定谷胱甘肽还原酶的方法主要有液体双试剂法和紫外酶法。液体双试剂目前存在稳定性差，抗干扰能力差等缺点；紫外酶法谷胱甘肽还原酶的试剂盒主要为进口干粉试剂，虽然结果准确，但是价格不菲，使用前需要复溶，操作不方便。复溶后需要尽快使用，使用非常不方便并且复溶后使用不完会出现大量的浪费。

发明内容

本发明的目的是提供了一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒及其检测方法，克服了现有技术的不足，该试剂盒操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，所述试剂盒通过双抗体夹心法检测所述人GR的含量，所述试剂盒包括包被板、校准品、结合抗体、酶结合物、质控品、显色剂A、显色剂B、终止液和浓缩洗涤液；

所述包被板包被有GR包被抗体，所述GR包被抗体来源于GR抗原，所述GR抗原是通过使所述人GR抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的，所述结合抗体是由GR抗原制备而成的，所述GR抗原是通过使所述人GR抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的；

所述GR抗原表位肽(1)和(2)的NCBI登录号为AAH69244.1，所述所述GR抗原表位肽(1)和(2)的氨基酸序列分别为：

(1)Tyr Glu Leu Gly Ala Arg Ala Ala Val Val Glu Ser His；

(2)Tyr Glu Lys Val Val Gly Ile His Met Gln Gly Leu Gly。

进一步，所述GR包被抗体浓度为0.4ng/L，所述结合抗体为0.2ng/L的兔抗人GR多抗，所述酶结合物为HRP标记的羊抗兔IgG，其浓度为1ng/L。

进一步，所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，所述显色剂A和显色剂B的体积比为1:1。

进一步，所述浓缩洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

进一步，所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120ng/L、80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、0ng/L。

一种基于上述试剂盒检测谷胱甘肽还原酶的检测方法，包括以下步骤：

1)洗涤液的配制：将20ml浓缩洗涤液加入500ml的容量瓶中，再加入480ml蒸馏水，振荡使浓缩洗涤液充分溶解。

2)将试剂盒平衡至室温后，将所需的微孔条取出固定于板架上，编好顺序；

3)加样：先加入50ul待测样本/GR校准品/GR质控品，再加入50ul GR结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；

4)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

5)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

6)加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；

7)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

8)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

9)显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；

10)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；

11)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值。

12)质量控制：如果GR最高浓度校准品OD.≥0.8，试验结果为有效。

13)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD.值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线。通过待测样本的OD.值可在校准曲线上查出其对应浓度值。

本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：

1.本发明采用双抗体夹心法，提供了一种用于定量检测样本中人GR蛋白的ELISA试剂盒，用该试剂盒检测样本中的人GR蛋白，可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的GR蛋白的水平操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

2.本发明选用人GR抗原表位肽与载体蛋白偶联制备的GR抗原和羊抗兔IgG，有效地排除非特异性的干扰，特异性强，提高检测的精确度。

附图说明

图1为本发明中GR抗原表位肽(1)和(2)的合成流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。

实施例1

GR抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成GR抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为1617.71、1646.88，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、GR抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如图1所示。

本发明的GR抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP树脂(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，可购自晶园化工公司)

MeoH(甲醇，可购自晶园化工公司)

哌啶(Piperidine，可购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司)

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，可购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

(2)连接氨基酸到树脂上

HOBt活化酯

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

新的偶联的肽－树脂

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。

分别得到GR肽段(1)的肽树脂147mg和GR肽段(2)的肽树脂141mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到GR肽段(1)和(2)的粗品。

二、GR抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C810×100mm，可购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速： 4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱： C184.6×150mm，可购自美国Waters公司

流动相： A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速： 1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的GR抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95％以上。

三、GR抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的GR抗原表位肽(1)和(2)的分子量。

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司)

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。

结果，测得所得GR抗原表位肽(1)的分子量为1618.02，GR抗原表位肽(2)的分子量为1647.13，与理论分子量1617.71、1646.88一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得GR抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：(1)偶联：异硫氰酸苯酯与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。(2)环化裂解：PTC-肽环化裂解。(3)转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，可购自sigma公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定

按仪器说明书进行。

结果：经鉴定，所得GR抗原表位肽(1)和(2)的序列目标合成肽段一致。

实施例2

分别将实施例1所得的GR抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备GR抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将GR肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)连接制备成GR抗原(1)和(2)。

