CN114957438B - 用于检测阿尔茨海默病的人Aβ1-42抗原决定簇多肽及制法 - Google Patents

用于检测阿尔茨海默病的人Aβ1-42抗原决定簇多肽及制法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测阿尔茨海默病的人Aβ1‑42抗原决定簇多肽及制法。该人Aβ1‑42抗原决定簇多肽可用于制备抗原、抗体、用途及试剂盒；本发明的人Aβ1‑42抗原决定簇多肽的氨基酸序列为Tyr‑Arg‑Asp‑Gly‑Asp‑Gly‑Asp‑Met‑Val‑Gly‑Gly‑Val‑Val‑Ile‑Ala。Aβ1‑42抗原可由人Aβ1‑42抗原决定簇多肽与蛋白载体偶联制得；Aβ1‑42单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的Aβ1‑42抗原制得；Aβ1‑42单克隆抗体或多克隆抗体用于制备Aβ1‑42体外诊断试剂盒；本发明的人Aβ1‑42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人Aβ1‑42的体外检测。本发明能够以高纯度大批量制备人Aβ1‑42抗原决定簇多肽。

Description

用于检测阿尔茨海默病的人Aβ1-42抗原决定簇多肽及制法
技术领域
本发明属于多肽化学和免疫学领域，涉及人Aβ1-42抗原决定簇多肽。使用该人Aβ1-42抗原决定簇多肽，可以制备Aβ1-42抗原，进而制备相应的单克隆抗体或多克隆抗体，此外，此类抗体可用于制备人Aβ1-42体外诊断试剂盒，此类试剂盒例如可以用于检测阿尔茨海默病患者血清或血浆样本中的Aβ1-42浓度，为阿尔茨海默病的诊断提供有效的科学依据。
背景技术
CN103665113A(中国专利申请号201210345681.6)公开了一种人Aβ1-42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒，其中涉及具有如下氨基酸序列的人Aβ1-42抗原决定簇多肽：Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。该人Aβ1-42抗原决定簇多肽用于阿尔茨海默病的预测、早期发现及预防、病程发展和疗效观察是有益的。此外，CN111197040A(申请号2020100721960，亿彤生物)公开了壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒，据信该发明的CHI3L1抗原表位肽呈现良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人CHI3L1的体外检测。上述CN103665113A和CN111197040A公开的相关技术信息通过引用并入本文。
目前，我国已经进入老龄化社会，而阿尔茨海默病(AD)是老年人的常见病和多发病，又称老年性痴呆，60岁以上老人的发病率>5％。AD是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，患者进行性智力和认知功能降低。神经退行性疾病是由于神经元进行性变性、死亡导致的、以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，严重危害人类身体健康，但其病因不清，发病机理复杂，缺乏有效的治疗措施。除人们熟知的老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)等以外，在人群中发病率日趋增高、且发病年龄日趋下降的糖尿病晚期并发症均以神经退行性病变为首发因素。由于神经退行性疾病缺乏有效的早期诊断措施，给治疗、护理带来了一系列实实在在的问题，同时给社会和家庭造成了沉重的经济负担和精神压力。例如老年性痴呆(AD，也称阿尔茨海默病)，预计到2050年我国老年性痴呆患者将达到2000万人。如果政府和家庭对每一位AD病人花费的医疗费、护理费和家庭成员的误工费等平均每年1万元，那么到2050年我国对老年痴呆患者每年将付出2000亿元的费用。如此之重的经济负担将严重阻碍我国的经济发展，并可能引发社会问题。故研究神经退行性变发病机理和延缓、阻断其发展的干预手段，有着至关重要的意义。
作为引起老年痴呆最常见的病因，阿尔茨海默病临床上表现为智力水平的慢性削弱及记忆的慢性丢失。随着全球人口的老龄化，AD发病率也与日俱增，因此，AD的及时诊断与治疗必将越来越受到重视。
老年性痴呆的主要神经病理学特征是神经元细胞内出现神经元纤维缠绕结，神经细胞外有神经变性斑(老年斑)。目前认为构成老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(amyloidbeta-protein，Aβ)，是β淀粉样前体蛋白(β-amyloid Precursor protein，APP)的代谢产物，Aβ有两种形式，分别是由40个氨基酸和42个氨基酸组成的多肽片段，前者称为Aβ1-40，正常老年人和AD患者脑内均有；后者称为Aβ1-42，主要见于AD患者脑内。近年大量研究表明Aβ1-42的增加与AD发病密切相关，它主要引起脑组织形成可溶性的Aβ1-42寡聚体及不溶性的Aβ沉积，即AD特有的病理改变，且Aβ1-42在CSF(脑脊液)和血液中都能检出，是AD重要的标志物。在AD病人患病期间，血液中Aβ1-42浓度增高，消耗了Aβ1-42抗体，进而导致Aβ1-42抗体含量低于健康老年人，因此，如果在AD发病前和发病过程中的不同阶段对血液中Aβ1-42及Aβ1-42抗体进行追踪检测，一方面可用于诊断已出现症状的病人并对病情程度进行跟踪；另一方面，也是更重要的，用于诊断尚未出现明显症状的老人，在发病之前进行预防性医治，延缓发病时间。因此，如CN103665113A所制成的Aβ1-42检测试剂盒和Aβ1-42抗体检测试剂盒，它们对于AD预测、早期发现及预防、病程发展和疗效观察具有重要意义。
本领域仍然期待有用于阿尔茨海默病检测、观察、预测等的更高效的手段，例如改进Aβ1-42检测试剂盒的制造过程。例如，本领域仍然期待有制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽的方法，例如制备高纯度人Aβ1-42抗原决定簇多肽的方法，以及由此方法制得的高纯度人Aβ1-42抗原决定簇多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种人Aβ1-42抗原决定簇多肽，该人Aβ1-42抗原决定簇多肽能够用于制备Aβ1-42抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，进而可将其用于制备体外诊断试剂盒，以用于阿尔茨海默病的检测、观察、预测。例如，本发明的目的在于提供一种制备高纯度人Aβ1-42抗原决定簇多肽的方法，例如本发明的目的在于提供一种高纯度人Aβ1-42抗原决定簇多肽。已经出人意料地发现，通过本发明方法能够获得高纯度人Aβ1-42抗原决定簇多肽。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其具有如下氨基酸序列：
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。
在本发明中，上述氨基酸链片段，可称为人Aβ1-42抗原决定簇多肽，或者亦可称为Aβ1-42抗原决定簇多肽、抗原决定簇多肽、肽、多肽等类似称呼。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，在制备该肽时，是以如下方式接入Tyr的：
