DE68911674T2

DE68911674T2 - Testverfahren und reagenzsatz dazu.

Info

Publication number: DE68911674T2
Application number: DE89901546T
Authority: DE
Inventors: Egil Olsen; Orjan Olsvik
Original assignee: Nycomed Pharma AS
Current assignee: Axis Shield PoC AS
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: US5616467A; FI92883B; DK164690D0; EP0398913A1; NO903124D0; DK172179B1; JPH03502244A; DK164690A; EP0398913B1; US5556756A; JP2701949B2; NO301193B1; AU2935989A; CA1336393C; NO903124L; FI903515A0; ATE99060T1; GB8800702D0; DE68911674D1; AU614109B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten (= zu analysierende Substanz) in einem wäßrigen Medium.
Die Detektion und/oder der Assay von Analyten unter Verwendung von Immunoassay-Techniken ist bekannt, insbesondere in Bezug auf Proteine, wie Antigene und Antikörper, sowie auf Zucker, Lectine und Nucleinsäuren. Jedoch sind viele bekannte Techniken zwar von hoher Sensitivität, aber oft arbeitsaufwendig, da sie eine Anzahl von Stufen benötigen, die jeweils eine lange Zeit in Anspruch nehmen können. Es hat sich jedoch erwiesen, daß es möglich ist, einige dieser Assays zu vereinfachen, indem man eine der Komponenten des Assay-Systems an einem festen Träger immobilisiert, da dies die Entfernung von überschüssigen Reagenzien erleichtert. Diese Assays beinhalten normalerweise die Verwendung eines markierten Makromoleküls, das der Analyt selbst oder ein Bindungspartner für den Analyten sein kann und das eine geeignete Markierungssubstanz, wie ein Radioisotop, ein Fluorophor oder ein Enzym, das eine charakteristische Reaktion auslöst, trägt.
Eine vorgeschlagene Vereinfachung besteht darin, eine farbige Substanz zu verwenden, die als sichtbarer Marker an einen der Immunoassay-Reaktionspartner gebunden ist. Jedoch sind nur sehr wenige farbige Substanzen in der Lage, ein ausreichend intensives Signal zu produzieren. US-Patent 4 313 734 von Akzona Inc. beschreibt die Verwendung von, neben anderen, kolloidalem Gold als farbigem Material, und führt auf, daß die Goldpartikel eine Partikelgröße von mindestens 5 Nanometern, vorzugsweise von 10 bis 100 nm, besitzen sollen.
Die Erfinder des Akzona-Patentes haben weiterhin mehrere Artikel veröffentlicht, die betonen, daß größere Partikel bevorzugt sind. So beschreiben Leuvering et al., (J. Immunoassay, 1, 77-91, 1980) die Verwendung von kolloidalem Gold mit 60 nm; diese Veröffentlichung steht in engem Zusammenhang mit der Offenbarung des Patentes und stellt fest, daß nur bei höherer Antigen-Konzentration die produzierte Farbe mit bloßem Auge wahrgenommen werden kann. Dies stimmt mit einer Methode überein, bei der das Gold in die Lösung extrahiert wird.
Dieselben Erfinder (Leuvering et al., J. Immunol. Meth. 45 183-194, 1981; und 62, 175-184, 1983) haben beschrieben, wie Antikörper und Antigene Metall-Sole in Lösung agglutinieren können, wodurch Veränderungen der Absorptions-Maxima und der Extinktions-Koeffizienten verursacht werden. Gold-Kolloide im Bereich von 40 bis 80 nm wurden getestet, und 50 nm wurden als optimal bestimmt.
Diese Erfinder haben weiterhin einen Sandwich-Assay mit Gold- Kolloiden beschrieben (J. Immunol. Meth. 62, 175-184, 1983). Gold-Kolloide im Bereich von 25 bis 70 nm wurden ausprobiert, und 55 nm wurden als optimal bestimmt. Dieser Assay basiert auf dem gewöhnlichen Platten-Immunoassay und ähnelt den im US- Patent 4313734 erwähnten Beispielen.
Gribnau et al. haben in einem Review (J. Chromatography, 376, 175-189, 1986) die Techniken diskutiert, die kleine Partikel in Immunoassays verwenden. Das Kapitel über kolloidales Gold beschreibt mehrere Methoden, erwähnt aber nur Gold mit einem Durchmesser von 50 nm.
Die europäische Patentanmeldung 0 158 746 A von Janssen Pharmaceutica N. V. betrifft "blotting overlay"-Techniken, die zum Assay von Substanzen in Komplex-Gemischen verwendet werden können. Dieses Patent beschreibt unter anderem die Verwendung von kolloidalem Gold, das mit Komponenten komplexiert ist, die mit entsprechenden Bindungs-Komponenten an einem festen Träger reagieren. Dieses Patent betont jedoch die spezielle Eigenart von "blotting overlay"-Assays im Vergleich zu Assays mit Analyten in wäßriger Lösung. Während es auf die Verwendung von Gold- oder Silberpartikeln mit einem Größenbereich von 3 bis 100 nm hinweist, werden Partikel-Größen im Bereich von 5 bis 50 nm als bevorzugt ausgewiesen, und die Beispiele offenbaren nur 20nm-Partikel. Es gibt keine Lehre über die Vorteile der Verwendung von Goldpartikeln, die zu 75 % einen Durchmesser unterhalb 5 nm besitzen oder über die gegenwärtige Verwendung solcher Partikel.
Surek und Latzko (Biochem. Biophys. Res. Comm. 121, 284-289, 1984) beschreiben die Verwendung von kolloidalem Gold von 5 nm und 15 nm bei einer bestimmten Blot-Technik von Elektrophorese- Gelen. Während die Autoren zwar herausfanden, daß 5nm- Goldpartikel eine schärfer gefärbte elektrophoretische Proteinbande als 15nm-Goldpartikel lieferten, berichteten sie weder über die intensivere Gesamt-Färbung noch über die schnellere Reaktion, die wir beobachtet haben.
Baschong et al. (Histochemistry, 1985, 83(s) 409-II) offenbaren die Verwendung eines kolloidalen Gold-Reagenzes zur Gewebefärbung bei der Elektronenmikroskopie, wobei die Partikelgröße der Goldpartikel homogen 2,6 nm beträgt. Die Elektronenmikroskopie beruht jedoch auf den Eigenschaften der Elektronenstreuung der Goldpartikel, und jeder Vorteil von kleinen Partikeln in diesem Zusammenhang ist nicht von Bedeutung für die Entwicklung einer intensiven Farbe, die visuell oder unter Verwendung eines einfachen Spektrometers untersucht werden kann.
Es ist behauptet worden, daß größere Goldpartikel, die mit dem Imunoassay-Reaktionspartner beschichtet sind, den Vorzug hätten, relativ große Mengen der Markierungssubstanz an den Analyten oder einen anderen Reaktionspartner zu binden. Unsere Experimente haben jedoch gezeigt, daß bei der Verwendung von Goldpartikeln mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm in einem Festphasen-Assaysystem die Reaktionsgeschwindigkeit im Immunoassay in bestimmten Fällen erhöht ist und die Intensität des immobilisierten Gold-Sols überraschenderweise größer ist, als bei der Verwendung von größeren Goldpartikeln.
