CN110317254A

CN110317254A - 人mbp抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒

Info

Publication number: CN110317254A
Application number: CN201810263839.2A
Authority: CN
Inventors: 朱建安; 朱仕杰
Original assignee: ANQUN BIOENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Current assignee: ANQUN BIOENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明涉及人MBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用、体外诊断试剂盒和检测人MBP和MBP‑Ab的化学发光试剂盒。所述人MBP抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列之一。所述检测人MBP的化学发光试剂盒采用双抗体夹心法检测人MBP并且包含化学发光底物。所述检测人MBP‑Ab的化学发光试剂盒采用双抗原夹心法检测人MBP‑Ab并且包含化学发光底物。本发明的人MBP抗原表位肽具有良好的抗原性，能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，所述化学发光法试剂盒具有灵敏度高、特异性强、价格低廉、稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。

Description

人MBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的MBP特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人MBP体外检测试剂盒上的应用、人MBP体外诊断试剂盒、用于定量检测样本中人MBP的化学发光试剂盒及其制备方法、以及所述特异性抗原在制备人MBP-Ab体外检测试剂盒上的应用、人MBP-Ab体外诊断试剂盒、以及用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒及其制备方法。

背景技术

髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是脊椎动物中枢神经系统少突细胞和周围神经系统雪旺细胞合成的一种强碱性膜蛋白，含有多种碱性氨基酸。构成髓鞘的蛋白质主要有髓鞘蛋白脂蛋白(MPLP)和MBP，其中MBP约占髓鞘蛋白总量的30％。MBP分中枢性MBP和周围性MBP两种。中枢性MBP由少突胶质细胞合成和分泌，在蛋白质中含量最高，主要在少突胶质细胞内以共价键结合于髓鞘质浆膜面，同时也与细胞骨架、微管、微丝相连。周围性MBP由雪旺细胞合成和分泌，存在于周围神经髓鞘中。除了神经组织外，心、肝、肾、肾上腺、骨骼肌等器官组织中MBP的含量很低，难以测出。MBP是组成髓鞘的主要蛋白之一，国内外学者对脑外伤、脑血管疾病、多发性硬化症、脑炎和脑膜炎等中枢神经系统疾病进行MBP含量测定，认为髓鞘蛋白可释放到脑脊液或血液，并可作为判断中枢神经系统破坏程度的指标，对判断病情严重程度和预后有重要意义。

人类MBP是中枢神经系统所特有的蛋白质。近年来大量研究表明，当中枢神经系统遭到损伤或患某种急性疾病时，血脑屏障受到破坏或通透性改变，使患者血清中的MBP含量明显增高。为此，采用特异性强，灵敏度高的酶联免疫吸附法对脊柱骨折伴随脊髓损伤患者血清中MBP含量测定，测定结果明显高于正常人；在脊髓损伤后24小时，患者血清中的MBP含量上升，其上升幅度与脊髓损伤程度相平行，即患者脊髓损伤越严重，其血清中的MBP含量越高，特别是当脊髓损伤严重，损伤脊髓发生坏死、液化时，其MBP含量升高持续时间延长，这点对于早期判断急性脊髓损伤程度和估计预后具有一定的临床意义。

多发性硬化(multiple Sclerosis,MS)是中枢神经系统中常见的脱髓鞘疾病，属于特异性抗原介导的、细胞免疫和体液免疫共同参与的、中枢神经系统(CNS)炎性脱髓鞘疾病。近年来国内外文献报道了髓鞘抗体与MS的关系，已发现MS患者中存在数种自身抗体，包括抗髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体、抗蛋白脂蛋白(PLP)抗体、抗髓鞘相关糖蛋白(MAG)抗体、抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体等，其中报道最多的是抗髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体(本文中还称为“MBP-Ab”或“MBP-Ab蛋白”)。由于MBP是一种封闭的自身抗原，当MBP暴露或释放至CSF中时，可引起免疫应答，并刺激机体产生抗MBP-Ab，导致多种神经系统疾病产生。MS是中枢神经系统受累最常见的疾病。因此，可通过进行抗MBP-Ab的检测以了解MS患者有无髓鞘的破坏，为MS急性期患者的复发及首次发病患者的诊断提供有力依据。测定抗MBP-Ab及结合其他髓鞘蛋白抗体(如抗MOG抗体)可以判断首次发病或单灶患者是否会发展为MS，并可通过抗体的连续测定来判断预后。

因此，寻找合适的具有免疫原性的MBP抗原表位肽、制备特异性的MBP抗原及抗体、应用MBP抗体和先进的酶免疫、化学发光技术检测血清中的MBP和MBP-Ab，以及开发定量检测MBP的试剂盒和定量检测MBP-Ab的试剂盒即成了重点。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了人MBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒及其制备方法。

具体而言，本发明提供了：

一种人MBP抗原表位肽，其中所述MBP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

本发明还提供了一种MBP抗原，其是通过使本发明所述的人MBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种MBP抗原，其是通过使本发明所述的人MBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人MBP抗体，其是由本发明所述的MBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述MBP抗原是通过使所述的人MBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了一种人MBP抗体，其是由本发明所述的MBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体，其中所述MBP抗原是通过使所述的人MBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

本发明还提供了根据本发明所述的人MBP抗体在制备人MBP体外检测试剂盒上的应用。

本发明还提供了根据本发明所述的人MBP抗原在制备人MBP-Ab体外检测试剂盒上的应用。

本发明还提供了一种用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人MBP蛋白，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述双抗体夹心法采用第一抗MBP抗体作为捕获抗体，所述第一抗MBP抗体来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗体夹心法采用第二抗MBP抗体作为检测抗体，所述第二抗MBP抗体来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

优选地，所述第一抗MBP抗体是由第一MBP抗原制备而成的，该第一MBP抗原是通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的。

优选地，所述第二抗MBP抗体是由第二MBP抗原制备而成的，该第二MBP抗原是通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。

优选地，所述捕获抗体为单克隆抗体，所述检测抗体为多克隆抗体。

优选地，所述捕获抗体是与磁珠偶联的。优选地，所述捕获抗体与所述磁珠的用量比为(12-20ng):(1-3mg)。

优选地，所述捕获抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml。

优选地，所述检测抗体的浓度为30ng/ml至40ng/ml。

优选地，所述用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒包含鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。

优选地，在所述鲁米诺盐系统中，所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L；所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L；吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L；过氧化脲的浓度为：0.3g/L-0.5g/L。

优选地，所述用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒用于定量检测血清和血浆中的人MBP蛋白。

本发明还提供了一种用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用双抗原夹心法检测所述人MBP-Ab，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述双抗原夹心法采用第一MBP抗原作为捕获抗原，所述第一MBP抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗原夹心法采用第二MBP抗原作为检测抗原，所述第二MBP抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