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂；将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥，得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂即保护的十五肽树脂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，在制备该肽之接入Tyr的过程中，所用的Fmoc保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比＝1：1：1：4。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，在制备该肽之接入Tyr的过程中，氨丁三醇的量是DIEA的6％，以摩尔百分数计。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其是通过如下方法制备得到的：
步骤1：Fmoc-Ala-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中，加入二氯甲烷，振荡并浸泡，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂，
向以上处理的树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，
将30mmol的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Ala-树脂；
步骤2：向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Ile-Ala-树脂；
步骤3：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤4：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤5：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤6：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤7：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤8：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Met-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤9：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤10：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤11：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤12：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤13：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤14：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤15：向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥，得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂即保护的十五肽树脂；
步骤16：肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶，加入预冷切割液(例如95％三氟乙酸/2％TIS/2％EDT/1％水)，室温搅拌反应，抽滤使分取滤液，用三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液和洗涤液，加冰冻乙醚使沉淀，过滤得沉淀物，即为十五肽的粗品；
步骤17：依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化，得肽精制品，即为人Aβ1-42抗原决定簇多肽。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤17之分离纯化照如下方式进行：
(1)将上一步骤所得肽粗品溶于例如含0.1％三氟乙酸的70％乙腈，用离子交换色谱系统例如ShodexIEC SP-420N例如以含0.1％三氟乙酸的70％乙腈为溶剂进行洗脱，收集肽主峰流分，
(2)使用如下高效液相色谱法，对上述肽主峰进行分离纯化：
色谱柱：C8，10×100mm，
色谱仪：工业制备液相色谱，
流动相：流动相A为0.1％TFA水溶液，流动相B为添加0.1％TFA的70％乙腈，洗脱梯度为0～45分钟期间15％B-60％B，
流速：4ml/分钟，
检测波长：214nm，
(3)将收集所得主峰流动相，浓缩，用冷冻干燥机冻干，得到肽精制品，即为人Aβ1-42抗原决定簇多肽。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤1～步骤15中，各步骤所用的Fmo c保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比＝1：1：1：4。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤1中，处理RinkAmide-MBHA树脂时，加入二氯甲烷80ml，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，每次各80ml，抽滤以除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤1中，向处理的树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤1中，将30mmol的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤2中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤2中，将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤15中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液例如100ml，室温下振荡进行脱帽反应例如60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，例如每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤15中，将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺例如100ml中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应例如1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，例如每次各80ml，抽滤除去溶剂。
根据本发明第一方面的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，其制备的步骤15中，氨丁三醇的量是DIEA的6％，以摩尔百分数计。
进一步的，本发明第二方面提供了制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽的方法，所述人Aβ1-42抗原决定簇多肽具有如下氨基酸序列：
