CN113281522B - 阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于体外检测技术领域。本发明化学发光免疫检测试剂盒包括链霉亲和素带有官能团的磁颗粒、化学发光标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体和偶联标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体。本发明化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明化学发光免疫测试剂盒的抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度，具有化学发光检测首创的效果。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种慢性进行性神经系统变性疾病。AD与多种因素有关，其临床表现以认知功能及记忆功能进行性损伤为主要特征，是引起痴呆的最主要原因。随着人口的老龄化，AD已逐渐成为威胁人类生命健康及生活质量的一大问题。然而就AD的目前研究现状来说，其病因及发病机制尚未明确，可能与遗传、炎症、自由基损伤、铝中毒等多种发病学说相关，其病理改变在临床症状出现前很长一段时间即有发生，临床治疗多以改善或延缓症状为主。
阿尔茨海默相关神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal threadprotein，AD7c-NTP)属于神经丝蛋白家族，是一种分子量为41kD的跨膜磷蛋白，在神经元中表达，定位于神经细胞轴突。阿尔茨海默病其主要的神经病理特征为神经元纤维缠结和神经变性斑，伴有轴突异常增生及神经元大量凋亡。对AD患者脑组织进行组织病理学研究发现，AD7c-NTP在AD患者神经元纤维缠结中大量存在，且在患者脑中呈分泌性上调表达，并且浓度随着AD病程的进展而增加。同β淀粉样蛋白和Tau蛋白相比，其浓度升高出现的更早，因此可作为早期诊断的一个指标。
目前检测AD7c-NTP的试剂盒多为酶联免疫法或免疫层析法。酶联免疫法检测时间长，手动操作较多，步骤繁琐复杂，人为误差较大，能进行半自动化检测却不能进行大规模全自动化检测。免疫层析法检测同样需要人工手动上样等操作，人为干扰较大，同时只能进行定性检测，不能对AD7c-NTP进行定量检测，不适合大规模全自动化检测。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，包括：R1、R2和R3试剂；
所述R1试剂为链霉亲和素带有官能团的磁颗粒；
所述R2试剂为化学发光标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体；
所述R3试剂为偶联标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体。
在上述技术方案中，所述R1试剂的质量比是0.01％～1％。
在上述技术方案中，所述R2试剂中：阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～20；缓冲液为100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.1～2μg/mL。
在上述技术方案中，所述R3试剂中：阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～20；缓冲液为100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.2～3μg/mL。
在上述技术方案中，所述R1试剂中磁颗粒的粒径是4～6μm，官能团为羧基、氨基、Tosyl或者环氧乙烷。
在上述技术方案中，所述R2试剂中化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌。
在上述技术方案中，所述R3试剂中偶联标记物为生物素或者抗体。
在上述技术方案中，所述过氧化物包括过氧化脲、过氧化氢或有相同作用的化学物质。
在上述技术方案中，所述化学发光免疫检测试剂盒还包括阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品；所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液。
本发明还提供的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、R1试剂的制备
取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后在100～500mMPB，pH6～8的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂；
步骤2、R2试剂的制备
将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后按照阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～20加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体；将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，pH6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1-2μg/mL的R2试剂；
步骤3、R3试剂的制备
取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后按照阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～20加入偶联标记物，经过封闭、纯化步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体；将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用100～500mM PB、50～100mg/mL过氧化物，pH6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2-3μg/mL的R3试剂；
将R1、R2和R3试剂组装成成品试剂即为阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒。本发明的化学发光免疫分析试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对阿尔茨海默相关神经丝蛋白的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。这种化学发光免疫分析试剂盒的检测精度较高。
本发明的有益效果是：
本发明提供的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫测试剂盒具有的优点是，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度，具有化学发光检测首创的效果。
本发明提供的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对阿尔茨海默相关神经丝蛋白的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时，提高了检测灵敏度。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1得到的AD7c-NTP标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同于描述的其他方式来实施。
本发明的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒包括R1、R2和R3试剂；所述R1试剂为链霉亲和素带有官能团的磁颗粒，所述R2试剂为化学发光标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体，所述R3试剂为偶联标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体。
优选的，R1试剂链霉亲和素带有官能团的磁颗粒的质量比是0.01％～1％，进一步优选将链霉亲和素带有官能团的磁颗粒于缓冲溶液中配制成磁珠浓度是0.072％。
优选的，R2试剂化学发光标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体中，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～20，缓冲液为100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.1～2μg/mL，进一步优选缓冲液为100mM PB，100mg/mL过氧化脲，抗体终浓度为0.1～1μg/mL。
