CN101215323A

CN101215323A - 人ad7c-ntp抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

Info

Publication number: CN101215323A
Application number: CNA2007101255845A
Authority: CN
Inventors: 盛树力; 王蓉; 姬志娟; 朱建安
Original assignee: Shenzhen Anqun Bioengineering Co ltd; Xuanwu Hospital
Current assignee: Shenzhen Anqun Bioengineering Co ltd; Xuanwu Hospital
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: CN101215323B

Abstract

本发明为一种人AD7C－NTP抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用。本发明的AD7C－NTP抗原决定簇多肽，为序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所述的多肽片段之一。本发明的AD7C－NTP抗体，是由本发明的任一种AD7C－NTP抗原决定簇多肽制备而成。本发明的AD7C－NTP抗体可应用于制备AD7C－NTP体外诊断试剂盒。

Description

人AD7C-NTP抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

技术领域

本发明涉及人AD7C-NTP抗原决定簇多肽、相应的抗体及其在制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒上的应用。

背景技术

在人口老龄化日益加剧的今天，以神经退行性变为主要特征的老年病的发病率呈现逐年上升趋势。在我国老龄化问题尤为严峻，2006年2月23日，全国老龄办在发布的《中国人口老龄化发展趋势预测研究报告》中指出，中国已于1999年进入老龄社会。许多发达国家65岁以上人口比重由5％上升到7％一般要经历50-80年，而我国从1982年的4.9％上升到2000年的7.2％只用了18年，说明我国人口老龄化速度远超过发达国家。第五次全国人口普查结果表明，目前我国65岁以上人口为8811万人，占全国总人口的6.96％；60岁以上人口已经达到1.43亿，占总人口的10.97％；在2010年后我国50、60年代高生育期出生的人将陆续进入老年，届时人口老龄化的发展更为迅速，预计2015年老年人口将达到2.02亿，2027年将超过3亿，从2040年起，中国60岁以上的人口将达到3.97亿，还将有1亿80岁以上的老人，比目前全球80岁以上的老人总数还多。2044年前后可能突破4亿，老年人的数量居世界之首。人口老龄化是我国乃至世界各国在二十一世纪将面临最大的挑战。

神经退行性疾病是由于神经元进行性变性、死亡导致的、以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，严重危害人类身体健康，但其病因不清，发病机理复杂，缺乏有效的治疗措施。引起神经退行性变的原因很多，如遗传性疾病、代谢性疾病、血管性疾病及某些原因不明的疾病，其致命危害就是造成神经元的不可逆损伤。除人们熟知的老年性痴呆(Alzheimer’s disease，以下简称AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，简称PD)等，在人群中发病率日趋增高、且发病年龄日趋下降的糖尿病晚期并发症，如肾脏微血管病变、视网膜病变，均以神经退行性变为首发因素。由于神经退行性变病的发病机理不清，缺乏有效的早期诊断措施，给治疗、护理带来了一系列实实在在的问题，同时给社会和家庭造成了沉重的经济负担和精神压力。我国65岁以上老人中痴呆患病率为4％-7％，其中2/3为阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD，即老年性痴呆，又称早老性痴呆Alzheimer’s dementia)，目前约有500万左右的患者，预计到2050年我国老年痴呆患者将达到2000万人。如果政府和家庭对每一位AD病人花费的医疗费、护理费和家庭成员的误工费等平均每年1万元，那么到2050年我国对老年痴呆患者每年将付出2000亿元的费用。如此之重的经济负担将严重阻碍我国的经济发展，并可能引发社会问题。故研究神经退行性变发病机理和延缓、阻断其发展的干预手段，有着至关重要的意义。

作为引起老年痴呆最常见的病因，阿尔茨海默病临床上表现为智力水平的慢性削弱及记忆的慢性丢失。随着全球人口的老龄化，AD发病率也与日俱增，因此，AD的及时诊断与治疗必将越来越受到重视。

