DE10109777A1 - Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren - Google Patents

Abstract

Eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ist ein Nanopartikel. Die Einheit zum Immobilisieren wird mit Fängermolekülen versehen, die makromolekulare Biopolymere binden können. Eine zu untersuchende Probe wird mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere werden an den Fängermolekülen gebunden und die makromolekularen Biopolymere werden mittels eines durch eine Markierung ausgesandten Signals erfasst.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren.

Aus [1] bis [4] sind Verfahren zum Erfassen von DNA-Molekülen bekannt, bei denen zur Erfassung Biosensoren eingesetzt werden, die auf Elektrodenanordnungen basieren.

Fig. 2a und Fig. 2b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] und [4] beschrieben ist. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 201, 202 sind als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 201, 202 sind DNA-Sondenmoleküle 206 immobilisiert (vgl. Fig. 2a). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel- Kopplung. Auf den Elektroden 201, 202 ist der zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 207, aufgebracht.

Sind in dem Elektrolyt 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 206 komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA-Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig. 2b).

Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. mit ihm zu hybridisieren.

Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig. 2b ersichtlich, die Kapazität zwischen den Elektroden. Diese Änderung der Kapazität wird als Messgröße für die Erfassung von DNA-Molekülen herangezogen.

Aus [5] ist eine weitere Vorgehensweise für die Untersuchung des Elektrolyts auf die Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge der gewünschten Sequenz mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und deren Existenz wird anhand der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle bestimmt. Hierzu wird Licht im Wellenlängenbereich sichtbaren Lichts auf den Elektrolyten gestrahlt und es wird das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden markierten DNA-Strang, reflektierte Licht erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d. h. insbesondere aufgrund der erfassten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyten enthalten ist oder nicht.

Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genau Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden DNA- Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist. Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können.

Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.

Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie (vgl. [6]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z. B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.

Ferner ist ebenfalls bekannt, dass bei Nachweisverfahren für Antigene oder Antikörper wie den sogenannten ELISA-Tests, die auf Festphasensystemen beruhen, einer der beiden Reaktionspartner an eine feste Phase (z. B. Mikrotiterplatten) gebunden wird. Die erfolgte Antikörper-Antigen-Reaktion wird durch einen markierten Reaktionspartner nachgewiesen (vgl. [7]). Genauer gesagt wird in einem solchen Antikörper- Einfang-Test zunächst das Antigen an einen festen Träger gebunden. Danach reagiert ein markierter, sich in einer Lösung befindender Antikörper mit dem Antigen. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Antikörpers erhält man eine qualitative oder quantitative Aussage durch Messen der Markierung am gebundenen Antikörper (vgl. [8] und [9]).

Weiterhin ist ein Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere aus [2] und [3] bekannt.

Das Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren, im weiteren auch als Redox-Recycling-Verfahren bezeichnet, wird im weiteren anhand der Fig. 4a bis Fig. 4c näher erläutert.

Fig. 4a zeigt einen Biosensor 400 mit einer ersten Elektrode 401 und einer zweiten Elektrode 402, die auf einem Substrat 403 als Isolatorschicht aufgebracht sind.

Auf der ersten Elektrode 401 aus Gold ist ein Haltebereich, ausgestaltet als Halteschicht 404, aufgebracht. Der Haltebereich dient zum Immobilisieren von DNA-Sondenmolekülen 405 auf der ersten Elektrode 401.

Auf der zweiten Elektrode ist kein solcher Haltebereich vorgesehen.

Sollen mittels des Biosensors 400 DNA-Stränge mit einer Sequenz erfasst werden, die komplementär zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 ist, so wird der Sensor 400 mit einer zu untersuchenden Lösung 406, z. B. einem Elektrolyten, derart in Kontakt gebracht, dass in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltene DNA-Stränge mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisieren können.

Fig. 4b zeigt den Fall, dass in der zu untersuchenden Lösung 406 die zu erfassenden DNA-Stränge 407 enthalten sind und an die DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisiert sind.

Die DNA-Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung sind mit einem Enzym 408 markiert, mit dem es möglich ist, im weiteren beschriebene Moleküle in Teilmoleküle zu spalten.

Üblicherweise ist eine erheblich größere Anzahl von DNA- Sondenmolekülen 405 vorgesehen, als zu ermittelnde DNA- Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung 406 enthalten sind.

Nachdem die in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltenen DNA-Stränge 407 mit dem Enzym 408 mit den immobilisierten DNA-Sondenmolekülen hybridisiert haben, erfolgt eine Spülung des Biosensors 400, wodurch die nicht hybridisierten DNA-Stränge entfernt werden und der Biosensor 400 von der zu untersuchenden Lösung 406 gereinigt wird.

Dieser zur Spülung verwendeten Spüllösung oder in einer weiteren Phase eigens zugeführten weiteren Lösung 412 wird eine elektrisch ungeladene Substanz beigegeben, die Moleküle enthält, die durch das Enzym an den hybridisierten DNA- Strängen 407 in ein erstes Teilmolekül einer negativen ersten elektrischen Ladung und in ein zweites Teilmolekül einer positiven zweiten elektrischen Ladung gespalten werden können.

Die negativ geladenen Teilmoleküle werden, wie in Fig. 4c gezeigt ist, zu der positiv geladenen Anode gezogen, wie durch den Pfeil 411 in Fig. 4c angedeutet ist.

Die negativ geladenen ersten Teilmoleküle 410 werden an der ersten Elektrode 401, die als Anode ein positives elektrisches Potential aufweist, oxidiert und werden als oxidierte Teilmoleküle 413 an die negativ geladene Katode, d. h. die zweite Elektrode 402 gezogen, wo sie wieder reduziert werden.

Die reduzierten Teilmoleküle 414 wiederum wandern zu der ersten Elektrode 401, d. h. zu der Anode.

Auf diese Weise wird ein elektrischer Kreisstrom generiert, der proportional ist zu der Anzahl der jeweils durch die Enzyme 408 erzeugten Ladungsträger.

Der elektrische Parameter, der bei dieser Methode ausgewertet wird, ist die Änderung des elektrischen Stroms dI/dt als Funktion der Zeit t, wie dies in dem Diagramm 500 in Fig. 5 dargestellt ist.

Weiterhin sind Verfahren zur Nanostrukturierung von Substraten wie Glas oder Silizium-Wafer bekannt, d. h. Verfahren, mit denen Nano-Partikel aus Metall auf diesen Substraten erzeugt werden (vgl. [12-14]. Aus [13] ist weiterhin bekannt, dass Streptavidin-Moleküle auf derartigen Gold-Nanopartikeln mittels Biotinderivaten gebunden und durch Rasterkraftmikroskopie (engl. Scanning Force Microscopy) sichtbar gemacht werden können.

Die vorstehend genannten Verfahren zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren haben gemeinsam, dass bei ihnen die genaue Anzahl der auf dem Substrat bzw. der Oberfläche immobilisierten Fängermoleküle nicht genau bestimmt ist. Dies ist insbesondere bei einem quantitativen Nachweis von makromolekularen Biopolymeren nachteilig.

Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren für die Erfassung von makromolekularen Biopolymeren bereitzustellen.

Das Problem wird gelöst durch die Verfahren mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen.

Bei einem solchem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren verwendet. Dabei ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von Biopolymeren ein Nanopartikel.

Bei einem ersten Verfahren wird die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können. Dann wird eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht wird, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. Dabei werden in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden und die makromolekularen Biopolymere werden mittels eines durch eine Markierung ausgesandten Signals erfasst.

Einfach ausgedrückt zeichnen sich die vorliegenden Verfahren gegenüber den bekannten Verfahren zur Erfassung von makromolekularen Biopolymer dadurch aus, dass sie als Einheit bzw. Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren (mittels Fängermolekülen) Nanopartikel verwenden.

