JPS63246671A - 免疫分析方法 - Google Patents

免疫分析方法

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JPS63246671A
JPS63246671A JP62080038A JP8003887A JPS63246671A JP S63246671 A JPS63246671 A JP S63246671A JP 62080038 A JP62080038 A JP 62080038A JP 8003887 A JP8003887 A JP 8003887A JP S63246671 A JPS63246671 A JP S63246671A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析方法に係り、特に見かけ主電気的に中
性、又は無電荷若しくは弱電筒の抗原物質に電荷を付与
して電気泳動を可能に抗原等の物質を好適に定量する免
疫分析方法に関する。
〔従来の技術〕
従来、実用化されている免疫分析方法の代表的な方法に
ラジオイムノアッセイ法がある。ところがこのラジオイ
ムノアッセイ法は取扱いが面倒である。この為に、電気
泳動を利用する高感度の免疫分析方法が開発された。こ
の免疫分析方法に関連する方法は例えば、特開昭６０−
５７２５７号に開示されている。この電気泳動を用いる
分析方法では、陽極と陰極との間に反応担体を設け、こ
の反応担体に被測定物質と特異的に反応する抗体をあら
かじめ結合させておく。そして被測定物質を電気泳動さ
せ反応担体に到着させ、担体中で被測定物質と、特異的
に反応する抗体とを抗体抗原反応を起こさせる。この方
法によれば、試料中の被測定物質を定量するにあたり測
定誤差の原因となる試料中の夾雑物質を電気泳動により
反応担体を通過させ反応担体中に保持させないようにす
るため１反応担体における抗原−抗体反応に影響を及ぼ
さない。このために測定精度が高く、また１１１ｇ定対
象物質は電気泳動によって反応担体に濃縮される状態に
なり血中微量成分も高感度が測定される。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、上記従来方法により被測定物質を分析下るには
、この被測定物質を電気泳動により陽極と陰極との間で
泳動させて反応担体に到達させることが必須の条件であ
る。その被測定物質が蛋白質成分などのように電荷を持
ったものであると電気泳動法による免疫分析方法は有効
に行なわれる。
しかしながら、電荷を持たない被測定物質には電気泳動
を利用できない。従って従来方法は、見かけ主電気的に
中性、又は無電荷若しくは弱電筒の被測定物質の定量と
いう点について配慮されておらず１例えばステロイド系
物質のハプテンなどを定量するのが困難であるというよ
うな問題点がある。
従って、本発明の目的は、見かけ主電気的に中性、又は
無電荷若しくは弱電苛性の被測定物質の抗原を電気泳動
を利用して高精度に定量する免疫分析方法を提供するも
のである。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明の免疫分析方法は、見かけ上電気的に中性、又は
無電荷若しくは弱電荷の被測定抗原と、１核被測定抗原
に対し特異的に反応する一定量の抗体とを反応させ、該
被測定抗原と該抗体とを結合して電荷を帯びさせて電気
泳動を可能にし１反応液を電気泳動させて陽電極と陰電
極との間に設けられた反応担体に向けて泳動し、該被測
定抗原に対して未反応の該抗体を該反応担体上に保持さ
せ、その未反応の該抗体の量を標識測定で険出し、試料
中の該被測抗原を定量する方法である。この場合、抗体
の反応前の量と未反応の量との差を求めて試料中の該被
測定抗原を定量してもよ（、又は抗体の標識量に対する
検量線を前もって求めておけば１次回からは標識量から
直ちに抗体Ａを定量し得る。本発明の免疫分析方法で被
測定抗原を測定するには次の４つの方法で行なうことが
適している。
第１の免疫分析方法は、該被測定抗原と、該被測定抗原
に対し特異的に反応する標識された一定量の抗体とを反
応させ、一方あらかじめ該反応担体に該被測定抗原を結
合しておき、反応液を該反応担体に向けて電気泳動し、
