CN103665113A - 人Aβ42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人Aβ42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒。本发明的Aβ42抗原决定簇多肽，为序列表SEQ ID NO.1所述的多肽片段。本发明的Aβ42抗原由Aβ42抗原决定簇多肽制得。本发明的Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的Aβ42抗原制得。本发明的Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体用于制备Aβ42体外诊断试剂盒。本发明的Aβ42抗原用于制备Aβ42抗体体外诊断试剂盒。本发明的人Aβ42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

Description

人Aβ42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒

技术领域

本发明属于多肽化学领域，具体涉及人Aβ42抗原决定簇多肽、用该多肽制备的Aβ42特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗原和抗体分别在制备人Aβ42体外诊断试剂盒和人Aβ42抗体体外诊断试剂盒上的用途，以及人Aβ42体外诊断试剂盒和人Aβ42抗体体外诊断试剂盒。 

背景技术

目前，我国已经进入老龄化社会，而阿尔茨海默病(AD)是老年人的常见病和多发病，又称老年性痴呆，60岁以上老人的发病率＞5％。AD是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，患者进行性智力和认知功能降低。神经退行性疾病是由于神经元进行性变性、死亡导致的、以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，严重危害人类身体健康，但其病因不清，发病机理复杂，缺乏有效的治疗措施。除人们熟知的老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)等以外，在人群中发病率日趋增高、且发病年龄日趋下降的糖尿病晚期并发症均以神经退行性病变为首发因素。由于神经退行性疾病缺乏有效的早期诊断措施，给治疗、护理带来了一系列实实在在的问题，同时给社会和家庭造成了沉重的经济负担和精神压力。例如老年性痴呆(AD，也称阿尔茨海默病)，预计到2050年我国老年性痴呆患者将达到2000万人。如果政府和家庭对每一位AD病人花费的医疗费、护理费和家庭成员的误工费等平均每年1万元，那么到2050年我国对老年痴呆患者每年将付出2000亿元的费用。如此之重的经济负担将严重阻碍我国的经济发展，并可能引发社会问题。故研究神经退行性变发病机理和延缓、阻断其发展的干预手段，有着至关重要的意义。 

作为引起老年痴呆最常见的病因，阿尔茨海默病临床上表现为智力水平的慢性削弱及记忆的慢性丢失。随着全球人口的老龄化，AD发病率也与日俱增，因此，AD的及时诊断与治疗必将越来越受到重视。 

老年性痴呆的主要神经病理学特征是神经元细胞内出现神经元纤维缠绕结，神经细胞外有神经变性斑(老年斑)。目前认为构成老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)，是β淀粉样前体蛋白(β-amyloid Precursor protein，APP)的代谢产物，Aβ有两种形式，分别是由40个氨基酸和42个氨基酸组成的多肽片段，前者称为Aβ40，正常老年人和AD患者脑内均有；后者称为Aβ42，主要见于AD患者脑内。近年大量研究表明Aβ42的增加与AD发病密切相关，它主要引起脑组织形成可溶性的Aβ42寡聚体及不溶性的Aβ沉积，即AD特有的病理改变，且Aβ42在CSF(脑脊液)和血液中都能检出，是AD重要的标志物。在AD病人患病晚期，血液中Aβ42浓度增高，消耗了Aβ42抗体导致Aβ42抗体含量低于健康老年人，因此，如果在AD发病前和发病过程中的不同阶段对血液中Aβ42及Aβ42抗体进行追踪检测，一方面可用于诊断已出现症状的病人并对病情程度进行跟踪；另一方面，也是更重要的，用于诊断尚未出现明显症状的老人，在发病之前进行预防性医治，延缓发病时间。如能顺利研制出Aβ42及Aβ42抗体检测试剂盒，将对AD预测、早期发现及预防、病程发展和疗效观察具有重要意义。 

而监测Aβ42及其抗体最理想的方法即是免疫测定，因此寻找合适的具有免疫原性的Aβ42肽段，制备特异性的Aβ42抗原及抗体就成了重点。 

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人Aβ42抗原决定簇多肽，用该多肽制备的Aβ42特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，以及人Aβ42体外诊断试剂盒和人Aβ42抗体体外诊断试剂盒。 

