DE3429377A1

DE3429377A1 - Immunoassay

Info

Publication number: DE3429377A1
Application number: DE3429377A
Authority: DE
Inventors: Kazumichi Kokubunji Imai; Teruaki Hachioji Kobayashi; Daizo Tokinaga
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1983-09-09
Filing date: 1984-08-09
Publication date: 1985-03-28
Also published as: DE3429377C2; JPS6057257A; US4628035A

Description

6, Kanda Surugadai 4-chome

Chiyoda-ku

Tokyo, Japan

A 5678

Beschrei-bung

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Immunoassay

Die Erfindung betrifft einen Immunoassay zur quantitativen Messung der Konzentration eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe.

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Yalow et al. (Nature, 18M, 1948) beschreiben ein Verfahren zur Messung von geringen Insulinmengen unter Verwendung eines speziellen, mit einem Radioisotop markierten Antikörpers. Seit dieser Zeit wird diese als Radioimmunoassay bezeichnete Messtechnik zur quantitativen Messung von verschiedenen biologischen Materialien und Arzneistoffen eingesetzt. Aufgrund der Verwendung von radioaktiven Isotopen sind jedoch bei der Durchführung derartiger Tests besondere Vorsichtsmassnahmen erforderlich. Aus diesem Grund wurden verschiedene Immunoassaytechniken unter Verwendung von nichtradioaktiven Markern, wie Enzymen, Enzymsubstraten, fluoreszierenden und chemilumineszierenden Materialien, untersucht. Insbesondere sind Verfahren unter Verwendung von Enzymen oder fluoreszierenden Materialien als Markern bis zur Praxisreife entwickelt worden. Jedoch sind derartige Verfahren und Radioimmunoassays wegen des für das gesamte Verfahren hohen Arbeits- und Zeitaufwands schwierig zu automatisieren.

ι In der US-PS 3 852 157 wird ein vereinfachtes Verfahren vor-

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BAD

geschlagen, wobei jedoch die Analyten auf Kaptene mit niedrigem Molekulargewicht beschränkt sind. Dieses Verfahren ist insofern vereinfacht, als eine Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freien Antigenen oder Antikörpern nicht erforderlich ist. Auf der anderen Seite wurde auch versucht, den Trennvorgang zu vereinfachen. Bei diesem sogenannten Festphasenverfahren wird ein Antikörper oder Antigen vorher an einen unlöslichen Träger gebunden. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird dann auf diesem Träger durchgeführt. Die freien Antigene oder Antikörper lassen sich von den jeweiligen gebundenen Formen leicht durch Waschen des Trägers mit Wasser entfernen.

Zwar lassen sich Immunoassays durch dieses Festphasenverfahren vereinfachen, diese Verfahren lassen aber im Hinblick auf eine Automation des Gesamtverfahrens noch in vielen Punkten zu wünschen übrig. Für eine Automation von Immunoassays ist es wesentlich, den Zeitbedarf für das Gesamtverfahren zu verringern. Bei Immunoassays erfordert die Antigen-Antikörper-Reaktion die meiste Zeit, üblicherweise werden dafür mehrere Stunden bis 1 Tag benötigt. Im allgemeinen wird die hierfür erforderliche Zeit umso länger, je geringer die Konzentration des durch den Immunoassay zu bestimmenden Materials ist.

Um die Reaktionszeit zu verkürzen, wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine Säule mit Mikrokristallen oder feinen Teilchen, an die ein Antikörper (oder Antigen) gebunden ist, gefüllt wird und ein Analyt zwangsweise durch die Säule geleitet wird. Dabei gelangt eine den Analyten enthaltende Flüssigkeit in einen Bereich oder eine Schicht des Trägers, in dem ein Antikörper oder dergleichen immobilisiert worden ist.