Unter einem Nanopartikel wird im Sinne der Erfindung ein Partikel verstanden, der durch sogenannte Nanostrukturierungs-Verfahren erhalten werden kann. Nanostrukturierungs-Verfahren, die zur Erzeugung solcher Nanopartikel auf geeigneten Substraten herangezogen werden können, sind beispielsweise die in [12] und [13] beschriebene Verwendung von Block-Copolymer-Microemulsionen oder die in [14] beschriebenen Verwendung von Kolloidpartikeln als Strukturierungsmasken. Das in [14] beschriebene Verfahren ist im Prinzip analog zu einem im Bereich der Substrat- Strukturierung üblicherweise eingesetzten Lithographie- Verfahren. Daher sei hier betont, dass ein Nanopartikel im Sinne der Erfindung nicht auf diejenigen Partikel beschränkt ist, die durch eines der hier beispielhaft genannten Verfahren erhalten werden. Vielmehr ist ein solcher Nanopartikel jeder Partikel, dessen Durchmesser im Nanometer- Bereich liegt, d. h. allgemein zwischen 2 und 50 nm, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 20 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 nm.

Eine "Einheit zur Immobilisierung, die ein Nanopartikel ist", die im folgenden auch nanopartikelförmige Einheit genannt wird, ist folglich ein oben beschriebener Nanopartikel, der eine Oberfläche aufweist, auf der die Fängermoleküle immobilisiert werden können, d. h. die Oberfläche ist so beschaffen, dass an ihr die Fängermoleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können. Diese Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein. Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine nanopartikelförmige Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, halbleitende Materialien wie Silizium, Kunststoffe wie Polyethylen- oder Polypropylen oder Siliziumdioxid, z. B. in Form von Glas. Nanopartikelförmige Einheiten aus Kunststoffen und Siliziumdioxid sind dabei durch Verwendung der in [14] beschriebenen Kolloidmasken- Verfahren erhältlich. Nanopartikelförmige Einheiten aus halbleitenden Materialien wie Silizium können beispielsweise auch durch das Stranski-Krastanov-Verfahren gebildet werden. Durch Oxidation solcher Nanopartikel aus Silizium sind weiterhin nanopartikelförmige Einheiten aus Siliziumdioxid erhältlich.

Wenn eines der in [12] bis [14] genannten oder ein dazu entsprechendes Herstellungsverfahren für die Erzeugung der nanopartikelförmigen Einheiten zum Immobilisieren angewendet wird, nehmen diese Einheiten auf den eingesetzten Substratoberflächen, beispielweise von Metall- oder Oxid- Oberflächen von Photodioden oder Elektroden eine regelmäßige Anordnung ein. Die einzelnen Einheiten weisen dabei üblicherweise Abstände voneinander im Bereich einiger 10 Nanometer, beispielsweise von ca. 10 bis 30 nm auf diesen Oberflächen auf. Die Art der Anordnung und der Abstand der Nanopartikel voneinander hängt ebenso wie ihre Größe von dem jeweiligen Verfahren zur Ausbildung der Nanopartikel ab.

Ein Vorteil bei der Verwendung einer oder mehrerer Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, die als Nanopartikel vorliegen, besteht darin, dass auf diesen Nanopartikeln eine genau definierte Anzahl von Fängermolekülen immobilisiert werden kann. Im optimalen Fall kann ein einziges Fängermolekül pro nanopartikelförmiger Einheit gebunden werden. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Nanopartikeln als Einheiten zum Immobilisieren bietet sich dadurch, dass durch den Abstand der Nanopartikel untereinander, d. h. die räumliche Trennung der Fängermoleküle, eine bessere räumliche Zugänglichkeit der Fängermoleküle für die daran bindenden makromolekularen Biopolymere gegeben ist und somit die Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung zwischen Fängermolekül und nachzuweisendem Molekül erhöht wird. Die Ausbildung als Nanopartikel vergrößert zudem die effektive Oberfläche.

Alle diese Vorteile sind insbesondere bei der quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren nützlich, so dass in einer bevorzugten Ausgestaltung das vorliegende Verfahren zur quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzt wird.

Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von makromolekularen Biopolymeren in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen" ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von makromolekularen Biopolymeren im Analyten festzustellen.

Allgemein kann jedes beliebige Substratmaterial verwendet werden, um darauf die nanopartikelfömige Einheit oder Einheiten auszubilden. So können diese z. B. auf einer Glasoberfläche, einem Silizium-Wafer, einer Metalloberfläche, einer Kunststoffoberfläche wie z. B. einer Mikrotiterplatte ausgebildet werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren auf einer Elektrode oder einer Photodiode aufgebracht ist. Vorzugsweise sind die mehreren Einheiten zum Immobilisieren auf der Elektrode oder der Photodiode, bzw. auf dem Substrat allgemein, in einer regelmäßigen Anordnung aufgebracht.

Bei einem ersten hier offenbarten Verfahren ist die Markierung, die zur Erfassung des makromolekularen Biopolymers dient, an dem Fängermolekül angebracht und nicht wie bei den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren an dem zu erfassenden makromolekularen Biopolymer. Die Tatsache, dass anstelle der zu erfassenden Biopolymere die Fängermoleküle vor ihrer Immobilisierung mit einer Markierung versehen werden, hat den Vorteil, dass die das Biopolymer möglicherweise enthaltende, zu untersuchende Probe nicht mehr einer Markierungsreaktion unterworfen werden muss, bei der möglicherweise ein Teil der Probe oder eventuell die gesamte Probe verloren geht oder bei der Markierung nicht vollständig abläuft.

Allerdings ist es auch möglich, dass die Markierung an dem zu erfassenden makromolekularen Biopolymer angebracht ist.

Bei dem ersten hier beschriebenen Verfahren wird durch die Markierung ein Signal erzeugt. In einer Ausgestaltung ist ein solches Signal ein elektrischer Strom. In einer weiteren Ausgestaltung ist das Signal sichtbares Licht oder UV-Licht. Das Signal kann auch aus radioaktiver Strahlung oder Röntgenlicht bestehen.

Daraus wird ersichtlich, dass bei dem Verfahren verschiedene Arten der Markierung, die nachfolgend auch als Reportergruppe bezeichnet wird, eingesetzt werden können.

Zum einen kann die Markierung eine (chemische) Verbindung oder Gruppe sein, die unmittelbar in der Lage ist, ein zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen. Die Erzeugung dieses Signals kann dabei extern angeregt werden, jedoch kann die Markierung das Signal auch ohne äußere Anregung abgeben. Im erstgenannten Fall ist die Markierung beispielsweise ein Fluoreszenz-Farbstoff (Fluorophor) oder ein Chemilumineszenz-Farbstoff, im zweitgenannten Fall beispielsweise ein Radioisotop.

Zum anderen kann die Markierung eine Substanz sein, die nur mittelbar ein Signal zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere erzeugt, d. h. eine Substanz, die die Erzeugung des Signals veranlasst. Beispielsweise kann eine solche Reportergruppe ein Enzym sein, welches eine chemische Reaktion katalysiert, und die chemische Reaktion zur Erfassung der Biopolymere herangezogen wird. Beispiele für solche Enzyme sind Alkalische Phosphatase, Glutathion-S- Transferase, Superoxid-Dismutase, Meerrechtich-Peroxidase, alpha-Galaktosidase und beta-Galaktosidase. Diese Enzyme sind in der Lage, geeignete Substrate zu spalten, die farbige Endprodukte oder z. B. Verbindungen ergeben, die in dem vorstehend beschriebenen Reduktions-/Oxidations-Recycling- Verfahren eingesetzt werden können. Zu der Gruppe der Markierungen, die nur mittelbar ein zum Nachweis von makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen, gehören ferner Liganden für Bindungsproteine und Substrate für Enzyme. Diese Markierung werden hier allgemein als Enzym- Liganden bezeichnet. Beispiele für solche als Markierung einsetzbare Enzym-Liganden sind Biotin, Digoxigenin oder Substrate für die oben genannten Enzyme.