Erfindungsgemäß stellen wir eine Methode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung bereit, die einen spezifischen Bindungs-Assay für einen Analyten in einer Testprobe beinhaltet, wobei ein Reagens, das ein Gold-Sol umfaßt, das an eine Substanz gebunden ist, die in der Lage ist, spezifisch an den Analyten oder an einen dafür spezifischen Bindungspartner zu binden, in gebundener Form an einer festen Phase immobilisiert wird, um eine Anzeige der Anwesenheit oder der Menge der zu analysierenden Substanz in der Probe zu ermöglichen durch Detektion der Präsenz oder der Intensität der Farbe eines immobilisierten Gold-Sols, die dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens 75 Gewichts-% der Goldpartikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm und nicht weniger als 3 nm besitzen.
Bei vielen Arten von Festphasen-Assays ist es vorteilhaft, ein Analyt-Analogon oder einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten an einen festen Träger zu binden, um die Festphase bereitzustellen, an der das markierte Reagens immobilisiert wird. Daher stellen wir als einen weiteren Aspekt der Erfindung eine Methode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe bereit, worin die Probe in einem wäßrigen Assay-Medium in Kontakt gebracht wird mit (i) einem Analyt-Analogon oder einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten, immobilisiert an einem festen Träger, und (ii) mit einem markierten Reagens, umfassend ein Gold-Sol, das mit einem Molekül verbunden ist, welches in der Lage ist, spezifisch den Analyten oder einen hierfür spezifischen Bindungspartner zu binden, wobei eine Menge des Gold-Sol- Reagenzes an diesem Träger immobilisiert wird, wobei die Untersuchung oder Bestimmung seiner Farbe dazu verwendet wird, die Präsenz oder die Menge der zu analysierenden Substanz in der Probe anzuzeigen, und wobei mindestens 75 Gewichts-% der Goldpartikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm und nicht weniger als 3 nm besitzen.
Die Festphase, an der das markierte Reagens immobilisiert wird, kann alternativ dazu inert sein und die gebundene Form des markierten Reagenses immobilisieren, indem dieses physikalisch festgehalten wird, d.h. indem die gebundene Form des markierten Reagenzes nicht durch die Poren der Festphase wandern kann, während das ungebundene, markierte Reagens durch diese Poren wandern kann.
Der Ausdruck "Analyt-Analogon", wie hier verwendet, soll so verstanden werden, daß er sich auf jede Substanz bezieht, die in der Lage ist, spezifisch an einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten des Assays zu binden, und er beinhaltet damit eine weitere Quantität des Analyten.
Wie oben gezeigt, besitzt das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil einer schnelleren Reaktion des Gold-Sol-Reagenses mit dem immobilisierten Reaktionspartner, was sich in einer kürzeren Inkubationsdauer zeigt. Weiterhin ist die Intensität der Farbe des Gold-Sols überraschenderweise in Systemen erhöht, in denen das Reagens durch den unlöslichen Membran-Träger filtriert wird. Dies kann ein anderer Vorteil im Zusammenhang mit einer schnelleren Reaktion sein.
Der mittlere Durchmesser eines Partikels, das nicht völlig sphärisch sein muß, ist das Mittel des größten und kleinsten Durchmessers des Partikels. Es ist insbesondere bevorzugt, daß mindestens 80 Gewichts-% der Goldpartikel einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm besitzen. Bestimmte Chargen des Produktes Colloidal Gold Sol G5 von Janssen Life Sciences Products, das zur Verwendung als histologisches Färbemittel verkauft wird, haben sich als nützlich erwiesen. In einer bestimmten Charge besaßen 85 % der Partikel einen Durchmesser von weniger als 5 nm, wobei der durchschnittliche Durchmesser 4,5 nm, mit einer Gauß-Verteilung zwischen 1,1 und 7,6 nm, betrug. Gold-Sole mit durchschnittlichen Durchmessern im Bereich von 2 bis 4 nm können weiterhin bequem durch leichte Modifikationen bekannter Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch Variation der Gerbsäure-Konzentration im Verfahren von Slot und Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38, 87-93, 1985). Wir haben gefunden, daß Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 4 bis 4,5 nm zu bevorzugen sind, da kleinere Partikel (das sind Partikel kleiner als etwa 3 nm) während der Waschschritte nicht so gut sedimentieren.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß es in etwa eine 1:1-Stöchiometrie zwischen den Gold-Sol-Partikeln mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm und den Antikörpern gibt, an die sie binden können. Dieses stöchiometrische Verhältnis erhöht sich auf mehr als ein Goldpartikel pro Antikörper, wenn der mittlere Durchmesser der Partikel weniger als 3 nm beträgt. Diese näherungsweise 1:1-Beziehung kann teilweise für die günstigere Reaktionskinetik der kleineren Partikel verantwortlich sein, verglichen mit Partikeln des Standes der Technik mit einer großen Anzahl Antikörpern pro Goldpartikel. Obwohl ein hohes Verhältnis von Antikörpern zu Goldpartikeln mit Partikeln einer Größe, wie von Leuvering et al. (siehe oben) vorgeschlagen, erreicht werden kann, kann die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen die Verfügbarkeit der anderen Antikörper auf dem Partikel zur Bindung anderer Antigen-Moleküle übermäßig beeinflussen.
Die vorliegende Methode kann auf jedes Festphasen-System zur Detektion oder für ein Assay von Analyten angewendet werden. Die folgenden Assay-Typen sind typisch:
1. Ein Sandwich-Assay, in dem Verbindung A an einen festen Träger gebunden wird. Die Testlösung mit dem Analyten B wird zugegeben, wobei B an A bindet. Die Gold-markierte Verbindung C wird zugegeben, und da C an B bindet, wird das kolloidale Gold immobilisiert und färbt den festen Träger.
Die Verbindungen A, B und C gehören alle zu den Rezeptor- Ligand-Typen, bei denen sowohl A als auch C mit B wechselwirken, während A und C nicht direkt aneinander binden.