該被測定抗原に対して反応した該標識された抗体との結
合体は該反応担体を通過し、未反応の該標識された抗体
は該反応担体に結合さ、れた該被定測抗原と結合して反
応担体に保持させ、該未反応の標識された抗体の量を標
識測定で検出し、試料中の該被測定抗原を定量する方法
である。
また、第２の免疫分析方法は、該被測定抗原と、該被測
定抗原・荷電物質の結合体と、該被測定抗原に対し特異
的に反応する標識された一定量の抗体とを反応させ、一
方あらかじめ該反応担体に該荷電物質に対し特異的に反
応する抗体を結合しておき、反応液を該反応担体に向け
て電気泳動し。
該被測定抗原に対して反応した該標識された抗体との結
合体は該反応担体を通過し、該被測定抗原・荷電物質の
結合体に対し反応した該標識された抗体は該反応担体に
結合された該荷電物質に対して特異的に反応する抗体と
結合して反応担体に保持させ、反応担体に保持される標
識された抗体の量を標識測定で検出し、試料中の該被測
定抗原を定量する方法である。
また、第３の免疫分析方法は、該被測定抗原と、該被測
定抗原・標識された荷電物質の結合体と。
該被測定抗原に対し特異的に反応する一定量の一次抗体
とを反応させ、一方あらかじめ該反応担体に該一次抗体
に対し特異的に反応する二次抗体を結合しておき１反応
液を該反応担体に向けて電気泳動し、該被測定抗原に対
して反応した該一次抗体との結合体、及び該被測定抗原
・標識された荷電物質の結合体に対して反応した該一次
抗体との結合体は該反応担体に結合された該二次抗体と
結合して反応担体に保持させ、保持された結合体の中で
標識された荷電物質を含む一次抗体の量を標識測定で検
出し、試料中の該被測定抗原を定量する方法である。
また、第４の免疫分析方法は、該被測定抗原と、標識さ
れた該被測定抗原と、該被測定抗原に対し特異的に反応
する一次抗体とを反応させ、一方あらかじめ該反応担体
に該一次抗体に対し特異的に反応する二次抗体を結合し
ておき１反応液を該反応担体に向けて電気泳動し、該被
測定抗原と反応した一次抗体との結合体、及び該標識さ
れた該被測定抗原と結合した一次抗体との結合体は該反
応担体に結合された該二次抗体に結合して反応担体に保
持させ、保持された結合体の中で標識された被ｊ１す定
抗原を含む一次抗体の量を標識測定で検出し、試料中の
該被測定抗原を定量する方法である。
また、この他の方法として反応の初段階に語物質を標識
化せず、電気泳動後に反応担体に保持される抗体に、標
識された抗体を結合させて、標識ｄ１す定で定量するこ
ともできる。即ち該被測定抗原と、該被測定抗原に対し
特異的に反応する抗体と。
又はこれらの両者に該被測定抗原・電荷物質の結合体を
添加し、前記第１又は第２の方法において。
標識化することを除いて初段階で反応させ、反応液を該
反応担体に向けて電気泳動し、反応担体に保持されてい
る該抗体に、その抗体に特異的に反応する標識された抗
体を結合し、その結合した抗体の量を標識測定で検出し
、試料中の該被測定抗原を定量する方法である。
〔作用〕
本発明の免疫分析方法は、見かけ上電気的に中性、又は
無電荷若しくは弱電荷の抗原と抗体とを反応して結合体
とし、電荷を帯びさせて反応担体に電気泳動し、未反応
の抗体が反応担体に保持されるようにして、抗体の反応
前の量と未反応の量との差から抗原を定量するものであ
る。前記第１ないし第４の分析方法を第１図に示す分析
模式図によって説明する。
第１の分析方法は、第１図（１）に示す。試料中に含ま
れる見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは弱電荷
の被測定抗原Ａと、この抗Ｊ！ＫＡに対し特異的に反応
する標識された抗体ＢＬとを反応する。このとき抗原Ａ
の推定される量よりも幾分多く抗体ＢＬの一定量を加え
る。反応液中には生成した抗原−抗体結合体Ａ−ＢＬ、
及び未反応体ＢＬが残る。抗原Ａは蛋白質等の抗体ＢＬ
と結合するので荷電を帯びて電気泳動されるようになる
。次に電気泳動させると、抗原−抗体結合体Ａ−ＢＬは
反応担体Ｔを通過するが、未反応の抗体ＢＬは反応担体
Ｔにあらかじめ結合されている抗ｆｆ１Ａに結合し、反
応担体Ｔに保持される。そして反応担体上の標識された
抗体ＢＬの量を測定する。
従って標識された抗体ＢＬの反応前の既知量から未反応