Ein zweites hier offenbartes Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren verwendet eine Elektrodenanordnung, die eine erste Elektrode und eine zweite Elektrode aufweist.

Bei diesem zweiten Verfahren ist die erste Elektrode mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren versehen. Die Einheit zur Immobilisierung ist dabei, wie auch bei dem ersten Verfahren, ein Nanopartikel. Bei diesem Verfahren wird die auf der ersten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können. Dann wird bei dem Verfahren ein Medium mit den Elektroden in Kontakt gebracht, wobei das zu untersuchende Medium die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere werden dabei an den Fängermolekülen gebunden. Anschließend werden die makromolekularen Biopolymere mittels einer elektrischen Messung erfasst.

In einer Weiterbildung des zweiten Verfahrens ist auch die zweite Elektrode mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren versehen, wobei diese mindestens eine Einheit zur Immobilisierung ebenfalls ein Nanopartikel ist. Bei dieser Ausgestaltung des Verfahrens wird die auf der zweiten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können.

Bei einer weiteren Ausgestaltung des zweiten Verfahrens wird vor dem Schritt a) oder dem Schritt b) eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird, d. h. entweder zu einem Zeitpunkt, zu dem die Fängermoleküle auf den Elektroden vorhanden sind (vor Schritt c) oder nicht (vor Schritt a). In diesen Fällen wird nach Schritt c) eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. Dann werden abhängig von einem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden die makromolekularen Biopolymere erfasst.

Bei dieser Ausgestaltung wird bei der ersten elektrischen Messung und der zweiten elektrischen Messung vorzugsweise die Kapazität zwischen den Elektroden, der elektrische Widerstand der Elektroden gemessen oder eine Impedanzmessung durchgeführt.

Bei einer weiteren Ausgestaltung des zweiten Verfahren werden erste und zweite Fängermoleküle verwendet. Dabei ist die auf der ersten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit den ersten Fängermolekülen versehen, die makromolekulare Biopolymere eines ersten Typs binden können. Die auf der zweiten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ist mit zweiten Fängermolekülen versehen, die makromolekulare Biopolymere eines zweiten Typs binden können.

Bei dieser Ausbildung wird ein Medium mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird derart, dass, falls sich in dem Medium makromolekulare Biopolymere des ersten Typs befinden, diese an die ersten Fängermoleküle binden können, und, falls sich in dem Medium makromolekulare Biopolymere des zweiten Typs befinden, diese an die zweiten Fängermoleküle binden können. Anschließend werden nicht gebundene erste Fängermoleküle oder zweite Fängermoleküle von der jeweiligen Elektrode entfernt werden und danach die zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt.

Als Elektrodenanordnung, die die eine Elektrode aufweist, die mit mindestens einer nanopartikelförmigen Einheit zum Immobilisieren versehen ist, kann hier eine Plattenelektrodenanordnung oder eine Interdigitalelektrodenanordnung, wie aus [1] bekannt, eingesetzt werden. Bei einer Interdigitalelektrodenanordnung können selbstverständlich mehrere oder alle "Finger" der Anordnung nanostrukturiert sein.

Ferner können verschiedene Anordnungen der Parallelschaltung von Elektroden in der Elektrodenanordnung vorgesehen sein, beispielsweise können die Elektroden als zylindrische Elemente ausgestaltet sein, die jeweils konzentrisch umeinander angeordnet sind und elektrisch voneinander beispielsweise mittels eines geeigneten Dielektrikums voneinander isoliert sind, so dass sich ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden ausbildet.

Anzumerken ist, dass es selbstverständlich auch bei dem ersten Verfahren möglich ist, nicht nur eine einzige Art von Biopolymeren in einer einzelnen Messreihe zu erfassen. Vielmehr können mehrere makromolekulare Biopolymere gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu können auf der Einheit zum Immobilisieren mehrere Arten von Fängermolekülen, von denen jedes eine (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Biopolymer aufweist, gebunden werden, und/oder es können mehrere Einheiten zum Immobilisieren eingesetzt werden, wobei an jeder von diesen Einheiten nur eine Art von Fängermolekül gebunden wird. Bei diesen Mehrfachbestimmungen wird für jedes zu erfassende makromolekulare Biopolymer vorzugsweise eine von den anderen Markierungen unterscheidbare Markierung verwendet. Beispielsweise können zwei oder mehrere Fluorophore als Markierungen verwendet werden, wobei jedes dieser Fluorophore vorzugsweise eine spezifische Anregungs- und Emissionswellenlänge besitzt.

Unter makromolekularen Biopolymeren, die mit Hilfe der hier offenbarten Verfahren erfasst werden können, werden zum einen Nukleinsäuren wie DNA und RNA-Moleküle oder auch kürzere Nukleinsäuren wie Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren (bp) verstanden. Die Nukleinsäuren können doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung (Strangtrennung) für ihren Nachweis, als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder vollständig vorgegeben, d. h. bekannt sein. Weitere makromolekulare Biopolymere sind Proteine oder Peptide. Diese können aus den üblicherweise in Proteinen vorkommenden 20 Aminosäuren aufgebaut sein, aber auch natürlich nicht vorkommende Aminosäuren enthalten oder z. B. durch Zuckerreste (Oligosaccharide) modifiziert sein oder post-translationale Modifikationen enthalten. Ferner können auch Komplexe aus mehreren unterschiedlichen makromolekularen Biopolymeren erfasst werden, beispielsweise Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen.

Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden als Fängermoleküle bevorzugt Liganden verwendet, die die zu erfassenden Proteine oder Peptide spezifisch binden können. Die Fängermoleküle/­ Liganden sind vorzugsweise durch kovalente Bindungen mit dem Mittel zur Immobilisierung verknüpft.

Als Liganden für Proteine und Peptide kommen niedermolekulare Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder irgendein Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.

Wenn DNA-Moleküle (Nukleinsäuren oder Oligonukleotide) einer vorgegeben Nukleotidsequenz mit den hier beschriebenen Verfahren erfasst werden, so werden sie vorzugsweise in einzelsträngiger Form erfasst, d. h. sie werden ggf. vor der Erfassung durch Denaturierung wie vorstehend erläutert in Einzelstränge überführt. In diesem Fall werden als Fängermoleküle dann vorzugsweise DNA-Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet. Die DNA-Sondenmoleküle können wiederum Oligonukleotide oder auch längere Nukleotidsequenzen aufweisen, solange diese keine der intermolekularen Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des Sondenmoleküls mit der zu erfassenden Nukleinsäure verhindern. Allerdings ist es auch möglich, DNA-bindende Proteine oder Agenzien als Fängermolekül einzusetzen.

Bei einem ersten Verfahrensschritt der hier beschriebenen Verfahren wird die zumindest eine Einheit zum Immobilisieren mit den Fängermolekülen versehen. Dabei können bei dem ersten Verfahren diese Fängermoleküle eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann.

Eine zu untersuchende Probe, vorzugsweise ein flüssiges Medium wie ein Elektrolyt, wird dann mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht. Dies erfolgt in der Weise, dass die makromolekularen Biopolymere an die Fängermoleküle binden können. Für den Fall, dass sich in dem Medium mehrere zu erfassende makromolekulare Biopolymere befinden, werden die Bedingungen so gewählt, dass diese jeweils zur gleichen Zeit oder nacheinander an ihre entsprechendes Fängermolekül binden können.