Ein Verfahren, bei dem nicht eine Flüssigkeit, sondern nur ein darin enthaltener spezieller Bestandteil (z.B.¹ eine nachzuweisende Substanz oder dergleichen) zugeführt wird,

besteht in der selektiven Zufuhr dieses Bestandteils durch Elektrophorese. Beispielsweise wird ein Teil einer auf einer Trägerplatte angeordneten Gelschicht durch ein Gel oder■ eine poröse Matrixschicht mit immobilisiertem Antikörper

5 oder Antigen ersetzt. Das nachzuweisende Antigen oder der Antikörper werden dann diesem Bereich zugeführt (vgl. US-PS 3 966 897). In diesem Fall muss die Zufuhrrichtung des nachzuweisenden Materials notwendigerweise parallel zur Oberfläche einer Trägerplatte, d.h. zu einer Oberflächenschicht IQ mit immobilisiertem Antikörper, verlaufen.

Ein weiteres elektrophoretisches Verfahren ist in der japanischen Patentveröffentlichung 1329^6/80 beschrieben. Dabei wird ein mit Polyacrylamidgel gefülltes Röhrchen für die Disk-Elektrophorese bereitgestellt. Eine Antikörperlösung oder Antigenlösung wird auf ein Ende des Gelröhrchens aufgesetzt. Anschliessend wird die Elektrophorese durchgeführt. Dabei bildet sich eine mit dem Antikörper oder Antigen angereicherte Schicht. In dieser angereicherten Schicht findet die Antigen-Antikörper-Reaktion statt, wenn die Antigenlösung oder Antikörperlösung der Elektrophorese unterworfen wird. Es wurde auch versucht, die Bildung dieser angereicherten Schicht durch Einsetzen einer proteinundurchlässigen Membran, d.h. einer Dialysemembran, in einen Bereich des Gels zu unterstützen. Dabei werden der Antikörper oder das Antigen nicht in der Trägermatrix für Elektrophoresezwecke immobilisiert, sondern liegen im freien Zustand in der Reaktionsschicht vor. Aufgrund der Tatsache, dass diese Bestandteile in der Reaktionsschicht in freiem Zustand vorliegen, kann die Reaktionsschicht selbst nicht direkt mit einer Elektrolytlösung auf der anodischen oder kathodischen Seite der Elektrophorese in Kontakt gebracht werden.

Bei allen Antigen-Antikörper-Verfahren, bei denen die beiden vorerwähnten elektrophoretischen Methoden angewandt werden, muss eine Trägermatrix für die Elektrophorese (d.h.

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* ein von Antikörper oder Antigen freier Bereich) ausserhalb des Reaktionsbereichs oder der Reaktionsschicht bereitgestellt werden. Somit ist man gezwungen, das Antigen oder den Antikörper dem Reaktionsbereich oder der Reaktionsschicht durch die Trägermatrix für die Elektrophorese zuzuführen. Demffemäss werden der Elektrophoreseweg und die für die Elektronhorese erforderliche Zeit langer. Ausserdem müssen zur Durchführung von Immunoassays nach diesen Methoden Inhibitoren (z.B. überschüssiger markierter Antikörper, der an der Reaktion nicht teilnimmt), die dem Reaktionsbereich oder der Reaktionsschicht zugeführt werden, aus diesem Bereich oder dieser Schicht entfernt werden. Für diese Entfernung bei derartigen elektrophoretischen Verfahren muss die Elektrophorese fortgesetzt werden, so dass ein zusätzlicher Zeitbedarf für die Wanderung des Inhibitors durch die Trägermatrix für Elektrophoresezwecke ausserhalb des Reaktionsbereichs oder der Reaktionsschicht entsteht.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Immunoassay

bereitzustellen, bei dem die Reaktionszeit der Antigen-Antikörper-Reaktion verkürzt ist und der sich leicht automatisieren lässt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Immunoassay zur Messung der Konzentration eines Antigens in einer Probe durch Fixieren des Antigens an einem immobilisierten Antikörper durch Antigen-Antikörper-Reaktion und Messen der Antigenkonzentration,-gekennzeichnet durch folgende Schritte:

_or^ (a) einen Schritt, bei dem der Antikörper im gesamten Bereich einer ou

wirksamen Trägermatrix für Elektrophoresezwecke immobilisiert wird,

(b) einen Schritt, bei dem die Antigen-Antikörper-Reaktion mit desi immobilisierten Antikörper ,im Verlauf einer elektrophoretischen Wanderung des Antigens der zu messenden Probe hervorgerufen wird,

gg um das Antigen zu fixieren,

(c) einen Schritt, bei dem man markierten Antikörper elektrophoretisch zum fixierten Antigen wandern lässt, um ihm mit dem Antigen umzu-

. setzen, oder markiertes Antigen elektrophoretisch in einen nicht

umgesetzten Bereich des immobilisierten Antikörpers überträgt, um es mit dem Antikörper umzusetzen, und (d) ein Schritt zur Messung.von markiertem Antikörper oder

markiertem Antigen.
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Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit

der Zeichnung. Es zeigen:
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Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Elektrophoresevorrichtung zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion ;

Fig. 2, 3 und k nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Eichkurven für Human-IgG, Human-Albumin und Human-Choriongonadotropin;

Fig. 5 eine bevorzugte Ausführungsform einer Haltevorrichtung für die Reaktionsmembran zur Durchführung des erfindungsgemässen Immunoassays ; und Fig. 6 und 7 nach dem erfindungsgemässen Verfahren gemessene Eichkurven für Human-Albumin.

Bei den vorerwähnten beiden elektrophoretischen Verfahren müssen das Antigen oder der Antikörper in der Trägermatrix für die Elektrophorese so weit wandern, bis sie den Reaktionsbereich oder die Reaktionsschicht erreichen, was zeitraubend ist. Ferner entsteht ein zusätzlicher Zeitbedarf für die Entfernung von nicht umgesetzten Material aus der Nähe des Reaktionsbereichs und der Reaktionsschicht. Die Entfernung des Bereichs, in dem keine Umsetzung stattgefunden hat, kann unterbleiben, wenn der Reaktionsbereich nach Beendigung der Reaktion entnommen wird und anschliessend die weitere Bearbeitung durchgeführt wird. Dies ermöglicht zwar eine zeitliche Verkürzung des Verfahrens, bringt aber das Problem mit sich., dass sich ein derartiger Arbeitsschritt nicht für die Automation eignet." ^l

? L 9 ° ° ⁷ 7

Erfindungsgemäss besteht die Trägermatrix für die Elektrophorese im wesentlichen nur aus dem Reaktionsbereich. Dies bedeutet, dass praktisch der gesamte Bereich der Trägermatrix den Reaktionsbereich darstellt,in dem der Antikörper

5 oder das Antigen immobilisiert worden ist. Dieser Bereich steht direkt mit einer Elektrolytlösung an der Anodenseite und einer Elektrolytlösung an der Kathodenseite in Berührung. Dabei ist es zur Erzielung einer zeitlichen Verkürzung wünschenswert, dass der Reaktionsbereich in Forrr. einer Metnbran vorliegt und der Reaktant, d.h. das Antigen oder der Antikörper, durch Elektrophorese in vertikaler Richtung zur Membranoberfläche wandert.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird unter pH-Bedingungen durchgeführt, bei denen der Analyt in einer spezifischen Umgebung in entsprechender Weise geladen ist. Zur praktischen Durchführung des erfindungsgemässen Immunoassays können fast sämtliche Techniken, bei denen eine Festphaser.-reaktion erfolgt, wie das Sandwich-Verfahren und der Immunosorptionsmittel-Assay,angewandt werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine Celluloseacetatmembran mit immobilisiertem anti-human-IgG-Antikörper wird hergestellt, indem man eine Celluioseacetatmembran (mit einer Dicke von etwa 120 jjm) für Elektrophoresezwecke etwa 1 Stunde in eine Lösung von anti-human-IgG-Antikörper ''(Kaninchen) eintaucht und anschliessend die erhaltene Membran 30 Minuten in eine mit PBS (0,1 m Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an 1/15 m NaCl, pH-Wert = 7,4) verdünnte 2,5-prozentige Glutaraldehydlösung eintaucht.