の抗体量を減することにより抗体Ａを定量でき、または
前もって基準として既知量の抗原Ａに対する標識値の検
量線を求めておけば、次回から試料抗原Ａの測定した標
識値から直ちに抗体Ａを定量し得る。
また、第２の方法は第１図（２）に示す。抗原Ａと、抗
原・荷電物質結合体ＡＣと、抗Ｊ７ＫＡに対し特異的に
反応する標識された抗体ＢＬの一定量とを反応する。こ
のとき、抗原Ａと結合体ＡＣは抗体ＢＬに競合的に反応
し、生成される抗原−抗体結合体Ａ−ＢＬとＡＣ−ＢＬ
は何れも電荷を帯び電気泳動され得るようになる。また
１反応担体Ｔには荷電物質Ｃに特異的に反応する抗体Ｂ
Ｃ’を結合させておく。図示において荷電物質Ｃに（−
−）　、抗体ＢＣ’　に（＋＋）を付したが、例示した
もので逆荷重でもよい。反応液を電気泳動すると、抗原
−抗体結合体Ａ−ＢＬは反応担体Ｔを通過するが、抗原
・荷電物質結合体−抗体の結合体ＡＣ−ＢＬ、及び抗原
・荷電物質結合体ＡＣは反応担体Ｔに結合されている抗
体ＢＣ’によって保持される。反応担体Ｔに保持されて
いる標識抗体ＡＣ−ＢＬの量を標識測定する。尚、結合
体ＡＣは標識化されていないので標識されない。従って
標識抗体ＡＣ−ＢＬの標識値を測定することにより、抗
原Ａを定量できる。尚、この場合、抗原Ａの試料中の推
定量よりも抗原・荷電物質結合体ＡＣの量、標識された
抗体ＢＬの量を幾分多く添加する。
また、第３の方法は第１図（３）に示す。抗原Ａと、標
識抗原・荷電物質結合体ＡＣＬと、抗原Ａに対し特異的
に反応する一次抗体Ｂｓの一定量とを反応する。このと
き抗原Ａと結合体ＡＣＬは抗体Ｂ１に競合的に反応し、
抗原−抗体結合体ＡＢｚ　とＡＣＬ−Ｂｔになり電気泳
動され得るようになる。また１反応担体Ｔには一次抗体
Ｂ１に対し特異的に反応する二次抗体Ｂ２を結合してお
く。反応液を電気泳動すると、抗原−抗体結合体ＡＢ工
及び標識抗原・荷原物質結合体−抗体、拮合体ＡＣＬＢ
１は反応担体Ｔの二次抗体Ｂ２により保持されるが、結
合体ＡＣＬは通過する。反応担体Ｔに保持されている結
合体ＡＣＬ−”Ｂｒの量を標識測定する。従って標識抗
原・荷電物質−抗体結合体ＡＣＬ−Ｂの標識値を測定す
ることにより、抗体Ａを定量できる。尚、この場合、抗
原Ａの推定量よりも標識された抗原・荷電物質結合体Ａ
ＣＬの量、一次抗体Ｂｌの量を幾分多く添加する。
また、第４の方法は第１図（４）に示す。抗原Ａと、標
識された抗原ＡＬと、抗原Ａに対し特異的に反応する一
次抗体Ｂ１の一定量とを反応する。
このとき抗原Ａと標識抗Ｊ７ｉ（ＡＬは一次抗体Ｂ１と
競合的に反応し、抗原−抗体結合体ＡＢＩとＡ　Ｌ　−
Ｂ　１になり、電気泳動され得るようになる。
また１反応担体Ｔには一次抗体Ｂｌに対し特異的に反応
する二次抗体Ｂ２を結合しておく。反応液を電気泳動す
ると、抗原−抗体結合体ＡＢｉ及び標識抗原−抗体結合
体Ａ　Ｌ　−Ｂ　ｔは反応担体Ｔに二次抗体Ｂ２により
保持される。しかし未反応の標識抗原ＡＬは電気的に中
性で電気泳動されない。反応担体Ｔに保持された標識抗
原−抗体結合体ＡＬ−Ｔの量を標識測定する。従って、
標識抗原−抗体結合体Ａ　Ｌ　−Ｂ　ｓの標識値を測定
することにより、抗体Ａを定量できる。尚、この場合、
抗原Ａの推定量よりも標識された抗原ＡＬの量、一次抗
体Ｂ１の量を幾分多く添加する。
また、上記の方法において、試料中の被測定抗原と抗体
との反応において、泳動前の反応で標識された物質を使
用しない方法でも行なわれる。これらの場合では、被測
定抗原と抗体とを反応させた後、反応物質を電気泳動に
より反応担体に到達させ、その後で、上記の方法で用い
た標識した物質に対応する標識した抗体を反応担体上で
さらに反応させることにより、被測定抗原を定量できる
。
例えば、第１の方法の変法として次のように行なう。試
料中の被測定抗原と、その被測定抗原に対し特異的に反
応する一次抗体とを反応させ、前述と同様に泳動する。
試料中の被測定抗原と反応した抗原−抗体結合体は反応
担体を通過する。しかし、未反応の一次抗体は反応担体
中に結合させである抗原と反応して反応担体中に留まる
。この後。
この一次抗体に対する標識した二次抗体を加える。
担体に留った一次抗体と反応した二次抗体の結合体の標
識量を測定することにより、被測定抗原を定量すること