优选的，R3试剂偶联标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体中，阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～20，缓冲液为100～500mMPB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.2～3μg/mL，进一步优选的是缓冲液为100mM PB，100mg/mL过氧化脲，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.2～2μg/mL。
优选的，所述R1试剂中磁颗粒的粒径是4～6μm，官能团为羧基、氨基、Tosyl或者环氧乙烷；进一步优选的是R1试剂中磁颗粒的粒径是3μm，官能团为羧基。
本发明的化学发光免疫检测试剂盒还包括阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品。其中所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液。
本发明R2和R3试剂的缓冲液中过氧化物例如过氧化脲的作用是将样本中阿尔茨海默相关神经丝蛋白的甲硫氨酸转化为甲硫氨酸亚砜，使标记了吖啶酯或生物素的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体可以识别其特殊位点，从而形成抗体-抗原-抗体复合物而被检测。
本发明的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒用于检测阿尔茨海默相关神经丝蛋白时，利用全自动化学发光免疫分析仪(CM180)对阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算阿尔茨海默相关神经丝蛋白的浓度。
使用本发明化学发光免疫检测试剂盒检测阿尔茨海默相关神经丝蛋白具有如下优点：
1、本发明的化学发光法检测阿尔茨海默相关神经丝蛋白的试剂盒，弥补目前市场上没有相关检测试剂盒空缺，同时采用利用过氧化剂作用于阿尔茨海默相关神经丝蛋白中的甲硫氨酸，增强了阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体的识别特异性，大大提高试剂的分析灵敏度。
2、本发明选择吖啶酯等为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。
3、本发明采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。
4、本发明阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。
5、本发明吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。
6、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。
实施例1：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备：
R1试剂的制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有羧基官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在200mM PB，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用200mM PB、100mg/mL过氧化脲，pH6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1μg/mL的R2试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3。
R3试剂的制备：取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用200mM PB、100mg/mL过氧化脲，pH6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2μg/mL的R3试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:20。
实施例2：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备：
R1试剂的制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有羧基官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在100mM PB，pH7的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用100mM PB、50mg/mL过氧化脲，pH7的缓冲液配制成抗体终浓度为1μg/mL的R2试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:10。
R3试剂的制备：取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用100mM PB、50mg/mL过氧化脲，pH7的缓冲液配制成抗体终浓度为2μg/mL的R3试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:10。
实施例3：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备：
R1试剂的制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有羧基官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在500mM PB，pH7.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用500mM PB、80mg/mL过氧化脲，pH8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.5μg/mL的R2试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:20。
R3试剂的制备：取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用500mM PB、80mg/mL过氧化脲，pH8的缓冲液配制成抗体终浓度为1.5μg/mL的R3试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5。
实施例4：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备：
R1试剂的制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有羧基官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在200mM PB，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂。
R2试剂的制备：将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用200mM PB，pH6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1μg/mL的R2试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:20。
R3试剂的制备：取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素Sulfo-NHS-LC-Biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体。将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用200mM PB，pH6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2μg/mL的R3试剂，其中阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5。
实施例5：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒性能评价