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala；
其中，该方法是以如下方式接入Tyr的：
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂；将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥，得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂即保护的十五肽树脂。
根据本发明第二方面的方法，在制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽之接入Tyr的过程中，所用的Fmoc保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比＝1：1：1：4。
根据本发明第二方面的方法，在制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽之接入Tyr的过程中，氨丁三醇的量是DIEA的6％，以摩尔百分数计。
根据本发明第二方面的方法，其中制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽的操作步骤如本发明第一方面任一项所述。
本发明还提供了一种Aβ1-42体外诊断试剂盒，其是使用本发明第一方面所述人Aβ1-42抗原决定簇多肽制备Aβ1-42抗原，以此抗原制备人Aβ1-42单克隆抗体或人Aβ1-42多克隆抗体，接着通过荧光层析法、ELISA法、化学发光法、或胶体金免疫测定法的原理，使用此类抗原和/或抗体构建的人Aβ1-42体外诊断试剂盒。
本发明还提供了一种Aβ1-42抗原，其通过使用Aβ1-42抗原决定簇多肽与载体蛋白偶联制备而成。
本发明还提供了一种Aβ1-42抗体，其是由所述的Aβ1-42抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还提供了所述Aβ1-42抗体(例如人Aβ1-42单克隆抗体或人Aβ1-42多克隆抗体)在制备Aβ1-42体外诊断试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种人Aβ1-42体外诊断试剂盒，其包含所述人Aβ1-42单克隆抗体或人Aβ1-42多克隆抗体。
根据本发明的人Aβ1-42体外诊断试剂盒，其采用所述人Aβ1-42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被捕获抗体。
根据本发明的人Aβ1-42体外诊断试剂盒，其采用所述人Aβ1-42多克隆抗体作为结合抗体。
本发明人Aβ1-42抗原决定簇多肽具有以下优点和积极效果：
1.本发明的人Aβ1-42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
2.本发明制备的Aβ1-42单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的Aβ1-42结合。
3.本发明的人Aβ1-42体外诊断试剂盒能够对AD进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控，因此对为AD的早期临床诊断提供依据、为病人得到及时治疗作出了重要贡献。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
发明详述
本文中所述的人Aβ1-42蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，例如在刘勉文献(刘勉，等，β-淀粉样肽的结构、合成与性质及其与老年痴呆症的关系，化学通报，2002，7:458-462)中披露该氨基酸序列为：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。
本发明涉及的人Aβ1-42抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala，即YRDGDGDMVGGVVIA。
如CN103665113A所记载的，以人Aβ1-42蛋白C末端的8个氨基酸残基作为抗原决定簇，在其N端添加亲水性肽段Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp，并在所得肽段的N端加Tyr，能够使最终所得多肽具有亲水性、抗原性强并且易于合成。
已知人Aβ1-42抗原决定簇多肽的肽段具有如下功能：1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用这种肽段制备的抗体可特异性的与人Aβ1-42结合，并且与类似物Aβ1-40无明显交叉反应。
本发明的Aβ1-42抗原决定簇多肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇肽段。本发明抗原决定簇多肽的分子量为1523.69，可利用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。肽段的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。
使用上述人Aβ1-42抗原决定簇多肽还可以制备Aβ1-42抗原，其包含本发明的人Aβ1-42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。该Aβ1-42抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的Aβ1-42抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
上述人Aβ1-42抗原决定簇多肽制备的Aβ1-42抗原还可以进一步的用于制备人Aβ1-42单克隆抗体和人Aβ1-42多克隆抗体，如CN103665113A所记载的，该抗体可以利用本发明的Aβ1-42抗原(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术。
上述人Aβ1-42单克隆抗体和人Aβ1-42多克隆抗体还可以用于制备人Aβ1-42体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于ELISA法对人体组织、细胞或体液中的Aβ1-42蛋白进行检测，优选对血液样本中的Aβ1-42蛋白进行检测。因此，根据本发明的精神可以提供包含本发明的人Aβ1-42单克隆抗体或多克隆抗体的人Aβ1-42体外诊断试剂盒。
本发明的人Aβ1-42体外诊断试剂盒可依据目前已知的常用于临床检验的免疫实验方法原理来设计，这些试剂盒的设计原理例如但不限于：荧光层析法、ELISA法、化学发光法、胶体金免疫测定法等。其中的ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。示例性的，本发明可以参考CN103665113A所记载的方式设计ELISA双抗体夹心法的人Aβ1-42体外诊断试剂盒来检测Aβ1-42蛋白，该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。示例性的，本发明还可以设计荧光层析法的人Aβ1-42体外诊断试剂盒来检测Aβ1-42蛋白，这一原理的试剂盒可以容易地参考现有技术制备。