Nachdem eine ausreichende Zeitdauer gewartet worden ist, damit die makromolekularen Biopolymere an das entsprechende Fängermolekül bzw. die entsprechenden Fängermoleküle binden konnten, werden nicht gebundene Fängermoleküle von der Einheit bzw. den Einheiten zum Immobilisieren, auf der bzw. auf denen sie sich befinden, entfernt.

Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden die nicht gebundenen, als Fängermoleküle verwendeten Liganden von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Material mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, wobei das Material imstande ist, die chemische Verbindung zwischen dem Liganden und der Einheit zum Immobilisieren zu hydrolysieren.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen.

Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit der Einheit zur Immobilisierung verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.

In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterbindung zwischen der Einheit zur Immobilisierung und dem jeweiligen Ligandenmolekül, das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dagegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Einheit zum Immobilisieren und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die Raumerfüllung des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle DNA-Stränge sind, erfolgt die Entfernung der nicht gebundenen Sondenmoleküle enzymatisch, beispielsweise mit Hilfe eines Enzyms mit Nukleaseaktivität. Vorzugsweise wird als Enzym mit Nukleaseaktivität ein Enzym verwendet, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht hybridisierter DNA- Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende DNA, die in Form eines doppelsträngigen Hybrids mit dem Sondenmolekül vorliegt, unerwünschterweise ebenfalls abgebaut.

Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease P1 oder die Nuklease S1 verwendet werden. Gleichfalls können DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.

Nach dem Entfernen der nicht gebundenen Fängermoleküle werden die makromolekularen Biopolymere erfasst. Bei dem ersten Verfahren erfolgt dies mittels der Markierung. Beispielsweise wird entweder ein von der Markierung spontan ausgesandtes Signal wie radioaktive Strahlung oder durch eines durch externe Anregung verursachtes Signal wie ausgesandte Fluoreszenzstrahlung gemessen. Bei dem zweiten Verfahren geschieht die Erfassung mittels einer elektrischen Messung.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.

Es zeigen

Fig. 1a bis 1d die Ausbildung eines Biosensors, mit dem ein hier beschriebenes Verfahren zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden kann;

Fig. 2a und 2b eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Fig. 2a) bzw. deren Nichtexistenz (Fig. 2b) nachgewiesen werden können;

Fig. 3a bis 3e einen Biosensor zu unterschiedlichen Verfahrenszuständen, anhand denen ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wird;

Fig. 4a bis 4c Skizzen eines Biosensors gemäß dem Stand der Technik, anhand derer einzelne Zustände im Rahmen des Redox-Recycling-Vorgangs erläutert werden;

Fig. 5 einen Funktionsverlauf eines Kreisstroms gemäß dem Stand der Technik im Rahmen eines Redox-Recycling- Vorgangs;

Fig. 6a und 6b einen Biosensor, mit dem ein Redox- Recycling-Vorgang als weitere Ausführungsform eines hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann.

Fig. 7a bis 7d eine Elektrodenanordnung zu unterschiedlichen Verfahrenszuständen, anhand denen ein weiteres Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wird;

Fig. 1 zeigt einen Biosensor 100, der mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung in Form von Nanopartikeln ausgestaltet ist, und mit dem die hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden können.

Der Biosensor 100 weist eine Schicht 101 aus einem geeigneten Substratmaterial wie z. B. Silizium oder Gold und eine weitere darauf befindliche Schicht 102 auf (Fig. 1a). Die zweite Schicht 102 besteht dabei aus einem Metall, das nicht für die Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren geeignet ist. Ein solches Metall ist z. B. Platin.

Auf der Schicht 102 werden die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, die die Form von Nanopartikeln aufweisen, durch folgendes Verfahren gebildet.

Eine Lösung von 0,5 Gew.-% Block-Copolymer Polystryol(PS)- block-poly(2-vinylpyridin)(P2VP) der allgemeinen Formel PS(x)-b-P2VP(y) wird, wie in [12] und [13] beschrieben, mit 0,5 Äquivalenten HAuCl₄.H₂O pro Pyridin-Einheit zur Ausbildung von monodispersen (micellar gelösten) Gold- Partikeln versetzt. x und y geben in der Formel die Anzahl der Grundeinheiten entsprechend dem Verhältnis zwischen Monomer und Initiator an.

Nach der Bildung homogener Micellen wird aus dieser Lösung durch Reduktion mit Hydrazin, wie in [12] und [13] beschrieben, eine Monoschicht von Nanopartikeln aus Gold auf der Schicht 102 abgeschieden. Anschließend werden die organischen Bestandteile der abgeschiedenen Micellen, d. h. das Block-Copolymer, durch Plasmaätzen mittels eines Sauerstoffplasmas von der Schicht 102 entfernt (vgl. [13]). Die Goldpartikel 103, die als die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren dienen, bleiben bei dieser Behandlung mit Plasma unversehrt und bilden, wie in der Schnittansicht und der Draufsicht von Fig. 1b veranschaulicht, eine regelmäßige Anordnung auf der Schicht 102 aus (vgl. [12]). Die Abstände zwischen den Gold- Nanopartikeln 103 betragen in der Regel einige 10 nm, z. B. ca. 20 bis 30 nm. Die Nanopartikel besitzen vorzugsweise eine Größe im Bereich von ca. 5 bis 10 nm.

Neben dem oben genannten Blockpolymeren sind selbstverständlich auch weitere Blockpolymere zur Ausbildung der Nanopartikel verwendbar.

Alternativ können die Einheiten 103 zum Immobilisieren in Nanopartikel-Form auf dem Biosensor erzeugt werden, wie in [14] beschrieben, indem zunächst eine Maske für die Nanostrukturierung aus Kolloidpartikel auf der Schicht 102 ausgebildet wird und dann z. B. mittels Vakuumdeposition Goldpartikel abgelagert werden.

Nach dem Aufbringen der Nanopartikel 103 aus Gold wird der Sensor 100 derart strukturiert, dass die Schicht 102 aus Platin samt den Einheiten 103 zum Immobilisieren nur auf ausgewählten Bereichen zurückbleibt, wie dies in der Schnittansicht und der Draufsicht von Fig. 1c gezeigt ist. Diese Strukturierung ist z. B. mit Hilfe jedes geeigneten gängigen chemischen Ätzverfahrens möglich.

Mit Hilfe des so gestalteten Biosensors 100 kann eines der hier beschriebenen Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden. Fig. 1d zeigt ein auf einem Gold-Nanopartikel 103 mittels der Gold- Schwefel-Kopplung immobilisiertes DNA-Fängermolekül 104.

Fig. 3 zeigt einen Ausschnitt eines Biosensors 300, mit dem eine Ausführungsform eines hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann.

Der Biosensor 300 weist eine erste Fotodiode 301 und eine zweite Fotodiode 302 auf, die in einer Isolatorschicht 303 aus Isolatormaterial wie Silizium angeordnet sind. Der Biosensor 300 weist weiterhin eine Oxidschicht 304 und eine zweite darauf befindliche Schicht 305 auf. Die zweite Schicht 305 besteht dabei aus einem Metall wie Platin, das nicht für die Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren geeignet ist.

Auf der Schicht 305 befinden sich die nanopartikelförmigen Einheiten 306 zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, wobei die Einheiten 306 durch das anhand Fig. 1 erläuterte Verfahren gebildet werden können (vgl. die Schnittansicht von Fig. 3a und die Draufsicht von Fig. 3b). Die Einheiten 306 zum Immobilisieren sind aus Gold ausgebildet.