根据实施例1进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液作标准曲线(如图1)，得到线性相关系数r＝0.9998。
| 浓度 | 光量子数 |
| 0 | 305 |
| 0.2 | 1026 |
| 0.5 | 10563 |
| 1.0 | 21115 |
| 2.0 | 43628 |
| 4.0 | 85236 |
| 6.0 | 126306 |
根据实施例1进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加上两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.02pg/mL，检测范围为0.1-6pg/mL。
实施例6：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒性能评价
根据实施例2进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9998。
| 浓度 | 光量子数 |
| 0 | 311 |
| 0.2 | 1423 |
| 0.5 | 10362 |
| 1.0 | 21662 |
| 2.0 | 43964 |
| 4.0 | 85637 |
| 6.0 | 126852 |
根据实施例2进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加上两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.06pg/mL，检测范围为0.1-6pg/mL。
实施例7：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒性能评价
根据实施例3进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9998。
| 浓度 | 光量子数 |
| 0 | 298 |
| 0.2 | 1362 |
| 0.5 | 10574 |
| 1.0 | 21984 |
| 2.0 | 43364 |
| 4.0 | 85552 |
| 6.0 | 125457 |
根据实施例3进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加上两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.03pg/mL，检测范围为0.1-6pg/mL。
实施例8：阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒性能评价
根据实施例4进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白蛋白溶液作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9998。
| 浓度 | 光量子数 |
| 0 | 754 |
| 0.2 | 1462 |
| 0.5 | 9574 |
| 1.0 | 149840 |
| 2.0 | 303264 |
| 4.0 | 505452 |
| 6.0 | 605245 |
根据实施例4进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加上两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.03pg/mL，检测范围为0.1-6pg/mL。
从以上数据可以看出，对于添加了过氧化物的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒实施例1～实施例3，其灵敏度均值在0.03pg/mL左右，而未添加过氧化物的灵敏度在0.34pg/mL左右，添加的过氧化物将试剂盒的灵敏度提高了一个数量级。因此，过氧化物的添加是本发明的重要组成部分。
上述实施例中的化学发光标记物、偶联标记物、过氧化物还可以替换为前述限定的其他物质，也可以取得上述技术效果，这里不再一一举例。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，包括：R1、R2和R3试剂；
其特征在于，
所述R1试剂为链霉亲和素带有官能团的磁颗粒；
所述R2试剂为化学发光标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体；
所述R3试剂为偶联标记物标记的阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体；
所述R2试剂中：阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～20；缓冲液为100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.1～2μg/mL；
所述R3试剂中：阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～20；缓冲液为100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体终浓度为0.2～3μg/mL。
2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的质量比是0.01％～1％。
3.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中磁颗粒的粒径是4～6μm，官能团为羧基、氨基、Tosyl或者环氧乙烷。
4.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌。
5.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述R3试剂中偶联标记物为生物素或者抗体。
6.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述过氧化物包括过氧化脲或者过氧化氢。
7.根据权利要求1所述的阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品；所述阿尔茨海默相关神经丝蛋白校准品的浓度分别为0pg/mL、0.2pg/mL、0.5pg/mL、1.0pg/mL、2.0pg/mL、4.0pg/mL和6.0pg/mL的阿尔茨海默相关神经丝蛋白溶液。
8.一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、R1试剂的制备
取浓度是100mg/mL的链霉亲和素带有官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后在100～500mMPB，pH6～8的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的R1试剂；
步骤2、R2试剂的制备
将500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后按照阿尔茨海默相关神经丝蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～20加入吖啶酯的DMF溶液，经过封闭、纯化步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体；将阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光标记物抗体浓溶液用100～500mM PB，50～100mg/mL过氧化物，pH6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1-2μg/mL的R2试剂；
步骤3、R3试剂的制备
取500μg阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体，将pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后按照阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体与偶联标记物的标记摩尔比例是1:5～20加入偶联标记物，经过封闭、纯化步骤后得到阿尔茨海默相关神经丝蛋白偶联标记物抗体；将阿尔茨海默相关神经丝蛋白抗体浓溶液用100～500mM PB、50～100mg/mL过氧化物，pH6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2-3μg/mL的R3试剂；
将R1、R2和R3试剂组装成成品试剂即为阿尔茨海默相关神经丝蛋白化学发光免疫检测试剂盒。
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