具体而言，本发明提供了： 

(1)一种人Aβ42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列为： 

Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。 

(2)一种Aβ42抗原，其包含(1)所述的人Aβ42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。 

(3)一种人Aβ42单克隆抗体或多克降抗体，其由(2)所述的人Aβ42抗原制备而成。 

(4)根据(3)所述的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体在制备人Aβ42体外诊断试剂盒上的用途。 

(5)一种人Aβ42体外诊断试剂盒，其包含(3)所述的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体。 

(6)根据(5)所述的试剂盒，其中所述试剂盒采用所述人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体。 

(7)根据(5)所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含人Aβ1-28多克隆抗体作为结合抗体。 

(8)根据(2)所述的Aβ42抗原在制备人Aβ42抗体体外诊断试剂盒上的用途。 

(9)一种人Aβ42抗体体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒采用(2)所述的人Aβ42抗原作为包被抗原。 

(10)根据(9)所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。 

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果： 

1.本发明的人Aβ42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。 

2.用本发明的人Aβ42抗原决定簇多肽制备的抗原能够高度特异地与血液样本中的Aβ42抗体结合，并且本发明制备的Aβ42单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的Aβ42结合。 

3.本发明的人Aβ42体外诊断试剂盒和人Aβ42抗体体外诊断试剂盒能够对AD进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控，因此对为AD的早期临床诊断提供依据、为病人得到及时治疗作出了重要贡献。 

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。 

本文中所述的人Aβ42蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，例如在参考文献：“β-淀粉样肽的结构、合成与性质及其与老年痴呆症的关系，刘勉，叶蕴华，化学通报，2002年，第7期458-462”中披露了该氨基酸序列。 

本发明提供了一种人Aβ42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，为： 

Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。 

本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，发现以人Aβ42蛋白C末端的8个氨基酸残基作为抗原决定簇，在其N端添加亲水性肽段Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp，并在所得肽段的N端加Tyr，能够使最终所得多肽具有亲水性、抗原性强并且易于合成。 

目前，本发明研究发现，本发明的肽段具有如下功能： 

1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用这种肽段制备的抗体可特异性的与人Aβ42结合，并且与类似物Aβ40无明显交叉反应。 

本发明的Aβ42抗原决定簇多肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇肽段。本发明的多肽的分子量为1675.15，可利用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原肽段的浓度。 

本发明还提供了一种Aβ42抗原，其包含本发明的人Aβ42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。该Aβ42抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的Aβ42抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。 

本发明还提供了一种人Aβ42单克隆抗体和人Aβ42多克隆抗体，该抗体可以利用本发明的Aβ42抗原(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。 

本发明的Aβ42单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人Aβ42体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于ELISA法对人体组织、细胞或体液中的Aβ42蛋白进行检测，优选对血液样本中的Aβ42蛋白进行检测。 

因此，本发明提供了一种人Aβ42体外诊断试剂盒，其包含本发明的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体。 

目前已知用于临床检验的ELISA主要包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。 

本发明的人Aβ42体外诊断试剂盒优选采用双抗体夹心法来检测Aβ42蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。 

优选的是，所述人Aβ42体外诊断试剂盒采用本发明的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体，在本文中，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体；此外，所述人Aβ42体外诊断试剂盒还优选包含人Aβ_1-28多克隆抗体以作为结合抗体，在本文中，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体；并且还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗鼠IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。术语“人Aβ_1-28”是指人Aβ42N端的1-28位氨基酸序列。 

用本发明的人Aβ42体外诊断试剂盒进行临床研究，对115例不同类别的血样标本进行检测。结果为，47例健康对照组的血浆Aβ42蛋白浓度值为95.1±7.2pg/ml；在35例轻度AD患者[19≤简易智力状态检查表(MMSE)值≤26分，临床痴呆程度量表(CDR)值＝1分]中，血浆Aβ42浓度值为146.4±9.7pg/ml；中晚期AD患者(MMSE＜19分，CDR≥2分)血浆标本中的Aβ42浓度为99.4±17.6pg/ml。由此可知，轻度AD患者血浆标本中的Aβ42中值明显高于健康对照组及中度及以上患者，而健康对照组与中晚期AD患者血浆标本中的Aβ42值无明显差异。这说明Aβ42浓度在AD早期会明显增大，而随着病情的加重，Aβ42与产生的Aβ42抗体结合，不再呈游离可测状态，故测到的Aβ42又会减少，表现出Aβ42浓度下降。 

