JPS6057257A - イムノアツセイ法 - Google Patents
イムノアツセイ法Info
- Publication number
- JPS6057257A JPS6057257A JP58164992A JP16499283A JPS6057257A JP S6057257 A JPS6057257 A JP S6057257A JP 58164992 A JP58164992 A JP 58164992A JP 16499283 A JP16499283 A JP 16499283A JP S6057257 A JPS6057257 A JP S6057257A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- immobilized
- electrophoresis
- membrane
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/561—Immunoelectrophoresis
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は自動化イムノアッセイ法、更に詳しくは試料中
の抗原或いは抗体の濃度を定量するための新規なイムノ
アッセイ方法に関する。
の抗原或いは抗体の濃度を定量するための新規なイムノ
アッセイ方法に関する。
ラジオアイソトープで標識した特定の抗体を用いて、微
量のインシュリンを測定する方法がＹａｌ□ｗ らによ
シ報告された（ Ｎａｔｕｒｅ、 １８４゜１６４８）
。これ以来、ラジオイムノアッセイと呼ばれるこの測定
法は５種々の生体物質及び薬物の定量に利用嘔れるよう
になった。しかし、ラジオアイソトープを用いるが故に
取扱い上格別の注意を要するという問題点がある。そこ
で酵素、酵素基質、螢光物質、化学発光物質等の非放射
性の標識物を利用する各種のイムノアッセイ法が検討さ
れ、これらのなかで酵素或いは螢光物質を標識物とする
方法が実用化の域に達している。しかし、これらの方法
もラジオイムノアッセイも全体のプロセスに手間と時間
を要するためにこれを自動化することが困難である。
量のインシュリンを測定する方法がＹａｌ□ｗ らによ
シ報告された（ Ｎａｔｕｒｅ、 １８４゜１６４８）
。これ以来、ラジオイムノアッセイと呼ばれるこの測定
法は５種々の生体物質及び薬物の定量に利用嘔れるよう
になった。しかし、ラジオアイソトープを用いるが故に
取扱い上格別の注意を要するという問題点がある。そこ
で酵素、酵素基質、螢光物質、化学発光物質等の非放射
性の標識物を利用する各種のイムノアッセイ法が検討さ
れ、これらのなかで酵素或いは螢光物質を標識物とする
方法が実用化の域に達している。しかし、これらの方法
もラジオイムノアッセイも全体のプロセスに手間と時間
を要するためにこれを自動化することが困難である。
全体のプロセスの簡略化法については、その１例が、米
国特許３，８５２，１５７に記載されているが、測定対
象物は低分子量のハプテンに限られる。
国特許３，８５２，１５７に記載されているが、測定対
象物は低分子量のハプテンに限られる。
この例は、抗原抗体反応物と非反応物とを分離する操作
を必要としないことによるプロセスの簡略化である。一
方、この分離操作を簡略化することも行われている。そ
れは固相法と呼ばれるものであり、あらかじめ非水溶性
の担体上に抗体或いは抗原を結合させておき、この担体
上で抗原抗体反応を行なわせるものである。担体を水洗
することにより、容易に反応物と非反応物とを分離する
ことができる。
を必要としないことによるプロセスの簡略化である。一
方、この分離操作を簡略化することも行われている。そ
れは固相法と呼ばれるものであり、あらかじめ非水溶性
の担体上に抗体或いは抗原を結合させておき、この担体
上で抗原抗体反応を行なわせるものである。担体を水洗
することにより、容易に反応物と非反応物とを分離する
ことができる。
固相法を用いることによりイムノアッセイプロセスは簡
略化されるが、全体のプロセスを自動化するという観点
からは、まだ不十分な点が多い。
略化されるが、全体のプロセスを自動化するという観点
からは、まだ不十分な点が多い。
イムノアッセイの自動化のためには全体のプロセスに要
する時間の短縮が必須である。イムノアッセイプロセス
のなかで最も時間を要するのは抗原抗体反応プロセスで
あシ５通常これに数時間から１日を要する。この所要時
間はより低濃度の物質をイムノアッセイにより測定しよ
うとする場合根長くなるのが普通である。
する時間の短縮が必須である。イムノアッセイプロセス
のなかで最も時間を要するのは抗原抗体反応プロセスで
あシ５通常これに数時間から１日を要する。この所要時
間はより低濃度の物質をイムノアッセイにより測定しよ
うとする場合根長くなるのが普通である。
この反応時間短縮のために、抗体（或いは抗原）を結合
させた微結晶或いは微粒子をカラムに充填し、これに被
検試料等を強制的に圧入する方法が提案されている（特
公昭５３−１２７８２３ ）。この例は、抗体等を固定
化した担体の部分或いは層に被検試料等の液体そのもの
を強制的に送り込む方法である。
させた微結晶或いは微粒子をカラムに充填し、これに被
検試料等を強制的に圧入する方法が提案されている（特
公昭５３−１２７８２３ ）。この例は、抗体等を固定
化した担体の部分或いは層に被検試料等の液体そのもの
を強制的に送り込む方法である。
液体そのものではなく、その中に含まれる特定成分（例
えば被検出物等］のみを送り込む方法として、電気泳動
によシ特定成分を送り込む方法がある。その一つの例は
１．支持平板上に配置したゲル層の１部分を抗体或いは