2. Ein Sandwich-Assay wie in 1, mit der Maßgabe, daß die Testlösung mit dem Analyten B und die Gold-markierte Verbindung C vermischt werden und das Gemisch zu dem festen Träger gegeben wird, an den die Verbindung A gebunden ist.
3. Ein kompetitiver Assay, bei dem die Verbindung A an einen festen Träger gebunden ist. Die Testlösung mit dem Analyten B wird mit einer bekannten Menge des Goldmarkierten Analyten B vermischt und zu dem festen Träger gegeben. B und Gold-markiertes B werden um die Bindung an A konkurrieren, und eine Reduktion der Farbe des kolloidalen Goldes an dem festen Träger zeigt steigende Mengen des Analyten B in der Testlösung an.
4. Ein kompetitiver Assay wie in 3, aber mit aufeinanderfolgender Zugabe der Testlösung und des Goldmarkierten B.
5. Ein Überschuß der Verbindung A wird mit kolloidalem Gold markiert und mit einer Testlösung vermischt, die eine unbekannte Menge des Analyten B enthält. A und B binden dann aneinander. Das Gemisch wird zu einem porösen Träger gegeben, an dem die Verbindung B immobilisiert ist. Überschüssiges, ungebundenes, markiertes A bindet dann an das an dem festen Träger immobilisierte B.
6. Man läßt den Analyten B mit einer Gold-markierten Verbindung C reagieren, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren anderen Bindungspartnern für den Analyten B, um ein komplexes Aggregat zu bilden. Man läßt das Reaktionsgemisch durch ein inertes Filter-Medium diffundieren, dessen Poren so klein sind, daß sie das komplexe Aggregat nicht hindurchwandern lassen, aber so groß sind, daß sie überschüssige, Gold-markierte Verbindung C hindurchwandern lassen.
Die feste Phase oder der Träger, woran man das markierte Reagens immobilisiert, kann verschiedene Formen annehmen, wobei die folgenden beispielhaft sind:
- Ein Plastikstab, gegebenenfalls beschichtet mit Auflagen aus einem porösen Material. Der Stab kann in die Reaktions-Lösung getaucht werden, um die verschiedenen Stufen eines Assays durchzuführen.
- Die Wand eines Teströhrchens, eine Kavität einer Mikrotiterplatte oder die Wand einer anderen, geeigneten Reaktionskammer.
- Ein poröses Material, geeigneterweise eine Membran, durch das die Reaktionslösungen transversal oder lateral diffundieren können. Für den Fall, daß man das Filtrations-Prinzip verwendet, erlauben solche Materialien vorteilhafterweise, daß überschüssiges Reagens hindurchwandern kann und sie können bequem mit einem Absorbens für solche überschüssigen Flüssigkeiten kombiniert werden.
- Perlen (einschließlich Mikrosphären), die isoliert werden können durch Zentrifugation, Filtration oder, wenn die Perlen ferromagnetische Verbindungen beinhalten, durch Magnetismus.
Die Bindung des Analyt-Analogons oder eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten des Assays an den Träger kann durch covalente, elektrostatische oder hydrophile Mittel oder durch eine Kombination dieser Verfahren erfolgen. Solche Verfahren gehören zum Stand der Technik.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Detektion oder zum Assay einer großen Zahl von Analyten verwendet werden, die z. B. ausgewählt werden können unter den folgenden Ligand- Rezeptor-Paaren: Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper, Hormon/Hormonrezeptor, Zucker/Lectin, Biotin/Avidin (Streptavidin), Protein A/Immunglobulin, Enzym/Enzym-Cofaktor, Enzym/Enzym-Inhibitor und Nukleinsäure-Paare (DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-DNA). Mindestens einer dieser Reaktionspartner kann an andere Moleküle gebunden oder mit diesen komplexiert sein. So können Biotin oder Avidin oder eine große Zahl von Antikörpern an andere Moleküle gebunden werden, um eine Möglichkeit des Assays für letztere bereitzustellen. Zum Beispiel kann eine spezifische Nukleinsäure-Sonde durch die Einfügung von biotinylierten Nukleosidtriphosphaten markiert werden. Diese Sonde kann nach Bindung an die Analyten-DNA oder -RNA unter Verwendung von Avidin oder Streptavidin, die mit einem Gold-Sol markiert sind, detektiert oder untersucht werden.
Im allgemeinen wird, wenn der Analyt zu den oben aufgelisteten zählt, ein Bindungspartner des erfindungsgemäßen Verfahrens die andere Verbindung des Paares sein. In Sandwich-Systemen, worin der Analyt sowohl an einen immobilisierten Bindungspartner als auch an einen mit Gold-Sol markierten Bindungspartner bindet, können die Bindungspartner gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise werden die Bindungspartner jeweils ein Antikörper- Reagens sein, das gegen verschiedene, getrennte Determinanten des Analyten gerichtet ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" ist so zu verstehen, daß er beinhaltet
(a) eine der verschiedenen Klassen oder Subklassen von Immunglobulinen, z. B. IgG, IgM, die von einem der gewöhnlich verwendeten Tiere stammen;
(b) monoklonale Antikörper; und
(c) Fragmente von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die eine Antigen-Bindungsstelle bewahrt haben, z. B. Fragmente ohne den Fc-Teil (z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sogenannten "Halbmolekül"-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schweren Ketten des intakten Antikörpers verbinden, erhalten werden.
Untenstehend ist eine nicht-abschließende Liste der Immunogen- Typen angegeben, die durch das erfindungsgemäße Verfahren detektiert oder quantifiziert werden können.
Proteine Glycoproteine
Nukleoproteine Peptid-Hormone
Serumproteine Komplement-Proteine
Coagulationsfaktoren Mikrobiozide Produkte
Virale Produkte Bakterielle Produkte
Fungische Produkte Spezifische Immunogene
Albumin Angiotensin
Bradykinin Calcitonin
Carcinoembryonisches Antigen Chloriomamotropin
Chorogonadotropin Cortiocotropin
Erythropoietin Faktor VIII
Fibrinogin alpha-2-H-Globulin
Follitropin Gastrin
Gastrinsulfat Glucagon
Gonadotropin Haptoglobin
Hepatitis B Oberflächen-Antigen Immunglobuline (A,D,E,G,M)
Insulin Lipotropin
Kallidin
Melanotropin Oxytocin
Pancreomyzin Placentales Lactogen
Prathryin Proangiotensin
Prolactin Somatotropin
Relaxin Secretin
Somatomadin Somatostatin
Thryrotropin Vasotocin
Thymopoietin Vasopressin
alpha-1-Fetoprotein alpha-2-H-Globulin
Besonders interessante Analyte für einen Assay nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Blut-Proteine wie Fibrin- Abbauprodukte, z. B. D&sub2;, die durch Immunglobuline wie IgG gebunden werden, und humanes C-reaktives Protein.