Diese Arbeitsgänge werden 3 mal wiederholt. Anschliessend ob

wird die erhaltene Membran etwa 1 Stunde in eine Lösung von anti-human-IgG-Antikörper getaucht und sodann ausreichend mit PBS gewaschen. Aus der erhaltenen Membran wird ein run-

des Membranstück mit einem Durchmesser von 8 mm ausgeschnitten. Ein Immunoassay wird unter Verwendung dieser runden Membran als Reaktionsmembran nach dem Sandwich-Verfahren durchgeführt, wobei human-lgG als Analyt verwendet wird.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird unter Verwendung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung durchgeführt. Die Reaktionsmembran 1 wird von einer Kugel verbindung aus Glas mit einer. Innendurchmesser von 4 mm gehalten. Oberer Elektrolyt

IC ^h ^un° unterer Elektrolyt 6, die jeweils aus Tris-Glycin- ?ufferlösung (pH-Wert 8,6) bestehen, werden in das obere Elektroiytgefäss 3 bzw. in das untere Elektrolytgefäss 5 gegeben. Die Bezugszeichen 7 und 8 stellen Platinelektroden, 9 eine Gleichstromquelle und 10 eine Dialysemembran ^dar-

Zunächst werden 10 ^uI einer mit 40-prozentiger Saccharoselösung auf das doppelte Volumen verdünnten Standardprobe vorsichtig unter Verwendung einer Mikrospritze auf den oberen Teil Reaktionsmembran aufgesetzt. Dabei werden gleichzeitig drei verschiedene Proben auf drei Membranen aufgetragen. Anschliessend wird die Elektrophorese 15 Minuten bei einer Spannung von 50 V durchgeführt. Sodann werden 10^uI einer handelsüblichen Lösung von mit alkalischer Phosphatase markiertem anti-human-IgG-Antikörper (Ziege) (Miles Lab.), die mit 40-prozentiger Saccharoselösung auf das doppelte Volumen verdünnt ist, auf den oberen Teil der Reaktionsmembran aufgesetzt. Anschliessend wird die Elektrophorese 15 Minuten bei einer Spannung von 50 V durchgeführt. Sodann wird die Reaktionsmembran entnommen und lediglich mit PBS gespült. Die Farbentwicklung aufgrund der enzymatischen Aktivität der in der Reaktionsmembran erhaltenen alkalischen Phosphatase erfolgt durch 30-minütiges Eintauchen in eine Flüssigkeit der in Tabelle I angegebenen Zusammensetzung.

Nach der Farbentwicklung wird die Reaktionsmembran mit Wasser gewaschen, getrocknet und anschliessend in Decalin getaucht, um sie durchsichtig zu machen. Das Ausmass der

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Farbentwicklung wird kolorimetrisch bei einer WeIler. Is.--'? von 600 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zura-.-engestellt. Die Ordinate dieser Figur zeigt die Absorptior.sdifferenzen bei den einzelnen Proben nach der Farber.tvicklung. Bei einer Standardprobe, die vollständig frei «r. human-IgG ist, ergibt sich keine Absorptionsänderung.