优选地，所述第一MBP抗原是通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的。

优选地，所述第二MBP抗原是通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。

优选地，所述捕获抗原是与磁珠偶联的。优选地，所述捕获抗原与所述磁珠的用量比为(15-25μg):(1-3mg)。

优选地，所述捕获抗原的浓度为15μg/L至25μg/L。

优选地，所述检测抗原的浓度为18μg/L至30μg/L。

优选地，所述用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒包含鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。

优选地，所述用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒用于定量检测血清和血浆中的人MBP-Ab。

本发明还提供了一种制备根据本发明所述的用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒的方法，其包括以下步骤：

1)提供第一抗MBP抗体作为捕获抗体；

2)提供第二抗MBP抗体作为检测抗体；以及

3)提供化学发光底物。

优选地，在步骤1)中，所述捕获抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml。

优选地，在步骤1)中，将所述捕获抗体与磁珠偶联，并且所述捕获抗体与所述磁珠的用量比为(12-20ng):(1-3mg)。

优选地，在步骤2)中，所述检测抗体的浓度为30ng/ml至40ng/ml。

优选地，在步骤3)中，所述化学发光底物为鲁米诺盐系统，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。

优选地，在所述鲁米诺盐系统中，所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L；所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L；吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L；过氧化脲的浓度为0.3g/L-0.5g/L。

本发明还提供了一种制备根据本发明所述的用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒的方法，其包括以下步骤：

1)提供第一MBP抗原作为捕获抗原；

2)提供第二MBP抗原作为检测抗原；以及

3)提供化学发光底物。

优选地，在步骤1)中，所述捕获抗原的浓度为15μg/L至25μg/L。

优选地，在步骤1)中，将所述捕获抗原与磁珠偶联，并且所述捕获抗原与所述磁珠的用量比为(15-25μg):(1-3mg)。

优选地，在步骤2)中，所述检测抗原的浓度为18μg/L至30μg/L。

本发明还提供了一种人MBP体外诊断试剂盒，其包含本发明所述的人MBP抗体作为包被抗体。

优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为本发明所述的人MBP抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

本发明还提供了一种人MBP-Ab体外诊断试剂盒，其包含本发明所述的MBP抗原作为包被抗原。

优选地，所述试剂盒还包含结合抗原，所述结合抗原为本发明所述的MBP抗原，并且当所述结合抗原来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗原来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明的人MBP抗原表位肽具有良好的抗原性，用由其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

2.用本发明制备的MBP单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本(特别是血清和血浆样本)中的MBP结合。

3.本发明的人MBP化学发光试剂盒可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的MBP的水平，可用于早期急性脊髓损伤程度和评估，患者治疗疗效监控以及预后与复发风险评估。本发明的人MBP-Ab化学发光试剂盒可以有效地检测血液样本(特别是血清样本)中的MBP-Ab的水平，可用于诊断多发性硬化和判断预后。

4.本发明将化学发光技术与双抗体夹心法、双抗原夹心法相结合，提供了一种用于定量检测样本中人MBP的化学发光试剂盒(本文中也称为“人MBP化学发光试剂盒”)和一种用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒(本文中也称为“人MBP-Ab化学发光试剂盒”)，用所述试剂盒检测样本中的人MBP和MBP-Ab，操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

5.本发明在制备所述人MBP化学发光试剂盒和人MBP-Ab化学发光试剂盒的过程中，通过大量的试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的化学发光试剂盒进行检测时，检测灵敏度和结果可信度得到提高；此外，本发明试剂盒在单一发光底物的基础上加入了增强剂及稳定剂，这与传统的只有一种发光底物成分(例如鲁米诺)的情况相比，增强了发光强度和时间，克服了原有发光试剂不稳定、不易保存的缺点。本发明试剂盒可保存一年以上。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、人MBP抗原表位肽

本文中所述的人MBP蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到。

本发明提供了人MBP抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，为：

(1)Y-D-H-A-R-H-G-F-L-P-R-H-R-D-T；和

(2)Y-Q-K-S-H-G-R-T-Q-D-E-N-P。

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。

MBP抗原表位肽(1)是MBP蛋白(NCBI登录号CAA35179.1)N端第23至36位的肽段，并且在N端加上Y，从而构成含15个氨基酸的MBP抗原表位肽(1)。

MBP抗原表位肽(2)是MBP蛋白(NCBI登录号CAA35179.1)C端第101至112位的肽段，并且在N端加上Y，从而构成含13个氨基酸的MBP抗原表位肽(2)。

与MBP蛋白其他位置的序列相比，本发明所选择的肽段区间和长度在亲水性、抗原性和合成性方面更理想。所选择和添加的额外的氨基酸进一步优化了亲水性、抗原性和合成性。因此，本发明的两条抗原表位肽具有良好亲水性、抗原性强和易于合成的特点。

目前，本发明研究发现，本发明的MBP抗原表位肽具有如下功能：

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人MBP蛋白结合；4.用抗原表位肽制备的抗原可特异性地与人MBP-Ab结合。

本发明的MBP抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为2130.24、1775.80，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。

二、MBP抗原

本发明还提供了MBP抗原，其可用作双抗原夹心法中的包被抗原和结合抗原，从而用于制备人MBP-Ab体外诊断试剂盒所述MBP抗原通过使本发明的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了MBP抗原(1)和(2)，所述MBP抗原(1)通过使本发明的人MBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述MBP抗原(2)通过使本发明的人MBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。当MBP抗原(1)被选择为包被抗原时，MBP抗原(2)则被选择为结合抗原；反之亦然。

本发明的MBP抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的MBP抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

三、MBP单克隆抗体、MBP多克隆抗体和人MBP体外诊断试剂盒

本发明还提供了人MBP单克隆抗体和人MBP多克隆抗体，所述抗体可以各自利用本发明的MBP抗原(1)或(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。

本发明的MBP单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人MBP体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的MBP进行检测，优选对血液标本，特别是血清和血浆中的MBP进行检测。

因此，本发明提供了一种人MBP体外诊断试剂盒，其包含本发明的人MBP单克隆抗体或多克隆抗体。

目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。

而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。

本发明的人MBP体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测MBP蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。

优选的是，所述人MBP体外诊断试剂盒采用本发明的人MBP单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人MBP体外诊断试剂盒还优选包含人MBP多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述包被抗体来源于本发明的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述结合抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记的抗抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的抗抗体，该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。

本发明的人MBP体外诊断试剂盒优选对血清中的MBP进行检测。

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。

四、MBP包被抗原、MBP结合抗原和人MBP-Ab体外诊断试剂盒

本发明的MBP抗原可用作双抗原夹心法中的包被抗原(MBP包被抗原)和结合抗原(MBP结合抗原)，从而用于制备人MBP-Ab体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的MBP-Ab进行检测，优选对血液标本，特别是血清和血浆中的MBP进行检测。

