CN111440237A - 一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人AD7c‑NTP单克隆抗体及其制备方法和应用，通过以下步骤制备：以AD7c‑NTP重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c‑NTP蛋白的单克隆抗体。本发明与现有的技术相比的优点在于：本发明提供了可产生抗人AD7c‑NTP单克隆抗体的杂交瘤细胞株I1B10和杂交瘤细胞株X1C11，以及抗人AD7c‑NTP单克隆抗体I1B10和X1C11，该抗体对可通过双抗体夹心法对人体液中AD7c‑NTP浓度进行检测，具有重要的应用前景。

Description

一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备领域，具体是一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病，以智力功能受损和失忆的慢性 恶化过程为特征。2001年，全世界有1100万人患有阿尔茨海默病(Gadit,2001)。到2005年，全世界有 2420万人患有老年痴呆[Reitz C,2011]；2010年，这一数字增至3600万，到2030年将增至6600万， 到2050年将增至1.15～1.35亿[The Global Impactof Dementia 2013–2050]。目前，阿尔茨海默病成 为第六主要死因(AA,2012)。阿尔茨海默病在所有痴呆症患者中约占70％。最新的诊断指南将阿尔茨海默 病分为三个阶段：痴呆阶段；有症状，痴呆前期(又称轻度认知障碍)和无症状，临床前阶段[Jack CR, 2011]。目前仍没有有效的治疗方法来预防、制止或逆转阿尔茨海默病；AD的唯一有效的治疗方法是延缓或减轻症状[Huang Y,2012]。因此，AD的早期诊断至关重要。
神经元丝状蛋白(Neuronal thread protein,NTP)是一类跨膜磷酸化蛋白，可诱导神经元凋亡和线粒 体功能障碍[De la Monte SM,2001]；NTP在神经元细胞增殖、分化、脑发育和AD神经元退变过程中表达 增加[De la Monte SM,1997]。
AD7c-NTP是NTP家族中的一个成员，是由Suzanne M.de la Monte等首次从AD晚期患者的颞叶中分 离出一个新的包含Alu序列cDNA，被命名为AD7c-NTP，其序列全长为1442bp，含有1125个核苷酸组成的 ORF，可编码含375个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为41kD，等电点为9.89[Monet SM,et al.1997]。 2004,桂俊豪等利用生物信息学方法发现AD7c-NTP基因定位于lp36.11的负链上，无内含子序列，编码 产物可能存在3个跨膜区。
Ghanbari H等采用免疫学方法对AD疑似患者脑脊液(CSF)或尿液中的AD7c-NTP蛋白含量进行检测 有助于AD的早期诊断和鉴别诊断。De la Monte SM等研究发现AD7c-NTP基因的异常表达与AD型痴呆的 典型细胞表型密切相关。AD7c-NTP可能是一种新的、具有重要临床应用价值的AD早期诊断的生物标记物 [De la Monte SM,2002&Neugroschl J,2002]。因此，开发用于临床诊断的AD7c-NTP抗原检测试剂盒 具有重要的意义。
2007年，盛树立等通过设计、合成AD7c-NTP抗原决定簇多肽片段，制备多克隆抗体，用于开发AD7c-NTP 体外诊断试剂盒；杨永芳(2015)等同样通过设计、合成AD7c-NTP抗原表位多肽，制备鼠单克隆抗体， 并用于开发AD7c-NTP体外诊断试剂盒。然而，市面上AD7c-NTP体外诊断试剂盒在临床应用时反馈率较高， 且与临床症状符合率不高，且临床操作不便、反应时间较长。因而，急需开发特异性更好、与临床符合率 更高、操作方便、快捷的AD7c-NTP体外诊断试剂盒。
AD7c-NTP体外诊断试剂盒中最核心的组分是抗AD7c-NTP抗体原料。由于AD7c-NTP在人体脑脊液及尿 液中含量甚微，很难获得天然蛋白。国内AD7c-NTP体外诊断试剂盒多数是基于AD7c-NTP多肽抗原开发的、 其灵敏度及特异性不足，因而获得高亲和力、高特异性抗AD7c-NTP抗体是成功研制AD7c-NTP体外诊断试 剂盒的关键。AD7c-NTP是一种膜蛋白，结构比较复杂，目前还未见报道通过DNA重组技术获得大量AD7c-NTP 蛋白抗原，制备抗AD7c-NTP单克隆抗体，研制AD7c-NTP体外诊断试剂盒。
所以，本发明利用DNA重组技术，合成AD7c-NTP全长基因，构建至原核表达载体，通过优化发酵、 纯化及复性工艺，体外获得了大量AD7c-NTP蛋白；并成功研制了高亲和力、高特异性抗AD7c-NTP单克隆 抗体；并以此为基础开发便捷、快速的AD7c-NTP蛋白诊断方法及其诊断试剂，通过检测脑脊液和尿液、 血清中AD7c-NTP含量可作为AD患者的早期筛查，以达到AD患者的早期诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服以上的技术缺陷，提供一种与人AD7c-NTP蛋白特异性结合的抗体， 该抗体为单克隆抗体。