Tabelle I

K^Tatriumnaphthol-AS-BI-phosphat 1 0 mg

p-Diazodimethylanilin-chlorid-Zinkchlorid 30 mg

10-prozentige wässrige Magnesiumchloridlösung . 2 Tropfen

0,1 m Tris-HCL-Pufferlösung (pH-Wert =8,6) 50 ml

Beispiel 2

Eine Membran aus Polyacrylamidgel (mit einer Dicke von etwa 300 ;um) mit immobilisiertem anti-human-Albumin-Antikörper (Kaninchen) wird folgendermassen hergestellt: 25^1 einer 2,5-prozentigen wässrigen Acroleinlösung werden zu 0,5 ml einer IgG-Fraktion von anti-human-Albumin-Antiserum (mit einer?. Gehalt an 2,H mg/ml aktivem Antikörper) gegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 30 Minuten stehengelassen 'j.na sodann gegen PBS dialysiert. 1,5 ml einer Lösung von Acrylic amid mit einem Gehalt an 0,32 g/ml, 1,5 ml einer Lösung von N,N'-Methylen-bis-acrylamid mit einem Gehalt an 0,016 g/ml, 1,25 ml einer wässrigen Lösung von N,N,N',N'-Tetramethylendiamin mit einem Gehalt an H,6^uI/ml und 5,75 ml einer Lösung von Ammoniumpersulfat mit einem Gehalt an 1,2 ^mS/^ml werden zum erhaltenen Gemisch gegeben. Sodann wird das Gemisch gerührt und anschliessend in eine Membranbildungsvorrichtung aus Glas gegossen und stehengelassen. Aus der erhaltenen Membran wird ein rundes Membranstück mit einem Durchmesser von 9 mm ausgeschnitten. Dieses Membranstück wird in entsprechender Weise wie in Beispiel 1 eingesetzt. In diesem Fall wird jedoch wegen der Brüchigkeit der Polyacrylamidgelmembran mit dem immobilisierten Antikörper ein Polyesternetz mit einer Dicke von 200/Urr. in die

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Reaktionsmembran eingesetzt. Entsprechend wie in Beispiel 1 wird die mit Saccharoselösung verdünnte Humanalbumin-Standardprobe auf die Membran aufgesetzt. Anschliessend wird die Elektrophorese 30 Minuten bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird in entsprechender Weise mit Fluoreszein markiertes anti-human-Albumin-Antiserum (Kaninchen), das gernäss dem Verfahren von M. Goldman hergestellt worden ist, aufgesetzt. Die Elektrophorese wird 20 Minuten bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird die Reaktions-

IC membran entnommen und lediglich mit PBS gespült. Die Fluoreszenzintensität der Membran wird unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen. Die Anregungswellenlänge beträgt 485 nm und die Messwellenlänge 520 nrn. Das Ergebnis ist in Fig. wiedergegeben.

Beispiel 3

Eine Polyacrylamidgelmembran (mit einer Dicke von etwa 300 ijm) mit einem Gehalt an einer immobilisierten IgG-Fraktion, die gemäss Beispiel 2 aus anti-human-Choriongonadotropin-

Antiserum (Kaninchen) erhalten worden ist, wird als Reaktionsmembran verwendet. Die Standardprobe wird in entsprechender Weise wie in Beispiel 2 aufgesetzt. Ferner wird in entsprechender Weise eine mit Luminol markierte Antikörperlösung auf die Membran aufgesetzt und 30 Minuten bei 25Q V

der Elektrophorese unterworfen. Sodann wird die Reaktionsmembran entnommen, 30 Minuten in eine 0,85-prozentige NaCl-Lösung getaucht und sodann auf den Boden einer quadratischen 1 cm-Quarzküvette mit einem durchsichtigen Bodenfenster gebracht. Hierauf werden in die Küvette von oben 100 ul einer ^r

0,1 m wässrigen H_?0p-Lösung und 200 ^jI einer 10 millimolaren

Natriumhypochloritlösung in 0,1 η wässriger NaOH-Lösung zugesetzt, wodurch eine oxidative Lumineszenz des Luminols auf der Reaktionsmembran hervorgerufen wird. Die Lumineszenzintensität wird mittels eines Photonenzählers, dessen 35

Lichtaufnahmeteil sich an der Unterseite der Quarzküvette befindet, gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel H

Die Reaktionsmembran von Beispiel 3 wird in einen Membranhalter aus Acrylharz, wie er in Fig. 5 dargestellt ist, gebracht. Die Wanderung der Standardprobe und des mit lumi-

° nol markierten Antikörpers erfolgt -gemäss Beispiel 3- Jedoch wird in diesem Beispiel der Elektrolyt während der Elektrophorese kontinuierlich ausgetauscht, indem man nach und nach in das obere Elektrolytgefäss frischen Elektrolyt zusetzt und nicht umgesetztes Material und überschüssiger.

