DE10307402A1

DE10307402A1 - Vorrichtung zum elektrochemischen Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen

Info

Publication number: DE10307402A1
Application number: DE2003107402
Authority: DE
Inventors: Harald Lossau
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Priority date: 2001-08-25
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2004-09-09

Abstract

Eine Vorrichtung zum elektrochemischen Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, insbesondere zur Durchführung des Verdrängungsassays nach zumindest einem der Verfahrensansprüche der Patentanmeldung 10141691.1, umfasst DOLLAR A - eine Messkammer (310) zur Aufnahme eines Messsubstrats (200) mit einer modifizierten Oberfläche, bei der die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Ligaten besteht, DOLLAR A - eine Zufuhreinrichtung (320-328) zum Zuführen von Signal-Liganden und einer Probe zu der modifizierten Oberfläche des Messsubstrats (200), DOLLAR A - eine Nachweiseinrichtung (340-370) zur Detektion der Signal-Liganden mit einer oberflächensensitiven, elektrochemischen Detektionsmethode, und DOLLAR A - eine Vergleichseinrichtung zum Vergleichen der durch die Nachweiseinrichtung ermittelten Messwerte mit Referenzwerten.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum elektrochemischen Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, insbesondere zur Durchführung des Verdrängungsassays nach zumindest einem der Verfahrensansprüche der Patentanmeldung 101 41 691.1.
Stand der Technik
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung so genannter DNA- oder Protein-Chips Anwendung. Auch bei den parallelen Verfahren beruht die eigentliche Detektion entweder auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.
Oligonukleotid- oder DNA-Chips können neben der Anwendung zur Sequenzierung auch zur SNP- (Single-Nucleotide-Polymorphism) oder Genexpressions-Analyse verwendet werden, da sie es erlauben, das Aktivitätsniveau einer großen Anzahl individueller aktiver Gene (cDNA oder mRNA) eines spezifischen Zelltyps oder Gewebes parallel zu messen, was mit konventionellen (seriellen) Gendetektionsmethoden nur schwer oder unter großem Aufwand möglich ist. Die Analyse pathologisch veränderter Genaktivitäten wiederum kann zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen und zur Identifizierung neuer therapeutischer Angriffspunkte beitragen. Daneben ermöglichen (nur) DNA-Chips so genannte pharmakogenomische Untersuchungen während der klinischen Entwicklung, durch die die Wirksamkeit und Sicherheit der Medikamente deutlich erhöht werden kann. Bei den pharmakogenomischen Untersuchungen steht die Frage im Vordergrund, welche genetischen Faktoren dafür verantwortlich sind, dass Patienten unterschiedliche Reaktionen auf das gleiche Arzneimittel zeigen. Durch umfangreiche Polymorphismen-Analysen (Basenpaar-Mismatch-Analysen) von Genen, die wichtige Stoffwechsel-Enzyme kodieren, können Antworten auf solche Fragen gefunden werden.
Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Target-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert (gelesen) werden.
Protein-Chips, deren Test-Sites statt Sonden-Oligonukleotiden bestimmte Antigen- (oder Antikörper-)Sonden tragen, können in der Proteom-Analyse oder in der Parallelisierung der Diagnostik eingesetzt werden.
Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. die aufwendigen, gesetzlich vorgeschriebenen Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Materialien. Bei der Fluoreszenz- und massenspektrometrischen Detektion sind die Kosten der apparativen Ausstattung sehr hoch.
Die Nachteile der Markierung mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können z.T. umgangen werden, wenn Assoziationsereignisse anhand der damit verbundenen Änderung der elektrochemischen Eigenschaften detektiert werden (vgl. WO 97/46568, WO 99/51778, WO 00/31101, WO 00/42217).
Sowohl für die Protein- als auch für DNA-Analyse ist es wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA-Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen.
Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Arrays (low density DNA- und Protein-Chips mit wenigen bis wenigen hundert Test-sites pro cm² z. B. für so genannte POC (Point of Care)- Systeme) hoch.
Darstellung der Erfindung
Hier setzt die Erfindung an. Der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung eines Detektionsverfahrens für Ligat-Ligand-Assoziaten zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Vorrichtung nach Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:

DNA	Desoxyribonukleinsäure
RNA	Ribonukleinsäure
PNA	Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH₂)₂-N(COCH₂-Base)-CH₂CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A	Adenin
G	Guanin
C	Cytosin
T	Thymin
U	Uracil
Base	A, G, T, C oder U
Bp	Basenpaar
Nukleinsäure	wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphatoder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
nt	Nukleotid
Nukleinsäure-	Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nuk

Oligomer	leinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
ns-Oligomer	Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer	Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid	Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo	Abkürzung für Oligonukleotid.
Mismatch	Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss	single strand (Einzelstrang)
ds	double strand (Doppelstrang)
Substrat, Cofaktor, Coenzym	Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms)
Antikörper	Komplexbindungspartner eines Antigens
Antigen	Komplexbindungspartner eines Antikörpers
Rezeptor	Komplexbindungspartner eines Hormons
Hormon	Komplexbindungspartner eines Rezeptors
Oxidationsmittel	chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) oxidiert.

Reduktionsmittel	chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) reduziert.
redoxaktiv	redoxaktiv bezeichnet die Eigenschaft einer Einheit unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen.
EDTA	Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
sulfo-NHS	N-Hydroxysulfosuccinimid
NHS	N-Hydroxysuccinimid
EDC	(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES	N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris	Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Ligand	Bezeichnung für Moleküle, die von Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure-Oligomers).
Ligat	Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template).
Linker	molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül.

	In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartnern eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h., die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1 – 20, insbesondere der Kettenlänge 1 – 14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer	Äquivalent zu Linker.
Mica	Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo	Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachtem Monolayer aus derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und dadurch je eine Au-S-R Bindung bewirkt.
Au-S-(CH₂)₂-ds-oligo	Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-Spacer hybridisiert mit dem zu ss-oligo komplementären Oligonukleotid.
K_A	Assoziationskonstante für die Assoziation von Ligat und Ligand bzw. Ligat und Signal-Ligand
E	Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.

E_Ox	Potential beim Strom-Maximum der Oxidation einer reversiblen Elektrooxidation oder -reduktion.
i	Stromdichte (Strom pro cm² Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie	Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder – reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie	Aufzeichnung einer Strom/Zeitkuve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Chronocoulometrie	Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden.