Die Analyt-Lösung kann direkt verwendet werden oder kann z. B. mit einer geeigneten Puffer-Lösung verdünnt werden. Die Gold- Sol-Präparation kann weiterhin unter Verwendung einer geeigneten Puffer-Lösung in verschiedenen Verdünnungen hergestellt werden, wobei die Verdünnungen so ausgewählt werden, daß sie am Ende des Assay-Verfahrens eine Farbe von gewünschter Intensität (d. h. optische Dichte oder Reflektion) ergeben. Um eine Hintergrundfarbe zu reduzieren, kann es erwünscht sein, daß man den Träger zur Entfernung von überschüssigem Reagens wäscht, z. B. mit einer Puffer-Lösung vor Beginn des Assays.
Falls der Assay auf der Gesamtmenge des Gold-Sols, das auf dem immobilisierten Träger zurückgehalten wird, basiert, kann die Farbe mit einem Reflektometer, einem Densitometer oder einer ähnlichen Einrichtung abgeschätzt werden.
Der zur Immobilisierung eines der Bindungspartner im Assay oder eines Analyt-Analogons verwendete Träger kann z. B. Nitrocellulose, Papier oder Celluloseacetat, aktiviert mit Reagenzien wie Cyanbromid, und Nylon, modifiziert durch Einführung von tertiären Aminogruppen, sein. Diese Träger werden gewöhnlich in Form von porösen Membranen verwendet.
In einem besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist der inerte Träger eine Membran, z. B. eine Nylon-Membran wie Hybond N (verkauft durch Amersham International), das leicht Proteine adsorbiert und das Poren besitzt, die den Durchtritt von Flüssigkeiten erlauben. Eine adsorbierende Auflage, wie Cellulose-Blot-Papier, wird vorteilhafterweise auf einer Seite der Membran plaziert, und ein vorzugsweise weißes, flüssigkeitsundurchlässiges Blatt wird über die Auflage gelegt. Ein ähnliches, flüssigkeitsundurchlässiges Blatt wird über die andere Seite der Membran gelegt. Dieses Blatt ist mit einem Loch, z. B. etwa 3,5 mm breit, versehen, um das Auftragen einer Analyt-Lösung und von Assay-Flüssigkeiten auf die Membran zu ermöglichen. Zu Beginn wird die Membran durch Auftragen eines kleinen Volumens, z. B. etwa 2 ul, einer wäßrigen Lösung, die eine bekannte Menge eines Bindungspartners für den Analyten enthält, aktiviert und anschließend getrocknet, z. B. indem man sie bei Raumtemperatur trocknen läßt. Man appliziert dann ein bekanntes Volumen der den Analyten enthaltenden, wäßrigen Lösung, z. B. etwa 25 ul, auf die Membran und läßt es in die darunter liegende absorbierende Auflage hindurchwandern. Dann appliziert man eine wäßrige Lösung, z. B. 25 ul, die eine bekannte Menge von kolloidalen Gold-Sol-Partikeln enthält, die mit einem Bindungspartner für den Analyten markiert sind, und läßt sie durch die Membran wandern.
Man kann gegebenenfalls ein kleines Volumen Wasser oder Puffer applizieren, um das Gold-Sol-Reagens zu waschen und somit die Hintergrundfarbe zu minimieren. Die Menge des auf der Membran immobilisierten Gold-Sols wird dann mit einem Reflektometer oder mit dem bloßen Auge durch Vergleich mit einer Farbskala bestimmt.
Bei der oben dargelegten Verfahrensmethode (6) kann die Membran ein blattförmiges Material der gewünschten Porosität sein, das sich insoweit inert verhalten kann, als es seine einzige Aufgabe ist, als Filter zu wirken. Die Aggregation des Analyten mit der Verbindung C kann dadurch verstärkt werden, daß 2 oder mehr verschiedene Bindungspartner für den Analyten einbezogen werden, um eine Form der Vernetzung zu bewirken, die zu größeren Aggregaten führt. Alternativ kann die Verbindung C einen an Perlen, z. B. monodispersen Perlen wie Dynospheres (Dyno Particles AS, Oslo, Norwegen), immobilisierten Bindungspartner für den Analyten umfassen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, umfassend (a) eine feste Phase, an der ein markiertes Reagens immobilisiert wird, um eine Indikation der Präsenz oder der Menge des Analyten in der Probe zu ermöglichen, und (b) ein markiertes Reagens, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das markierte Reagens ein Gold-Sol umfaßt, das an eine Substanz gebunden ist, welche in der Lage ist, spezifisch an den Analyten oder einen hierfür spezifischen Bindungspartner zu binden, wobei mindestens 75 Gewichts-% der Goldpartikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm und nicht weniger als 3 nm besitzen. Eine bevorzugte Form des Kits umfaßt (a) einen festen Träger zur Immobilisierung eines Analyt-Analogons oder eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten oder eines Komplexes des Analyten mit einem oder mehreren anderen Reagenzien, (b) dieses Analyt-Analogon oder einen Bindungspartner und (c) ein Reagens, umfassend ein Gold-Sol, das an ein Molekül gebunden ist, welches in der Lage ist, spezifisch an den Analyten oder einen hierfür spezifischen Bindungspartner zu binden, wobei mindestens 75 % der Partikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm besitzen. Gegebenenfalls kann die in dem Kit enthaltene feste Phase ein fester Träger sein, der so vorbereitet ist, daß er vom Anwender mit dem Analyten in Kontakt gebracht werden kann, indem zunächst ein Analyt-Analogon oder ein spezifischer Bindungspartner für den Analyten an den Träger gebunden wird. Bei einigen Assays beinhaltet dieser Kit eine Standardmenge des Analyten, eine Standardmenge eines spezifischen Bindungspartners dafür und das Gold-Sol-Reagens. Standardmengen des Analyten oder des spezifischen Bindungspartners oder des Reagenzes können in Form von wäßrigen Lösungen oder, häufiger, in Form von lyophilisierten Präparationen, die zum Anwendungszeitpunkt als Lösung zubereitet werden, vorliegen. In einer Form des Assays kann der feste Träger eine inerte, poröse Membran sein, die dazu dient, einen Komplex des Analyten und eines Bindungspartners in aggregierter Form zurückzuhalten, die aber die Diffusion des Gold-Sol-Reagenzes erlaubt, wie oben in Methode 6 beschrieben. In diesem System kann die Größe des Analyt-Komplexes dadurch erhöht werden, daß der Bindungspartner oder das Analyt-Analogon, verbunden mit relativ großen Partikeln, z. B. den oben erwähnten Dynospheres, bereitgestellt wird.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Erläuterung gegeben:

BEISPIEL 1

Kolloidale Goldpartikel

Partikel mit einer dokumentierten mittleren Größe von weniger als 5 nm wurden von Janssen Pharmaceuticals gekauft. Die durchschnittliche Größe der Partikel wurde unter Verwendung eines Sub-Mikron-Partikelanalysators Modell A4 von Coulter zu 4,5 nm, mit 85 % der Partikel weniger als 5 nm, bestätigt.
Die Partikel wurden unter Verwendung des von Slot und Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38: 87-93, 1985) beschriebenen Verfahrens mit einem Maus-monoklonalen IgG mit Spezifität für D&sub2;, einem Abbauprodukt von Fibrinpolymeren, markiert. Die Dichte der Partikel-Lösung wurde unter Verwendung eines Puffers reguliert; eine 1:20-Verdünnung sollte eine optische Dichte von 2,0 bei 580 nm ergeben.

Test-Vorrichtung

Ein 1x1 cm großes Stück Nylon-Membran (Hybond N von Amersham mit einer Porengröße von 450 nm) wurde unter einen Streifen weißes Polyvinylchlorid (PVC), 0,28 mm dick und mit einem über der Membran zentrierten, 3,5 mm großen Loch, gelegt. Die Membran wurde unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebandes an dem Kunststoff befestigt. Der PVC-Streifen mit der befestigten Membran wurde dann an einer 1 mm dicken Auflage von Cellulose-Blot-Papier (Schleicher & Schuell) an der Klebeband- Fläche, die nicht von der Membran bedeckt war, befestigt. Die Vorrichtung wurde darunter durch einen anderen Streifen PVC, 0,40 mm dick, der unter Verwendung von doppelseitigem Klebeband an der Auflage befestigt wurde, abgeschlossen. Diese Konstruktion ermöglicht es einer Flüssigkeit, durch das Loch in dem oberen PVC-Streifen und durch die Membran zu wandern und sich in der Auflage anzusammeln.

Aktivierung der Membran

Die Membran wurde durch Zugabe von 2 ul einer Lösung von 3,6 mg/ml eines zweiten Maus-monoklonalen IgG, der gegen D&sub2; gerichtet war, aktiviert. Man ließ die Membran in der Vorrichtung vor ihrer Verwendung bei Raumtemperatur trocknen.

Durchführung des Testes

25 ul Plasma, das möglicherweise D&sub2; enthielt, oder Plasma, das mit gereinigtem D&sub2; angereichert worden war, wurde auf die Membranoberfläche der Test-Vorrichtung appliziert. Nach etwa einer Minute war die Lösung durch die Membran und in die Auflage gewandert. 25 ul der Gold-Lösung wurden dann auf die Membran gegeben. Nachdem diese hindurchgewandert war, resultierte die Präsenz von D&sub2; in der Probe in einer rötlichen Farbe des Goldes auf der Membran. Die Intensität der Farbe wurde visuell in Bezug gesetzt zur Konzentration von D&sub2; der Probe innerhalb bestimmter Konzentrationsstufen. Die Hintergrundfarbe der Kontrollen konnte durch Zugabe von 25 ul Wasser reduziert werden.

Instrumentalanalyse der Test-Resultate

Die Test-Resultate wurden instrumentell ermittelt durch Verwendung eines Reflektometers (Color Eye, Macbeth), das mit einem IBM PC verbunden war, und unter Verwendung von Macbeths Software-Programm. Die unter Verwendung dieses Gerätes erhaltenen Reflektometer-Werte zeigten, innerhalb eines bestimmten Bereiches, eine lineare Korrelation zwischen der Farbintensität und der D&sub2;-Konzentration.