但是，迄今为止，AD的早期诊断十分困难，原因如下：1.需做脑脊液检查，取材不便；2.虽然脑脊液中磷酸化的Tau蛋白和其它骨架蛋白增加，但并无特异性，在其它神经系统疾病中也有变化；而Aβ42在AD早期无变化，随病情加重而减少，不便于测定；3.其它各种蛋白质包括酶的测定对诊断无指导意义。故有关AD早期诊断方面虽有百余篇报道，但只限于描述性研究，由于缺乏有效的生化指标，并无实用价值。

1992年，麻省总医院的Suzanne de la Monte和Jack Wands博士首先在AD脑中发现大量的神经丝蛋白(neural thread protein，NTP)与神经元纤维缠结(neuronal fibril tangle，NFT)有关，表明其在AD的病理改变过程中可能发挥一定作用；1996年，同一研究小组成功克隆出一种41KDa的、与AD相关的NTP，命名为AD7C-NTP。

AD7C-NTP由375个氨基酸组成，分子量41,718Da，等电点9.89，富含丝氨酸(11.7％)和脯氨酸(8.8％)，包括15个氨基酸的信号肽和7个可能的跨膜区。AD7C-NTP存在于神经细胞发出的轴突中；并且大量存在于AD患者脑中的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)中。AD7C-NTP参与脑神经元的修补与再生，AD患者脑中AD7C-NTP基因表达水平异常增高。AD7C-NTP现已被确定为诊断AD的生化指标，在AD患者的脑组织和脑脊液中都选择性升高。最新的研究发现，AD患者尿样或血清中AD7C-NTP水平的检测与CSF(脑脊液)中AD7C-NTP的检测具有同样的意义。这一无创性的检查更易被病人接受，也易于在临床上推广。

因此，监测脑脊液和尿液、血清中AD7C-NTP水平可作为早期AD的初筛试验，协助AD或有记忆障碍症状及体征患者的早期临床诊断。

而监测AD7C-NTP最理想的方法即是免疫测定，但前提是必须制备针对AD7C-NTP的特异性抗体，因此寻找合适的具有免疫原性的AD7C-NTP多肽片段，就成了研究的重点。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对AD诊断和治疗的现状，提供具有免疫原性的AD7C-NTP多肽片段，即提供人AD7C-NTP抗原决定簇多肽。

本发明的第二个目的在于利用本发明的人AD7C-NTP抗原决定簇多肽制备抗体，提供能与人AD7C-NTP抗原决定簇多肽特异性结合的抗体。

本发明的第三个目的在于将本发明的人AD7C-NTP抗体应用于制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒。

本发明的人AD7C-NTP抗原决定簇多肽，为如下多肽片段之一：

(1)Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro，即序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；

(2)Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn，

即序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列；

本发明的多肽片段(1)是人AD7C-NTP蛋白N端的一段13个氨基酸的残基，在该肽段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(3)、多肽片段(4)，如下：

(3)Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro，

即序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列；

(4)Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Tyr，

即序列表中SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列。

多肽片段(1)在N端或C端加Tyr是为了通过BDB(双偶氮联苯胺二氯化物Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Tyr加在N端产生抗多肽C端抗体，Tyr加在C端，产生抗多肽N端抗体。

本发明的多肽片段(2)是人AD7C-NTP蛋白C端的一段8个氨基酸残基，在该肽段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(5)、多肽片段(6)，如下：

(5)Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn，

即序列表中SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列；

(6)Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Tyr，

即序列表中SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列。

多肽片段(2)在N端或C端加Tyr是为了通过BDB(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原制备抗体，Tyr加在N端产生抗多肽C端抗体，Tyr加在C端，产生抗多肽N端抗体。

上述两种AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段----多肽片段(1)和多肽片段(2)是按以下原则筛选出来的：

1、亲水；

2、抗原性强；

3、易于合成。

迄今为止经研究我们发现上述两种多肽片段具有如下功能：

1、具有免疫原性

2、与载体蛋白连接后作为抗原可刺激动物产生特异性的抗体。

3、用这两种多肽片段制备的抗体可特异性的与人AD7C-NTP结合。

本发明的上述AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇多肽。多肽的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原多肽的浓度。

将本发明的任意一种AD7C-NTP抗原决定簇多肽与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物即可制备本发明的特异性的多克隆抗体或单克隆抗体。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例二。