本发明的Aβ42抗原可以用于制备Aβ42抗体体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于ELISA法对人体组织、细胞或体液中的Aβ42抗体进行检测，优选对血液样本中的Aβ42抗体进行检测。 

因此，本发明提供了一种人Aβ42抗体体外诊断试剂盒，该试剂盒优选采用间接法来检测Aβ42抗体。该试剂盒可以包含包被抗原、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。 

优选的是，本发明的人Aβ42抗体体外诊断试剂盒采用本发明的人Aβ42抗原作为包被抗原。在本文中，术语“包被抗原”是指包被于固相的酶标板上的抗原。 

优选的是，所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为抗人IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 

用本发明的人Aβ42抗体体外诊断试剂盒进行临床研究，对115例不同类别的血样标本进行检测。结果为，47例健康对照组的血浆Aβ42抗体浓度值为169.32±62.97μg/ml；在35例轻度AD患者[19≤简易智力状态检查表(MMSE)值≤26分，临床痴呆程度量表(CDR)值＝1分]中，有30例的血浆Aβ42抗体浓度超过190.42μg/ml，35例患者的平均水平为200.44±58.78μg/ml；而中晚期AD患者(MMSE＜19分，CDR≥2分)血浆标本中的Aβ42抗体浓度下降，平均水平 为90.4±23.6μg/ml。由此可知，轻度AD患者血液中的Aβ42抗体浓度较健康组略有升高，而中晚期AD患者血浆标本中的Aβ42抗体浓度与健康对照组和轻度AD患者有明显差异。这说明Aβ42抗体在AD早期稍有升高，但随着病情的加重，Aβ42抗体与Aβ42结合，表现出Aβ42抗体浓度显著下降。 

基于此发现，利用本发明的Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体制备的人Aβ42体外诊断试剂盒，以及利用本发明的Aβ42抗原决定簇多肽或Aβ42抗原制备的人Aβ42抗体体外诊断试剂盒能够对AD进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控。 

在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。 

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。 

实施例 

除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。 

实施例1：Aβ42抗原决定簇多肽片段的制备。 

制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇肽段。多肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定抗原肽段的浓度。本发明的多肽的分子量为1675.15，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。 

一、Aβ42抗原决定簇肽段的合成 

该肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。 

本发明的Aβ42抗原决定簇肽段的具体制备步骤如下： 

1.所用原料： 

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，可购自sigma公司) 

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸，可购自Merck公司) 

NMP(氮甲基吡咯烷酮，可购自sigma公司) 

DCM(二氯甲烷，可购自中原化工公司) 

MeoH(甲醇，可购自中原化工公司) 

Piperidine(哌啶，可购自sigma公司) 

DMAP(二甲基氨基吡啶，可购自sigma公司) 

HOBT(羟基苯并三唑，可购自sigma公司) 

DCC(二环已基碳二亚胺，可购自sigma公司) 

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司) 

EDT(1，2-乙二硫醇，可购自sigma公司) 

硫代苯甲醚，可购自广州伟伯化工有限公司 

结晶苯酚，可购自国药集团化学试剂有限公司 

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司 

2.使用仪器： 

多肽自动合成仪，型号431A，可购自ABI公司 

旋转蒸发仪，型号R-201，可购自上海中顺公司 

高效液相色谱仪，Waters 600，可购自美国Waters公司 

冷冻干燥机，型号VFD-2000，可购自北京博医康公司 

3.合成方法和过程： 

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即将0.1mmol置于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下： 

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法) 

Fmoc保护的氨基酸 

(2)连接氨基酸到树脂上 

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基 

(4)另一氨基酸的活化(HOBt/DCC法) 