BEISPIEL 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Gold- Kolloiden mit einer durchschnittlichen Größe von 4,7 nm, 15 nm und 30 nm wiederholt. Alle Kolloide wurden von Janssen Pharmaceuticals gekauft. Die Kolloide wurden bis zum Sättigungs-Punkt (gemessen mittels des Verfahrens von Slot und Geuze) mit Antikörpern markiert.
Alle Kolloid-Suspensionen wurden bis zu OD&sub5;&sub2;&sub5; = 0,1 unter Verwendung von 2 mmol/l Natriumphosphat-Puffer (pH 6,4) verdünnt.
Der Test wurde wie in Beispiel 1 für jede Partikelgröße durchgeführt. Positive Resultate ergaben eine Farbe auf der festen Membran, die die gleiche Intensität für die 15 und 30 nm Kolloide besaß. Diese Intensität betrug die Hälfte der Intensität der 4,7 nm Kolloide. Messungen mittels Reflektometrie, wie in Beispiel 1, bestätigten unsere visuellen Befunde.

BEISPIEL 3

Verfahren und Aufbau von Beispiel 2 wurden mit einem Maus- monoklonalen Antikörper, der gegen das humane C-reaktive Protein (CRP) gerichtet war, wiederholt. Da CRP ein Pentamer ist, wurde der gleiche Antikörper in der Membran (es wurden 5 ul, enthaltend 2 ug Antikörper, zugegeben), sowie auf den Gold-Konjugaten verwendet. Die zur Membran zugegebene Probe war ein Human-Serum, das etwa 40 ug CRP/ml, das 15-fach in destilliertem Wasser verdünnt wurde, enthielt. 20 ul wurden zur Membran gegeben, gefolgt von 20 ul des kolloidalen Gold- Konjugates, das mit dem Antikörper gesättigt war, und wie in Beispiel 2 verdünnt. Die Resultate entsprachen in etwa denen des Beispiels 2 und zeigten, daß die Intensität der Farbe, die mit 4,7 nm Gold gebildet wurde, mindestens das 1,5-fache der Intensität betrug, die entweder mit dem 15 nm oder mit dem 30 nm Gold-Kolloid gebildet wurde.

BEISPIEL 4

Verfahren und Versuchsaufbau des Beispiels 2 wurden unter Verwendung von Gold-Kolloiden mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 3, 4 und 4,5 nm wiederholt. Die Kolloide wurden gemäß der Methode von Mühlpfordt (1982, Experientia 38, S. 1127-28) hergestellt, indem die Mengen der Gerbsäure erhöht wurden, um die Partikelgröße zu verringern. Die Partikelgrößen wurden mit einem Elektronenmikroskop bestätigt. Da die Titration so kleiner Partikel in Hinsicht auf die Antikörper- Sättigung sich wahrscheinlich als schwierig erwiesen hätte, wurde die Titration mit den 4,5 nm Partikeln durchgeführt, und die gleiche Menge Antikörper wurde bei 3 und 4 nm verwendet. Das Verfahren entsprach in allen anderen Punkten dem in Beispiel 2 beschriebenen. Die Resultate zeigten, daß die produzierte Farbe etwas intensiver bei 3 nm als bei 4 nm Gold- Kolloiden war, welche wiederum gleich zu 4,5 nm war.
Es soll betont werden, daß die Handhabung von 3 nm Gold- Kolloid-Konjugaten bei Waschprozeduren die Verwendung einer Ultrazentrifuge erforderte, um die sehr kleinen Partikel zu sedimentieren. In allem anderen entsprach die Durchführung mit diesen Partikeln dem mit den 4 und 4,5 nm Partikeln.

BEISPIEL 5

Es wurden 15 nm und 30 nm kolloidales Gold (gekauft von Janssen Pharmaceuticals, Belgien) und 4,5 nm Goldpartikel, hergestellt mittels der in Beispiel 4 beschriebenen Methode, verwendet. Die Kolloide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Maus- monoklonalem IgG, spezifisch für D&sub2;, konjugiert. Die kolloidalen Gold-Konjugate wurden schließlich unter Verwendung von 2 mmol/l Natriumphosphat-Puffer (pH 6,4) auf OD&sub5;&sub2;&sub5; = 0,010 verdünnt.
Membranen von etwa 0,5 x 2,0 cm aus Hybond C (Amersham UK) wurden mit 10 ul D&sub2; (0,5 mg/ml in 0,15 mol/l NaCl) betüpfelt und für etwa 30 Minuten getrocknet. Freie Bindungsstellen wurden dann durch Inkubation der Membranen für 30 Minuten mit 2 ml 1 % Rinderserum-Albumin in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) blockiert.
Sieben Membranen wurden für jede Größe des Gold-Kolloides getestet. Jede wie oben hergestellte Membran wurde in jeweils einem Test-Röhrchen plaziert, zu dem 2 ml von einem der verdünnten kolloidalen Gold-Konjugate zugegeben worden waren. Die Membranen wurden in geeigneten Zeitintervallen aus den Röhrchen genommen, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gespült und getrocknet. Die Menge des Gold-Kolloides wurde unter Verwendung eines Reflektometers wie in Beispiel 1 bestimmt.
Die Resultate zeigten, daß die Entwicklung der Farbe in den Test-Röhrchen mit 4,5 nm Gold-Kolloiden mehr als dreimal stärker war als für das 15 nm oder das 30 nm Gold-Kolloid. Das 15 nm und das 30 nm ergaben untereinander sehr ähnliche Resultate.