为了解决上述问题，本发明的技术方案为：一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，通过 以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融 合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克 隆抗体。
作为改进，所述AD7c-NTP重组蛋白具有SEQ ID NO.1序列，其制备方法如下：将人AD7c-NTP基因(SEQ ID NO.2)插入表达载体pET30a，构建pET30a-AD7c-NTP融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导， 纯化、复性得到人AD7c-NTP重组蛋白。
作为改进，BALB/c小鼠为8-12周龄雌性小鼠。
作为改进，抗人AD7c-NTP单克隆抗体是采用ELISA法(酶联免疫吸附试验)高通量筛选获得的。
作为改进，纯化方法为Protein A亲和纯化。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体，所述抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体如上述制备方法制备得 到。
一种AD7c-NTP抗体对筛选方法，采用棋盘滴定法进行AD7c-NTP抗原检测，选择灵敏度及特异性较好 的配对抗体。
一种AD7c-NTP浓度的检测方法，通过鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和鼠抗人AD7c-NTP单克隆 抗体X1C11可基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中AD7c-NTP浓度进行检测，优选对尿液样本中的人 AD7c-NTP进行检测。
作为改进，所述体液包括尿液、脑脊液、血清或血液。
本发明与现有的技术相比的优点在于：
提供了可产生抗人AD7c-NTP单克隆抗体的杂交瘤细胞株I1B10和杂交瘤细胞株X1C11，以及抗人 AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和X1C11，该抗体对可通过双抗体夹心法对人体液中AD7c-NTP浓度进行检测， 具有重要的应用前景。
本发明提供了一种人AD7c-NTP体外重组蛋白的表达与纯化方法，解决了人AD7c-NTP蛋白体外不易获 得，且不稳定的问题，而且，利用人AD7c-NTP重组蛋白免疫动物，可制备更加广谱抗AD7c-NTP抗体，尤 其可制备亲和力、特异性更好的鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，此外，采用抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10 和X1C11，建立人AD7c-NTP蛋白检测ELISA方法，实现了检测的高灵敏度(0.3ng/ml)和特异性，最后， 可以快速、准确地测定尿液中人AD7c-NTP蛋白的含量，对于AD患者的早期诊断、早期治疗提供可靠的临 床参考价值。
附图说明
图1是重组质粒pET30a-AD7c-NTP小样诱导表达SDS-PAGE鉴定结果图。
图2是人AD7c-NTP重组蛋白纯化及复性后SDS-PAGE鉴定结果图。
图3是人AD7c-NTP抗原ELISA检测方法线性及灵敏度图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在 不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是 显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫 原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆 抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体。
所述AD7c-NTP重组蛋白具有SEQ ID NO.1序列，其制备方法如下：将人AD7c-NTP基因(SEQ ID NO.2) 插入表达载体pET30a，构建pET30a-AD7c-NTP融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化、 复性得到人AD7c-NTP重组蛋白，BALB/c小鼠为8-12周龄雌性小鼠，抗人AD7c-NTP单克隆抗体是采用ELISA 法(酶联免疫吸附试验)高通量筛选获得的，纯化方法为Protein A亲和纯化。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体，所述抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体如上述制备方法制备得 到。