因此，本发明还提供了一种人MBP-Ab体外诊断试剂盒，其包含本发明的MBP包被抗原和/或MBP结合抗原。

本发明的人MBP-Ab体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗原夹心法来检测MBP-Ab。该试剂盒可以包含包被抗原、酶标记的结合抗原和/或必要的工具和试剂等。所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。所述结合抗原本身也可以不带有酶标记，而是在反应中先添加结合抗原后再额外添加酶从而实现检测。酶的例子是本领域已知的。

在此，术语“包被抗原”是指包被于固相的酶标板上的抗原，其能够与待测抗体特异性结合。优选的是，所述人MBP-Ab体外诊断试剂盒包含MBP包被抗原和MBP结合抗原，其中，当所述包被抗原来源于本发明的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述结合抗原来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗原”是指试剂盒中另一种可与待测抗体特异性结合的抗原。待测抗体分别特异性识别包被抗原和结合抗原上的不同表位。

本发明的人MBP-Ab体外诊断试剂盒优选对血清中的MBP-Ab进行检测。

五、用于定量检测人MBP的化学发光试剂盒

本发明还提供了一种用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用化学发光双抗体夹心法检测所述人MBP蛋白，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述化学发光双抗体夹心法采用第一抗MBP抗体作为捕获抗体，所述第一抗MBP抗体来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述化学发光双抗体夹心法采用第二抗MBP抗体作为检测抗体，所述第二抗MBP抗体来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

在本发明的检测人MBP的化学发光试剂盒中，术语“捕获抗体”是指能够特异性识别待测抗原并结合待测抗原的抗体。

在本发明人的检测人MBP的化学发光试剂盒中，术语“检测抗体”是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别特异性识别同一待测抗原分子上的不同抗原表位。检测抗体可与检测物(例如酶标记的抗抗体)结合，或者其本身标记有检测物(例如酶标记)，从而实现待测抗原的检测。检测抗体可以为多克隆抗体。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含酶标记的抗抗体，该抗抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶等，其中优选为辣根过氧化物酶。在另一些实施方案中，所述检测抗体本身带有酶标记，例如HRP。

在本发明中，所述第一抗MBP抗体可以由第一MBP抗原制备而成，该第一MBP抗原可以通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成；并且所述第二MBP抗体可以由第二MBP抗原制备而成，该第二MBP抗原可以通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。

在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。

本发明的发明人通过大量的实验摸索，对本发明的化学发光试剂盒中的各个成分进行了优化，从而使其能够针对人MBP蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。

在本发明中，所述捕获抗体优选为单克隆抗体，并且优选是与磁珠偶联的。优选采用下文所述的方法将捕获抗体与磁珠偶联。所述检测抗体可以为多克隆抗体。

优选地，在本发明的检测人MBP的化学发光试剂盒中，所述捕获抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml，更优选为16ng/ml至18ng/ml，最优选为18ng/ml。

优选地，所述第一抗MBP抗体与所述磁珠的用量比为(12ng至20ng):(1mg至3mg)，更优选为(16ng至18ng):(1mg至2.5mg)，最优选为18ng:2mg。

优选地，在本发明的化学发光试剂盒中，所述检测抗体的浓度为30ng/ml至40ng/ml，更优选为32ng/ml至38ng/ml，最优选为36ng/ml。

优选地，本发明的人MBP的化学发光试剂盒中所用的化学发光底物是鲁米诺盐系统。鲁米诺的化学名称为5-氨基-2,3-二氢-1,4酞嗪二酮，其发光为氧化反应发光，它在碱性条件下通过HRP催化，被过氧化脲氧化而生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。

本发明对鲁米诺盐系统的组成和各组分的用量比例进行了优化。优选地，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚(4-Iodophenol，线性分子式：IC₆H₄OH)和吐温-20。其中过氧化脲作为氧化剂，鲁米诺作为发光剂，4-碘苯酚作为增强剂，吐温-20作为稳定剂。本发明的发明人惊奇地发现，这种组合既增强了发光强度和时间，又克服了常规发光剂不稳定，不易保存的缺点，使得本发明的化学发光底物可保存一年以上。

优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，鲁米诺的浓度为0.6g/L至0.9g/L，更优选为0.7g/L至0.9g/L，最优选为0.8g/L。优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，4-碘苯酚的浓度为0.1g/L至0.3g/L，更优选为0.2g/L。优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，过氧化脲的浓度为0.3g/L至0.5g/L，更优选为0.4g/L。优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，吐温-20的浓度为0.3ml/L至0.6ml/L，更优选为0.5ml/L。

优选地，本发明的检测人MBP的化学发光试剂盒还包含校准品，校准品的浓度梯度优选为0.375ng/ml、0.75ng/ml、1.5ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、12ng/ml，校准品来源于用MBP单克隆抗体纯化的MBP，可以从例如Abcan公司购买获得。

本发明的人MBP的化学发光试剂盒优选对血清和血浆中的MBP进行检测。

在一个具体的实施方案中，本发明的化学发光试剂盒在使用时，将待测血液(优选为血清或血浆)样品与偶联有MBP单克隆抗体(即捕获抗体)的磁珠混合，样品中的待测抗原(MBP)与捕获抗体特异性结合为捕获抗体-待测抗原复合物。然后洗涤去除未结合的成分，从而分离捕获抗体-待测抗原复合物。然后加入本发明的检测抗体，该检测抗体与捕获抗体-待测抗原复合物中的待测抗原特异性结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物。然后洗涤去除未结合的成分，从而分离捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗抗体，其与捕获抗体-待测抗原-检测抗体复合物中检测抗体结合。洗涤去除未结合的抗抗体，然后加入本发明所述的鲁米诺盐系统，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。之后，用化学发光仪检测光子释放的发光值，根据发光值计算MBP的浓度值。

在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明所述的用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒的方法，其包括以下步骤：

1)提供第一抗MBP抗体作为捕获抗体；

2)提供第二抗MBP抗体作为检测抗体；以及

3)提供化学发光底物。

本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人MBP蛋白的化学发光试剂盒的方法的各个步骤的条件，包括将捕获抗体与磁珠偶联，确定捕获抗体和检测抗体的浓度，选择合适的化学发光底物等，由此使得本发明的化学发光试剂盒能够针对人MBP蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。

优选地，作为所述捕获抗体的第一抗MBP抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml，更优选为16ng/ml至18ng/ml，最优选为18ng/ml。

还优选地，在步骤1)中，将所述第一抗MBP抗体与磁珠偶联，并且所述第一抗MBP抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml，所述第一抗MBP抗体与所述磁珠的用量比为(12ng至20ng):(1mg至3mg)，更优选为(16ng至18ng):(1mg至2.5mg)，最优选为18ng:2mg。

优选地，作为所述检测抗体的第二抗MBP抗体的浓度为30ng/ml至40ng/ml，更优选为32ng/ml至38ng/ml，最优选为36ng/ml。

优选地，在步骤3)中，使用鲁米诺盐系统作为所述化学发光底物，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。