markierten Antikörper, die in der Reaktionsmembran nicht zur Umsetzung gebracht worden sind, entfernt. Das Bezugszeichen 14 bezeichnet eine Einlassöffnung und das Bezugszeichen 15 eine Auslassöffnung für den Elektrolyten. Nach der Elektrophorese des .mit Luminol markierten Antikörpers

werden der obere Elektrolyt im oberen Elektrolytgefäss', der. " -Membranhalter und der untere Elektrolyt im unteren Elektrolytgefäss entfernt. Sodann wird gemäss Beispiel 3 wässrige HpOp-Lösung und Natriumhypochloritlösung auf den Membran-.

halter aufgebracht, wodurch die Lumineszenz des Luminols '.

hervorgerufen wird. Die Lumineszenzintensität wird mit ei- nem Photonenzähler, dessen Lichtempfangsteil 12 auf der Unterseite des Elektrolytgefässes angeordnet ist, gemessen. Ähnlich wie in Beispiel 3 erhält man eine Eichkurve, die '-■*-'■

■ proportional zur zugesetzten Menge an Antigen, nämlrch '^ ' f

■

human-Choriongonadotropin, verläuft. .

Beispiel 5 ' \ '; * ί

Die gemäss Beispiel 2 hergestellte Lösung von Acrolein-antihuman-Albumin-Antikörper-Konjugat wird mit PBS auf das 100- ' '-, ^s fache Volumen verdünnt. Mit 0,5 ml der erhaltenen Lösung wird gemäss Beispiel 2 eine Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem Antikörper hergestellt. Daraus wire ein , rundes Membranstück mit einem Durchmesser von 9 mm ausge- j schnitten und als Reaktionsmembran verwendet. Die Reaktions-rmembran wird in die Vorrichtung von Beispiel 2 gelegt. Nae'i

^Aufsetzen einer Standardprobe von Humanalbumin wird 45 Mi- J nuten eine Elektrophorese bei einer Spannung von 100 V durch- I

geführt. Anschliessend wird eine gemäss dem Verfahren von M. Goldman hergestellte Lösung von mit Fluorescein markiertem Humanalbumin, die mit einem gleichen Volumen an 40-prozentiger Saccharose lösung verdünnt worden ist, aufgesetzt. Dann wird die Elektrophorese 45 Minuten bei 100 V durchgeführt. Anschliessend wird die Reaktionsmembran entnommen und 5 Minuten in PBS getaucht. Die Fluoreszenzintensität wird gemäss Beispiel 2 mittels eines Fluorimeters gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 6 dargestellt.

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Beispiel 6 "T" .- ^v~ '

Verschieden dicke Polyacrylamidgelmembranen mit anti-human-Albuminantikörper werden durch Variation der Bedingungen bei der Membranbildung hergestellt. Die Zusammensetzung des Gels entspricht der von Beispiel 2. Die Dicken der erhaltenen Gelmembranen betragen 20 bis 200 /xm. Es werden jeweils runde Membranstücke von 9 mm Durchmesser aus der Gelmembran ausgeschnitten und in die Vorrichtung von Beispiel 1 eingesetzt. Anschliessend werden 10 iil der Lösung von mit Fluores-

cein markiertem anti-human-Albumin-Antiserum, die mit einer gleichen Menge an 40-prozentiger Saccharoselösung verdünnt worden ist, aufgesetzt. Die Elektrophorese wird Ί Stunde bei einer Spannung von 250 V durchgeführt. Sodann wird die erhaltene Membran entnommen und kurz mit PBS gespült. Die ■ Menge an mit Fluorescein markiertem Antikörper wird fluorimetrisch gemessen. Es ergibt sich, dass die verbleibende Fluoreszenz an Membranen mit einer Dicke von mehr als 1000 ,./itn ermittelt werden kann, wobei aber die Entfernung von Fluoreszenz hervorrufenden Bestandteilen nur bei Membranen ' ■ ....