Die erste Fotodiode 301 und die zweite Fotodiode 302 sind über erste elektrische Anschlüsse 307 bzw. zweite elektrische Anschlüsse 308 mit einer Auswerteeinheit (nicht dargestellt) verbunden.

Alternativ können die Einheiten 306 zum Immobilisieren auch aus Siliziumoxid hergestellt sein, z. B. indem Siliziumpartikel durch die in [14] beschriebenen Masken und Vakuumdeposition bzw. durch das Verfahren nach Stranski- Krastanov ausgebildet werden und anschließend zu Siliziumoxid oxidiert werden. Diese so erhältichen Einheiten 306 aus Siliziumdioxid können mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, Fängermoleküle zu immobilisieren.

Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie

• - 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
• - 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
• - 3-Aminopropyltriethoxysilan,
• - 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
• - 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan,

oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy-, Acetoxy-, Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.

Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Einheit zum Immobilisieren gebunden.

Auf den nanopartikelförmigen Einheiten zum Immobilisieren 306 werden DNA-Sondenmoleküle 309, 310 als Fängermoleküle aufgebracht (Fig. 3c, die Einheiten 306 sind zur Vereinfachung nicht dargestellt).

Dabei sind auf der ersten Fotodiode 301 mittels der Einheiten 306 erste DNA-Sondenmoleküle 309 mit einer zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz komplementären Sequenz aufgebracht. Die DNA-Sondenmoleküle 309 sind jeweils mit einem ersten Fluorophor 311 markiert.

Als Fluorophor kann beispielsweise Fluorescein verwendet werden. Die Markierung der Fängermoleküle 309 kann dadurch geschehen, dass ein entsprechend markiertes Nukleotid wie ChromaTide Fluorescein-12-dUTP (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7604) enzymatisch, d. h. mittels geeigneter Polymerasen wie DNA-Polymerase oder Klenow Polymerase, in die Oligonukleotide (Fängermoleküle) 309 eingebaut wird (vgl. [10]).

Auf der zweiten Fotodiode 302 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 310 mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz ist, aufgebracht. Die DNA- Sondenmoleküle 310 sind jeweils mit einem zweiten Fluorophor 312 markiert. Als Markierung 312 kann dabei z. B. das Fluorophor "Oregon Green™ 488" dienen, das ebenfalls an ein Nukleotid wie dUTP gekoppelt (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7630) auf enzymatischem Wege in die DNA-Moleküle 310 eingebaut wird.

An die Pyrimidinbasen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) bzw. Uracil (U) im Falle einer oben beschriebenen Markierung, oder Cytosin (C), können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d. h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T oder U bzw. zwischen C und G, hybridisieren.

Fig. 3c zeigt ferner einen Elektrolyten 313, der mit den Fotodioden 301, 302 und den DNA-Sondenmolekülen 308, 309 in Kontakt gebracht wird.

Fig. 3d zeigt den Biosensor 300 für den Fall, dass in dem Elektrolyten 313 DNA-Stränge 314 enthalten sind, die eine vorgegebene erste Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär ist zu der Sequenz der ersten DNA-Sondenmoleküle 309.

In diesem Fall hybridisieren die zu den ersten DNA- Sondenmolekülen 309 komplementären DNA-Stränge 314 mit den ersten DNA-Sondenmolekülen 309, die auf der ersten Fotodiode 301 aufgebracht sind.

Da die Sequenzen von DNA-Strängen nur mit der jeweils spezifischen Komplementärsequenz hybridisieren, hybridisieren die zu den ersten DNA-Sondenmolekülen komplementären DNA- Stränge nicht mit den zweiten DNA-Sondenmolekülen 310.

Wie aus Fig. 3d ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung, dass sich auf der ersten Fotodiode 301 hybridisierte Moleküle befinden, d. h. doppelsträngige DNA-Moleküle immobilisiert sind. Auf der zweiten Fotodiode 302 sind nur die zweiten DNA-Sondenmoleküle 310 als weiterhin einsträngige Moleküle vorhanden.

In einem weiteren Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens, beispielsweise durch Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 313, eine Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 310 auf der zweiten Fotodiode 302 bewirkt.

Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau der nicht hybridisierten DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise die als doppelsträngige DNA vorliegende zu erfassende Nukleinsäure ebenfalls (unerwünschterweise) abgebaut, was zu einer Verfälschung des Messergebnisses führen würde.

Nach Entfernen der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle, d. h. der zweiten DNA-Sondenmoleküle 310 auf der zweiten Fotodiode 302 sind lediglich die Hybride aus den zu erfassenden DNA- Molekülen 314 und den dazu komplementären ersten DNA- Sondenmolekülen 309 (vgl. Fig. 3e) vorhanden.

Beispielsweise kann zum Entfernen der nicht gebundenen einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 310 auf der zweiten Fotodiode 302, d. h. der zweiten Einheit zum Immobilisieren, einer der folgenden Stoffe zugegeben werden:

• - Nuklease aus Mung-Bohnen,
• - Nuklease P1, oder
• - Nuklease S1.

Zu diesem Zweck können ebenfalls DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.

Nach dem Abbau der einzelsträngigen Sondenmoleküle kann der Elektrolyt von den Fotodioden 301 und 302 gegebenenfalls entfernt werden. Dies erhöht den Kontrast, d. h. reduziert den Hintergrund, bei der nachfolgenden Fluoreszenz-Messung.

Mittels eines nicht gezeigten Lasers wird daraufhin durch Pfeile 315 symbolisiertes Licht mit einer Wellenlänge eingestrahlt, die geeignet ist, das erste Fluorophor 311 und das zweite Fluorophor 312 zur Fluoreszenz anzuregen. Dabei können, je nach Art der Fluorophore, auch unterschiedliche Wellenlängen verwendet werden, entweder gleichzeitig oder auch nacheinander.

Durch das eingestrahlte Licht wird nur das an den ersten DNA- Sondenmolekülen 309 befindliche Fluorophor 311 zur Emission angeregt, da die ungebundenen zweiten DNA-Sondenmoleküle 310 samt dem Fluorophor 312 von der zweiten Fotodiode 302 durch die Nukleasebehandlung entfernt worden sind (vgl. Fig. 3e). Die durch den Pfeil 316 symbolisierte Fluoreszenzstrahlung, die von dem Fluorophor 311 emittiert wird, wird von der ersten Fotodiode 301 erfasst. An der zweiten Fotodiode 302 wird hingegen keine Fluoreszenzstrahlung detektiert.

Auf diese Weise wird die Anwesenheit der DNA-Moleküle 314 ermittelt. Die Verwendung des hier beschriebenen Biosensors 300 erlaubt eine örtlich aufgelöste Erfassung und bietet eine deutliche Vereinfachung der gesamten Messanordnung, da keine externe Einheit zur Erfassung der Fluoreszenz-Strahlung notwendig ist.

Fig. 6 zeigt einen Biosensor 600, mit dem ein Redox-Recycling- Vorgang als ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung durchgeführt werden kann. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird ein makromolekulares Biopolymere sowohl mit Hilfe eines durch eine Markierung ausgesandten Signals erfasst als auch mit Hilfe einer Elektrodenanordnung, die eine erste Elektrode aufweist, die mit mindestens einer nanopartikelfömigen Einheit zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren versehen ist.

Der Biosensor 600 weist drei Elektroden auf, eine erste Elektrode 601, eine zweite Elektrode 602 sowie eine dritte Elektrode 603.

Die Elektroden 601, 602, 603 sind mittels eines Isolatormaterials als Isolatorschicht 604 elektrisch voneinander isoliert.