如前所述依次制得AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段和其特异性抗体后，即可将该抗体用于制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒。

将采用本发明的抗体制备的人AD7C-NTP体外诊断试剂盒进行临床研究，在223例AD病人中，206例尿AD7C-NTP超过2.5ng/ml，而非AD对照平均值为0.8ng/ml，二者比较p＜0.001。若以1.5ng/ml为划定标准，尿AD7C-NTP诊断早期AD的特异性为91％，灵敏度为85％-92％，说明AD7C-NTP作为一种诊断AD的生化标记物是切实可行性的，同时说明本发明的多肽片段抗原性强，制备的抗体特异性强。

具体实施方式

实施例一：两种AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段的制备。

实施例采用的两种AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段为本发明的多肽片段(3)和多肽片段(5)，即：

Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro，

Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn。

制备方法采用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇多肽。多肽的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原多肽的浓度。

该两种多肽片段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。下图表示了这个合成过程。

上述两种AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段的制备如下：

1.所用原料：

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)

NMP(氮甲基吡咯烷酮)

DCM(二氯甲烷)

MeoH(甲醇)

Piperidine(哌啶)

DMAP(二甲基氨基吡啶)

HOBT(羟基苯并三唑)

DCC(二环己基碳二亚胺)

TFA(三氟乙酸)

EDT(1，2-乙二硫醇)

硫代苯甲醚

结晶苯酚

乙腈

2.使用仪器：

多肽自动合成仪

旋转蒸发仪

高效液相色谱仪

冷冻干燥机

3.合成方法和过程：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即0.1mmol于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的AA按不同的顺序联接起来，偶联率达99％。反应如下：

(1)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

(2)联接氨基酸到树脂上

(3)脱去氨基酸的Fmoc保护基

(4)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

(5)偶联

新的偶联的肽-树脂

(6)重复3-5直至合成结束，得到AD7C-NTP多肽的肽树脂260mg。

(7)裂解肽树脂：

用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT，硫代苯甲醚，H₂O作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到AD7C-NTP多肽的粗品。

多肽的纯化：

采用高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱 C₈ 10×100mm

色谱仪 Waters 600美国Waters公司

流动相 A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

B-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

检测波长 214nm

流速 4ml/分钟

洗脱梯度 20-60％B于30分钟

HPLC(高效液相色谱)分析

色谱柱： C₁₈ 4.6×150mm

流动相： A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

B-0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈

检测波长： 214nm

流速： 1ML/min

洗脱梯度： 0-60％B于30分钟

两种多肽片段分析结果显示纯度95％以上。

实施例二：将实施例一所得的AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物制备特异性的多克隆抗体。

(一)AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段(3)多克隆抗体制备：

1.抗原的制备：用碳二亚胺法将AD7C-NTP多肽片段(3)与载体蛋白血兰蛋白(KLH)联接制备成抗原。

2.动物制备抗血清：取抗原与1ml弗氏完全佐剂(基础免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每次剂量为50-200μg/ml，分20点皮内注射，共免疫7-8次，末次免疫后的第十天取耳血测定抗体效价。

3.测定抗体效价：用ELISA法测定抗体效价，结果显示抗体效价达到1∶32000以上。

4.接种H22肝癌细胞于腹腔内。

5.取腹水及分离上清。

6.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化。

7.抗体分装后冻干，低温保存。

(二)AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段(5)多克隆抗体制备：

1.抗原的制备：用碳二亚胺法将AD7C-NTP多肽片段(5)与载体蛋白KLH联接制备成抗原。

2.免疫动物制备抗血清：取抗原与1ml弗氏完全佐剂(基础免疫)或弗氏完不全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫新西兰大白兔背部，每次剂量为50-200μg/ml，分20点皮内注射，共免疫7-8次，末次免疫后的第十天取耳血测定抗体效价。

4.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

5.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化。

6.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例三：AD7C-NTP ELISA试剂盒的制备。

将上述制备的AD7C-NTP多抗用于制备尿中AD7C-NTP诊断试剂盒，本实施例将两种AD7C-NTP多抗中的多肽片段(3)多克隆抗体作为试剂盒中的包被抗体，多肽片段(5)多克隆抗体则作为结合抗体。