Erfindungsgemäß umfasst die Vorrichtung zum elektrochemischen Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, insbesondere zur Durchführung des Verdrängungsassays nach zumindest einem der Verfahrensansprüche der Patentanmeldung 101 41 691.1, eine Messkammer zur Aufnahme eines Messsubstrats mit einer modifizierten Oberfläche, bei der die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Ligaten besteht, eine Zufuhreinrichtung zum Zuführen von Signal-Liganden und einer Probe zu der modifizierten Oberfläche, eine Nachweiseinrichtung zur Detektion der Signal-Liganden mit einer oberflächensensitiven, elektrochemischen Detektionsmethode, und eine Vergleichseinrichtung zum Vergleichen der durch die Nachweiseinrichtung ermittelten Messwerte mit Referenzwerten.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine separate Messkammer vorgesehen sein, in die das Messsubstrat eingebracht wird. Die Messkammer kann auch auf dem Messsubstrat angeordnet sein, so dass Messkammer und Messsubstrat eine gekapselte Einheit bilden, die zum Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen mit der Zufuhreinrichtung in Kontakt gebracht wird.
Das Verdrängungsassay der Hauptanmeldung 101 41 691.1 umfasst in seiner allgemeinsten Form die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Ligaten besteht, Bereitstellen von Signal-Liganden, Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen einer definierten Menge der Signal-Liganden mit der modifizierten Oberfläche, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Signal-Liganden und Vergleich der bei der Detektion der Signal-Liganden erhaltenen Werte mit Referenzwerten.
Die angesprochenen Referenzwerte werden insbesondere vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche jeweils neu bestimmt. Dazu wird nach Inkontaktbringen einer definierten Menge der Signal-Liganden mit der modifizierten Oberfläche eine Detektion der Signal-Liganden durchgeführt und erst danach die Probe mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht. Danach werden die Signal-Liganden ein zweites Mal detektiert und die bei der zweiten Detektion bestimmten Werte mit den bei der ersten Detektion bestimmten Referenzwerten verglichen.
In dem oben beschriebenen Verfahren kann zweckmäßig nach der ersten Detektion der Signal-Liganden die modifizierte Oberfläche gewaschen werden und nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche nochmals die gleiche definierte Menge an Signal-Liganden mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden. Erst danach wird die zweite Detektion der Signal-Liganden durchgeführt.
Weiter werden vorteilhaft in dem oben beschriebenen Verfahren nach dem Inkontaktbringen einer definierten Menge der Signal-Liganden mit der modifizierten Oberfläche, aber vor dem Waschen der modifizierten Oberfläche, Bedingungen eingestellt, die zur zumindest überwiegenden Dissoziation von Ligaten und Signal-Liganden führen. Dadurch wird bei dem anschließenden Wasch-Schritt ein möglichst großer Teil der Signal-Liganden von der Oberfläche entfernt.
Eine Bedingung, die in jedem Fall zu einer erhöhten Dissoziation von Ligaten und Signal-Liganden ist die Zugabe von chaotropen Salzen, vorteilhafterweise in einer Konzentration von wenigstens 3 mol/l. Werden als Ligat und als Signal-Ligand Oligonukleotide verwendet, so ist auch eine Temperaturerhöhung über die Schmelztemperatur des Ligat – Signal-Ligand – Oligonukleotids möglich, insbesondere bis wenigstens 5°C über die Schmelztemperatur, sowie das Anlegen eines Potentials, das über dem elektrostringenten Potential liegt, insbesondere eine Erhöhung des (negativen) Potentials um wenigstens 10 mV über das elektrostringente Potential. Werden als Ligat und als Signal-Ligand Antigen (bzw. Antikörper) und Antikörper (bzw. Antigen) verwendet, so kann eine erhöhte Dissoziation z. B. durch Zugabe von Harnstoff, vorteilhafterweise in einer Konzentration von wenigstens 3 mol/l, oder durch Zugabe eines Guanidinium-Salzes, vorteilhafterweise in einer Konzentration von wenigstens 3 mol/l, erreicht werden.
Die Schmelztemperatur des Ligat – Signal-Ligand – Oligonukleotids kann entweder bei den entsprechenden äußeren Bedingungen bestimmt werden, also bei gegebener Konzentration der Oligonukleotide, einem bestimmten Salzgehalt, einem bestimmten Salz, in Gegenwart dissoziationsfördernder organischer Lösungsmittel wie Formamid, DMF etc. Die Schmelztemperatur kann aber auch in weiten Bereichen relativ genau errechnet werden (siehe z. B. den im Internet verfügbaren Oligo-analyzer www.idtdna.com/program/main /home.asp).