还优选地，在所述鲁米诺盐系统中，鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L，更优选为0.8g/L。优选地，在所述鲁米诺盐系统中，4-碘苯酚的浓度为0.1g/L至0.3g/L，更优选为0.2g/L。优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，过氧化脲的浓度为0.3g/L至0.5g/L，更优选为0.4g/L。优选地，在本发明的鲁米诺盐系统中，吐温-20的浓度为0.3ml/L至0.6ml/L，更优选为0.5ml/L。

在本发明的一个具体实施方案中，所述步骤1)包括：从4℃冰箱取出磁珠，超声洗涤2分钟；取200μl磁珠置于磁架上，去掉上清液，余下约20μl磁珠；向磁珠中加入2.5倍体积的初洗液(9.76g MES(一水吗啉乙磺酸)，溶解于500ml水中，调节pH到6.0)，超声洗涤1分钟，反复3次；加入300μl初洗液；再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl；室温反应30分钟，去上清液，洗涤；加入偶联缓冲液(H₃BO₃ 1.24g，加入到100ml的水中，配成溶液①，Na₂B₄O₇·10H₂O 1.91g，加入到100ml水中，配成溶液②，取50ml溶液①和14.5ml溶液②，混合，加入100ml水，使用2N氢氧化钠调整pH为8.5，定容到200ml)，3倍磁珠体积，洗3次后去上清液；加入18ng/ml的MBP抗体，反应2小时，去上清液；加入4倍体积的1％(w/v)BSA封闭液，室温反应1小时，去上清液；加入0.1M的Tris终洗液，2.5倍体积洗3次，最后3倍体积定容。

在本发明的一个具体实施方案中，为确定合适的捕获抗体浓度和检测抗体浓度，将捕获抗体浓度设为18ng/ml，将MBP抗原校准品浓度设为0.375、0.75、1.5、3、6、12ng/ml，检测抗体在30ng/ml-40ng/ml的范围内分别取30ng/ml、32ng/ml、34ng/ml、36ng/ml、38ng/ml、40ng/ml这几个浓度进行试验，最终确定检测抗体最佳浓度。由比较结果可知，检测抗体浓度优选为32ng/ml至38ng/ml，最优选为36ng/ml。类似地，将检测抗体浓度设为36ng/ml，将捕获抗体浓度分别设为12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml和20ng/ml，进行对比，最终确定捕获抗体浓度。由比较结果可知，捕获抗体浓度优选为16ng/ml至18ng/ml，最优选为18ng/ml。

在本发明的一个具体实施方案中，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，因此优选以0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液(0.05mol/L的Na₂B₄O₇和0.2mol/L的H₃BO₃按照5.5:4.5的体积比配制而成，pH＝8.6)作底物液。鲁米诺和过氧化脲在无HRP催化时也能缓慢自发发光，从而在最后光强度测定中造成空白干扰，因此优选将发光底物分开配制成两部分，即：A液和B液，A液包含过氧化脲、缓冲液；B液包含4-碘苯酚、鲁米诺、吐温-20、缓冲液(A液和B液中的缓冲液均可以为上述0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液)，在使用前将A液和B液即刻混合。另外，HRP发光增强剂如某些酚试剂(如邻碘酚)或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。本系统中采用4-碘苯酚作为增强剂。

六、用于定量检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒

本发明还提供了一种用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用化学发光双抗原夹心法检测所述人MBP-Ab，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述化学发光双抗原夹心法采用第一MBP抗原作为捕获抗原，所述第一MBP抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述化学发光双抗原夹心法采用第二MBP抗原作为检测抗原，所述第二MBP抗原来源于人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

在本发明的检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒中，术语“捕获抗原”是指能够被样本中待测抗体特异性识别并结合的抗原。

在本发明人的检测MBP-Ab的化学发光试剂盒中，术语“检测抗原”是指另一种指能够被待测抗体特异性识别并结合的抗原，待测抗体能分别特异性识别捕获抗原和检测抗原上的不同表位。检测抗原可与检测物结合，或者其本身标记有检测物(例如酶标记)，从而实现待测抗体的检测。

在一些实施方案中，所述检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒包含酶标记的检测抗原，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶等，其中优选为辣根过氧化物酶。在另一些实施方案中，所述检测抗原本身也可以不带有酶标记，而是在反应中先添加检测抗原后再额外添加酶进行反应而实现检测。酶的例子是本领域已知的。

在本发明中，所述第一MBP抗原可以通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成；并且所述第二MBP抗原可以通过使所述人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。

本发明的发明人通过大量的实验摸索，对本发明的检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒中的各个成分进行了优化，从而使其能够针对人MBP-Ab的蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。

在本发明中，所述捕获抗原优选是与磁珠偶联的。优选采用下文所述的方法将捕获抗体与磁珠偶联。

优选地，在本发明的检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒中，所述捕获抗原的浓度为15μg/L至25μg/L，更优选为18μg/L至22μg/L，最优选为22μg/L。

优选地，所述捕获抗原与所述磁珠的用量比为(15μg至25μg):(1mg至3mg)，更优选为(18μg至22μg):(1mg至2.5mg)，最优选为22μg:2mg。

优选地，在本发明的检测人MBP-Ab化学发光试剂盒中，所述检测抗原的浓度为18μg/L至30μg/L，更优选为22μg/L至28μg/L，最优选为24μg/L。

优选地，本发明的人MBP-Ab的化学发光试剂盒中所用的化学发光底物是鲁米诺盐系统。鲁米诺的化学名称为5-氨基-2,3-二氢-1,4酞嗪二酮，其发光为氧化反应发光，它在碱性条件下通过HRP催化，被过氧化脲氧化而生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。

优选地，本发明的人MBP-Ab的化学发光试剂盒还包含校准品，校准品的浓度梯度优选为0.75μg/L、1.5μg/L、3μg/L、6μg/L、9μg/L，校准品来源于纯化的MBP-Ab，可以从例如Abcan公司购买获得。

本发明的人MBP-Ab的化学发光试剂盒优选对血清和血浆中的MBP-Ab进行检测。

在一个具体的实施方案中，本发明的检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒在使用时，将待测血液(优选为血清或血浆)样品与偶联有纯化的MBP抗原(即捕获抗原)的磁珠混合，样品中的待测抗体(MBP-Ab)与捕获抗原特异性结合为捕获抗原-待测抗体复合物。然后洗涤去除未结合的成分，从而分离捕获抗原-待测抗体复合物。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)(以下简称酶)标记的本发明的检测抗原，该酶标记的检测抗原与捕获抗原-待测抗体复合物中的待测抗体特异性结合，形成捕获抗原-待测抗体-酶标记的检测抗原复合物。然后洗涤去除未结合的成分，从而分离捕获抗原-待测抗体-酶标记的检测抗原复合物。然后加入本发明所述的鲁米诺盐系统，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。之后，用化学发光仪检测光子释放的发光值，根据发光值计算MBP-Ab的浓度值。