抗原を固定化したゲル層或いは多孔質構造体からなる層
に置き換え、この部分に被検出物質である抗原或いは抗
体を送り込むものである（米国特許３，９６６．８９７
） 。この場合、被検出物質を送り込む方向は、必然的
に支持平板面、つまり抗体固定化層面と平行となる。
えば被検出物等］のみを送り込む方法として、電気泳動
によシ特定成分を送り込む方法がある。その一つの例は
１．支持平板上に配置したゲル層の１部分を抗体或いは
抗原を固定化したゲル層或いは多孔質構造体からなる層
に置き換え、この部分に被検出物質である抗原或いは抗
体を送り込むものである（米国特許３，９６６．８９７
） 。この場合、被検出物質を送り込む方向は、必然的
に支持平板面、つまり抗体固定化層面と平行となる。
電気泳動を用いる他の例は、特公昭５５−１３２９４６
に示されるものである。これは、デイスク電気泳動用の
ポリアクリルアミドゲルを充填したゲル管を用意し、こ
れの一端に抗体溶液或いは抗原溶液を注入したあと電気
泳動を行なうことにより抗体或いは抗原の濃縮層を形成
せしめ、しかるのちに抗原溶液或いは抗体溶液を注入し
て電気泳動を行ないつつ上記濃縮層で抗原抗体反応を行
なわせしめるものである。濃縮層の形成を助長する目的
で蛋白不透過性の膜、例えば透析膜をゲルの１部分に挿
入することも行なわれる。ここでは、抗体或いは抗原は
電気泳動用の担体に固定化畑れておらず１反応層中に遊
離した状態で存在している。さらに、反応層中に遊離し
た状態で存在しているが故に、反応層そのものを電気泳
動の陰極側であれ陽極側であれ電解液と直接接触させる
ことはできない。
に示されるものである。これは、デイスク電気泳動用の
ポリアクリルアミドゲルを充填したゲル管を用意し、こ
れの一端に抗体溶液或いは抗原溶液を注入したあと電気
泳動を行なうことにより抗体或いは抗原の濃縮層を形成
せしめ、しかるのちに抗原溶液或いは抗体溶液を注入し
て電気泳動を行ないつつ上記濃縮層で抗原抗体反応を行
なわせしめるものである。濃縮層の形成を助長する目的
で蛋白不透過性の膜、例えば透析膜をゲルの１部分に挿
入することも行なわれる。ここでは、抗体或いは抗原は
電気泳動用の担体に固定化畑れておらず１反応層中に遊
離した状態で存在している。さらに、反応層中に遊離し
た状態で存在しているが故に、反応層そのものを電気泳
動の陰極側であれ陽極側であれ電解液と直接接触させる
ことはできない。
上であけた。２つの電気泳動法を利用した抗原抗体反応
方法は、いずれも必然的に反応部分或いは反応層以外（
つまり抗体或いは抗原が含まれていない）の電気泳動用
担体を用意することが構成要件となる。それ故に反応部
分或いは反応層まで抗原或いは抗体を電気泳動用担体を
経て送り込むことを余儀なくされ、それだけ泳動距離が
長くなシ、泳動に要する時間が長くなる。さらに、これ
らの方法を用いて、イムノアッセイを行なうためには、
反応部分或いは反応層に送り込まれた測定妨害物（例え
ば反応にあずからなかった過剰な標識抗体）を反応部分
或いは反応層から除去しなくてはならない。この除去を
電気泳動法により行なうためにはさらに電気泳動を続け
なけれはならず、この場合も反応部分或いは反応層以外
の電気泳動用担体中を泳動させるために、より一層の時
間を必要とすることになる。
方法は、いずれも必然的に反応部分或いは反応層以外（
つまり抗体或いは抗原が含まれていない）の電気泳動用
担体を用意することが構成要件となる。それ故に反応部
分或いは反応層まで抗原或いは抗体を電気泳動用担体を
経て送り込むことを余儀なくされ、それだけ泳動距離が
長くなシ、泳動に要する時間が長くなる。さらに、これ
らの方法を用いて、イムノアッセイを行なうためには、
反応部分或いは反応層に送り込まれた測定妨害物（例え
ば反応にあずからなかった過剰な標識抗体）を反応部分
或いは反応層から除去しなくてはならない。この除去を
電気泳動法により行なうためにはさらに電気泳動を続け
なけれはならず、この場合も反応部分或いは反応層以外
の電気泳動用担体中を泳動させるために、より一層の時
間を必要とすることになる。
本発明の目的は、イムノアッセイにおける抗原抗体反応
に要する時間を短縮することにより、自動化が容易なイ
ムノアッセイ法を提供することにある。
に要する時間を短縮することにより、自動化が容易なイ
ムノアッセイ法を提供することにある。
かかる目的を達成するうえで、上にあげた２つの電気泳
動法を用いた抗原或いは抗体の送り込み方法は極めて有
効である。しかし、反応部分或いは反応層まで抗原或い
は抗体を送り込むまでに、これらを電気泳動用担体中で
泳動させねばならず、それだけ時間を要するし、さらに
反応部分近傍或いは反応層近傍から未反応物を除去する
際も電気泳動用担体中でこれらを泳動させるために、さ
らに時間を要することになる。未反応物の除去について
は、反応終了後、反応部分を取り出してその後の操作を
行えば、これを省略することはできるが、この方法は時
間短縮にはなるものの操作が繁雑になり、自動装置化に
向かないという新たな問題点を生ずることになる。
動法を用いた抗原或いは抗体の送り込み方法は極めて有
効である。しかし、反応部分或いは反応層まで抗原或い
は抗体を送り込むまでに、これらを電気泳動用担体中で
泳動させねばならず、それだけ時間を要するし、さらに
反応部分近傍或いは反応層近傍から未反応物を除去する
際も電気泳動用担体中でこれらを泳動させるために、さ
らに時間を要することになる。未反応物の除去について
は、反応終了後、反応部分を取り出してその後の操作を
行えば、これを省略することはできるが、この方法は時
間短縮にはなるものの操作が繁雑になり、自動装置化に
向かないという新たな問題点を生ずることになる。