AD7C-NTP ELISA试剂盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：0.050M，pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)

Na₂CO₃(MW 105.99) 16.0克

NaHCO₃(MW 84.01) 29.0克

蒸馏水溶至1000ml。

B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的PBS-Tween 20

Na₂HPO₄.12H2O 58克

KH₂PO₄ 4克

NaCl 100克

KCl 4克

蒸馏水溶至1000ml

加Tween 20 20ml。

C、酶标记物稀释液：

10×PBS 10ml

FCS(小牛血清) 20ml

蒸馏水溶至1000ml

稳定剂 1克

防腐剂 1ml。

D、显色剂A：

柠檬酸 35.5克

过氧化脲 10克

蒸馏水溶至1000ml

Tween 20 10ml。

E、显色剂B：

柠檬酸 120克

EDTA-2Na 1克

TMB.2HCl 2克

蒸馏水溶至1000ml。

F、终止液：2M H₂SO₄

浓硫酸(95-98％) 22.2ml

蒸馏水 177.3ml

配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。

2.预包被板的制备：

将AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段(3)多克隆抗体溶于PH＝9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液中，多抗浓度为10μg/ml，制成预包被液，在酶标板上每孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经封闭、干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体(即AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段(5)多克隆抗体)和酶标二抗浓度确定：

结合抗体和酶标二抗浓度用方阵滴定实验确定。

4.试剂盒的组成：

(1)预包被板 48/96孔

(2)人AD7C-NTP标准品1→6个 6×50μl

(3)结合抗体 1×10ml

(4)酶标二抗(HRP-IgG) 1×10ml

(5)浓缩洗涤液(25×) 1×20ml

(6)样品稀释液 1×20ml

(7)显色剂A 1×6.0ml

(8)显色剂B 1×6.0ml

(9)终止液 1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在预包被板的各孔中加入按待检的尿液标本以及标准品100μl/孔，均为双孔，同时设空白孔，37℃孵育60分钟，洗涤5次，拍干。在各孔内加入结合抗体(即AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段(5)多克隆抗体)100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。再在各孔内加入标记有辣根过氧化酶的抗人IgG抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶联检测仪测定各孔的450nm处的吸光度。

6.结果判定：

OD比值计算：待测标本孔的OD值-空白孔的OD值

通过标准曲线计算结果。

尿中AD7C-NTP的浓度≤1.5ng/ml，为阴性。

尿中AD7C-NTP的浓度＞1.5ng/ml，为阳性。

将上述试剂盒应用于79例AD病人，其中66例尿AD7C-NTP超过2.5ng/ml，而非AD对照平均值为0.8ng/ml，二者比较p＜0.001。以1.5ng/ml为划定标准，尿AD7C-NTP诊断早期AD的特异性为91％，灵敏度为80％-85％。

序列表

<110>首都医科大学宣武医院

深圳市安群生物工程有限公司

<120>人AD7C-NTP抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Asn Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro

1 5 10

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn

1 5

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Tyr Asn Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro

1 5 10

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Asn Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr

1 5 10

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Tyr

1 5

Claims

1.一种人AD7C-NTP抗原决定簇多肽，为如下两种多肽片段之一：

(1)Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro；

(2)Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn。

2.如权利要求1所述的人AD7C-NTP抗原决定簇多肽，其特征在于：在所述多肽片段(1)、多肽片段(2)的N端或C端加有Tyr。

3.一种人AD7C-NTP抗体，由权利要求1或2所述的任意一种多肽片段制备而成的多克隆抗体或单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的人AD7C-NTP抗体在制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒上的应用。

5.如权利要求4所述的人AD7C-NTP抗体在制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述试剂盒采用权利要求3所述的任意一种人AD7C-NTP抗体作为包被抗体。

6.如权利要求5所述的人AD7C-NTP抗体在制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述制剂盒还包括结合抗体，结合抗体为权利要求3所述的另一种人AD7C-NTP抗体，与包被抗体的多肽来源不同。

7.根据权利要求6所述的人AD7C-NTP抗体在制备人AD7C-NTP体外诊断试剂盒上的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标记的二抗。