ができる。また過剰の標識された二次抗体は反応担体を
通過する。
上述のように本発明方法により、見かけ上電気的に中性
、又は無荷電若しくは弱電筒の測定物質の抗原に電荷を
帯びさせて電気泳動させ得るようにし、電気泳動により
免疫分析を行なうので測定物質を高感度に定量する。
また、上述の方法では反応担体上に保持され標識物質を
測定する方法を述べたが、逆に反応担体を通過した反応
液中の標識物質について測定し、測定物質を定量しても
よい。
また、上述の被測定抗原は電気的に中性、又は無電荷若
しくは弱電筒のものについて述べたが、電荷を持つ抗原
についても免疫分析を行い得ることは勿論である。中で
も電荷を持つ抗原でも、希薄濃度の場合が泳動性を向上
させる場合等に有利行ない得る。
〔実施例〕
実施例１ 試料中の見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは弱
電苛性の被測定抗原と、該被測定抗原と特異的に反応す
る標識化抗体とを反応させる。また被測定抗原として例
えばＴａやＴ４等のハプテンを測定する。また標識物質
として蛍光物質、リン光物質、酵素等を使用するが、特
にこれらに限定されない。また陽電極と陰電極との間に
反応担体を設け、この反応担体に該被測定抗原をあらか
じめ結合させておく。
さて、該被測定抗原と一定量の該標識化抗体とを反応さ
せ、被測定抗原と標識化抗体との結合体を生成させるこ
とにより、被測定抗原の結合体は電荷を帯び、電気泳動
させられるようになる。また被測定抗原の量をおおよそ
推定し、これよりも若干過剰に標識化抗体量を反応させ
る。その後、抗原−抗体反応物を電気泳動によって反応
担体に到達させる。このとき、試料溶液中の被測定抗原
−標識化抗体の結合体は、反応担体にあらかじめ結合し
ている被測定抗原と反応せずに反応担体を通過する。し
かし、未反応の標識化抗体は反応担体に結合させである
被測定抗原と反応することにより反応担体に残る。電気
泳動後、その反応担体に保持されている標識化抗体量を
標識によって検出する。そして反応前の標識化抗体量と
反応担体上の未反応の標識化抗体量との差を求めること
により、目的とする試料中の被測定抗原の定量を高感度
に行なう。
次に被測定抗原としてハプテンＴ４の定量を例にとり、
詳細に説明する。先ず、Ｔａ　を反応担体の反応膜に結
合させる前処理としてＴ４とアルブミンとの結合体を合
成した。この為に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μ
ｇを０．１Ｍ　リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６，８）５００
μＱ　に溶解した。
一方、Ｔ４フリーアンド〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕
２ｍｇを４　ｍ　Ｑのジメチルホルムアミドに溶解して
その５０μｇ相当（１００μＱ）を前者に加えた。次に
２５％グルタルアルデヒド０．３ｍＱ　をリン酸塩緩衝
溶液で１．５％にしたものを１０μＱを加えて混和し、
その後で２５°Ｃ１２，５時間静置した。次いでセファ
デックスＧ−１００カラムにかけ、リン酸塩緩衝溶液を
用いてＴ４−ＢＳＡ結合体を分取した。
次に、このＴ４−ＢＳＡ結合体を反応担体であるポリア
クリルアミドゲル膜に固定化した。その方法は、先ず０
．５ｍＱのＴａ−ＢＳＡ結合体フラクションに０．２５
％のアクロレイン水溶液を加えて水冷下で３０分間放置
した。その後、１／１５ＭのＮａＣＱを含む０．１Ｍ　
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７，４（ＰＢＳと称す）でよく透
析した。次にこれに０．３２ｇ／ｍΩ　のアクリルアミ
ド溶液１．５ｍＱ、０．０１６ｇ／ｍＱのＮ、　Ｎ’−
メチレンビスアクリルアミド溶液１．５ｍ＋１，４６μ
Ｑ／　ｍ　ＱのＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチル
エチレンジアミン水溶液を１．２５ｍＱ、及び１．２５
ｒｎ　ｇ　／　ｍ　ｆｌの過硫酸アンモニウム溶液を５
．７５ｍ　Ｑを加えてよく撹拌した。その後、ガラス製
のゲル膜成形器に上記の混合液を注入して静置し、ゲル