(5)偶联 

新的偶联的肽-树脂 

(6)重复步骤(3)至(5)直至合成结束，得到Aβ42肽段的肽树脂260mg。 

(7)裂解肽树脂： 

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT(2.5体积％)、硫代苯甲醚(2.5体积％)作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到Aβ42肽段的粗品。 

二、Aβ42抗原决定簇肽段粗品的纯化： 

采用高效液相色谱分离纯化： 

条件：色谱柱：C810×100mm，可购自美国Waters公司 

色谱仪：Waters600，美国Waters公司 

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液 

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈 

检测波长：214nm 

流速：4ml/分钟 

洗脱梯度：20-60％B，30分钟 

HPLC(高效液相色谱)分析 

色谱柱：C184.6×150mm，可购自美国Waters公司 

流动相：A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液 

B：0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈 

检测波长：214nm 

流速：1ml/分钟 

洗脱梯度：0-60％B，30分钟 

肽段分析结果显示纯度为95％以上。 

三、Aβ42抗原决定簇肽段的鉴定 

1.利用质谱测定纯化所得的Aβ42抗原决定簇肽段的分子量。 

(1)试剂原料 

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司) 

HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，可购自sigma公司) 

乙腈(可购自国药集团化学试剂有限公司) 

(2)仪器 

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF-MS(型号：REFLEX III，德国Bruker公司)； 

(3)基质液：将α-CCA溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清； 

(4)仪器检测条件：反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器：波长337nm，加速电压20KV；反射电压23KV。 

(5)操作步骤：取1μL上述纯化多肽样品，与1μL的饱和基质上清液混合等体积混合，取1μL分别点在样品靶上，送入离子源中进行检测。 

结果，测得所得Aβ42抗原决定簇肽段的分子量为1675.2，与Aβ42合成多肽的理论分子量1675.15一致，证明合成多肽即为目的产物。 

2.通过多肽序列测定鉴定所得Aβ42抗原决定簇多肽的序列。 

(1)原理：多肽氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：(1)偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。(2)环化裂解：PTC-肽环化裂解。(3)转化：噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。 

(2)仪器：美国ABI公司491型蛋白质/多肽N-末端氨基酸序列分析仪 

(3)试剂原料 

异硫氰酸苯酯PITC，可购自sigma公司 

正庚烷，可购自国药集团化学试剂有限公司 

三甲胺TMA水溶液，可购自国药集团化学试剂有限公司 

TFA(三氟乙酸，可购自sigma公司) 

乙酸乙酯，可购自国药集团化学试剂有限公司 

氯丁烷，可购自sigma公司 

乙腈，可购自国药集团化学试剂有限公司 

(4)测定 

按仪器说明书进行。 

结果：经鉴定，所得Aβ42抗原决定簇肽段的序列为Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Iie-Ala，与目标合成肽段一致。 

实施例2：将实施例1所得的Aβ42抗原决定簇肽段与载体蛋白连接制备抗原，并用所得抗原分别免疫动物，从而制备特异性的单克降抗体和多克隆抗体。 

1.抗原的制备：用BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法将Aβ42肽段与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)连接制备成Aβ42抗原。 

取Aβ42肽段10.0mg，用1ml 0.1M PBS缓冲液(pH7.4)溶解； KLH10mg，用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl₂ 110μL，室温下反应1.5h，透析过夜后分装，-20℃保存。 

在本实施例中，PBS缓冲液的配方为：0.2mol/L的Na₂HPO₄81ml加0.2mol/L的NaH₂PO₄ 19ml混合而成。 

硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成。 

2.免疫动物制备单克隆抗体： 

2.1.取上述制备的抗原(免疫原)与等体积的弗氏完全佐剂(购自上海源聚生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，抗原剂量35μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为6次，融合前连续加强免疫两次，之后取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG(MW4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用HAT条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入CO₂培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接ELISA进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存、制备腹水。 

2.2.将Balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。 

2.3.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，结果显示单抗的效价均达到1∶32000以上。 

3.免疫动物制备多克隆抗体： 

3.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将300μg上述制备的抗原(免疫原)与等体积的弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。 