電気泳動法により、抗原或いは抗体を送り込む方法にお
いて、上に述べたような従来法の問題点を解決するため
に、本発明では電気泳動用担体は定住された反応部分で
あ＃）％この部分は直接一方で陰極側の電解液と、他方
で陽極側の電解液と接触する。この場合、同様に時間短
縮の目的で、反応部分は膜状とし、さらにこの膜面に対
して垂直方向に反応対象物である抗原或いは抗体を電気
泳動によｐ移動させることが望ましい。
いて、上に述べたような従来法の問題点を解決するため
に、本発明では電気泳動用担体は定住された反応部分で
あ＃）％この部分は直接一方で陰極側の電解液と、他方
で陽極側の電解液と接触する。この場合、同様に時間短
縮の目的で、反応部分は膜状とし、さらにこの膜面に対
して垂直方向に反応対象物である抗原或いは抗体を電気
泳動によｐ移動させることが望ましい。
本発明ｆ′ｉ、測定対象物が特定環境下で電荷を帯びる
ｐＨ条件を選んで行なうもので、イムノアッセイ法とし
ては、いわゆるサンドイツチ法、免疫吸収競合法等の固
相反応を利用したほとんど全てのものに用いうる。
ｐＨ条件を選んで行なうもので、イムノアッセイ法とし
ては、いわゆるサンドイツチ法、免疫吸収競合法等の固
相反応を利用したほとんど全てのものに用いうる。
以下、実施側音まじえながら本発明を烙らに詳しく説明
する。
する。
実施例１
電気泳動用セルロースアセテート膜（厚さ約１２０μｍ
）を抗ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ）溶液に約１時間浸漬し
たあと、 ２．５％グルタルアルデヒド溶液ＣＰＢＳ、
つまｔ） １／１５Ｍ Ｎａｃｌ ｋ含む０、１ Ｍ
リン酸緩衝液ｐ Ｈ７，４で希釈したもの）に３０分間
浸漬する操作ｔ３回繰り返したあと、さらに抗ヒ）Ｉｇ
Ｇ抗体溶液に約１時間浸漬してから、ＰＢ８で十分に洗
うことにより、抗ヒトＩｇＧ抗体固定化セルロースアセ
テート膜を作った。この膜から直径８＋＋ａ＋＋の円形
膜を切り出し反応膜とし。
）を抗ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ）溶液に約１時間浸漬し
たあと、 ２．５％グルタルアルデヒド溶液ＣＰＢＳ、
つまｔ） １／１５Ｍ Ｎａｃｌ ｋ含む０、１ Ｍ
リン酸緩衝液ｐ Ｈ７，４で希釈したもの）に３０分間
浸漬する操作ｔ３回繰り返したあと、さらに抗ヒ）Ｉｇ
Ｇ抗体溶液に約１時間浸漬してから、ＰＢ８で十分に洗
うことにより、抗ヒトＩｇＧ抗体固定化セルロースアセ
テート膜を作った。この膜から直径８＋＋ａ＋＋の円形
膜を切り出し反応膜とし。
ヒトＩｇＧを測定対象物としてサンドインチ法によりイ
ムノアッセイを行なった。
ムノアッセイを行なった。
第１図に模式的に示す装置を用いて、抗原抗体反応を行
わせた。反応膜１は、内径４ｗｍのガラス製ポールジヨ
イント２によって保持される。上部電解液４及び下部電
解液６Ｆｉ、トリス・グリシン緩衝液（１）Ｈ８，６）
とした。
わせた。反応膜１は、内径４ｗｍのガラス製ポールジヨ
イント２によって保持される。上部電解液４及び下部電
解液６Ｆｉ、トリス・グリシン緩衝液（１）Ｈ８，６）
とした。
まず、４０％しよ糖溶液で２倍に希釈した標準試料１０
μｔをマイクロシリンジを用いて、静かに反応膜上部に
注入した。この際３ケ膜にそれぞれ異なる試料を注入し
た。つぎに印加電圧５０■で１５分間電気泳動を行なっ
た。次に、市販のアルカリ性フォスファターゼ標識抗ヒ
）ＩｇＧ抗体（ヤギ）溶液（マイルス社）を４０％しよ
糖溶液で倍量に希釈したもの１０μｔを反応膜上部に注
入してから、印加電圧５０■で１５分間電気泳動を行な
った。このあと、反応膜を取り出し％ＰＢ８で簡単にリ
ンスしたあと、反応膜中に存在するアルカリ性フォスフ
ァターゼの酵素活性染色を第１表に示す組成の液に３０
分間浸漬することによって行なった。活性染色後、反応
膜を水洗し、いったん乾燥してからデカリンに浸漬して
反応膜の透明化を行なってから、染色濃度を波長６００
ｎｍで比色定量した。この結果を第２図に示す。なお
、この図において縦軸は、各染色試料の吸光度と、標準
試料としてヒ）ＩｇＧを全く含まないものを注入して以
下の操作を同様にして行なった染色試料の吸光度との差
を表わしである。
μｔをマイクロシリンジを用いて、静かに反応膜上部に
注入した。この際３ケ膜にそれぞれ異なる試料を注入し
た。つぎに印加電圧５０■で１５分間電気泳動を行なっ
た。次に、市販のアルカリ性フォスファターゼ標識抗ヒ
）ＩｇＧ抗体（ヤギ）溶液（マイルス社）を４０％しよ
糖溶液で倍量に希釈したもの１０μｔを反応膜上部に注
入してから、印加電圧５０■で１５分間電気泳動を行な
った。このあと、反応膜を取り出し％ＰＢ８で簡単にリ
ンスしたあと、反応膜中に存在するアルカリ性フォスフ
ァターゼの酵素活性染色を第１表に示す組成の液に３０
分間浸漬することによって行なった。活性染色後、反応
膜を水洗し、いったん乾燥してからデカリンに浸漬して
反応膜の透明化を行なってから、染色濃度を波長６００
ｎｍで比色定量した。この結果を第２図に示す。なお
、この図において縦軸は、各染色試料の吸光度と、標準
試料としてヒ）ＩｇＧを全く含まないものを注入して以
下の操作を同様にして行なった染色試料の吸光度との差
を表わしである。
第１表
ナフトールＡｓ−ＢＩフォスフエイト、Ｎａ塩０ｍｇ
塩化ｐ−ジアゾメチルアニリン塩化亜鉛塩０ｍｇ
１０％塩化マグネシウム水溶液 ２滴
０、１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）５０ｔｒ
＋ｚ実施例２ 抗ヒトアルブミン抗体（ウサギ）を固定化したポリアク
リルアミドゲル膜（厚さ約３００μｍ）を作った。作り