在一个实施方案中，所述人Aβ1-42体外诊断试剂盒采用本发明的人Aβ1-42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体，在本文中，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体；此外，所述人Aβ1-42体外诊断试剂盒还可以包含人Aβ1-42多克隆抗体以作为结合抗体，在本文中，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体；并且还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗鼠IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
如本文所详述的，本发明制备的人Aβ1-42抗原决定簇多肽、由其制备的抗原以及抗体和由它们构建的人Aβ1-42体外诊断试剂盒能够有效地测定不同类别的血浆样本中的Aβ1-42浓度。
根据本发明的一些检测结果，表明利用本发明的Aβ1-42单克隆抗体或多克隆抗体制备的人Aβ1-42体外诊断试剂盒，能够对阿尔茨海默病进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控。
在本发明的各种试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，依据其检测原理，包括但不限于预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
以下通过各实施例进一步解释或说明本发明的内容：除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液；在涉及百分数时，以液体/液体配制的混合物料百分数均为体积/体积百分数，以固体/液体配制的混合物料的百分数均为质量/体积百分数，以固体/固体配制的混合物料的百分数均为质量/质量百分数。
CN111197040A(申请号2020100721960，亿彤生物)案使用到的一些如下典型原材 料必要时亦可用于本发明：
HMP树脂(HMP resin，P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，购自Sigma-Aldrich公司)，
Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，根据多肽合成的需要提供，购自Merck公司)，
NMP(氮甲基吡咯烷酮，购自Sigma-Aldrich公司)，
DCM(二氯甲烷，购自中原化工公司)，
MeOH(甲醇，购自中原化工公司)，
Piperidine(哌啶，购自Sigma-Aldrich公司)，
DMAP(二甲基氨基吡啶，购自Sigma-Aldrich公司)，
HOBT(羟基苯并三唑，购自Sigma-Aldrich公司)，
DCC(二环已基碳二亚胺，购自Sigma-Aldrich公司)，
TFA(三氟乙酸，购自Sigma-Aldrich公司)，
EDT(1,2-乙二硫醇，购自Sigma-Aldrich公司)，
硫代苯甲醚，购自广州伟伯化工有限公司，
结晶苯酚，购自国药集团化学试剂有限公司，
乙腈，购自国药集团化学试剂有限公司。
未提及的原材料亦均是容易从市场购得的。
CN111197040A(申请号2020100721960，亿彤生物)案使用到的一些如下典型仪器 必要时亦可用于本发明：
多肽自动合成仪，型号431A，购自ABI公司，
旋转蒸发仪，型号R-201，购自上海中顺公司，
高效液相色谱仪，Waters600，购自Waters公司，
冷冻干燥机，型号VFD-2000，购自北京博医康公司。
本发明未提及的仪器设备亦均是容易从市场购得的。
实施例1：Aβ1-42抗原决定簇多肽的制备
本实施例利用ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成Aβ1-42抗原决定簇多肽。Aβ1-42抗原决定簇多肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽段的浓度。本实施例1所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的分子量为1523.57(理论分子量为1523.69)，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。
一、Aβ1-42抗原决定簇多肽的合成
上述肽段，即Aβ1-42抗原决定簇多肽，可以采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。示意性合成过程如下所示：
上述合成过程之步骤(5)经脱保护基之后即得到目标多肽。
本实施例的Aβ1-42抗原决定簇多肽的具体制备步骤如下：
称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，依据Aβ1-42抗原决定簇多肽的肽序列，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来。反应如下：
(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)
(2)连接氨基酸到树脂上
(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基
(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法)
(5)偶联
(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束，得到Aβ1-42抗原决定簇多肽的肽树脂256.8mg。
(7)裂解肽树脂
用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，分别得到Aβ1-42抗原决定簇多肽的粗品。
二、Aβ1-42抗原决定簇多肽粗品的纯化：
1、分离纯化
采用高效液相色谱分离纯化，条件：
色谱柱：C8，10×100mm，购自Waters公司
色谱仪：Waters600，Waters公司
流动相：
A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液
B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈
检测波长：214nm
流速：4ml/分钟
洗脱梯度：20-60％B，30分钟。
2、纯度测定
使用HPLC(高效液相色谱)分析Aβ1-42抗原决定簇多肽的纯度。
色谱条件：
色谱柱：C18，4.6×150mm，购自Waters公司
流动相：
A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液
B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈
检测波长：214nm
流速：1ml/分钟
洗脱梯度：0-60％B，30分钟
肽段分析结果显示本实例所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的纯度为95％以上(97.8％)。
三、Aβ1-42抗原决定簇多肽的鉴定
1.利用质谱分别测定纯化所得的Aβ1-42抗原决定簇多肽的分子量：
(1)试剂原料
TFA(三氟乙酸，购自Sigma-Aldrich公司)，
HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，购自Sigma-Aldrich公司)，
乙腈(购自国药集团化学试剂有限公司)。
(2)仪器
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)；
(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；
(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV；