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定抗体效价，结果显示抗体效价达到1∶16000以上。 

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。 

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma公司)亲和纯化。 

5.抗体分装后冻干，低温保存。 

实施例3：人Aβ42单克隆抗体的特异性鉴定 

以ELISA检测。分别以Aβ42、Aβ40、tau蛋白为检测抗原包被ELISA板，ELISA检测制备的Aβ42单克隆抗体与其特异性反应，以正常BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。 

结果：Aβ42单克隆抗体与Aβ42反应为阳性(P/N＞2.1)，而与Aβ40和tau蛋白的反应为阴性(P/N＜2.1)，说明此Aβ42单克隆抗体具有特异性。 

实施例4：人Aβ42多克隆抗体的特异性鉴定 

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定。 

结果显示：Aβ42多克隆抗体与Aβ42反应为阳性(P/N＞2.1)，而与Aβ40和tau蛋白的反应为阴性(P/N＜2.1)，说明此Aβ42多克降抗体具有特异性。 

实施例5：利用Aβ42单克隆抗体制备Aβ42体外诊断试剂盒。 

在本实施例中，将Aβ42的第1至28位氨基酸多肽(由首都医科大学宣武医院赠送，可按实施例1的方法合成得到)连接至载体蛋白KLH，将其作为免疫原免疫新西兰大白兔，从而制得Aβ1-28多克隆抗体(具体方法可参见实施例2)，将其作为本试剂盒中的结合抗体；将实施例2制备的Aβ42单抗作为包被抗体。 

Aβ42体外诊断试剂盒的制备和操作如下： 

1.各种缓冲液及试剂的配制： 

A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液) 

Na₂CO₃：16.0克 

NaHCO₃：29.0克 

蒸馏水溶至1000ml 

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween20 

Na₂HPO₄·12H₂O：58克 

KH₂PO₄：4克 

NaCl：100克 

KCl：4克 

蒸馏水溶至1000ml 

加Tween20：20ml 

C、酶标记物稀释液： 

10×PBS-Tween20：10ml 

FCS(小牛血清)：20ml 

蒸馏水溶至1000ml 

酶稳定剂(可购自上海西宝公司)：1克 

生物防腐剂(可购自上海西宝公司)：1ml 

D、显色剂A： 

柠檬酸：35.5克 

过氧化脲：10克 

蒸馏水溶至1000ml 

Tween20：10ml 

E、显色剂B： 

柠檬酸：120克 

EDTA-2Na：1克 

TMB·2HCl：2克 

蒸馏水溶至1000ml 

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml 

蒸馏水：177.3ml 

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。 

2.预包被板的制备： 

将Aβ42单克隆抗体溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华公司)上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经BSA封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。 

3.结合抗体(即Aβ_1-28多克隆抗体)和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(购自北京中杉金桥公司)的稀释比例均由方阵滴定实验确定。 

4.试剂盒的组成： 

预包被板：48/96孔 

Aβ42校准品(原料购自Wako公司)6个：6×500μl(浓度分别为0、31.3、62.5、125、250、500pg/ml) 

Aβ_1-28多克隆抗体：1×10ml(经1∶5000稀释) 

酶联物：1×10ml(经1∶5000稀释) 

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween20)：1×20ml 

显色剂A：1×6.0ml 

显色剂B：1×6.0ml 

终止液：1×6.0ml 

5.试剂盒的操作步骤： 

在预包被板的各孔中分别加入待检的115例血浆标本以及标准品100μl/孔，均为双孔，同时设空白孔(即不加血浆标本)，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入结合抗体(即Aβ_1-28多克隆抗体)100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液， 每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)测定各孔在450nm处的吸光度。 