方は以下の通９である。まず、抗ヒトアルブミン抗血清
のＩｇＧフラクション（有効抗体成分を２．４ｍｇ／ｒ
ｎｔ含む）０．５ｍｔに′２．５％アクロレイン水溶液
を２５μを加えて氷冷下で３０分間放置したあと、ＰＢ
Ｓでよく透析してから、これに０．３２ ｇ／ｍＡのア
クリルアミド溶液１．５ｍｌ、０．０１６ｇ／ｍｔのＮ
、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド溶液を１．５ｍｔ
、４．６μｔ／ｍｔのＮ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を１．２５ｍｔ、及び１．
２ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム溶液５．７５ｍｔを
加えて、よく攪拌したあとガラス製のゲル膜成形器にこ
れを注入してから静置してゲル化させることによシ製膜
を行なった。この膜から直径９１１ＩＩの円形膜を切り
出して、これを実施例１と同様に反応膜とした。
＋ｚ実施例２ 抗ヒトアルブミン抗体（ウサギ）を固定化したポリアク
リルアミドゲル膜（厚さ約３００μｍ）を作った。作り
方は以下の通９である。まず、抗ヒトアルブミン抗血清
のＩｇＧフラクション（有効抗体成分を２．４ｍｇ／ｒ
ｎｔ含む）０．５ｍｔに′２．５％アクロレイン水溶液
を２５μを加えて氷冷下で３０分間放置したあと、ＰＢ
Ｓでよく透析してから、これに０．３２ ｇ／ｍＡのア
クリルアミド溶液１．５ｍｌ、０．０１６ｇ／ｍｔのＮ
、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド溶液を１．５ｍｔ
、４．６μｔ／ｍｔのＮ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を１．２５ｍｔ、及び１．
２ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム溶液５．７５ｍｔを
加えて、よく攪拌したあとガラス製のゲル膜成形器にこ
れを注入してから静置してゲル化させることによシ製膜
を行なった。この膜から直径９１１ＩＩの円形膜を切り
出して、これを実施例１と同様に反応膜とした。
たたし、この場合は、抗体固定化ポリアクリルアミドゲ
ル膜の脆弱性を考慮して、反応膜の周囲の厚さ２００μ
ｍのポリエステル製のスペーサーリングを挿入した。
ル膜の脆弱性を考慮して、反応膜の周囲の厚さ２００μ
ｍのポリエステル製のスペーサーリングを挿入した。
実施例１と同様に、ヒトアルブミン標準試料のしよ糖混
合液を注入してから、印加電圧２５０■で３０分間電気
泳動を行ない、さらに、Ｍ。
合液を注入してから、印加電圧２５０■で３０分間電気
泳動を行ない、さらに、Ｍ。
Ｑｏｌｄｍａｎの方法に準じて調製したフルオレツセイ
ンを標識した抗ヒトアルブミン抗血清（ウサギ）を同様
に注入してから、印加電圧２５０■で２０分間電気泳動
を行なった。次に反応膜を取り出して、これをＰＢＳで
簡単にリンスし、膜の螢光強度の測定を螢光光度計を用
いて行なった。なお、励起波長は４８５ ｎｍ％測定波
長は５２０ ｎｍとした。その結果を第３図に示す。
ンを標識した抗ヒトアルブミン抗血清（ウサギ）を同様
に注入してから、印加電圧２５０■で２０分間電気泳動
を行なった。次に反応膜を取り出して、これをＰＢＳで
簡単にリンスし、膜の螢光強度の測定を螢光光度計を用
いて行なった。なお、励起波長は４８５ ｎｍ％測定波
長は５２０ ｎｍとした。その結果を第３図に示す。
実施例３
実施例２と同様な方法で抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗
血清（ウサギ）から得たＩｇＧフラクションを固定化し
たポリアクリルアミドゲル膜（厚さ約３００μｍ）を作
り、これを反応膜として実施例２と同様の方法で標準試
料を泳動したあと、ル ルミノー／標識抗体溶液を同様に注入して、２５０■で
３０分間泳動したあと、反応膜を取シ出して、０．８５
％ＮａＣ１溶液に３０分間浸漬したあと、低面が光学活
性な１ｃｒｎ角の石英セルの底に反応膜を置き、上から
０．１ＭのＨｓ（ｈ水溶液１００μｔと０．１ＮＮａＯ
Ｈ水溶液に１０ｍＭの濃度で次亜塩素酸ナトリウムを含
む溶液２００μｔを加えて、反応膜中のルミノールを酸
化発光させてその発光量を石英セルの下側にその受光部
を配置したフォトンカウンターで計測した。その結果を
第４図に示す。
血清（ウサギ）から得たＩｇＧフラクションを固定化し
たポリアクリルアミドゲル膜（厚さ約３００μｍ）を作
り、これを反応膜として実施例２と同様の方法で標準試
料を泳動したあと、ル ルミノー／標識抗体溶液を同様に注入して、２５０■で
３０分間泳動したあと、反応膜を取シ出して、０．８５
％ＮａＣ１溶液に３０分間浸漬したあと、低面が光学活
性な１ｃｒｎ角の石英セルの底に反応膜を置き、上から
０．１ＭのＨｓ（ｈ水溶液１００μｔと０．１ＮＮａＯ
Ｈ水溶液に１０ｍＭの濃度で次亜塩素酸ナトリウムを含
む溶液２００μｔを加えて、反応膜中のルミノールを酸
化発光させてその発光量を石英セルの下側にその受光部
を配置したフォトンカウンターで計測した。その結果を
第４図に示す。
実施例４
実施例３と同じ反応膜を第５図に示すアクリル製の膜保
持器１１に装着し、標準試料、さらにルミノール標識抗
体を実施例３と同様にして電気泳動させた。ただし、本
実施例では電気泳動中に下部電解液をがん渡場せて、反
応膜で反応しなかった未反応物及び過剰な標識抗体の除
去を行なった。
持器１１に装着し、標準試料、さらにルミノール標識抗
体を実施例３と同様にして電気泳動させた。ただし、本
実施例では電気泳動中に下部電解液をがん渡場せて、反