一种AD7c-NTP抗体对筛选方法，采用棋盘滴定法进行AD7c-NTP抗原检测，选择灵敏度及特异性较好 的配对抗体。
一种AD7c-NTP浓度的检测方法，通过鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和鼠抗人AD7c-NTP单克隆 抗体X1C11可基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中AD7c-NTP浓度进行检测，优选对尿液样本中的人 AD7c-NTP进行检测，所述体液包括尿液、脑脊液、血清或血液。
实施例一：人AD7c-NTP重组蛋白的制备
(1)、人AD7c-NTP原核表达载体的构建
人工合成人AD7c-NTP基因序列SEQ ID NO.2，将其插入至经NdeI和XhoI双酶切的原核表达质粒pET30a 中，并转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)。0.1g/L卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，并用终浓度为1mM IPTG 进行诱导，诱导温度分别为16℃、25℃、30℃、37℃诱导，优选的是25℃诱导，200rpm振荡培养14h诱 导人AD7c-NTP重组蛋白表达。最后经SDS-PAGE鉴定，结果如图1.所示。
注：M：预染蛋白Marker，泳道1-3分别为诱导前pET30a-AD7c-NTP菌液、诱导后pET30a-AD7c-NTP 菌液超声上清、诱导后pET30a-AD7c-NTP菌液超声后沉淀。
(2)、pET30a-AD7c-NTP融合蛋白的表达
将鉴定正确的pET30a-AD7c-NTP菌种转接至含100ug/ml卡那霉素LB培养基过夜培养，次日以1:100 转接到新鲜的含有100ug/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃、200rpm震荡培养至A600+0.4-0.6时，加 入IPTG时期终浓度为1mmol/L，温度调至25℃诱导表达14h。4℃，10000r/min离心10min收集沉淀。
(3)、pET30a-AD7c-NTP融合蛋白的纯化
A、将上述的菌体沉淀用菌体裂解Buffer A(20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，0.1％Triton X-100， 1mM DTT)重悬，600W功率超声破碎，10000rpm离心30min，收集包涵体沉淀。
B、将包涵体沉淀用缓冲液I(20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM DTT,8M尿素)、缓冲液II(20mM Tris-HCl (pH9.0)，1mM DTT,8M尿素)、缓冲液III(20mM Tris-HCl(pH11)，1mM DTT,8M尿素)进行溶解，优选 为缓冲液III，10000rpm，离心30min，收集上清。
C、溶解后的包涵体蛋白通过Ni柱亲和层析纯化：本发明采用AKTA Pure25纯化仪对蛋白样品进行纯 化。
装柱：取5ml Ni Sepharose excel(GE)亲和填料转入XK 16/20Colum(GE)色谱柱，用5倍柱体 积的结合缓冲液III(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素)平衡镍柱；
上样：将蛋白样品经0.45μm滤膜过滤后准备上样，流速2ml/min；最后用5-10倍柱体积缓冲液III 进行平衡。
洗脱：分别用洗脱液I(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素，50mM咪唑)、洗脱液II(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素，200mM咪唑)和洗脱液(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M 尿素，500mM咪唑)进行洗脱，分别收集不同洗脱峰。
平衡及保存：分别用5倍柱体积的结合缓冲液III、纯化水、20％乙醇进行平衡镍柱，并于4℃保存。
(4)、蛋白复性：采用尿素梯度透析法进行复性，复性缓冲液为：20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM GSH， 0.1GSSG，0.5M精氨酸,4M尿素，最终得到可溶性的人AD7c-NTP重组蛋白。
(5)、SDS-PAGE鉴定
采用SDS-PAGE对人AD7c-NTP重组蛋白纯化及复性后的样品进行鉴定，结果见图2.