(5)操作步骤：取1μL上述纯化Aβ1-42抗原决定簇多肽的样品，与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，取1μL分别点在样品靶上，送入离子源中进行检测；
结果，本实施例测得所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的分子量1523.57，与理论分子量1523.69一致，证明合成多肽即为目的产物。
2.通过多肽序列测定分别鉴定所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的序列。
(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程，包括三个主要的化学步骤：
偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽；
环化裂解：PTC-肽环化裂解；
转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)，留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。
(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪
(3)试剂原料：
异硫氰酸苯酯PITC，购自Sigma-Aldrich公司
正庚烷，购自国药集团化学试剂有限公司
三甲胺TMA水溶液，购自国药集团化学试剂有限公司
TFA(三氟乙酸，购自Sigma-Aldrich公司)
乙酸乙酯，购自国药集团化学试剂有限公司
氯丁烷，购自Sigma-Aldrich公司
乙腈，购自国药集团化学试剂有限公司
(4)测定：按仪器说明书进行。
结果，经鉴定，所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的序列为：Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala，即YRDGDGDMVGGVVIA，该结果与目标合成肽段一致。
实施例11：Aβ1-42抗原决定簇多肽的制备
本发明尤其是实施例11等使用的Rink Amide-MBHA树脂和Fmoc-AA-OH若无另外说明均购自吉尔生化公司，HBTU、HOBT、DIEA等试剂购自阿拉丁试剂公司，其它试剂亦可容易的通过市售途径获得，例如CN111197040A(申请号2020100721960，亿彤生物)之实施例1所述。
本实施例11使用经典的方法制备本发明以下序列的Aβ1-42抗原决定簇多肽：
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。
在以下各制备步骤中，使用氨基酸(Fmoc-AA-OH)：肽偶联剂HBTU：酰胺键形成促进剂HOBT：有机碱DIEA四者的摩尔比均为1：1：1：4；
溶剂用量根据经验和具体操作掌握，例如10g树脂中清洗、脱帽反应、偶联反应中溶剂用量为50～150ml，特别是在清洗时每次用尽量少的溶剂。试验所用市售购得的一些典型的保护氨基酸如下：
Fmoc-Ala-OH[CAS No.35661-39-3]、
Fmoc-Arg(Tos)-OH[CAS No.83792-47-6]、
Fmoc-Asp(OtBu)-OH[CAS No.71989-14-5]、
Fmoc-Gly-OH[CAS No.29022-11-5]、
Fmoc-Ile-OH[CAS No.71989-23-6]、
Fmoc-Met-OH[CAS No.71989-28-1]、
Fmoc-Tyr(tBu)-OH[CAS No.71989-38-3]、
Fmoc-Val-OH[CAS No.68858-20-8]。
步骤1：Fmoc-Ala-树脂的制备
本步骤中，取Rink Amide-MBHA树脂(0.79mmol/g)10g和30mmol(9.33g)的Fmoc-Ala-OH投料。
将Rink Amide-MBHA树脂置反应器中，加入二氯甲烷80ml，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，每次各80ml，抽滤以除去溶剂。
向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml)，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色，若不显蓝色则需重新进行本步骤。(上述茚三酮检测亦称为KT检测，取微量的1～2mg树脂检测即可，下同)。将规定比例的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂；KT检测应显黄色，若不显黄色则延长反应时间。本步骤1所得标题树脂即Fmoc-Ala-树脂经检测偶联率为0.90。该树脂全部用于后续的反应步骤(下同)。
步骤2：Fmoc-Ile-Ala-树脂的制备
参考步骤1的操作方法，取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ile-OH投料；
向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml)，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色，若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解，加入DIE A，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂；KT检测应显黄色，若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂，经检测其偶联率为0.91。
步骤3：Fmoc-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.88。
步骤4：Fmoc-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.89。
步骤5：Fmoc-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.90。
步骤6：Fmoc-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.89。
步骤7：Fmoc-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.92。
步骤8：Fmoc-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Met-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.91。
步骤9：Fmoc-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.88。
步骤10：Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.91。
步骤11：Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.89。
步骤12：Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.90。
步骤13：Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.91。
步骤14：Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得标题树脂，经检测其偶联率为0.89。