6.结果判定： 

OD测值计算：OD平均值_{待测标本孔}-OD值_空白孔

根据标准曲线计算Aβ42浓度结果，标准曲线的R²＝0.987。 

47例正常老人血浆中Aβ42浓度均值为95.1±7.2pg/ml； 

35例AD早期患者Aβ42血浆浓度较高，均值为146.4±9.7pg/ml； 

33例中晚期AD患者Aβ42血浆浓度有很大程度的下降，其均值为99.4±17.6pg/ml。 

实施例6：利用Aβ42多克隆抗体制备Aβ42ELISA试剂盒。 

利用上述实施例5中相同的方法制备Aβ42 ELISA试剂盒，不同之处在于利用本发明制备的Aβ42多克降抗体代替本发明制备的Aβ42单克隆抗体。 

试剂盒的组成与上述实施例5中的相同，不同之处在于利用本发明制备的Aβ42多克降抗体代替本发明制备的Aβ42单克隆抗体。 

试剂盒的操作步骤与上述实施例5中所描述的相同。 

实施例7：Aβ42抗体ELISA试剂盒的制备。 

本实施例中，将实施例2制备的Aβ42抗原作为包被抗原；选用辣根过氧化物酶标抗人IgG单抗作为第二抗体。 

Aβ42抗体ELISA试剂盒的制备和操作如下： 

1.各种缓冲液及试剂的配制： 

A、包被缓冲液：0.050M，pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液) 

Na₂CO₃：16.0克 

NaHCO₃：29.0克 

蒸馏水溶至1000ml 

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween20 

Na₂HPO₄.12H₂O：58克 

KH₂PO₄：4克 

NaCl：100克 

KCl：4克 

蒸馏水溶至1000ml 

加Tween20：20ml 

C、酶标记物稀释液： 

10×PBS-Tween20：10ml 

FCS(小牛血清)：20ml 

蒸馏水溶至1000ml 

酶稳定剂：1克 

生物防腐剂：1ml 

D、显色剂A： 

柠檬酸：35.5克 

过氧化脲：10克 

蒸馏水溶至1000ml 

Tween 20：10ml 

E、显色剂B： 

柠檬酸：120克 

EDTA-2Na：1克 

TMB·2HCl：2克 

蒸馏水溶至1000ml 

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％)：22.2ml 

蒸馏水：177.3ml 

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。 

2.预包被板的制备： 

将Aβ42抗原溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成包被液，在酶标板(可购自深圳金灿华)上每孔按0.1μg/孔加入100μl， 于4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经BSA4℃封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。 

3.酶标二抗(抗人IgG单抗，购自北京中杉金桥公司)的稀释比例用方阵滴定实验确定。 

4.试剂盒的组成： 

包被有Aβ42抗原的酶标板：48/96孔 

Aβ42抗体校准品(原料购自sigma公司)6个：6×1.0ml(浓度分别为0、40、100、200、300、500μg/ml) 

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween20)：1×20ml 

显色剂A：1×6.0ml 

终止液：1×6.0ml 

显色剂B：1×6.0ml 

酶标二抗：2×6.0ml(经1∶10000稀释) 

标本稀释液：1×20ml 

5.试剂盒的操作步骤： 

在预包被板的各孔中加入待检的血液样本以及标准品100μl/孔，均为双孔，同时设空白孔(即不加血浆标本)，37℃孵育30分钟，1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入酶标二抗100μl/孔，37℃孵育30分钟，1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液每孔各50μl，混匀，37℃孵育10分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)测定各孔的450nm处的吸光度。 

6.结果判定： 

OD测值计算：OD值_{待测标本孔}-OD值_空白孔

根据Aβ42抗体标准曲线计算Aβ42抗体浓度结果，标准曲线的R²＝0.992； 

47例正常老人血浆中Aβ42抗体浓度均值为169.32±62.97μg/ml； 

35例AD早期患者Aβ42抗体浓度较高，均值为200.44±58.78μg/ml； 

33例中晚期AD患者Aβ42抗体浓度有很大程度的下降，其均值为90.4±23.6μg/ml。 

Claims (10)

1.一种人Aβ42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列为：

Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。

2.一种Aβ42抗原，其包含权利要求1所述的人Aβ42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。

3.一种人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体，其由权利要求2所述的人Aβ42抗原制备而成。

4.根据权利要求3所述的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体在制备人Aβ42体外诊断试剂盒上的用途。

5.一种人Aβ42体外诊断试剂盒，其包含权利要求3所述的人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒采用所述人Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含人Aβ1-28多克隆抗体作为结合抗体。

8.根据权利要求2所述的Aβ42抗原在制备人Aβ42抗体体外诊断试剂盒上的用途。

9.一种人Aβ42抗体体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒采用权利要求2所述的人Aβ42抗原作为包被抗原。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。