BEISPIEL 6

Beispiel 5 wurde unter Verwendung eines kompletten Sandwiches wiederholt. Die Membranen wurden mit einem monoklonalen Maus- IgG, spezifisch für D&sub2; (10 ul, enthaltend insgesamt 5 ug Antikörper) betüpfelt und getrocknet.
Die Membranen wurden dann blockiert und für eine Stunde bei 37ºC mit 2 ml einer Lösung, enthaltend 0,1 mg/ml gereinigtes D&sub2; in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4), enthaltend 1 % Rinderserum-Albumin, inkubiert. Die Membranen wurden dann gespült und gemäß dem Verfahren des Beispiels 5 mit Gold- Kolloid-Konjugaten inkubiert.
Es wurde ein ähnliches Resultat erhalten, das zeigte, daß die Farbentwicklung unter Verwendung des 4,5 nm Gold-Kolloid- Konjugates etwa doppelt so stark war wie die Intensität, die entweder mit den 15 nm oder den 30 nm Kolloiden erhalten wurde.

BEISPIEL 7

Beispiel 6 wurde wiederholt, indem zwei D&sub2;-spezifische Antikörper durch den gleichen CRP-spezifischen Antikörper auf der Membran sowie auf den Gold-Konjugaten ersetzt wurde. Das Verfahren und die Medien waren in allen anderen Punkten identisch.
Die Farbentwicklung der 4,5 nm Gold-Kolloid-Konjugate betrug etwa das Dreifache der Intensität, die mit 15 nm Gold erhalten wurde, welche wiederum das 1,2-fache der Intensität des 30 nm Goldes betrug.

BEISPIEL 8

Zwei für D&sub2; spezifische Maus-monoklonale Antikörper, wie in den vorherigen Beispielen verwendet, wurden wie folgt behandelt:
Einer der Antikörper wurde an Gold-Kolloide mit 4,5 nm, 15 nm bzw. 30 nm konjugiert. Die Kolloide wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 erhalten. Die Konjugate wurden wie in Beispiel 5 hergestellt und in 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,15 mol/l NaCl, 0,01 % Tween 20 und 1 % Rinderserum-Albumin, auf OD&sub5;&sub2;&sub5; = 0,010 verdünnt.
Der zweite Antikörper wurde an 3-Mikron-Partikel (Dynospheres CA-031-A, Dyno Particles AS, Norwegen) konjugiert. Die Partikel waren vom Hersteller zur Protein-Kopplung voraktiviert worden. Der Antikörper wurde zu 170 ug/ml in 10 mmol/l Natriumphosphat- Puffer (pH 7,5) mit 0,15 mol/l NaCl und 30 mg/ml der Partikel gelöst. Zu diesem Gemisch wurde ein halbes Volumen 0,05 mol/l Natriumborat-Puffer (pH 9,5) gegeben, und das Gemisch wurde kopfüber für 20 Stunden bei 20ºC rotiert. Danach wurden die Partikel gewaschen, zentrifugiert und in einem Phosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert. Verbliebene aktive Gruppen wurden durch Inkubation mit 1 mol/l Ethanolamin (pH 9,5), enthaltend 0,1 % Tween 20, für weitere 20 Stunden bei 20ºC blockiert. Die Partikel wurden sodann zweimal mit 50 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 0,1 mol/l NaCl, 0,01 % Rinderserum-Albumin und 0,1 % Tween 20, gewaschen.
Die auf diese Weise hergestellten Partikel können in einer homogenen Suspension für mindestens eine Stunde stehen bleiben.
1 mg der Partikel wird näherungsweise 5 ug Antikörper binden.
Aliquots von etwa 1 mg der Partikel wurden zentrifugiert, in jeweils 0,5 ml einer der drei Gold-Kolloid-Konjugat-Lösungen, die auf 0,1 mg/ml gereinigtes D&sub2; eingestellt worden waren, resuspendiert und kopfüber vermischend bei 20ºC inkubiert. In bestimmten Zeitintervallen wurden Aliquots von 50 ul dem Gemisch entnommen und zu einer, wie in Beispiel 1 beschriebenen, Test-Vorrichtung mit einer Membran, die mit Rinderserum-Albumin völlig blockiert war, gegeben.
Bei Verwendung dieses Verfahrens werden die Gold-Kolloid- Konjugate an den Partikeln haften, und durch Filtration in der Vorrichtung werden die farbigen Gold-Kolloide in dem Filter aufgehalten. Ungebundene, kolloidale Gold-Konjugate werden durch den Filter wandern.
Während einer halbstündigen Inkubation wurden alle 5 Minuten Aliquots entnommen. Die Intensität der mit 15 nm oder 30 nm Kolloiden gebildeten Farbe war an allen Punkten fast gleich und erhöhte sich linear bis etwa 20 Minuten. Die mit 4,5 nm Kolloiden erreichte Intensität war nach 5 Minuten etwa 2,5-fach höher, und diese Intensitäts-Differenz nahm nach 10 Minuten ab.
Den obigen Beispielen kann man entnehmen, daß Gold-Kolloide mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm schnellere Reaktions-Kinetiken erlauben und eine intensivere Farbentwicklung liefern, als zum Stand der Technik gehörende Gold-Kolloid-Konjugate.

Claims

1. Eine Methode zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung, die einen spezifischen Bindungs-Assay für eine zu analysierende Substanz in einer Test-probe beinhaltet, worin ein Reagens, das ein Gold-Sol umfaßt, das an eine Substanz gebunden ist, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder an einen dafür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, in gebundener Form an einer festen Phase immobilisiert wird, um eine Anzeige des Vorhandenseins oder der Menge der zu analysierenden Substanz in der Probe zu ermöglichen durch Detektion der Präsenz oder der Intensität der Farbe eines immobilisierten Gold-Sols, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 75 Gewichtsprozent der Goldpartikel des Gold- Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.

2. Eine Methode gemäß Anspruch 1, worin die Probe in einem wäßrigen Assay-Medium in Kontakt gebracht wird mit (i) einem Analogon der zu analysierenden Substanz oder einem spezifischen Bindungs-Partner für die zu analysierende Substanz, immobilisiert an einem festen Träger, und (ii) mit einem markierten Reagens, umfassend ein Gold-Sol, das mit einem Molekül verbunden ist, welches in der Lage ist, spezifisch die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, wobei eine Menge des Gold-Sol-Reagenzes an diesem Träger immobilisiert wird, wobei die Inspektion oder Bestimmung seiner Farbe dazu verwendet wird, die Präsenz oder die Menge der zu analy-sierenden Substanz in der Probe anzuzeigen, und wobei mindestens 75 Gewichtsprozent der Gold-Partikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.