步骤15：Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂的制备
参考步骤2的操作方法，取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH投料；
向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml)，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。茚三酮检测应显蓝色，若不显蓝色则需重新进行本步骤。将规定比例的Fmoc-保护氨基酸、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺(100ml)中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇(其量是DIEA的6％，以摩尔百分数计)，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂；KT检测应显黄色，若不显黄色则延长反应时间。本步骤所得标题树脂，经检测其偶联率为0.90。
至上述步骤15接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥过夜，称重，得保护的十五肽树脂。
步骤16：肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至500ml的圆底烧瓶，加入100ml预冷切割液(95％三氟乙酸/2％TIS/2％EDT/1％水)，室温搅拌反应2小时，抽滤使分取滤液，用三氟乙酸洗涤树脂2次，每次25ml，合并滤液和洗涤液；加冰冻乙醚1200ml使沉淀5小时，过滤得沉淀物，即为十五肽的粗品。
步骤17：分离纯化
(1)将上一步骤所得肽粗品溶于70％乙腈(含0.1％三氟乙酸)，用离子交换色谱系统Shodex IEC SP-420N(北京谱朋)以70％乙腈(含0.1％三氟乙酸)为溶剂进行洗脱，收集肽主峰流分；
(2)使用如下高效液相色谱法，对上述肽主峰进行分离纯化：
色谱柱：C8，10×100mm，美国Waters公司；
色谱仪：YMC工业制备液相色谱；
流动相：流动相A为0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液，流动相B为添加0.1％TFA(三氟乙酸)的70％乙腈，洗脱梯度为0～45分钟期间15％B-60％B；
流速：4ml/分钟；
检测波长：214nm；
(3)将收集所得主峰流动相，浓缩，用冷冻干燥机冻干，得到肽精制品，即为Aβ1-42抗原决定簇多肽。
经【HPLC纯度测定法】纯度和含量测定，从步骤1之10g树脂起始投料至终产物肽精制品的17个步骤，经计算，总收率为29.3％，该肽精制品纯度为98.6％。
根据上述结果可见，与CN103665113A使用多肽自动合成仪只能一次合成小批量肽相比，本实施例11可以一次性大批量制备多肽，并且其收率满意、多肽纯度高、分子量与理论值相同、序列与目标值相同。
【HPLC纯度测定法】：
本法使用HPLC测定Aβ1-42抗原决定簇多肽的纯度，主要测定条件如下：
色谱柱：C18，4.6×150mm，Waters公司，
色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦，
流动相：0.1％TFA水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈为流动相B，洗脱梯度为30分钟期间0-60％B，
流速：1ml/分钟，
检测波长：214nm。
【多肽分子量的质谱测定法】：
本法使用质谱测定本发明所得多肽的分子量，主要测定条件如下：
(1)试剂原料：TFA(三氟乙酸，购自Sigma-Aldrich公司)，HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，购自Sigma-Aldrich公司)，乙腈(购自国药集团化学试剂有限公司)；
(2)仪器：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEXIII，德国Bruk er公司)；
(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清；
(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV；
(5)操作步骤：取10μL纯化多肽样品(用乙腈溶解制成50mg/ml浓度)，与10μL基质液混合，取1μL点在样品靶上，送入离子源中进行检测。
结果：本实施例所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的分子量1523.26，与它的理论分子量1523.69一致，证明合成多肽即为目的产物。
【多肽序列测定法】：
本法使用多肽氨基酸序列分析仪，测定本发明所得多肽的氨基酸序列，主要测定条件/操作如下：
(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程，包括三个主要的化学步骤：
偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽；
环化裂解：PTC-肽环化裂解；
转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)，留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行；
(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪；
(3)试剂原料：异硫氰酸苯酯PITC(Sigma-Aldrich公司)，正庚烷(国药集团化学试剂有限公司)，三甲胺TMA水溶液(国药集团化学试剂有限公司)，三氟乙酸(TFA，Sigma-Aldrich公司)，乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)，氯丁烷(Sigma-Aldrich公司)，乙腈(国药集团化学试剂有限公司)；
(4)测定：按仪器说明书进行。
结果，经鉴定，实施例11所得Aβ1-42抗原决定簇多肽的序列为：
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。
上述结果与实施例制备的目标合成肽段一致。
实施例11a：参照本文实施例11之步骤1～步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，未添加氨丁三醇，制得15种标题树脂；经检测，步骤1～步骤14标题树脂的偶联率均在0.88～0.92范围内例如步骤14标题树脂偶联率＝0.91，而步骤15标题树脂偶联率＝0.62。
实施例11b：参照本文实施例11之步骤1～步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(PO3H2)-OH，制得15种标题树脂；经检测，步骤1～步骤14标题树脂的偶联率均在0.89～0.92范围内例如步骤14标题树脂偶联率＝0.91，而步骤15标题树脂偶联率＝0.64。
实施例11c：参照本文实施例11之步骤1～步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Bzl)-OH，制得15种标题树脂；经检测，步骤1～步骤14标题树脂的偶联率均在0.89～0.91范围内例如步骤14标题树脂偶联率＝0.89，而步骤15标题树脂偶联率＝0.68。
实施例11d：参照本文实施例11之步骤1～步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr-OH，制得15种标题树脂；经检测，步骤1～步骤14标题树脂的偶联率均在0.88～0.91范围内例如步骤14标题树脂偶联率＝0.90，而步骤15标题树脂偶联率＝0.71。