注：M：预染蛋白Marker，泳道2：纯化及复性后人AD7c-NTP重组蛋白。
实施例二：抗人AD7c-NTP单克隆抗体的制备
(1)、动物免疫
以纯化的人AD7c-NTP重组蛋白为免疫原，常规方法免疫8-12周龄BALB/c雌性小鼠，初次用弗氏完 全佐剂与抗原进行乳化，经皮下和腹腔多点免疫，剂量为100μg/只；隔两周加强免疫一次，共三次，佐 剂为弗氏不完全佐剂，剂量100μg/只/次；采用间接ELISA法检测小鼠尾血效价>1:10^4，融合前三天进 行腹腔注射加强免疫100μg人AD7c-NTP抗原。
(2)、细胞融合
取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按照5:1的比例混合，1000rpm，离心10min，弃上清；用RPMI-1640 培养基重悬细胞，1000rpm，离心10min，弃上清，用滴管吸出残留液体，轻击管底，使沉淀细胞松散均匀， 至于37℃水浴中预热，在60s内加入预热的PEG1500(Roche)1ml，然后缓慢滴加RPMI-1640培养基至 20ml，1000rpm，离心10min，弃上清。用含HAT培养基重悬细胞，并分装至96孔细胞培养板，并置于37℃， 5％CO2培养箱内培养。
(3)、细胞筛选及单克隆化
采用间接ELISA法筛选与人AD7c-NTP重组蛋白特异性结合的阳性培养孔，其具体过程为：
A、抗原酶标板的制备
用50mM pH9.6碳酸盐华冲也将人AD7c-NTP重组蛋白稀释至2μg/ml，分别加入至96孔酶标板，100 μl/孔，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS(pH7.4)，0.05％T-80)洗涤3-5次，甩干后，用封闭液(10mM PBS(pH7.4)，5％BSA)37℃封闭2h后备用。
B、细胞上清ELISA检测
分别取待筛选的96孔细胞上清100μl，加入至96孔已制备的抗原酶标板，37℃，孵育1h，用PBST 洗版3-5次。进一步，在每孔中加入1:5000稀释的羊抗鼠-HRP 100μl，37℃孵育45min，用PBST洗板 3-5次。最后加入底物H2O2-TMB((3,3’，5,5’-四甲基联苯胺))，100μl/孔，避光显色10min，加入2M 硫酸50ul/孔终止反应，于酶标仪中测定450nM的吸光值。
C、细胞单克隆化
选择ELISA检测阳性的细胞孔，采用有限稀释法分别进行细胞单克隆化，确保每个培养孔内至多含有 一个杂交瘤细胞。待细胞长至培养孔1/3-1/2时再次经间接ELISA法筛选，最终确保单一细胞株可稳定分 泌抗人AD7c-NTP重组蛋白的抗体。
(4)、细胞冻存
细胞冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO，将杂交瘤细胞离心，重悬于预冷的细胞冻存液中，细胞密度为 10^7，分转至冻存管中，1ml/支，置于-80℃冰箱中，次日放入液氮长期保存。
(5)、单克隆抗体制备
本发明中，通过制备小鼠腹水法获得抗人AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体，具体步骤如下：
首先将8-12周龄BALB/c雄性致敏(腹腔注射液体石蜡，0.5ml/只)，2周后腹腔接种上述获得的杂交 瘤细胞(需经无血清培养洗涤至少一次)，接种量10^6/只，待小鼠腹部可见明显膨胀，反复抽取腹腔腹水， 4000rmp，离心30min，收集上清，分装，于-20℃备用。
实施例三：抗人AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体纯化
(1)、单克隆抗体的纯化
将实施例二中得到的单抗腹水通过Protein A亲和层析法进行纯化，具体步骤如下：
基本步骤为：平衡-上样-平衡-洗脱-平衡-保存
平衡液：20mM PB(pH7.2)缓冲液
洗脱液：0.1M pH 3.0甘氨酸-HCl缓冲液
中和缓冲液：1M，pH9.0，Tris-HCl缓冲液
保存液：20％无水乙醇
取3-5ml腹水，用50％饱和硫酸铵进行沉淀2h以上，10000rmp，离心20min，弃上清；沉淀用平衡液 进行溶解，并用0.45μm滤膜过滤后，准备上样；Protein A亲和柱预先经5倍柱体积的平衡液平衡，然 后以2ml/min的流速将硫酸铵沉淀的蛋白进行上样，最后再用5倍柱体积平衡液进行平衡；更换为洗脱液 进行洗脱，并收集目的蛋白，然后按照抗体：中和缓冲液＝20:1的体积比进行中和，得到纯化的抗抗人 AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体。
实施例四：抗体配对检测
(1)、抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记