3. Eine Methode gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens 80 Gewichtsprozent der Gold-Partikel des Gold- Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.

4. Eine Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens 85 Gewichtsprozent der Gold-Partikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.

5. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der durchschnittliche, mittlere Gold-Partikel- Durchmesser nicht weniger als 4 Nanometer beträgt.

6. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der durchschnittliche, mittlere Gold-Partikel- Durchmesser nicht weniger als 4 Nanometer und nicht mehr als 4,5 Nanometer beträgt.

7. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zu analysierende Substanz und das markierte Reagens gemischt werden, bevor sie in Kontakt mit der festen Phase oder dem festen Träger kommen.

8. Eine Methode gemäß einem der Ansprüche 1 - 6, wobei die zu analysierende Substanz und das markierte Reagens nacheinander mit der festen Phase oder dem festen Träger in Kontakt gebracht werden.

9. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein kompetitiver Assay durchgeführt wird.

10. Eine Methode gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, wobei ein Sandwich-Assay durchgeführt.

11. Eine Methode gemäß einem der Ansprüche 1 - 8, wobei die zu analysierende Substanz zur Reaktion mit einem Gold- markierten Reagens gebracht wird, gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen Bindungs-Partnern für die zu analysierende Substanz, um ein komplexes Aggregat zu bilden, und wobei man das Reaktionsgemisch durch eine feste Phase diffundieren läßt, die ein inertes Filter-Medium enthält, dessen Poren so klein sind, daß sie das komplexe Aggregat nicht hindurchwandern lassen, aber so groß sind, daß sie überschüssiges Gold-markiertes Reagens hindurchwandern lassen.

12. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Form der festen Phase ausgewählt wird aus einem Tauchstab, einem porösen Material oder einer Wand einer Reaktionskammer.

13. Eine Methode gemäß einem der Ansprüche 2 - 11, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus einem Tauchstab, einem porösen Material, einer Wand einer Reaktionskammer oder Perlen unter Einschluß von Mikrokugeln.

14. Eine Methode gemäß einem der Ansprüch 12 - 13, wobei die feste Phase oder der feste Träger ein poröses Material ist, und Mittel vorgesehen sind, die den Flüssigkeitstransport durch das poröse Material verstärken.

15. Eine Methode gemäß Anspruch 13, wobei der feste Träger aus einer Vielzahl von Perlen besteht, und Mittel vorgesehen sind, welche die Perlen aus dem Gemisch der zu analysierenden Substanz und dem Reagens-Gemisch isolieren.

16. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge der zu analysierenden Substanz quantitativ bestimmt wird.

17. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase oder das feste Trägermaterial ausgewählt wird aus Nitrocellulose, Papier, Celluloseacetat, Nylon oder anderem, polymerem Material, an das biologische Substanzen binden können.

18. Eine Methode gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindung der zu analysierenden Substanz mit ihrem spezifischen Bindungs-Partner auf Interaktionen von Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper, Hormon/Hormon- Rezeptor, Zucker/Lectin, Biotin/Avidin, Protein A/Immunglobulin, Enzym/Enzym-Cofaktor, Enzym/Enzym- Inhibitor oder Nukleinsäure-Paaren (DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-DNA) beruht.

19. Ein Kit zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung, beinhaltend einen spezifischen Bindungs-Assay einer zu analysierenden Substanz in einer Testprobe, umfassend (a) eine feste Phase, an der ein markiertes Reagens immobilisiert wird, um eine Indikation der Präsenz oder der Menge der zu analysierenden Substanz in der Probe zu ermöglichen, und (b) ein markiertes Reagens, umfassend ein Gold-Sol, das an eine Substanz gebunden ist, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 75 Gewichtsprozent der Gold-Partikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.

20. Ein Kit gemäß Anspruch 19, der eine Standardmenge einer Substanz enthält, ausgewählt aus mindestens einer Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner oder das Gold-Sol-Reagens zu binden.

21. Ein Kit gemäß Anspruch 19 oder Anspruch 20, wobei die feste Phase eine Form, ausgewählt aus einem Tauchstab, einer porösen Membran oder der Wand einer Reaktionskammer, besitzt.

22. Ein Kit gemäß einem der Ansprüche 19 - 21, wobei eine Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, an die feste Phase oder an Perlen oder an Mikrokugeln gekoppelt wird.

23. Ein Kit gemäß Anspruch 22, wobei die Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, ausgewählt wird aus Antikörpern, Antigenen oder deren Analoga.

24. Ein Kit gemäß einem der Ansprüche 19 - 23, wobei das markierte Reagens Antikörper oder Antigene oder deren Analoga beinhaltet.

25. Ein Kit gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Festphasen-Material ausgewählt wird aus Nitrocellulose, Papier, Celluloseacetat, Nylon oder einem anderen polymeren Material, an das biologische Substanzen binden können.

26. Ein Kit gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase ein poröses Material ist, und Mittel vorgesehen sind, die den Flüssigkeitstransport durch das poröse Material verstärken.

27. Ein Kit gemäß Anspruch 19, umfassend (a) einen festen Träger zur Immobilisierung eines Analogons der zu analysierenden Substanz oder eines spezifischen Bindungs- Partners für die zu analysierende Substanz oder eines Komplexes der zu analysierenden Substanz mit einem oder mehreren Reagentien, (b) dieses Analogon der zu analysierenden Substanz oder einen Bindungs-Partner und (c) ein Reagens, umfassend ein Gold-Sol, das an ein Molekül gebunden ist, das in der Lage ist, spezifisch an die zu analysierende Substanz oder einen hierfür spezifischen Bindungs-Partner zu binden, wobei mindestens 75 % der Partikel des Gold-Sols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Nanometer und nicht weniger als 3 Nanometer besitzen.