实施例11e：参照本文实施例11之步骤1～步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，将使用的Fmoc-Tyr(tBu)-OH改为等摩尔量的Fmoc-Tyr(Me)-OH，制得15种标题树脂；经检测，步骤1～步骤14标题树脂的偶联率均在0.89～0.91范围内例如步骤14标题树脂偶联率＝0.89，而步骤15标题树脂偶联率＝0.63。
实施例11f：参照本文实施例11b、实施例11c、实施例11d、实施例11e之步骤15的操作制备各种肽树脂，不同的仅是，步骤15中，未添加氨丁三醇，制得4种标题树脂；经检测，此步骤15所得4种标题树脂的偶联率均在0.65～0.70范围内例如参照实施例11b时所得步骤15标题树脂偶联率＝0.66。
根据上述实施例11a～11f的结果以及实施例11的结果，出人意料的发现，在肽链中接入氨基酸Tyr时，使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH并且在反应溶剂中同时添加6％的氨丁三醇可以显著提高偶联率，而不使用氨丁三醇或者改用其它保护形式的Tyr则偶联率显著更低。
下文的具体实验中，若未另外说明，所使用的Aβ1-42抗原决定簇多肽是由实施例11制得。
实施例2：制备Aβ1-42抗原决定簇多肽的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体
本实施例将实施例11所得的Aβ1-42抗原决定簇多肽与载体蛋白连接以制备Aβ1-42抗原，利用所得抗原免疫动物，从而利用抗原制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
1.抗原的制备：
用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将Aβ1-42抗原决定簇多肽与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)连接制备成Aβ1-42抗原；
取Aβ1-42抗原决定簇多肽10.0mg，用1ml的0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解；将10mg的KLH用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取110μL的BDBCl2，室温下反应1.5h，透析过夜(12～15小时)后分装，-20℃保存(必要时可以冷冻干燥)，即为Aβ1-42抗原；
在本实施例中，PBS缓冲液的配方为：0.2mol/L的Na2HPO4 81ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合而成；
硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。
2.免疫动物制备人Aβ1-42单克隆抗体：
2.1.取上述制备的Aβ1-42抗原(免疫原)与弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射；4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前连续加强免疫两次，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自Sigma-Aldrich公司)选择培养；融合后放入CO2培养箱中37℃培养10～11天后，孔内出现较大的细胞克隆；11天开始用间接ELISA进行筛选；对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。Balb/c小鼠购自福建医科大学(SYXK(闽)2020-0005)。
2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自Sigma-Aldrich公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×106个/只，10天后收集腹水。
2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用Aβ1-42抗原制备的人Aβ1-42单克隆抗体的效价，结果显示单抗的效价达到1：34300。
3.免疫动物制备人Aβ1-42多克隆抗体：
3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物；基础免疫中，将1-2mg上述制备的Aβ1-42抗原与弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射；每隔4周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。新西兰白兔购自福建医科大学(SYXK(闽)2020-0004)。
3.2.测定抗体效价：
用间接ELISA法测定利用人Aβ1-42抗原制备的人Aβ1-42多克隆抗体的效价，结果显示该抗体效价达到1：28000。
3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。
4.分离纯化抗体：
以上所得腹水或血清，经硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自Sigma-Aldrich公司)亲和纯化。
5.抗体冻存：
抗体分装后冻干，低温保存。
实施例3：人Aβ1-42单克隆抗体的特异性鉴定
以ELISA进行检测，分别以Aβ1-42、Aβ1-40、tau蛋白为检测抗原包被ELISA板，ELISA检测实施例2制备的Aβ1-42单克隆抗体与其特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照；
结果：Aβ1-42单克隆抗体与Aβ1-42反应为阳性(P/N>2.1)，而与Aβ1-40和tau蛋白的反应为阴性(P/N<2.1)，说明此Aβ1-42单克隆抗体具有特异性。
实施例4：人Aβ1-42多克隆抗体的特异性鉴定
利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法对实施例2所制备的Aβ1-42多克隆抗体进行鉴定；
结果显示：Aβ1-42多克隆抗体与Aβ1-42反应为阳性(P/N>2.1)，而与Aβ1-40和tau蛋白的反应为阴性(P/N<2.1)，说明此Aβ1-42多克降抗体具有特异性。
实施例5：示例性应用
在本实施例中，将实施例2所得Aβ1-42多克隆抗体作为本试剂盒中的结合抗体；将实施例2制备的Aβ1-42单抗作为包被抗体；接着参照CN103665113A之实施例5的各种条件和操作方式，对取自36例健康组(年龄71～79岁)血浆、32例AD早期患者(年龄74～82岁，19≤简易智力状态检查表(MMSE)值≤27分，临床痴呆程度量表(CDR)值＝0.8～1.3分)血浆、35例AD中晚期患者(年龄73～80岁，MMSE<19分，CDR≥2分)血浆(均为某医院提供的确诊/治疗患者和志愿的样品)，检测并计算其中Aβ1-42的浓度，结果：健康组血浆Aβ1-42浓度＝107.3±13.6pg/ml(n＝36)、AD早期患者血浆Aβ1-42浓度＝171.8±11.4pg/ml(n＝32)、AD中晚期患者血浆Aβ1-42浓度＝103.6±15.2pg/ml(n＝35)；这些结果表明，本发明制备的人Aβ1-42抗原决定簇多肽，由其制备的抗原以及进一步制备的抗体在构建Aβ1-42体外诊断试剂盒时是有效的。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.制备人Aβ1-42抗原决定簇多肽的方法，所述人Aβ1-42抗原决定簇多肽具有如下氨基酸序列：
