CN106519028A - 检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，方法包括AD7c‑NTP‑230单克隆抗体的表达和AD7c‑NTP‑230单克隆抗体的纯化，通过合成高纯度AD7c‑NTP相关多肽对6‑8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，如果抗体滴度在1:10000以上时，可将免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，得到AD7c‑NTP‑230的单克隆抗体的杂交瘤细胞；向6‑8周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后10天收集腹水，protein A/G柱子纯化腹水，获得纯度较高的AD7c‑NTP‑230单克隆抗体，用于体外诊断阿尔茨海默病和确定疾病进展的阶段。

Description

检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法
技术领域
本发明公开检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），又称老年痴呆症，是一种进行性的神经退行性疾病。AD的病理改变可用生物标志物来监测。常用的AD检测材料是脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF)或体液)。后者包括血液或尿液。和侵入式且风险较大的脑脊液采集相比，血液或尿液采集具有不可比拟的优势。因此发展后者的AD早期诊断试剂成为首选。国外研究表明, 在早期或相对严重的AD患者脑脊液及尿液样本中可以检测到AD7c-NTP, 而且脑脊液及尿液中AD7c-NTP水平与痴呆的严重程度呈正相关, 而且在AD患者的尿液样品和脑脊液样品中检测AD7c-NTP的效果相同。我们通过分析发现AD患者尿液样本中的含有AD7c-NTP相关多肽AD7c-NTP-230。
发明内容
本发明的目的在于公开了制备可以检测AD患者尿液样本中AD7c-NTP相关多肽AD7c-NTP-230的含量的单克隆抗体的方法。
本发明的技术方案：检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，所述方法包括AD7c-NTP-230单克隆抗体的表达和AD7c-NTP-230单克隆抗体的纯化。
作为本发明进一步限制地，AD7c-NTP-230的单克隆抗体的表达包括以下步骤：
第一步， 将合成的高纯度AD7c-NTP-230多肽与载体蛋白BSA用SPDP连接法进行偶联：4.6mg SPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM，0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h，HiTrapTM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP，4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜；
第二步，用BSA偶联的AD7c-NTP-230多肽进行动物免疫：选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，按照每只100µg的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。免疫2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射，免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清，使用间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度，如果抗体滴度在1:10000以上，在融合前三天加强免疫，100微升的PBS溶解50µg抗原腹腔内注射，否则，继续进行每两走一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
第三步，细胞融合和筛选：为了产生分泌的单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇（PEG）介导的条件下融合，脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合，将细胞的混合物用用无血清的DMEM培养基洗涤5次，在37℃水浴中，向细胞团中逐滴加入50%PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的DMEM培养基洗涤1次，用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200微升/空接种于96孔细胞培养板中，之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选，使用间接法ELISA筛选分泌针对AD7c-NTP-230抗体阳性细胞孔，手册确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌AD7c-NTP-230抗体的杂交瘤细胞株。
第四步，腹水制备：选择6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-10天后注射杂交瘤细胞。
作为本发明进一步限制地，所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的纯化包括以下步骤：
第一步，注射细胞后10天左右收集腹水；
第二步，protein A/G柱子纯化腹水，获得纯度较高的AD7c-NTP-230单克隆抗体。
本发明的技术效果：本发明的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，用AD7c-NTP-230多肽对小鼠进行免疫，如果抗体滴度在1:10000以上时，可将免疫小鼠脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，向小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后10-14天收集腹水， protein A/G 柱子纯化腹水，获得AD7c-NTP-230单克隆抗体，该方法可以有效检测AD患者尿液样本中AD7c-NTP相关多肽AD7c-NTP-230的含量的单克隆抗体，抗体能够特异性检测阿尔茨海默病人脑脊液和尿液样品中的AD7c-NTP含量，单克隆抗体和包含它的组合物用于体外诊断阿尔茨海默病和确定疾病进展的阶段，在取自患有阿尔茨海默病的个体的尿液及脑脊液样品中体外诊断疾病的诊断剂中的应用。
具体实施方式：
下面，结合实例对本发明的实质性特点和优势作进一步的说明，但本发明并不局限于所列的实施例。
实施例1
本发明的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，所述方法包括AD7c-NTP-230单克隆抗体的表达和AD7c-NTP-230单克隆抗体的纯化。
AD7c-NTP-230单克隆抗体的表达包括以下步骤：
第一步，用BSA偶联的AD7c-NTP-230多肽进行动物免疫：选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，按照每只鼠100µg的量，与等体积的完全弗氏佐剂乳化，乳浊液皮下多点注射，2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清，间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度，如果抗体滴度在1:10000以上，可以砸融合前3天加强免疫，100µl的PBS溶解100µg 用BSA偶联的AD7c-NTP-230多肽腹腔内注射，否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