mit einer Dicke von 1000 ^m oder weniger besonders gut ab

läuft. Ferner sind Membranen mit einer Dicke unter 100 ,,um brüchig und schwer handzuhaben. Somit beträgt die Dicke der Polyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem Antikörper vorzugsweise 100 bis 1000

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Beispiel 7

Man verfährt hinsichtlich der Reaktionsmembran, der Vorrichtung, der Reagentien und des Messverfahrens wie in Beispiel 2, variiert aber die Spannung bei der Elektrophorese in geeigneter Wei se von 20 bis 1500 V. Übersteigt die Spannung 1000 V, ergibt sich eine geringe Fluoreszenzintensität, und eine günstige Eichkurve lässt sich nicht auf stellen .--Andererseits erhält man auch bei einer Spannung unter 50 V keine günstige Eichkurve, da die Restmenge an Fluoreszenz hervorrufenden Bestandtei-¹^ len gross ist und somit ein starker Hintergrund entsteht. Im Bereich von 50 bis 1000 V lassen sich gute Eichkurven aufstellen, bei denen die Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration an zugesetztem Humanalbumin ist.

Beispiel 8 -

Gemäss Beispiel 5 wird eine Reaktionsmembran aus einer ?olyacrylamidgelmembran mit immobilisiertem anti-humar.-Alburnin-Antikörper hergestellt. Der Immunoassay auf Humanalbumin ■ _on wird nach der Kompetitivmethode durchgeführt.

Eine Probe, die durch Zusatz einer gleichen Menge an mit Fluorescein markiertem Albumin zur Humanalbumin-Standarcprobe hergestellt worden ist, wird gemäss Beispiel 5 ^5 Minuten der Elektrophorese bei 'einer Spannung von 100 V" unterworfen. Die Markierung mit Fluorescein erfolgt dabei gemäss dem Verfahren von M. Goldman. Nach der Elektrophorese wird die Reaktionsmembran entnommen und lediglich mit P3S gespült. Die Fluoreszenzintensität der Membran wird fluorimetrisch gemessen.* Die übrigen Messbedingungen entsprechen' denen von Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 zusammengestellt. ■■""..

Wie vorstehend erläutert, kann gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren die Reaktionszeit, die bei Antigen-Antikörper-Reaktionen von herkömmlichen Immunoassays 3 oder k Stunden bis zu 1 Tag beträgt, auf 1 Stunde verkürzt werden. Selbst-

BADORIGINAL

verständlich hängt beim erfindungsgemässen Verfahren die erforderliche Reaktionszeit von der Art der Reaktionsmembran, der Dicke der Reaktionsmembran, der Wasserstoffionenkonzentration und der Ionenstärke-der bei der Elektrophorese verwendeten Elektrolyten, der angelegten Spannung'und dergleichen ab. Beispielsweise beträgt die Dicke der Polyacrylamidgelmerabran mit immobilisiertem Antikörper in Beispiel 2 etwa 300 ^m. Bei Verwendung von entsprechenden dünneren Membranen kann die erforderliche Reaktionszeit bei gleicher Spannung weiter verkürzt werden.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass sich im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays eine weitere Vereinfachung ergibt. Erfindungsgemäss wandern nicht umgesetztes Material und überschüssiger markierter Antikörper durch die Reaktionsmembran in das untere Elektrolytgefäss. Daher kann ein Waschvorgang mit Wasser, der bei herkömmlichen, auf einer Festphasenreaktion beruhenden Irnmunoassays erforderlich ist, entfallen.^ .

Die vorstehend geschilderten beiden Vorteile ermöglichen die Bereitstellung von vollkommen automatisierten Vorrichtungen zur Durchführung von Immunoassays. Schwierigkeiten, . .die sich aufgrund ,langer Reaktionszeiten und schwieriger Verfahrensdurchführung ergeben und die bei herkömmlichen Immunoassays als Hinderungsgründe für eine Automatisierung angesehen werden, lassen sich erfindungsgemäss gleichzeitig beseitigen. ...-■■_ _ ■·...:■■■ "■>,.'■:-. ■ . .;

30. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die erforderliche Menge an markiertem Antigen 10 ul oder weniger beträgt, was zu einer Senkung Ger Analysenkosten beiträgt.