応膜で反応しなかった未反応物及び過剰な標識抗体の除
去を行なった。
ルミノール標識抗体を電気泳動させたあと上部電解槽３
及び膜保持器中の上部電解液及び下部電解槽５中の下部
電解液を抜き取ってから膜保持器中に実施例３と同様に
Ｈ２Ｏ２水溶液及び次亜塩素酸ナトリウム溶液を注いで
ルミノールを発光させて、下部電解槽の下に受光部１２
を配置したフォトカウンターにより発光量を計測した。
及び膜保持器中の上部電解液及び下部電解槽５中の下部
電解液を抜き取ってから膜保持器中に実施例３と同様に
Ｈ２Ｏ２水溶液及び次亜塩素酸ナトリウム溶液を注いで
ルミノールを発光させて、下部電解槽の下に受光部１２
を配置したフォトカウンターにより発光量を計測した。
この場合も実ロビン量に比例的な良好な標準曲線が得ら
れた。
れた。
実施例５
実施例２と同様にしで作ったアクロレイン結合抗ヒトア
ルブミン抗体溶液を１０００倍にＰＢＳで希釈し、この
溶液０．５ ｍ ｌを用い、他は実施例２と同様にして
抗体固定化ポリアクリルアミドゲル膜を作シ、これから
直径９ＩＩＩｎ＋の円形膜をｖＪ９出して反応膜として
、実施例２と同様の装置に装着し、ヒトアルブミン標準
試料を注入して１００ｖの印加電圧で４５分間電気泳動
を行なった。次に、Ｍ、 Ｇｏｌｄｍａｎの方法によっ
て調整したフルオレツセイン標識ヒトアルブミン溶液を
４０％しよ糖溶液と等貴混合してから注入して、同じく
１００Ｖの印加電圧で４５分間電気泳動を行なってから
、反応膜を取り出し、ＰＢＳ中に５分間浸漬してから螢
光光度針によりその螢光強度を実施例２と同様に計測し
た。その結果を第６図に示す。
ルブミン抗体溶液を１０００倍にＰＢＳで希釈し、この
溶液０．５ ｍ ｌを用い、他は実施例２と同様にして
抗体固定化ポリアクリルアミドゲル膜を作シ、これから
直径９ＩＩＩｎ＋の円形膜をｖＪ９出して反応膜として
、実施例２と同様の装置に装着し、ヒトアルブミン標準
試料を注入して１００ｖの印加電圧で４５分間電気泳動
を行なった。次に、Ｍ、 Ｇｏｌｄｍａｎの方法によっ
て調整したフルオレツセイン標識ヒトアルブミン溶液を
４０％しよ糖溶液と等貴混合してから注入して、同じく
１００Ｖの印加電圧で４５分間電気泳動を行なってから
、反応膜を取り出し、ＰＢＳ中に５分間浸漬してから螢
光光度針によりその螢光強度を実施例２と同様に計測し
た。その結果を第６図に示す。
実施例６
抗ヒトアルブミン抗体同定化ポリアクリルアミドゲル膜
の膜成形条件を変えて膜厚の異なるゲル膜を作った。な
おゲル化させる際の組成は実施例２と同じくした。得ら
れたゲル膜の厚さは２０〜２０００μｍでおった。それ
ぞれから直径９＋＋ｍの円形膜を切シ出して、実施例１
と同じ装置に装着してから、実施例２で用いたフルオレ
ツセイン標識抗ヒトアルブミン抗血清溶液を４０％しよ
糖溶液と等量混合したものを１０μを注入して、２５０
■の印加電圧で１時間電気泳動させたあと膜を取υ出し
てこれをＰＢＳで軽くリンスしたあと、この膜に残留す
るフルオレツセイン標識抗体の量を螢光光度計によシ計
測した。その結果、膜厚が１０００μｍを越えるものに
ついては残留螢光が認められたが％１０００μｍ以下の
ものでは螢光色素は良好に膜から抜けていた。また、膜
厚が１００μｍより薄いものでは膜そのものが脆弱であ
り取り扱いが極めて困難であった。これらのことより、
抗体固定化ポリアクリルアミドゲルの膜厚は１００〜１
０００μｍの範囲とすることが望ましい。
の膜成形条件を変えて膜厚の異なるゲル膜を作った。な
おゲル化させる際の組成は実施例２と同じくした。得ら
れたゲル膜の厚さは２０〜２０００μｍでおった。それ
ぞれから直径９＋＋ｍの円形膜を切シ出して、実施例１
と同じ装置に装着してから、実施例２で用いたフルオレ
ツセイン標識抗ヒトアルブミン抗血清溶液を４０％しよ
糖溶液と等量混合したものを１０μを注入して、２５０
■の印加電圧で１時間電気泳動させたあと膜を取υ出し
てこれをＰＢＳで軽くリンスしたあと、この膜に残留す
るフルオレツセイン標識抗体の量を螢光光度計によシ計
測した。その結果、膜厚が１０００μｍを越えるものに
ついては残留螢光が認められたが％１０００μｍ以下の
ものでは螢光色素は良好に膜から抜けていた。また、膜
厚が１００μｍより薄いものでは膜そのものが脆弱であ
り取り扱いが極めて困難であった。これらのことより、
抗体固定化ポリアクリルアミドゲルの膜厚は１００〜１
０００μｍの範囲とすることが望ましい。
実施例７
実施例２と同じ反応膜、装置、試薬、及び測定手順を用
い、電気泳動時の印加電圧のみを２０〜１５００Ｖの範
囲で変えて適正な印加電圧をめた。
い、電気泳動時の印加電圧のみを２０〜１５００Ｖの範
囲で変えて適正な印加電圧をめた。
その結果印加電圧が１００ＯＶを越えた場合計測される
螢光量が小さく、良好な検量線が得られなかった。いっ
ぽう％５０Ｖよシ低い印加電圧では残留螢光色素の量が
多く、バックグランドレベルが高いために、これも良好
な検量線が得られなかった。５０〜１００ＯＶの範囲内
では添加したヒトアルブミンの濃度に螢光強度が応じた
良好な検量線が得られた。
螢光量が小さく、良好な検量線が得られなかった。いっ
ぽう％５０Ｖよシ低い印加電圧では残留螢光色素の量が
多く、バックグランドレベルが高いために、これも良好
な検量線が得られなかった。５０〜１００ＯＶの範囲内
では添加したヒトアルブミンの濃度に螢光強度が応じた
良好な検量線が得られた。
以上で説明したように、本発明によれば従来のイムノア
ッセイ法で１回の抗原抗体反応で必要とする３〜４時間
ないし１日という反応時間を１時間以内に短縮できる。
ッセイ法で１回の抗原抗体反応で必要とする３〜４時間
ないし１日という反応時間を１時間以内に短縮できる。