在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明所述的用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒的方法，其包括以下步骤：

1)提供第一MBP抗原作为捕获抗原；

2)提供第二MBP抗原作为检测抗原；以及

3)提供化学发光底物。

本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人MBP-Ab的化学发光试剂盒的方法的各个步骤的条件，包括将捕获抗原与磁珠偶联，确定捕获抗原和检测抗原的浓度，选择合适的化学发光底物等，由此使得本发明的化学发光试剂盒能够针对人MBP-Ab获得符合临床检测要求的结果，即，准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好。

优选地，作为所述捕获抗原的第一MBP抗原的浓度为15μg/L至25μg/L，更优选为18μg/L至22μg/L，最优选为22μg/L。

还优选地，在步骤1)中，将所述第一MBP抗原与磁珠偶联，并且所述第一MBP抗原的浓度为15μg/L至25μg/L，所述第一MBP抗原与所述磁珠的用量比为(15μg至25μg):(1mg至3mg)，更优选为(18μg至22μg):(1mg至2.5mg)，最优选为22μg:2mg。

优选地，作为所述检测抗原的第二MBP抗原的浓度为18μg/L至30μg/L，更优选为22μg/L至28μg/L，最优选为24μg/L。

在本发明的一个具体实施方案中，所述步骤1)包括：从4℃冰箱取出磁珠，超声洗涤2分钟；取200μl磁珠置于磁架上，去掉上清液，余下约20μl磁珠；向磁珠中加入2.5倍体积的初洗液(9.76g MES(一水吗啉乙磺酸)，溶解于500ml水中，调节pH到6.0)，超声洗涤1分钟，反复3次；加入300μl初洗液；再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl；室温反应30分钟，去上清液，洗涤；加入偶联缓冲液(H₃BO₃ 1.24g，加入到100ml的水中，配成溶液①，Na₂B₄O₇·10H₂O 1.91g，加入到100ml水中，配成溶液②，取50ml溶液①和14.5ml溶液②，混合，加入100ml水，使用2N氢氧化钠调整pH为8.5，定容到200ml)，3倍磁珠体积，洗3次后去上清液；加入22μg/L的MBP抗原，反应2小时，去上清液；加入4倍体积的1％(w/v)BSA封闭液，室温反应1小时，去上清液；加入0.1M的Tris终洗液，2.5倍体积洗3次，最后3倍体积定容。

在本发明的一个具体实施方案中，为确定合适的捕获抗原浓度和检测抗原浓度，将捕获抗原浓度设为22μg/L，将MBP-Ab校准品浓度设为0.75、1.5、3、6、9μg/L，检测抗原在18μg/L-30μg/L的范围内分别取18μg/L、20μg/L、22μg/L、24μg/L、26μg/L、28μg/L、30μg/L这几个浓度进行试验，最终确定检测抗原最佳浓度。由比较结果可知，检测抗原浓度优选为22μg/L至28μg/L，最优选为24μg/L。类似地，将检测抗原浓度设为24μg/L，将捕获抗原浓度分别设为15μg/L、16μg/L、18μg/L、20μg/L、22μg/L、24μg/L和25μg/L，进行对比，最终确定捕获抗原浓度。由比较结果可知，捕获抗原浓度优选为18μg/L至22μg/L，最优选为22μg/L。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

实施例

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。

实施例1：MBP抗原表位肽(1)和(2)的制备。

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别合成MBP抗原表位肽(1)和(2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为2130.24、1775.80，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。

一、MBP抗原表位肽(1)和(2)的合成

上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。

本发明的MBP抗原表位肽(1)和(2)的各自的具体制备步骤如下：

1.所用原料：

HMP树脂(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司)

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司)

DCM(二氯甲烷，可购自中原化工公司)

MeoH(甲醇，可购自中原化工公司)

哌啶(Piperidine，可购自sigma公司)

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司)

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司)

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司)

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司)

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

2.使用仪器：

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司

旋转蒸发仪，型号R－201，可购自上海申顺公司

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(2)连接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束。

分别得到MBP肽段(1)的肽树脂28mg和MBP肽段(2)的肽树脂36mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到MBP肽段(1)和(2)的粗品。

二、MBP抗原表位肽(1)和(2)粗品的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱：C8 10×100mm，可购自美国Waters公司

色谱仪：Waters 600，美国Waters公司

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长：214nm

流速：4ml/分钟

洗脱梯度：20-60％B，30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱：C18 4.6×150mm，可购自美国Waters公司流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/分钟

洗脱梯度：0-60％B，30分钟

肽段分析结果显示本发明的MBP抗原表位肽(1)和(2)的纯度均为95％以上。

三、MBP抗原表位肽(1)和(2)的鉴定

1.利用质谱分别测定纯化所得的MBP抗原表位肽(1)和(2)的分子量。

(1)试剂原料

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司)

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司)

(2)仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。

(5)操作步骤：分别取1μL上述纯化多肽(1)和(2)的样品，各自与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，分别取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。

结果，测得所得MBP抗原表位肽(1)的分子量为2131.02，MBP抗原表位肽(2)的分子量为1774.98，与理论分子量2130.24、1775.80一致，证明合成多肽即为目的产物。

2.通过多肽序列测定分别鉴定所得MBP抗原表位肽(1)和(2)的序列。

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：(1)偶联：异硫氰酸苯酯与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。(2)环化裂解：PTC-肽环化裂解。(3)转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪

(3)试剂原料

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司)

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司

氯丁烷，可购自sigma公司

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司

(4)测定

按仪器说明书进行。

结果：经鉴定，所得MBP抗原表位肽(1)和(2)的序列分别为：

(1)Y-D-H-A-R-H-G-F-L-P-R-H-R-D-T；和

(2)Y-Q-K-S-H-G-R-T-Q-D-E-N-P。

该结果与目标合成肽段一致。

实施例2：分别将实施例1所得的MBP抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备MBP抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将MBP肽段(1)和(2)分别与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)(购自sigma公司)连接制备成MBP抗原(1)和(2)。

取MBP肽段(1)或(2)6.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)溶解；KLH 10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH 8.6)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂ 110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。

在各实施例中，PBS缓冲液(如果使用)的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄ 81ml加0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19ml混合而成。

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.取上述制备的MBP抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的不完全弗氏佐剂(购自sigma公司)充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，每次间隔2-3周，融合前另外连续加强免疫两次，每次间隔1-2周，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自宝域生物公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA方法进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只，10天后收集腹水。

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用MBP抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:32000以上。