HRP标记采用高碘酸钠氧化法。标记抗体采用间接ELISA法进行效价检测，于-20℃保存备用。
(2)、抗体对筛选
采用棋盘滴定法进行抗体配对，分别取浓度为0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、 10ng/ml、20ng/ml的人AD7c-NTP重组蛋白筛选最佳配对抗体。以经验浓度200ng/孔包被24种酶标抗体， 4℃过夜，PBST洗涤3-5遍，加入封闭液300μl/孔，37℃封闭2h，PBST洗涤3-5遍；加入定值人AD7c-NTP 重组蛋白，37℃孵育1h后PBST洗3-5遍；再分别加入1:500倍稀释的HRP标记抗体，37℃孵育45min，PBST洗3-5遍；加入底物TMB，37℃避光显色10min后，加入终止液2M硫酸50μl，于酶标仪中测定450nM 的吸光值。结果见表1-2所示，分析配对结果。
表1.HRP标记抗人AD7c-NTP抗体效价ELISA检测结果
Figure BDA0002393168030000071
表2.棋盘法滴定法筛选的最优配对抗体检测结果
Figure BDA0002393168030000072
实施例五：临床尿液样本中人AD7c-NTP含量的检测
采用实施例四中的I1B10-X1C11配对抗体，建立人AD7c-NTP抗原双抗体夹心ELISA检测方法，并对 临床尿液样本进行检测，具体步骤如下：
样本采集：留晨尿，健康人样本8份、临床阳性样本5份
AD7c-NTP抗体酶标板的制备：方法与实施例四中抗体对筛选相同
AD7c-NTP蛋白标准品的配制：用10mM pH7.4 PBS稀释AD7c-NTP蛋白至终浓度分别为0.3ng/ml、 0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。
向预包被酶标板中加入待见尿液和抗原标准品各100μl/孔，空白孔加100μl PBS，37℃孵育60min， PBST洗涤3-5遍，拍干。在各孔内加入标记HRP的配对抗体100μl/孔，37℃孵育45min，PBST洗涤3-5 遍，拍干。加入底物TMB，37℃避光显色15min。每孔加入终止液2M硫酸50μl，于酶标仪中测定450nM 的吸光值(OD值)。以吸光度值为Y轴，抗原标准品浓度为X轴，制作标准曲线，并计算样本中AD7c-NTP 的浓度。具体结果见表3.和图3.
表3. 13份尿液样本中AD7c-NTP的浓度检测结果
Figure BDA0002393168030000081
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：通过以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述AD7c-NTP重组蛋白具有SEQ ID NO.1序列，其制备方法如下：将人AD7c-NTP基因(SEQ ID NO.2)插入表达载体pET30a，构建pET30a-AD7c-NTP融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化、复性得到人AD7c-NTP重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：BALB/c小鼠为8-12周龄雌性小鼠。
4.根据权利要求1所述的一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：抗人AD7c-NTP单克隆抗体是采用ELISA法(酶联免疫吸附试验)高通量筛选获得的。
5.根据权利要求1所述的一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：纯化方法为Protein A亲和纯化。
6.一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体如权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到。
7.一种AD7c-NTP抗体对筛选方法，其特征在于：采用棋盘滴定法进行AD7c-NTP抗原检测，选择灵敏度及特异性较好的配对抗体。
8.一种AD7c-NTP浓度的检测方法，其特征在于：通过鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体X1C11可基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中AD7c-NTP浓度进行检测，优选对尿液样本中的人AD7c-NTP进行检测。
9.根据权利要求8所述的一种AD7c-NTP浓度的检测方法，其特征在于：所述体液包括尿液、脑脊液、血清或血液。
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