本発明において、この反応所要時間は反応膜の種類、反
応膜の厚さ、電気泳動時の電解液の水素イオン濃度及び
イオン強度、印加電圧などによって変わるのは当然であ
る。例えば、実施例２で用いた抗体固定化ポリアクリル
アミドゲル膜の厚さは約３００μｍであるが、これをさ
らに薄くすれば同様の印加電圧でさらに反応所要時間を
短縮することができる。
応膜の厚さ、電気泳動時の電解液の水素イオン濃度及び
イオン強度、印加電圧などによって変わるのは当然であ
る。例えば、実施例２で用いた抗体固定化ポリアクリル
アミドゲル膜の厚さは約３００μｍであるが、これをさ
らに薄くすれば同様の印加電圧でさらに反応所要時間を
短縮することができる。
本発明の他の効果として、従来のイムノアッセイで必要
とされるプロセスを簡略化できることがあげられる。つ
まり、本発明によれば、非反応物及び過剰の標識抗体は
反応膜を透過して下部電解液中に移動してしまうので、
従来の同相反応に基づくイムノアッセイで必要とされる
水洗という操作が不要となる。
とされるプロセスを簡略化できることがあげられる。つ
まり、本発明によれば、非反応物及び過剰の標識抗体は
反応膜を透過して下部電解液中に移動してしまうので、
従来の同相反応に基づくイムノアッセイで必要とされる
水洗という操作が不要となる。
上で述べた本発明の二つの効果は１本発明を用いれば、
イムノアッセイの全自動化装置を容易に作りうろことを
暗示する。一般にイムノアッセイを自動化する際に問題
とされているイムノアッセイプロセスに要する時間及び
プロセスの複雑さとを本発明は同時に解決するからであ
る。
イムノアッセイの全自動化装置を容易に作りうろことを
暗示する。一般にイムノアッセイを自動化する際に問題
とされているイムノアッセイプロセスに要する時間及び
プロセスの複雑さとを本発明は同時に解決するからであ
る。
本発明のさらなる効果として、本発明を用いれば必要と
する標識抗体或いは標識抗原の量は１０μを以下である
ので、分析コストを低減できることがあげられる。
する標識抗体或いは標識抗原の量は１０μを以下である
ので、分析コストを低減できることがあげられる。
第１図は抗原抗体反応を行わせるための電気泳動装置の
概略図、第２図、第３図、第４図はそれぞれヒトＩｇＧ
、ヒトアルブミン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを本発明
により測定したときの検量線を表わす図、第５図は本発
明を実施するための反応膜保持形態の１例を示す図、第
６図はヒトアルブミンを本発明により測定したときの検
量線を表わす図である。 １・・・反応膜、２・・・ガラス製ポールジヨイント、
３・・・上部電解槽、４・・・上部電解液、５・・・下
部電解槽、６・・・下部電解、７．８・・・白金電極、
９・・・直流電源、１０・・・透析膜、１１・・・アク
リル製の反応膜保持器ｔ１２・・・フォトンカウンター
用の受光部、１３・・・石英板、１４・・・下部電解液
入口、１５・・・下部電解液箒 ３ 図 Ｚ ４ 図 （ｒＬｌ／）） 第 ５ 図 ′ｆＪ に 図
概略図、第２図、第３図、第４図はそれぞれヒトＩｇＧ
、ヒトアルブミン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを本発明
により測定したときの検量線を表わす図、第５図は本発
明を実施するための反応膜保持形態の１例を示す図、第
６図はヒトアルブミンを本発明により測定したときの検
量線を表わす図である。 １・・・反応膜、２・・・ガラス製ポールジヨイント、
３・・・上部電解槽、４・・・上部電解液、５・・・下
部電解槽、６・・・下部電解、７．８・・・白金電極、
９・・・直流電源、１０・・・透析膜、１１・・・アク
リル製の反応膜保持器ｔ１２・・・フォトンカウンター
用の受光部、１３・・・石英板、１４・・・下部電解液
入口、１５・・・下部電解液箒 ３ 図 Ｚ ４ 図 （ｒＬｌ／）） 第 ５ 図 ′ｆＪ に 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試料中の抗原を固定化された抗体と抗原抗体反応に
より固定させ、上記抗原の濃度を測定するイムノアッセ
イ法において、 （イ）電気泳動用担体の実質的に全域に抗体を固定させ
る工程、 （ロ）被測定試料の抗原を電気泳動によって移動せしめ
る過程で上記固定化された抗体と抗原抗体反応を起こさ
せ、固定させる工程、 （ハ）上記固定化させた抗原に、標識された抗体を電気
泳動によって移動せしめて反応させるか、又は上記固定
化された抗体の未反応部に標識された抗原を電気泳動に
よって移動せしめて反応させるかのいずれかの反応を行
なわせる工程及び。 に）上記標識された抗体又は標識された抗原の濃度を測
定することによシ、試料中の抗原の濃度を測定すること
を特徴とするイムノアッセイ法。 ２ 抗体を固定化した担体が膜状であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のイムノアッセイ法。 ３、抗体を固定化した担体の膜が多孔性セルロースアセ
テート膜であることを特徴とする特許請求の範囲第２項
記載のイムノアッセイ法。 ４、抗体を固定化した担体の膜がポリアクリルアミドゲ
ル膜であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載
のイムノアッセイ法。 ５、抗体を固定化したポリアクリルアミドゲル膜が、あ
らかじめ抗体とアクロレインとを結合させておき、この
結合物とアクリルアミドモノマー、！：Ｎ、Ｎ’−メチ
レンビスアクリルアミドモノマーとを重合架橋させるこ
とによって得られるものであることを特徴とする特許請