利用MBP抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.选用三个月龄、体重约为2.5kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的MBP抗原(1)和(2)(免疫原)分别与等体积的完全弗氏佐剂(购自sigma生物公司)混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射，每隔4周加强免疫一次，共加强免疫6次。之后抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射进行末次加强免疫。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用MBP抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:32000以上。

利用MBP抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人MBP单克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人MBP蛋白、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)(均购自上海联硕公司)为包被抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的MBP单克隆抗体(1)和(2)与该人MBP蛋白的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：MBP单克隆抗体(1)和(2)分别只与MBP反应为阳性(P/N>2.1)，而与髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)反应为阴性，说明本发明的MBP单克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4：人MBP多克隆抗体(1)和(2)的特异性鉴定

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。

结果显示：MBP多克隆抗体(1)和(2)分别与MBP反应为阳性(P/N>2.1)，而与髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)反应为阴性，说明本发明的MBP多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例5：本发明制备的MBP抗原与MBP-Ab的特异性反应鉴定

以ELISA进行检测。分别以人MBP-Ab、人MAG-Ab、人MOG-Ab(均购自上海联硕公司)为包被抗体包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的MBP抗原与MBP-Ab的特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：本发明制备的MBP抗原只与人MBP-Ab反应为阳性(P/N>2.1)，而与人MAG-Ab、人MOG-Ab反应为阴性，说明本发明的MBP抗原只与MBP-Ab特异性反应。

实施例6：利用MBP单克隆抗体和MBP多克隆抗体制备MBP体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用MBP抗原表位肽(1)制备的MBP单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用MBP抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为结合抗体。

MBP体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、酶标记物稀释液

10×PBS-Tween 20：10ml

FCS(小牛血清)：20ml

蒸馏水溶至1000ml

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克

生物防腐剂(可购自上海西宝公司)：1ml

D、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

E、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

F、终止液：2M H2SO4

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将MBP单克隆抗体(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(MBP多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

MBP校准品(原料购自Abcan公司)：6个：6×1.0ml(浓度分别为0.375ng/ml、0.75ng/ml、1.5ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、12ng/ml)

MBP结合抗体：1×10ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×10ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血清以及校准品100μl/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入MBP结合抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ng/ml	0.375	0.75	1.5	3	6	12
							平均OD值	0.076	0.146	0.298	0.549	1.113	2.236

以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.975。

根据标准曲线计算所检测的标本中的MBP浓度结果。

对54例患者和114例健康者按上述方式进行血清MBP检测，患者血清中的MBP含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2：两组样本MBP浓度比较

由以上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的MBP含量，从而检测出患者和正常人之间的MBP含量差异。

实施例7：利用MBP抗原(1)和MBP抗原(2)制备MBP-Ab体外诊断试剂盒。

在本实施例中，将实施例2中利用MBP抗原表位肽(1)制备的MBP抗原(1)作为本试剂盒中的包被抗原；将实施例2中利用MBP抗原表位肽(2)制备的MBP抗原(2)作为结合抗原。

MBP-Ab体外诊断试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃：16.0克

NaHCO₃：29.0克

蒸馏水溶至1000ml

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20

Na₂HPO₄·12H₂O：58克

KH₂PO₄：4克

NaCl：100克

KCl：4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20：20ml

C、显色剂A：

柠檬酸：35.5克

过氧化脲：10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20：10ml

D、显色剂B：

柠檬酸：120克

EDTA-2Na：1克

TMB·2HCl：2克

蒸馏水溶至1000ml

E、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml

蒸馏水：177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将MBP抗原(1)溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液(包被抗原浓度22μg/L)，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗原(MBP抗原(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，用辣根过氧化物酶标记抗原使用本领域的常规方法和条件进行。

4.试剂盒的组成：

预包被板：48/96孔

MBP-Ab校准品(原料购自Abcan公司)：5个：5×1.0ml(浓度分别为0.75μg/L、1.5μg/L、3μg/L、6μg/L、9μg/L)

酶标记的MBP结合抗原：1×10ml(浓度为24μg/L)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中分别加入待检血清以及校准品100μl/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入酶标记MBP结合抗原100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液，每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表3：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

浓度ug/L	0.75	1.5	3	6	9
						平均OD值	0.066	0.127	0.215	0.374	0.714

以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.977。

根据标准曲线计算所检测的标本中的MBP-Ab浓度结果。

对70例患者和152例健康者按上述方式进行血清MBP-Ab检测，患者血清中的MBP-Ab含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4：两组样本MBP浓度比较

由以上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的MBP-Ab含量，从而检测出患者和正常人之间的MBP-Ab含量差异。

实施例8：用于检测样本中人MBP的化学发光试剂盒的制备。

在本实施例中，将实施例2中利用MBP抗原表位肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中的捕获抗体；将实施例2中利用MBP抗原表位肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为检测抗体。

MBP化学发光试剂盒的制备和操作如下：

1.缓冲液配制

A、初洗缓冲液

称取MES(一水吗啉乙磺酸)9.76克，溶于500毫升水中，调节PH到6.0。

B、偶联缓冲液

称取硼酸(H₃BO₃)1.24克，溶于100毫升水中，配制成溶液1；

称取四硼酸钠(硼砂)1.91克，溶于100毫升水中，配制成溶液2；

取50毫升溶液1和14.5毫升溶液2，混合，加入100毫升水；

使用2N氢氧化钠调整PH到8.5，定容至200毫升。

C、封闭缓冲液

取乙醇胺，配制成0.08M溶液；

向该溶液中加入BSA，并使其最终固含量达到1％(w/v)。

D、终洗缓冲液

在纯化水中加入吐温-20，至溶液浓度0.2％(v/v)；

向溶液中加入BSA，并使其最终固含量达到1％。

2.磁珠与捕获抗体的偶联：

从4℃冰箱取出磁珠(购自天津倍斯乐公司，产品货号3412)，超声洗涤2分钟；取200μl磁珠置于磁架上，去掉上清液，余下约20μl磁珠；向磁珠中加入2.5倍体积的初洗缓冲液，超声洗涤1分钟，反复3次；加入300μl初洗缓冲液；再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl；室温反应30分钟，去上清液，洗涤；加入偶联缓冲液，3倍磁珠体积，洗3次后去上清液；加入18ng/ml的MBP抗体500μl，室温反应2小时，去上清液；加入4倍体积的封闭缓冲液，室温反应1小时，去上清液；加入0.1M的终洗缓冲液，2.5倍体积洗3次，最后3倍体积定容。

3.检测抗体(MBP多克隆抗体(2))和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)(购自北京中杉金桥公司)的浓度和稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液以1:5000进行稀释。

4.试剂盒的组成：

与捕获抗体偶联的磁珠：1×2ml(捕获抗体浓度为18ng/ml)

MBP校准品(原料购自Abcan公司)：6个，6×1.0ng/ml(浓度分别为0.375ng/ml、0.75ng/ml、1.5ng/ml、3ng/ml、6ng/ml、12ng/ml)