Auf der ersten Elektrode 601 ist ein Haltebereich 605 zum Halten von Sondenmolekülen, die makromolekulare Biopolymere binden können, vorgesehen. Dieser Haltebereich 605 weist Einheiten zum Immobilisieren 606 in Form von Nanopartikeln auf, wobei die Einheiten 606 aus Gold bestehen.

Die Sondenmoleküle (Fängermoleküle) 607 gemäß diesem Ausführungsbeispiel, die an dem Haltebereich immobilisiert sind, sind DNA-Sondenmoleküle, mit denen DNA-Stränge mit zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementärer Sequenz hybridisieren können. Als Markierung 608 tragen die Sondenmoleküle 607 an ihrem 5'-Terminus eine Biotin-Gruppe, die z. B. durch Verwendung des "FluoReporter Biotin-X-C5 Oligonucleotide Labeling Kits" (Produkt-Nr. F-6095) der Firma Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA dort angefügt werden kann (vgl. [11]).

Die DNA-Sondenmoleküle 607 werden mittels der bekannten Gold- Schwefel-Kopplung an die Einheiten 606 zum Immobilisieren auf der ersten Elektrode 601 immobilisiert. Bei Einsatz eines anderen Materials zum Binden der Sondenmoleküle wird das Material mit dem entsprechenden Beschichtungsmaterial versehen, auf dem die Sondenmoleküle immobilisiert werden können.

Während der Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle auf der ersten Elektrode 601 werden an die Elektroden unterschiedliche elektrische Potentiale angelegt, so dass ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden derart entsteht, dass eine Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle nur an der ersten Elektrode 601 möglich ist und an der zweiten Elektrode 602 und/oder an der dritten Elektrode 603 verhindert wird.

In analoger Weise zu dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie er oben beschrieben worden ist (vgl. Fig. 4), wird in einem weiteren Schritt eine zu untersuchende Lösung 610, beispielsweise ein Elektrolyt, mit dem eventuell zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren, d. h. den DNA- Strängen, die mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisieren können, mit dem Biosensor 600, d. h. insbesondere mit der ersten Elektrode 601 und den darauf befindlichen markierten DNA-Sondenmolekülen 607 in Kontakt gebracht. Dies erfolgt derart, dass eventuelle in der zu untersuchenden Lösung enthaltene DNA-Stränge 609 mit den DNA-Sondenmolekülen 606 hybridisieren können.

Anschließend werden Fängermoleküle 607, an die keine zu erfassenden DNA-Stränge hybridisiert haben, entfernt. Dies kann durch Zugabe der obengenannten DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 610 erfolgen. Auch in diesem Fall kann zur Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 607 einer der folgenden Stoffe eingesetzt werden:

• - Nuklease aus Mung-Bohnen,
• - Nuklease P1,
• - Nuklease S1, oder
• - DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
  5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
  3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.

Nach der Nukleasebehandlung befinden sich auf dem Biosensor lediglich die Hybride aus markierten Fängermolekülen 607 und zu erfassenden DNA-Molekülen 609. Dieser Zustand ist in Fig. 6a gezeigt.

In diesem Zustand wird der Biosensor 600 mittels einer nicht dargestellten Spüllösung gespült, d. h. es werden die Fragmente der nicht hybridisierten DNA-Stränge sowie die zu untersuchende Lösung entfernt.

In einem nächsten Schritt wird eine weitere Lösung (nicht dargestellt) mit dem Biosensor 600, insbesondere mit der ersten Elektrode 601, in Kontakt gebracht.

Dabei enthält diese weitere Lösung ein Enzym 611, das an die Markierung 608 der hybridisierten DNA-Sondenmoleküle 607 bindet, und das die im folgenden erläuterten Moleküle, die in einer weiteren Lösung 612 zugegeben werden, spalten kann.

Als Enzym 611 können gemäß diesem Ausführungsbeispiel beispielsweise

• - alpha-Galactosidase,
• - beta-Galactosidase,
• - beta-Glucosidase,
• - alpha-Mannosidase,
• - Alkalische Phosphatase,
• - Saure Phosphatase,
• - Oligosaccharid-Dehydrogenase,
• - Glucose-Dehydrogenase,
• - Laccase,
• - Tyrosinase,
• - oder artverwandte Enzyme

verwendet werden.

Das Enzym 611 wird vorliegend in Form eines Avidin-Konjugats eingesetzt. Grund dafür ist, dass Avidin eine spezifische Bindung mit der hier beispielhaft verwendeten Biotin- Markierung 608 eingeht (Fig. 6b).

Es ist hierbei anzumerken, dass niedermolekulare Enzyme die höchste Umsatzeffizienz und daher auch die höchste Empfindlichkeit bei Verwendung als Enzym, das das Redox- Recyling bewirkt, gewährleisten können.

In der weiteren Lösung 612 sind Moleküle 613 enthalten, die durch das Enzym 611 in ein erstes Teilmolekül 614 mit negativer elektrischer Ladung und in ein zweites Teilmolekül mit positiver elektrischer Ladung gespalten werden können (vgl. Fig. 6b).

Als das spaltbare Molekül 613 können vor allem beispielsweise

• - p-Aminophenyl-hexopyranoside,
• - p-Aminophenyl-phosphate,
• - p-Nitrophenyl-hexopyranoside,
• - p-Nitrophenyl-phosphate, oder
• - geeignete Derivate von
  • a) Diaminen,
  • b) Catecholaminen,
  • c) Fe(CN) 4-|6,
  • d) Ferrocen,
  • e) Dicarboxylsäure,
  • f) Ferrocenlysin,
  • g) Osmiumbipyridyl-NH, oder
  • h) PEG-Ferrocen²

verwendet werden.

An die Elektroden 601, 602, 603 wird bei dieser Ausführungsform nun jeweils ein elektrisches Potential angelegt.

Dabei wird an die erste Elektrode 601 ein erstes elektrisches Potential V(E1) angelegt, an die zweite Elektrode 602 ein zweites elektrisches Potential V(E2) und an die dritte Elektrode 603 ein drittes elektrisches Potential V(E3).

Während der eigentlichen Messphase, die grundsätzlich analog der Vorgehensweise aus dem Stand der Technik, wie oben beschrieben wurde, erfolgt, wird ein abhängig von dem Vorzeichen der Ladung, jeweils folgendes Potentialgefälle der elektrischen Potentiale an die Elektroden 601, 602, 603 angelegt derart, dass gilt:

V(E3) < V(E1) < V(E2).

Weist beispielsweise die dritte Elektrode 603 ein positives elektrisches Potential V(E3) auf, so weist die dritte Elektrode 603 das größte elektrische Potential der Elektroden 601, 602, 603 des Biosensors 600 auf.

Dies bewirkt, dass die erzeugten ersten Teilmoleküle 614 mit negativer Ladung aufgrund des größten elektrischen Potentials V(E3), das an der dritten Elektrode 603 anliegt, zu der positiv geladenen dritten Elektrode 603 gezogen wird, und nicht mehr, wie gemäß dem Stand der Technik, zu der ersten Elektrode 601.

Folglich wird in diesem Ausführungsbeispiel die erste Elektrode 601 nicht mehr sowohl als Halte-Elektrode zum Halten der Sondenmoleküle und als Messelektrode zum Oxidieren oder Reduzieren der jeweiligen Teilmoleküle verwendet. Vielmehr dient die Elektrode 601 nur zum Immobilisieren der Sondenmoleküle bzw. den Komplexen aus Sondenmolekülen und zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren.

Die Funktion der Elektrode, an der die Oxidation bzw. Reduktion der erzeugten Teilmoleküle stattfindet, übernimmt nunmehr die dritte Elektrode 603.