化させることにより製膜した。この膜から直径９　ｍｍ
の円形膜を切り取って反応膜にした。
尚、電気永動に用いる電解液として、１−リス・グリシ
ン緩衝溶液を用いた。
測定は、先ずＴ４標準試料とこれよりも幾分過剰な既知
量の市販の蛍光標識のＦＩＴＣ標識抗標識抗体４抗 電気泳動装置の反応膜上部に注入した後、印加電圧２５
０Ｖで３０分間電気泳動した。その後、反応膜を取り出
し、ＰＢＳで洗浄し、反応膜の保持されている未反応の
ＦＩＴＣ標識抗標識抗体４抗蛍光測定波長は５２Ｑｎｍ
で測定した。
試料Ｔ４の濃度を変えて蛍光強度を測定し、Ｔ４検量線
を第２図に示す。第２図から試料中のＴ４Ｊ！度が低い
と、試料Ｔ４と標識抗Ｔ４抗体との結合体が反応液中で
少ししか生成されないが。
未反応の標識抗Ｔ４抗体が反応膜に固定化されているＴ
ａ−ＢＳＡ結合体と結合して、この結合体が反応膜に多
く保持させて蛍光強度が大になる。
また、Ｔａ’ａ度が高くなるにつれ、標識抗Ｔ４抗体と
Ｔ４−ＢＳＡ結合体との結合体が減少し、反応膜上で保
持される量も減少して、蛍光強度が低下する。このよう
に本分析方法によれば、Ｔ４濃度は蛍光強度と精度よく
相関し、前もってＴ４濃度の検量線を得ていれば、後で
蛍光強度を測定すればＴ４濃度を求めることができる。
実施例２ 被測定抗体源の試料としてコルチゾールを用いた。予じ
め実施例１と同様な方法により、コルチゾールと牛血清
アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）との結合体、及び抗ＢＳＡ抗
体結合の反応膜を調製した。
先ず、コルチゾールを含む試料と、コメチゾールーＢＳ
Ａ結合体と、既知量のアルカリフォスファターゼ標識抗
コルチゾール抗体とを反応させた。
次にこの反応液１００μＱを電気泳動装置の反応膜上部
に注入した後、２５０Ｖ，３０分間電気泳動した。この
後、反応膜を取り出してＰＢＳで洗浄した。更に反応膜
をアルカリフォスファターゼ基質緩衝溶液に３０分間浸
漬し１反応膜に保持されているコルチゾール−ＢＳＡ結
合体と標識抗コルチゾール抗体との結合体を発色試薬の
添加により発色させた。次にこの結合体の量を波長５０
０ｎｍでの吸光度の測定し、その量を検出した。
試料コルチゾールの濃度を変えて吸光度をｆｌｌ’Ｊ定
し、その結果からコルチゾールの検量線を第３図に示す
。このコルチゾールの場合も実施例１の場合と同様に、
フルチゾール濃度は吸光度と精度よく相関し、コルチゾ
ールを高感度に測定できることが明らかである。
〔発明の効果〕
本発明の免疫分析方法により、見かけ上電気的中性、又
は無電荷若しくは弱電筒の被測定の抗原を、標識された
抗体、抗原・荷電物質結合体と抗体、標識された抗原・
荷電物質結合体と抗体、及び標識された抗原と抗体等と
、反応させ、′ｆｊ１測定抗原に荷電を帯びさせるので
、電気泳動を用いた分析法により定量することができ、
抗原の微ｆｄｆｆｉ度でも高感度に分析でき、高精度、
高信頼性で定量できる。特にホルモン系試料の測定には
有効な分析方法である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の免疫分析方法の模式図を示し、第２図
は本免疫分析方法によるＴ４検量線、第３図はコルチゾ
ール検量線を示す。 Ａ・・・抗原、ＡＣ・・・抗原・荷電物質結合体、ＡＣ
Ｌ・・・標識された抗原・荷電物質結合体、ＡＬ・・・
標識された抗原、ＢＬ・・・標識された抗体、ＢＣ’・
・・荷電物質に対し特異的に反応する抗体、Ｂ１・・・
一次抗体、Ｂ２・・・二次抗体、Ａ−ＢＬ・・・抗原−
標識された抗体の結合体、ＡＣ−ＢＬ・・・抗原・荷電
物質結合体−標識された抗体の結合体、ＡＢｌ・・・抗
原−一次抗体の結合体、ＡＣＬ　　Ｂ１・・・標識され
た抗原・荷電物質−一次抗体の結合体、ＡＬ−８１・・
・標識された抗原−一次抗体の結合体、Ｔ・・・反応担
体。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは弱電荷
    の被測定抗原と、該被測定抗原に対し特異的に反応する
    一定量の抗体とを反応させ、該被測定抗原と該抗体とを
    結合して電荷を帯びさせて電気泳動を可能にし、反応液