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala；
其中，该方法是以如下方式接入Tyr的：
向制得的Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂；将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥，得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂即保护的十五肽树脂；其中，所用的Fmoc保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比=1：1：1：4，以摩尔百分数计氨丁三醇的量是DIEA的6%。
2.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：
步骤1：Fmoc-Ala-树脂的制备
将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中，加入二氯甲烷，振荡并浸泡，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂，
向以上处理的树脂中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，
将30mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Ala-树脂；
步骤2：向上一步骤所得树脂中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Ile-Ala-树脂；
步骤3：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤4：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤5：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤6：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤7：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Val-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤8：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Met-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤9：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤10：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤11：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤12：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Gly-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤13：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Asp(OtBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤14：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Arg(Tos)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂；
步骤15：向上一步骤所得树脂中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，接肽反应结束后，滤取树脂，放入真空干燥器内干燥，得Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Tos)-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Asp(OtBu)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-树脂即保护的十五肽树脂；其中，所用的Fmoc保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比=1：1：1：4，以摩尔百分数计氨丁三醇的量是DIEA的6%；
步骤16：肽链的裂解
将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶，加入预冷切割液，室温搅拌反应，抽滤使分取滤液，用三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液和洗涤液，加冰冻乙醚使沉淀，过滤得沉淀物，即为十五肽的粗品；
步骤17：依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化，得肽精制品，即为人Aβ1-42抗原决定簇多肽。
3.根据权利要求2的方法，所述预冷切割液为95%三氟乙酸、2%TIS、2%EDT、1%水的混合液。
4.根据权利要求2的方法，步骤1~步骤14中，各步骤所用的Fmoc保护氨基酸：HBTU：HOBT：DIEA的摩尔比=1：1：1：4。
5.根据权利要求2的方法，处理Rink Amide-MBHA树脂时，加入二氯甲烷80ml，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，每次各80ml，抽滤以除去溶剂。
6.根据权利要求2的方法，向处理的树脂中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
7.根据权利要求2的方法，步骤1中将30mmol的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂。
8.根据权利要求2的方法，步骤2中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
9.根据权利要求2的方法，步骤2中，将30mmol的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂。
10.根据权利要求2的方法，步骤15中，加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液100ml，室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，并抽滤除去溶剂。
11.根据权利要求2的方法，步骤15中，将30mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺100ml中使溶解，加入DIEA和氨丁三醇，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应1小时，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，每次各80ml，抽滤除去溶剂。
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