求の範囲第４項記載のイムノアッセイ法。 ６、抗体を固定化した担体の膜の面に対して垂直方向に
電位勾配をかけ、この方向に抗原、標識抗体及び標識抗
原を電気泳動させることを特徴とする特許請求の範囲第
２項記載のイムノアッセイ法。 ７、標識抗体或いは標識抗原の標識物が酵素、螢光物質
及びルミノールのなかから１つ選ばれたものである特許
請求の範囲第１項記載のイムノアッセイ法。 ８、抗体を固定化したポリアクリルアミドゲル膜の厚さ
が１００〜１０００μｍの範囲の中から選ばれたもので
ある特許請求の範囲第４項記載のイムノアッセイ法。 ９、抗原、標識抗体、及び標識抗原を電気泳動させる時
の印加電圧が５０〜１００ＯＶの範囲内であることを特
徴とする特許請求の範囲第６項記載のイムノアッセイ法
。 １０、電気泳動させながら抗原抗体反応をさせる工程に
おいて、泳動方向側の電解液をがん流することを行なう
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のイムノア
ッセイ法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58164992A JPS6057257A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | イムノアツセイ法 |
| US06/638,423 US4628035A (en) | 1983-09-09 | 1984-08-07 | Immunoassay method |
| DE3429377A DE3429377A1 (de) | 1983-09-09 | 1984-08-09 | Immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58164992A JPS6057257A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | イムノアツセイ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6057257A true JPS6057257A (ja) | 1985-04-03 |
Family
ID=15803778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58164992A Pending JPS6057257A (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | イムノアツセイ法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4628035A (ja) |
| JP (1) | JPS6057257A (ja) |
| DE (1) | DE3429377A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62285062A (ja) * | 1986-06-04 | 1987-12-10 | Agency Of Ind Science & Technol | イムノアツセイ装置 |
| JPS6379071A (ja) * | 1986-09-24 | 1988-04-09 | Agency Of Ind Science & Technol | 多項目イムノアツセイ |
| JPS63118660A (ja) * | 1986-11-07 | 1988-05-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 免疫学的定量装置 |
| JP2010518398A (ja) * | 2007-02-07 | 2010-05-27 | ライザー ダイアグノスティックス， インコーポレイテッド | 電気泳動を使用する迅速な均一系イムノアッセイ |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61272661A (ja) * | 1985-05-29 | 1986-12-02 | Hitachi Ltd | イムノアツセイ法 |
| US5057438A (en) * | 1986-09-24 | 1991-10-15 | Agency Of Industrial Science And Technology | Electrophoretic antigen-antibody determination with laminate of multiple membranes |
| JP2564540B2 (ja) * | 1987-04-01 | 1996-12-18 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析方法 |
| US5006473A (en) * | 1988-08-09 | 1991-04-09 | Abbott Laboratories | Electrophoresis method using vesicles |
| US5376249A (en) * | 1992-11-25 | 1994-12-27 | Perseptive Biosystems, Inc. | Analysis utilizing isoelectric focusing |
| US7214300B2 (en) * | 2001-06-04 | 2007-05-08 | Epocal Inc. | Integrated electrokinetic devices and methods of manufacture |