    を電気泳動させて陽電極と陰電極との間に設けられた反
    応担体に向けて泳動させ、該被測定抗原に対して未反応
    の該抗体を該反応担体上に保持させ、その未反応の該抗
    体の量を標識測定で検出し、試料中の該被測定抗原を定
    量することを特徴とする免疫分析方法。 ２、該被測定抗原と、該被測定抗原に対し特異的に反応
    する標識された一定量の抗体とを反応させ、一方あらか
    じめ該反応担体に該被測定抗原を結合しておき、反応液
    を該反応担体に向けて電気泳動し、該被測定抗原に対し
    て反応した該標識された抗体との結合体は該反応担体を
    通過し、未反応の該標識された抗体は該反応担体に結合
    された該被測定抗原と結合して反応担体に保持させ、該
    未反応の標識された抗体の量を標識測定で検出すること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の免疫分析方
    法。 ３、該被測定抗原と、該被測定抗原・荷電物質の結合体
    と、該被測定抗原に対し特異的に反応する標識された一
    定量の抗体とを反応させ、一方あらかじめ該反応担体に
    該荷電物質に対し特異的に反応する抗体を結合しておき
    、反応液を該反応担体に向けて電気泳動し、該被測定抗
    原に対して反応した該標識された抗体との結合体は該反
    応担体を通過し、該被測定抗原・荷電物質の結合体に対
    して反応した該標識された抗体は該反応担体に結合され
    た該荷電物質に対して特異的に反応する抗体と結合して
    反応担体に保持させ、反応担体に保持される標識された
    抗体の量を標識測定で検出することを特徴とする特許請
    求の範囲第１項に記載の免疫分析方法。 ４、該被測定抗原と、該被測定抗原・標識された荷電物
    質の結合体と、該被測定抗原に対し特異的に反応する一
    定量の一次抗体とを反応させ、一方あらかじめ該反応担
    体に該一次抗体に対し特異的に反応する二次抗体を結合
    しておき、反応液を該反応担体に向けて電気泳動し、該
    被測定結果に対して反応した該一次抗体との結合体、及
    び該被測定抗原・標識された荷電物質の結合体に対して
    反応した該一次抗体との結合体は該反応担体に結合され
    た該二次抗体と結合して反応担体に保持させ、保持され
    た結合体の中で標識された荷電物質を含む一次抗体の量
    を標識測定で検出することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項に記載の免疫分析方法。 ５、該被測定抗原と、標識された該被測定抗原と、該被
    測定抗原に対し特異的に反応する一次抗体とを反応させ
    、一方あらかじめ該反応担体に該一次抗体に対し特異的
    に反応する二次抗体を結合しておき、反応液を該反応担
    体に向けて電気泳動し、該被測定抗原と反応した一次抗
    体との結合体、及び該標識された該被測定抗原と結合し
    た一次抗体との結合体は該反応担体に結合された該二次
    抗体に結合して反応担体に保持させ、保持された結合体
    の中で標識された被測定抗原を含む一次抗体の量を標識
    測定で検出することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    に記載の免疫分析方法。 ６、該被測定抗原と、該被測定抗原に対し特異的に反応
    する抗体、又はこれら両者に該被測定抗原・電荷物質の
    結合体を添加し、特許請求の範囲第２項及び第３項記載
    の方法において、標識化することを除いて初段階で反応
    させ、反応液を該反応担体に向けて電気泳動し、反応担
    体に保持されている該抗体に、その抗体と特異的に反応
    する標識化された抗体を結合させ、その結合した該標識
    された抗体の量を標識測定で検出することを特徴とする
    特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の免疫分析方法
    。
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