MBP检测抗体(MBP多克隆抗体(2))：1×10ml(浓度为36ng/ml)

酶联物：1×20ml

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

发光底物(A液包含0.4g/L过氧化脲、0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液；B液包含0.2g/L 4-碘苯酚、0.8g/L鲁米诺、0.5ml/L吐温-20、0.1mol/L pH8.6硼酸盐缓冲液)：2×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

自4℃冰箱取出试剂，室温平衡15分钟；浓缩洗涤液1:25稀释成工作液。将待测的血清、血浆样品及校准品分别定位于含20μl磁珠的反应杯中，校准品各浓度各设一杯，另设一杯作空白对照。样品或校准品于相应反应杯分别加100μl，置37℃恒温反应60分钟，洗涤。吸除反应杯中的反应液，各反应杯加入洗涤液约400μl，静置20秒左右，除去其中液体，洗涤。如此共洗三次，最后一遍将反应杯中液体吸干。除空白反应杯外，各反应杯加MBP多克隆抗体(2)100μl，置37℃恒温反应60分钟。吸除反应杯中的反应液，各反应杯加入洗涤液约400μl，静置20秒左右，除去其中液体，洗涤。如此共洗三次，最后一遍将反应杯中液体吸干。每反应杯加入化学发光底物A、B液各50μl。于加底物后的第10分钟测定各孔的发光值RLU(检测仪器：江苏泽成公司生产的化学发光分析仪，型号CIA600)。

6.结果判定：

表5：校准品浓度和对应的平均发光值RLU

以校准品浓度和对应发光值的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.976。根据标准曲线计算所检测的样品中的MBP浓度结果。

由于标准曲线的R²＝0.976，因此用本发明的MBP化学发光试剂盒检测的校准品浓度与校准品的实际浓度拟合程度较高，这说明本发明的化学发光试剂盒的检测准确性和可信度优良。

鲁米诺盐发光系统参数不变，其他浓度的捕获抗体和检测抗体的检测结果如表6所示。

表6

捕获抗体和检测抗体的浓度不变，不同含量的鲁米诺盐发光系统(过氧化脲浓度0.4g/L)的检测结果如表7所示。

表7

7.MBP化学发光试剂盒性能评价

1)灵敏度：对0.375ng/ml校准品进行20次重复测定，计算发光值RLU值，用标准曲线反算出其x+2s对应的浓度值，结果是0.350ng/ml，表明本发明的MBP化学发光试剂盒灵敏度良好。

2)准确度：用回收试验测定，在MBP浓度为12ng/ml的1份体积校准品中加入10份体积MBP浓度为0.375ng/ml校准品并混合，测定回收率范围在85～115％，表明本发明的MBP化学发光试剂盒准确度良好。

3)精密度：用本发明的MBP化学发光试剂盒分别检测MBP浓度分别为3ng/ml和12ng/ml的校准品血清，重复检测10次，进行批内精密度测定。

每天对上述2个浓度的三个不同批次的校准品血清进行测定，1天1次，连续测20天，进行批间精密度测定。结果批内CV(变异系数)分别是4.8％和6.1％，批间CV分别是9.5％和8.6％。批内CV和批间CV均小于10％，说明本发明的MBP化学发光试剂盒精密性良好。

4)稳定性：用本发明的MBP化学发光试剂盒在37℃保温箱中放置3天、5天、7天，用这些试剂盒做测试结果标准曲线，观察到放置3天、5天与放置0天无明显区别，放置7天后，最大A值较低，且线性较差，利用阿伦尼乌斯方程换算得知本发明的MBP化学发光试剂盒在出厂后12个月内稳定性良好。

5)特异性：用本发明的MBP化学发光试剂盒，检测含人抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)且MBP阴性的临床血清和血浆样本，用校准品稀释液(PBS、10％(w/v)小牛血清及0.03％(w/v)生物防腐剂配制而成)稀释，测定发光值RLU，计算与MOG的交叉反应情况。试验结果表明，与MOG的交叉反应率为0.36％，本发明的MBP化学发光试剂盒特异性良好。

实施例9：用于检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒的制备。

在本实施例中，将实施例2中利用MBP抗原表位肽(1)制备的MBP抗原(1)作为本试剂盒中的捕获抗原；将实施例2中利用MBP抗原表位肽(2)制备的MBP抗原(2)作为检测抗原。

MBP-Ab化学发光试剂盒的制备和操作如下：

1.缓冲液配制

A、初洗缓冲液

B、偶联缓冲液

称取硼酸(H₃BO₃)1.24克，溶于100毫升水中，配制成溶液1；

称取四硼酸钠(硼砂)1.91克，溶于100毫升水中，配制成溶液2；

取50毫升溶液1和14.5毫升溶液2，混合，加入100毫升水；

使用2N氢氧化钠调整PH到8.5，定容至200毫升。

C、封闭缓冲液

取乙醇胺，配制成0.08M溶液；

向该溶液中加入BSA，并使其最终固含量达到1％(w/v)。

D、终洗缓冲液

在纯化水中加入吐温-20，至溶液浓度0.2％(v/v)；

向溶液中加入BSA，并使其最终固含量达到1％。

2.磁珠与捕获抗原的偶联：

从4℃冰箱取出磁珠(购自天津倍斯乐公司，产品货号3412)，超声洗涤2分钟；取200μl磁珠置于磁架上，去掉上清液，余下约20μl磁珠；向磁珠中加入2.5倍体积的初洗缓冲液，超声洗涤1分钟，反复3次；加入300μl初洗缓冲液；再分别配制25mg/ml EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC和NHS溶液按1:1体积的比例各加入100μl；室温反应30分钟，去上清液，洗涤；加入偶联缓冲液，3倍磁珠体积，洗3次后去上清液；加入22μg/L的MBP抗原80μl，室温反应2小时，去上清液；加入4倍体积的封闭缓冲液，室温反应1小时，去上清液；加入0.1M的终洗缓冲液，2.5倍体积洗3次，最后3倍体积定容。

3.酶(辣根过氧化物酶，购自北京中杉金桥公司)标记的检测抗原(MBP抗原(2))的浓度和稀释比例均由方阵滴定实验确定。

4.试剂盒的组成：

与捕获抗原偶联的磁珠：1×2ml

MBP-Ab校准品(原料购自Abcan公司)：5个，5×1.0μg/L(浓度分别为0.75μg/L、1.5μg/L、3μg/L、6μg/L、9μg/L)

酶标记的MBP检测抗原(MBP抗原(2))：1×10ml(浓度为24μg/L)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