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Claims

PATENT- UND RFCHTSAN\VÄLT£ f ' BARDEHLE, PAGENBERG. DCS Γ. -ALT EN B U P-G ^ PARTNER RECHTSANWÄLTE PATENTANWÄLTE - EUROPEAN PATENT A^TO R N Ξ ν-J JOCHEN PAGENBERG DR jur ll μ harvard HEINZ BARDEHLE dipl ing BERNHARD FROHWITTER dipl ing WOLFGANGA DOST DR dipl -chem GUNTER FRHR. v. GRAVENREUTH dipl -ing <fh> UDO W ALTENBURG dipl -phvs POSTFACH S606 20. 8000 MÜNCHEN S?· Λ / O Q O "7 "7 TELEFON (0 BQ) 08 0361 O H £.<J O I I TELEX5 22 791 pad d CABLE PADBUROMUNCHEN BÜRO: GALILEIPLATZ 1. 8 MÜNCHEN ?.~ Datum 9. August 1984 A 5678 Patentansprüche

1. Immunoassay zur Messung der Konzentration eines Antigens in einer Probe durch Fixieren des Antigens mit einem immobilisierten Antikörper durch Antigen-Antikörper-Reaktion, gekennzeichnet durch folgende Schritte

(a) einen Schritt, bei dem der Antikörper im gesamten Be- f reich einer wirksamen Trägermatrix für Elektrophorese- < zwecke immobilisiert wird,

(b) einen Schritt, bei dem die Antigen-Antikörper-Reaktior. mit dem immobilisierten Antikörper im Verlauf einer elektrophoretischen Wanderung des Antigens der zumessenden Probe hervorgerufen wird, um das Antigen zu fixieren,

(c) einen Schritt, bei dem man markierten Antikörper elektrophoretisch zum fixierten Antigen wandern lässt, um ihn mit dem Antigen umzusetzen, oder markiertes Antigen elektrophoretisch in einen nicht umgesetzten Bereich des immobilisierten Antikörpers wandern lässt, um es mit dem Antikörper umzusetzen, und

(d) einen Schritt zur Messung der Konzentration des

markierten Antikörpers oder markierten Antigens in der Probe. -

2. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die den immobilisierten Antikörper tragende Matrix membranähnlich ist.

3· Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Membran der den immobilisierten Antikörper tragenden Matrix um eine poröse Celluloseacetatmembran handelt.

4. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der den immobilisierten Antikörper tragenden Matrix um eine Polyacrylamidgelmembran handelt.

5. Immunoassay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Polyacrylamidgelmembran mit dem immobilisierten Antikörper durch vernetzende Polymerisation von Acrolein, an das vorher ein Antikörper gebunden worden ist, mit einem Acrylamidmonomeren und einem N,N'-Methylen-bis-acrylamidmonomeren erhalten worden ist.

6. Immunoassay nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Potentialgradienten in vertikaler Richtung zur Oberfläche der den immobilisierten Antikörper tragenden Matrixmembran anlegt und das Antigen, den markierten Antikörper und das markierte Antigen der Elektrophorese in dieser Richtung unterwirft.

7. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsmaterial für den markierten Antikörper oder das markierte Antigen aus der Gruppe Enzyme, fluoreszierende Substanzen und Luminol ausgewählt ist.

8. Immunoassay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Polyacrylamidgelmembran mit dem immobilisierten Antikörper 100 bis 1000 ^m beträgt.

ι I

9- Immunoassay nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass

man bei der Elektrophorese des Antigens, des markierten Antikörpers und des markierten Antigens eine Spannung von 50 bis 1000 V anlegt.

ι-

10. Immunoassay nach Anspruch 2, "dadurch gekennzeichnet, dass man den Elektrolyten in der Elektrophoreserichtung kontinuierlich bei der Stufe der Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion während der Durchführung der Elektrophorese austauscht.

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