取GR肽段(1)或(2)10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解；KLH 10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 8.6)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl2110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。

在各实施例中，PBS缓冲液(如果使用)的配方为：0.2mol/L的Na2HPO481ml加0.2mol/L的NaH2PO419ml混合而成。

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.取上述制备的GR抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，每次间隔2-3周，融合前另外连续加强免疫两次，每次间隔1-2周，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自晶园化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO2培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只，10天后收集腹水。

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用GR抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用GR抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的GR抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，加强免疫6次，抗原与不完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用GR抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上。

利用GR抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3

人GR单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人GR蛋白、CRP(C反应蛋白)蛋白(购自深圳雅为公司)、PCT(降钙素原)蛋白(购自杭州启泰公司)为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的GR单克隆抗体(1)和(2)与该人GR蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：GR单克隆抗体(1)和(2)分别只与GR反应为阳性(P/N>2.1)，而与CRP蛋白、PCT蛋白反应为阴性，说明本发明的GR单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4

人GR多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。

结果显示：GR多克隆抗体(1)和(2)分别与GR反应为阳性(P/N>2.1)，而与CRP蛋白、PCT蛋白反应为阴性，说明本发明的GR多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5

利用GR单克隆抗体和GR多克隆抗体制备GR体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用GR抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用GR抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。

GR体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na2CO3：16.0克

NaHCO3：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na2HPO4·12H2O：58克

KH2PO4：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(可购自sigma公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H2SO4

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将GR单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(GR多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

GR校准品(原料购自Abnova公司)：6个：6×0.5ml(浓度分别为120ng/L、80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、0ng/L)

GR结合抗体：1×2.5ml/1×5.0ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×5.0ml/2×5.0ml(经1:10000稀释)

GR质控品：1×0.5ml

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×5.0ml

显色剂B：1×5.0ml

终止液：1×5.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

4)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

6)加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；

7)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

10)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；

11)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值。

6.结果判定：

表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ng/L	0	10	20	40	80	120
							平均OD值	0.034	0.088	0.182	0.289	0.536	1.064

以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R2＝0.982。

根据标准曲线计算所检测的标本中的GR浓度结果。

对51例病人和109例健康者按上述方式进行血清GR检测，病人血清中的GR含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2：两组样本GR浓度比较

组别	人数	GR浓度均值(ng/L)
			患者	51	77.27
对照组	109	6.84

由以上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的GR蛋白含量，从而检测出病人和正常人之间的GR蛋白含量差异。

以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过双抗体夹心法检测人GR的含量，所述试剂盒包括包被板、校准品、结合抗体、酶结合物、质控品、显色剂A、显色剂B、终止液和浓缩洗涤液；

所述包被板包被有GR包被抗体，所述GR包被抗体来源于第一GR抗原，所述第一GR抗原是通过使人GR抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的，所述结合抗体是由第二GR抗原制备而成的，所述第二GR抗原是通过使所述人GR抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的；

所述人GR抗原表位肽(1)和(2)的氨基酸序列分别为：

(1)Tyr Glu Leu Gly Ala Arg Ala Ala Val Val Glu Ser His;

(2)Tyr Glu Lys Val Val Gly Ile His Met Gln Gly Leu Gly。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述GR包被抗体浓度为0.4ng/L，所述结合抗体为0.2ng/L的兔抗人GR多抗，所述酶结合物为HRP标记的羊抗兔IgG，其浓度为1ng/L。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，所述显色剂A和显色剂B的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120ng/L、80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、0ng/L。

6.一种使用权利要求1-5任意一项所述的试剂盒检测谷胱甘肽还原酶的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）洗涤液的配制：将20ml浓缩洗涤液加入500ml的容量瓶中，再加入480ml蒸馏水，振荡使浓缩洗涤液充分溶解；

2）将试剂盒平衡至室温后，将所需的微孔条取出固定于板架上，编好顺序；

3）加样：先加入50ul 待测样本/GR校准品/GR质控品，再加入50ul GR结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；

4）温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

5）洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

6）加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；

7）温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

8）洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

9）显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；

10）终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；

11）测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD值；

12）质量控制：如果GR最高浓度校准品OD≥0.8，试验结果为有效；

13）结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线，通过待测样本的OD值可在校准曲线上查出其对应浓度值。