第二步，细胞融合和筛选：为了产生分泌AD7c-NTP-230单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液融合，然后在聚乙二醇（PEG）介导的条件下融合：脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合，将细胞的混合物用无血清DMEM培养基洗涤5次，于37℃水浴中，向细胞团中逐渐加入50%PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的DMEM培养基洗涤1次，用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200微升/空接种于96孔细胞培养板中，之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌的抗体阳性细胞孔，首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌AD7c-NTP-230抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2
所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的纯化包括以下步骤：
第一步，注射细胞后10天左右收集腹水；
第二步，protein A/G柱子纯化腹水，获得纯度较高的AD7c-NTP-230单克隆抗体。
AD7c-NTP-230单克隆抗体的纯化，选择6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-10天后注射杂交瘤细胞，注射后10天左右收集腹水，protein A/G柱子纯化腹水，获得纯度较高的AD7c-NTP-230单克隆抗体。
1、protein A/G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为1ml；
2、以缓冲液C平衡10个床体积，流速为1ml/min；
3、将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml，0.45μm 滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、用缓冲液C再洗5 个柱床体积，流速为1ml/min；
5、用洗脱液E,洗脱3体积；
6、在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中性；
7、将分离纯化的单克隆抗体进行滴度测定，抗体滴度为1:20000。
上述实施例所用缓冲液配方包括五种缓冲液配方，其分别为A至E缓冲液配方：
A缓冲液：
1mol/L Na2HPO4.12H2O (MW358.14)……………… 358.14g
1.5mol/L NaCl (MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
B缓冲液：
1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………156.01g
1.5mol/L NaCl (MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
C 吸附和洗涤缓冲液：
取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后PH6.5
D 中和缓冲液:
A液77.4ml 、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液
E 洗脱液:
0.1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………15.601g
0.15mol/L NaCl (MW68.08g/mol) ……………………… 8.77g
溶于1升水，滤膜过滤，HCl调整PH至3.0
本发明的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，用AD7c-NTP-230多肽对小鼠进行免疫，如果抗体滴度在1:10000以上时，可将免疫小鼠脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，向小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后10-14天收集腹水，protein A/G柱子纯化腹水，获得AD7c-NTP-230单克隆抗体，该方法可以有效检测AD患者尿液样本中AD7c-NTP相关多肽AD7c-NTP-230的含量的单克隆抗体，抗体能够特异性检测阿尔茨海默病人脑脊液和尿液样品中的AD7c-NTP含量，单克隆抗体和包含它的组合物用于体外诊断阿尔茨海默病和确定疾病进展的阶段，在取自患有阿尔茨海默病的个体的尿液及脑脊液样品中体外诊断所述疾病的诊断剂中的应用。需要指出的是，上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括AD7c-NTP-230单克隆抗体的表达和AD7c-NTP-230单克隆抗体的纯化。
2.根据权利要求1所述的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的表达包括以下步骤：
第一步， 将合成的高纯度AD7c-NTP-230多肽与载体蛋白BSA用SPDP连接法进行偶联：4.6mg SPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM，0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h，HiTrapTM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP，4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜；
第二步，用BSA偶联的AD7c-NTP-230多肽进行动物免疫：选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，按照每只100µg的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射，免疫2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射，免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清，使用间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度，如果抗体滴度在1:10000以上，在融合前三天加强免疫，100微升的PBS溶解50µg抗原腹腔内注射，否则，继续进行每两走一次免疫，直到达到较高的抗体滴度；
第三步，细胞融合和筛选：为了产生分泌的单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇（PEG）介导的条件下融合，脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合，将细胞的混合物用用无血清的DMEM培养基洗涤5次，在37℃水浴中，向细胞团中逐滴加入50%PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的DMEM培养基洗涤1次，用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200微升/空接种于96孔细胞培养板中，之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选，使用间接法ELISA筛选分泌针对AD7c-NTP-230抗体阳性细胞孔，手册确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌AD7c-NTP-230抗体的杂交瘤细胞株；
第四步，腹水制备：选择6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-10天后注射杂交瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的纯化包括以下步骤：
第一步，注射细胞后10天左右收集腹水；
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