| JP2003066047A (ja) * | 2001-06-14 | 2003-03-05 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定用試薬 |
| US20040018556A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Cantor Thomas L. | Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator |
| KR20050083623A (ko) * | 2002-12-10 | 2005-08-26 | 마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤 | 면역반응 측정방법 |
| US20060246511A1 (en) * | 2005-04-27 | 2006-11-02 | B&C Biotech | Methods of determining levels of steroid fractions utilizing SHBG calculations |
| US8105844B2 (en) * | 2008-05-20 | 2012-01-31 | Honeywell International Inc. | Apparatus and method of using porous material for antigen separation, identification, and quantification with electrophoresis techniques |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3852157A (en) * | 1971-05-14 | 1974-12-03 | Syva Corp | Compounds for enzyme amplification assay |
| US3966897A (en) * | 1973-04-02 | 1976-06-29 | Marine Colloids, Inc. | Medium for use in bioassay and method of using same |
| DE2406959C3 (de) * | 1974-02-14 | 1979-02-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Anordnung und Verfahren zur Bestimmung von Antigenen |
| SE7609263L (sv) * | 1976-08-20 | 1978-02-21 | Wadsworth Charlies | Forfaringssett for faststellande av kvantiteten av viss i en biologisk vetska loslig komponent, samt apparat for utovande av forfarandet |
| US4452901A (en) * | 1980-03-20 | 1984-06-05 | Ciba-Geigy Corporation | Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP58164992A patent/JPS6057257A/ja active Pending
-
1984
- 1984-08-07 US US06/638,423 patent/US4628035A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-09 DE DE3429377A patent/DE3429377A1/de active Granted
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62285062A (ja) * | 1986-06-04 | 1987-12-10 | Agency Of Ind Science & Technol | イムノアツセイ装置 |
| JPH0529065B2 (ja) * | 1986-06-04 | 1993-04-28 | Kogyo Gijutsuin | |
| JPS6379071A (ja) * | 1986-09-24 | 1988-04-09 | Agency Of Ind Science & Technol | 多項目イムノアツセイ |
| JPH0529066B2 (ja) * | 1986-09-24 | 1993-04-28 | Kogyo Gijutsuin | |
| JPS63118660A (ja) * | 1986-11-07 | 1988-05-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 免疫学的定量装置 |
| JP2010518398A (ja) * | 2007-02-07 | 2010-05-27 | ライザー ダイアグノスティックス， インコーポレイテッド | 電気泳動を使用する迅速な均一系イムノアッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3429377C2 (ja) | 1987-10-01 |
| US4628035A (en) | 1986-12-09 |
| DE3429377A1 (de) | 1985-03-28 |
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