Anschaulich bedeutet dies, dass mittels der dritten Elektrode 603 die erste Elektrode 601 von den gespaltenen Teilmolekülen abgeschirmt wird.

Auf diese Weise kann als weiterer Vorteil bei dieser Ausführungsform die Bedeckung der ersten Elektrode mit den DNA-Sondenmolekülen 607 erheblich erhöht werden.

An der dritten Elektrode 603 erfolgt eine Oxidation der negativ geladenen Teilmoleküle 614 und die oxidierten ersten Teilmoleküle 615 werden zu der zweiten Elektrode 602 gezogen, da diese das kleinste elektrische Potential V(E2) aller Elektroden 601, 602, 603 in dem Biosensor 600 aufweist.

An der zweiten Elektrode 602 erfolgt eine Reduktion der oxidierten Teilmoleküle und die reduzierten Teilmoleküle 616 werden wiederum an die dritte Elektrode 603 gezogen, wo wiederum eine Oxidation erfolgt.

Auf diese Weise ergibt sich vorliegend - analog zu der im Stand der Technik bekannten Weise - ein Kreisstrom, der ebenfalls auf bekannte Weise erfasst wird. Somit ergibt sich auch hier ein Verlauf des Kreisstroms über die Zeit als Signal. Aus diesem kann (mittels des über die Markierung 608 gebundenen Enzyms 611) aufgrund der Proportionalität des Kreisstroms zu der Anzahl der durch das Enzym 611 erzeugten Ladungsträger wiederum die Anzahl der hybridisierten DNA- Stränge 607 und somit der zu erfassenden DNA-Moleküle 609 ermittelt werden.

Allerdings sei hier angemerkt, dass ein Redox-Recycling Verfahren im Sinne der Erfindung auch mit der bekannten "2- Elektroden-Anordnung" gemäß Fig. 4 durchgeführt werden kann. Dann kann jedoch nicht auf den Vorteil des hier beschriebenen Biosensors 600 zurückgegriffen werden, der durch die Ausgestaltung der Elektrode 601 als Immobilisierungselektrode, eine höhere Bedeckungsdichte als die aus dem Stand der Technik bekannte Anordnung erlaubt.

Fig. 7a zeigt eine Elektrodenanordnung 700 mit einer ersten Elektrode 701 und einer zweiten Elektrode 702, die in einer Isolatorschicht 703 aus Isolatormaterial angeordnet sind.

Die erste Elektrode 701 ist mit einem ersten elektrischen Anschluss 704 versehen und die zweite Elektrode 702 ist mit einem zweiten elektrischen Anschluss 705 versehen.

Die erste Elektrode 701 und die zweite Elektrode 702 weisen beide eine regelmäßige Anordnung aus Einheiten zum Immobilisieren 706 auf, wobei die Einheiten 706 als Nanopartikel aus Gold ausgebildet sind.

Alternativ können die Einheiten 706, wie vorstehend beschrieben, auch aus Siliziumoxid hergestellt sein. Diese können ebenfalls mit einem der oben aufgeführten Materialien beschichtet werden, das geeignet ist, die Sondenmoleküle darauf zu immobilisieren.

Auf den Einheiten 706 zum Immobilisieren der Elektroden 701, 702 sind DNA-Sondenmoleküle 707, 708 aufgebracht.

Auf der ersten Elektrode 701 sind erste DNA-Sondenmoleküle 707 mit einer zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz komplementären Sequenz aufgebracht (Fig. 7b).

Auf der zweiten Elektrode 702 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 708 mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz ist, aufgebracht (Fig. 7b).

Fig. 7b zeigt ferner einen Elektrolyten 709, der mit den Elektroden 701, 702 und den DNA-Sondenmolekülen 707, 708 in Kontakt gebracht wird.

Fig. 7c zeigt die Elektrodenanordnung 700 für den Fall, dass in dem Elektrolyt 709 DNA-Stränge 710 mit der vorgegebenen ersten Sequenz enthalten sind, die komplementär ist zu der Sequenz der ersten DNA-Sondenmoleküle 707.

In diesem Fall hybridisieren die zu den ersten DNA- Sondenmolekülen komplementären DNA-Stränge 710 mit den ersten DNA-Sondenmolekülen 707, die auf der ersten Elektrode 701 aufgebracht sind.

Da die Sequenzen von DNA-Strängen nur mit der jeweils spezifischen Komplementärsequenz hybridisieren, hybridisieren die zu den ersten DNA-Sondenmolekülen komplementären DNA- Stränge nicht mit den zweiten DNA-Sondenmolekülen 708.

Wie aus Fig. 7c ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung, dass auf der ersten Elektrode 701 hybridisierte Moleküle aufgebracht sind, d. h. doppelsträngige DNA-Moleküle. Auf der ersten Elektrode sind nur die zweiten DNA-Sondenmoleküle 708 als weiterhin einsträngige Moleküle vorhanden.

In einem weiteren Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens beispielsweise durch die oben beschriebene Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 709 eine Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 708 der zweiten Elektrode 702 bewirkt.

Nach Entfernen der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle, d. h. der zweiten DNA-Sondenmoleküle 708 auf der zweiten Elektrode 702 sind lediglich die Doppelstrang-Moleküle aus den DNA- Strängen 710 mit den ersten DNA-Sondenmolekülen 707 (vgl. Fig. 7d).

Mittels eines an die Elektrodenanschlüsse 704, 705 angeschlossenen Messgeräts (nicht dargestellt) erfolgt gemäß diesem ersten Ausführungsbeispiel eine Kapazitätsmessung zwischen den Elektroden 701, 702 in dem in Fig. 7b dargestellten Zustand, d. h. in nicht-hybridisiertem Zustand.

Im Rahmen der ersten Kapazitätsmessung wird ein Referenz- Kapazitätswert ermittelt und in einem Speicher (nicht dargestellt) gespeichert.

Eine zweite Kapazitätsmessung erfolgt, nachdem die einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 708 von der jeweiligen Elektrode entfernt worden sind.

Dies erfolgt wiederum mittels des nicht dargestellten Messgeräts. Mittels der zweiten Kapazitätsmessung wird ein Kapazitätswert ermittelt, der mit dem Referenz-Kapazitätswert verglichen wird.

Ist der Differenzwert zwischen diesen Kapazitätswerten größer als ein vorgegebener Schwellenwert, so bedeutet dies, dass in dem Elektrolyt 710 DNA-Stränge enthalten waren, die entweder mit den ersten DNA-Sondenmolekülen oder mit den zweiten DNA- Sondenmolekülen hybridisiert sind.

In diesem Fall wird ein entsprechendes Ausgangssignal von dem Messgerät dem Benutzer des Messgeräts ausgegeben.

Es ist in diesem Zusammenhang anzumerken, dass je nach verwendetem Stoff zum Entfernen der einzelsträngigen DNA- Sondenmoleküle 708 auf der zweiten Elektrode der einzelsträngige Anteil der hybridisierten DNA-Stränge 710 erhalten bleiben oder auch entfernt werden kann.

Das Verfahren gemäß diesem Ausführungsbeispiel hat im Vergleich zu dem aus [1] oder [4] bekannten Verfahren den Vorteil, dass ein robusteres Messsignal erzielt wird. Es wird nämlich hier eine größere Veränderung in dem Impedanzsignal zwischen dem Zustand, in dem keine Fängermoleküle oder ausschließlich Fängermoleküle auf den Elektroden angebracht sind und dem Zustand, dass zumindest teilweise eine Bindung mit den nachzuweisenden makromolekularen Biopolymeren erfolgt hat, erreicht.