5.试剂盒的操作步骤：

自4℃冰箱取出试剂，室温平衡15分钟；浓缩洗涤液1:25稀释成工作液。将待测的血清、血浆样品及校准品分别定位于含20ul磁珠的反应杯中，校准品各浓度各设一杯，另设一杯作空白对照。样品或校准品于相应反应杯分别加100μl，置37℃恒温反应60分钟，洗涤。吸除反应杯中的反应液，各反应杯加入洗涤液约400μl，静置20秒左右，除去其中液体，洗涤。如此共洗三次，最后一遍将反应杯中液体吸干。除空白反应杯外，各反应杯加酶标记的MBP抗原(2)100μl，置37℃恒温反应60分钟。吸除反应杯中的反应液，各反应杯加入洗涤液约400μl，静置20秒左右，除去其中液体，洗涤。如此共洗三次，最后一遍将反应杯中液体吸干。每反应杯加入化学发光底物A、B液各50μl。于加底物后的第10分钟测定各孔的发光值RLU(检测仪器：江苏泽成公司生产的化学发光分析仪，型号CIA600)。

6.结果判定：

表8：校准品浓度和对应的平均发光值RLU

以校准品浓度和对应发光值的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R²＝0.975。根据标准曲线计算所检测的样品中的MBP-Ab浓度结果。

由于标准曲线的R²＝0.975，因此用本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒检测的校准品浓度与校准品的实际浓度拟合程度较高，这说明本发明的化学发光试剂盒的检测准确性和可信度优良。

鲁米诺盐发光系统参数不变，其他浓度的捕获抗原和检测抗原的检测结果如表9所示。

表9

捕获抗原和检测抗原的浓度不变，不同含量的鲁米诺盐发光系统(过氧化脲浓度0.4g/L)的检测结果如表10所示。

表10

7.MBP-Ab化学发光试剂盒性能评价

1)灵敏度：对0.75μg/L校准品进行20次重复测定，计算发光值RLU值，用标准曲线反算出其x+2s对应的浓度值，结果是0.743μg/L，表明本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒灵敏度良好。

2)准确度：用回收试验测定，在MBP-Ab浓度为9μg/L的1份体积校准品中加入10份体积的MBP-Ab浓度为0.75ug/L的校准品并混合，测定回收率范围在85～115％，表明本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒准确度良好。

3)精密度：用本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒分别检测MBP-Ab浓度分别为1.5μg/L和6μg/L的校准品血清，重复检测10次，进行批内精密度测定。

每天对上述2个浓度的三个不同批次的校准品血清进行测定，1天1次，连续测20天，进行批间精密度测定。结果批内CV(变异系数)分别是6.9％和5.4％，批间CV分别是8.8％和9.2％。批内CV和批间CV均小于10％，说明本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒精密性良好。

4)稳定性：用本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒在37℃保温箱中放置3天、5天、7天，用这些试剂盒做测试结果标准曲线，观察到放置3天、5天与放置0天无明显区别，放置7天后，最大A值较低，且线性较差，利用阿伦尼乌斯方程换算得知本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒在出厂后12个月内稳定性良好。

5)特异性：用本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒，检测含人抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体(MOG-Ab)且MBP-Ab阴性的临床血清和血浆样本，用校准品稀释液(PBS、10％(w/v)小牛血清及0.03％(w/v)生物防腐剂配制而成)稀释，测定发光值RLU，计算与MOG-Ab的交叉反应情况。试验结果表明，与MOG-Ab的交叉反应率为0.42％，本发明的MBP-Ab化学发光试剂盒特异性良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市安群生物工程有限公司

<120> 人MBP抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒

<130> FI-180870-59:52/C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Tyr Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Tyr Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro

1 5 10

Claims

1.一种人MBP抗原表位肽，其中所述MBP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之一：

(1)Tyr-Asp-His-Ala-Arg-His-Gly-Phe-Leu-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr；

(2)Tyr-Gln-Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro。

2.一种MBP抗原，其是通过使权利要求1所述的人MBP抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的。

3.一种MBP抗原，其是通过使权利要求1所述的人MBP抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。

4.一种人MBP抗体，其是由权利要求2所述的MBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

5.一种人MBP抗体，其是由权利要求3所述的MBP抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求4或5所述的人MBP抗体在制备人MBP体外检测试剂盒上的应用。

7.根据权利要求2或3所述的MBP抗原在制备人MBP-Ab体外检测试剂盒上的应用。

8.一种用于定量检测样本中人MBP蛋白的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用双抗体夹心法检测所述人MBP蛋白，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述双抗体夹心法采用第一抗MBP抗体作为捕获抗体，所述第一抗MBP抗体来源于权利要求1所述的抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗体夹心法采用第二抗MBP抗体作为检测抗体，所述第二抗MBP抗体来源于权利要求1所述的抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

9.根据权利要求8所述的化学发光试剂盒，其中所述捕获抗体是与磁珠偶联的，并且所述捕获抗体与所述磁珠的用量比为(12-20ng):(1-3mg)。

10.根据权利要求8所述的化学发光试剂盒，其中所述捕获抗体的浓度为12ng/ml至20ng/ml，所述检测抗体的浓度为30ng/ml至40ng/ml。

11.一种用于定量检测样本中人MBP-Ab的化学发光试剂盒，所述试剂盒采用双抗原夹心法检测所述人MBP-Ab，并且所述试剂盒包含化学发光底物，其中：

所述双抗原夹心法采用第一MBP抗原作为捕获抗原，所述第一MBP抗原来源于权利要求1所述的抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗原夹心法采用第二MBP抗原作为检测抗原，所述第二MBP抗原来源于权利要求1所述的抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

12.根据权利要求11所述的化学发光试剂盒，其中所述捕获抗原是与磁珠偶联的，并且所述捕获抗原与所述磁珠的用量比为(15-25μg):(1-3mg)。

13.根据权利要求11所述的化学发光试剂盒，其中所述捕获抗原的浓度为15μg/L至25μg/L，所述检测抗原的浓度为18μg/L至30μg/L。

14.根据权利要求8或11所述的化学发光试剂盒，其中所述化学发光底物为鲁米诺盐系统，所述鲁米诺盐系统包含过氧化脲、鲁米诺、4-碘苯酚和吐温-20。

15.根据权利要求14所述的化学发光试剂盒，其中在所述鲁米诺盐系统中，所述鲁米诺的浓度为0.6g/L-0.9g/L；所述4-碘苯酚的浓度为0.1g/L-0.3g/L；吐温-20的浓度为0.3ml/L-0.6ml/L；过氧化脲的浓度为：0.3g/L-0.5g/L。

16.一种人MBP体外诊断试剂盒，其包含权利要求4或5所述的人MBP抗体作为包被抗体。

17.根据权利要求16所述的人MBP体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为权利要求4或5所述的人MBP抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。

18.一种人MBP-Ab体外诊断试剂盒，其包含权利要求2或3所述的MBP抗原作为包被抗原。

19.根据权利要求18所述的人MBP-Ab体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合抗原，所述结合抗原为权利要求2或3所述的MBP抗原，并且当所述结合抗原来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗原来源于所述的人MBP抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。