Allerdings ist es im Sinne der Erfindung selbstverständlich auch möglich, das in [1] und [4] beschriebene Verfahren mit Hilfe von Elektroden durchzuführen, die die hier offenbarten nanopartikelförmigen Einheiten zum Immobilisieren aufweisen.

In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] R. Hintsche et al., Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al., Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267-283, 1997
[2] R. Hintsche et al. Microbiosensors using electrodes made in Si-technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al. Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, 1997
[3] M. Paeschke et al. Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1-8, 1996
[4] P. von Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S. 907-910, 16.-19. Juni 1997
[5] N. L. Thompson, B. C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluorescence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58-64, 1997P.
[6] Cuatrecasas, Affinity Chromatography of Macromolecules, Advances in Enzymology, Vol. 36, S. 29-89, 1972
[7] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 280, 1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.
[8] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 397, 1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.
[9] J. Dodt et al., Skript zum biochemischem Praktikum IId (Immunchemie), ELISA, S. 1, Institut für Biochemie, Technische Hochschule Darmstadt, Beschreibung des Versuchs ELISA, 10.-28. Februar 1992.
[10] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 157-160, Molecular Probes, Inc. 1996
[11] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 83-84, Molecular Probes, Inc. 1996
[12] J. P. Spatz et al., Mineralization of Gold Nanoparticles in a Block Gold Copolymer Microemulsion, Chem. Eur. J., Vol. 2, S. 1552-1555, 1996
[13] J. P. Spatz et al., Ordered Deposition of Inorganic Cluster from Micellar Block Copolymer Films, Langmuir, Vol. 16, S. 407-415, 2000
[14] F. Burmeister et al., Mit Kapillarkräften zu Nanostrukturen, Physikalische Blätter, Vol. 36, S. 49- 51, 2000

Bezugszeichenliste

100

Biosensor

101

Schicht aus Substratmaterial

102

Schicht aus zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren nicht geeignetem Material

103

Nanopartikel aus Gold

104

DNA-Fängermolekül

200

Sensor

201

Elektrode

202

Elektrode

203

Isolator

204

Elektrodenanschluss

205

Elektrodenanschluss

206

DNA-Sondenmolekül

207

Elektrolyt

208

DNA-Stränge

300

Biosensor

301

Fotodiode

302

Fotodiode

303

Isolator

304

Oxidschicht

305

Schicht aus zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren nicht geeignetem Material

306

Nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren

307

Elektrischer Anschluss

308

Elektrischer Anschluss

309

DNA-Sondenmolekül

310

DNA-Sondenmolekül

311

Fluorophor

312

Fluorophor

313

Elektrolyt

314

DNA-Stränge

315

Pfeil

316

Pfeil

400

Biosensor

401

Erste Elektrode

402

Zweite Elektrode

403

Isolatorschicht

404

Haltebereich erste Elektrode

405

DNA-Sondenmolekül

406

Elektrolyt

407

DNA-Strang

408

Enzym

409

Spaltbares Molekül

410

Negativ geladenes erstes Teilmolekül

411

Pfeil

412

Weitere Lösung

413

Oxidiertes erstes Teilmolekül

414

Reduziertes erstes Teilmolekül

500

Diagramm

501

Elektrischer Strom

502

Zeit

503

Kurvenverlauf Strom-Zeit

504

Offsetstrom

600

Biosensor

601

Erste Elektrode

602

Zweite Elektrode

603

Dritte Elektrode

604

Isolatorschicht

605

Haltebereich

606

Nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren

607

DNA-Sondenmoleküle

608

Markierung

609

DNA-Stränge

610

Elektrolyt

611

Enyzm

612

weitere Lösung

613

spaltbares Molekül

614

Negativ geladenes erstes Teilmolekül

615

Oxidiertes erstes Teilmolekül

616

Reduziertes erstes Teilmolekül

700

Elektrodenanordnung

701

Elektrode

702

Elektrode

703

Isolator

704

elektrischer Anschluss

705

elektrischer Anschluss

706

Nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren

707

DNA-Sondenmoleküle

708

DNA-Sondenmoleküle

709

Elektrolyt

710

DNA-Doppelstränge

Claims (19)

1. Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, wobei die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von Biopolymeren ein Nanopartikel ist,

• a) bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen wird, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können,
• b) bei dem eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht wird, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann,
• c) bei dem in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden werden,
• d) bei dem die makromolekularen Biopolymere mittels eines durch eine Markierung ausgesandten Signals erfasst werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren auf einer Elektrode oder einer Photodiode aufgebracht ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem mehrere Einheiten zum Immobilisieren auf der Elektrode oder der Photodiode in einer regelmäßigen Anordnung aufgebracht sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Markierung an dem Fängermolekül angebracht ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Markierung an dem zu erfassenden makromolekularen Biopolymer angebracht ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Markierung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Farbstoffen, Radioisotopen, Enzymen und Enzym-Liganden besteht.

7. Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung, die aufweist:
eine erste Elektrode,
eine zweite Elektrode,
wobei die erste Elektrode mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren versehen ist, wobei die Einheit zur Immobilisierung ein Nanopartikel ist,

• a) bei dem die, auf der ersten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen wird, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können,
• b) bei dem ein Medium mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird, wobei das zu untersuchende Medium die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann,
• c) bei dem in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden werden,
• d) bei dem die makromolekularen Biopolymere mittels einer elektrischen Messung erfasst werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7,
wobei die zweite Elektrode mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren versehen ist, wobei die Einheit zur Immobilisierung ein Nanopartikel ist, und
bei dem die, auf der zweiten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen wird, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können.

9. Verfahren nach Anspruch 8,
bei dem vor Schritt a) oder Schritt b) eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird,
bei dem nach Schritt c) eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird, und
bei dem abhängig von einem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden die makromolekularen Biopolymere erfasst werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9,
bei dem die auf der ersten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit ersten Fängermolekülen versehen ist, die makromolekulare Biopolymere eines ersten Typs binden können und,
bei dem die auf der zweiten Elektrode befindliche mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit zweiten Fängermolekülen versehen ist, die makromolekulare Biopolymere eines zweiten Typs binden können,
bei dem ein Medium mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird derart, dass
für den Fall, dass sich in dem Medium makromolekulare Biopolymere des ersten Typs befinden, diese an die ersten Fängermoleküle binden können,
für den Fall, dass sich in dem Medium makromolekulare Biopolymere des zweiten Typs befinden, diese an die zweiten Fängermoleküle binden können,
bei dem nicht gebundene erste Fängermoleküle oder zweite Fängermoleküle von der jeweiligen Elektrode entfernt werden,
bei dem anschließend die zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, oder Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen erfasst werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11,
bei dem als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, und
bei dem als Fängermoleküle Liganden verwendet werden, die die Proteine oder Peptide spezifisch binden können.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem nicht gebundene Liganden von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Material mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, wobei das Material imstande ist, die chemische Verbindung zwischen dem Liganden und der Einheit zum Immobilisieren zu hydrolysieren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Material, das mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, ein Enzym ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Enzym, das mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) ist.

16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem als makromolekulare Biopolymere DNA- oder RNA- Moleküle erfasst werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16,
bei dem als makromolekulare Biopolymere DNA-Einzelstränge mit einer vorgegebenen Nukleotidsequenz erfasst werden, und
bei dem als Fängermoleküle Moleküle DNA-Sondenmoleküle mit einer zu der vorgegebenen Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz verwendet werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem nicht gebundene DNA-Sondenmoleküle von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Enzym mit Nukleaseaktivität mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem als Enzym mit Nukleaseaktivität mindestens einer der folgenden Stoffe verwendet wird:
Nuklease aus Mung-Bohnen,
Nuklease P1,
Nuklease S1, oder
DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.