Das Elektrodenpotential kann bei Elektroden-immobilisierten Ligaten-Oligonukleotiden mit assoziiertem Gegenstrang dazu benutzt werden, den polyanionischen Gegenstrang von der Elektrode zu verdrängen. Wie für die Schmelztemperatur beschrieben, kann auch dieses so genannte elektrostringente Potential für bestimmte äußere Parameter experimentell bestimmt werden.
Anionen chaotroper Salze für die Dissoziation von Doppelstrang-Oligonukleotiden sind z. B. CCl₃COO^–, CNS^–, CF₃COO^–, ClO₄ ^– , I^–, (siehe auch: Robinson und Grant, Journal of Biological Chemistry, 241, 1966, S. 1329ff und Kessler et al. US 5,753,433 ). Durch chaotrope Salze wird die Schmelztemperatur erniedrigt.
Die Erfindung der Hauptanmeldung betrifft außerdem die Verwendung von Substraten, Cofaktoren, Coenzymen, Proteinen, Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren, Hormonen und Nukleinsäure-Oligomeren als Ligaten und/oder Signal-Liganden und/oder Liganden in einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen.
Die Erfindung der Hauptanmeldung stellt somit ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen wie z. B. sequenzspezifischen Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen oder Antigen-Antikörper- Assoziaten anhand eines Verdrängungsassays zur Verfügung. Dabei dienen auf Oberflächen immobilisierte Ligate wie z. B. DNA-/RNA-/PNA-Oligomer-Einzelstränge oder Antigene, die an einer Oberfläche gebunden sind, als Assoziationsmatrix (Sonde) zum Nachweis bestimmter Targets (z. B. bestimmter Oligonukleotide, DNA-Fragmente oder bestimmter Antigene). Zunächst werden die Ligaten der Assoziationsmatrix mit einer Lösung von Signal-Liganden in Kontakt gebracht, wodurch einige der Signal-Liganden an die oberflächenimmobilisierten Ligaten komplexiert werden und die restlichen Signal-Liganden in der überstehenden Lösung bleiben. Die Signal-Liganden sind so gewählt, dass die Oberflächen-Assoziate aus Ligat und Signal-Ligand eine Assoziationskonstante besitzen, die geringer ist als die Assoziationskonstante zwischen Ligat und Ligand. Daneben fungieren die Signal-Liganden entweder selbst als signalgenerierende Substanz für die Detektion oder sie sind mit einer detektierbaren signalgenerierenden Substanz markiert. In einer ersten (Referenz-) Detektion werden die oberflächenimmobilisierten Signal-Liganden mit einer geeigneten oberflächensensitiven Messmethode (z. B. der total internal reflection fluorescence oder elektrochemischen Methoden wie z. B. der Chronocoulometrie) erfasst, die es erlaubt, zwischen oberflächenimmobilisierten Signal-Liganden und Signal-Liganden in der Volumenphase zu diskriminieren. Anschließend wird durch Zugabe der zu untersuchenden Ligandenenthaltenden Lösung zu der modifizierten Oberfläche ein Teil der Signal-Liganden vom Ligaten verdrängt, wodurch das ursprünglich im System Ligat / Signal-Ligand vorhandene Referenzsignal moduliert wird und qualitative wie quantitative Aussagen über Liganden in der Untersuchungslösung ermöglicht werden. In der allgemeinsten Ausführungsform besteht die Assoziationsmatrix aus nur einem Test-Site mit einem Ligaten.
Grundsätzlich erfolgt also die Bestimmung einer unbekannten Substanz (Ligand) durch Detektion einer dritten Verbindung (Signal-Ligand), die ebenso wie die unbekannte Substanz (Ligand) an ein Sonden-Molekül (Ligat) assoziiert. Bei Anwesenheit von Signal-Ligand und Ligand wird durch die stärkere Assoziationsfähigkeit der unbekannten Substanz (Ligand) zumindest ein Teil der Signal-Liganden aus dem vorher gebildeten assoziierten Komplex aus Signal-Ligand und Sonden-Molekül (Ligat) verdrängt.
Das Verdrängungsassay umfasst also ein Komplexierungsereignis zwischen einem Ligaten und einem Signal-Liganden, dem sich ein weiteres Komplexierungsereignis nach Zugabe des eigentlichen Targets (Ligand) anschließt, welches unter Verdrängung des Signal-Liganden erfolgt.
Oberflächensensitive Detektionsmethoden erlauben die Unterscheidung zwischen an eine Oberfläche assoziierten und im Überstand gelösten Markermolekülen. Als Detektionsmethoden eignen sich dabei elektrochemische, spektroskopische und elektrochemolumineszente Verfahren, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung die oberflächensensitive elektrochemische Detektion zum Einsatz kommt.
Bei elektrochemischen Methoden kann anhand der Kinetik der elektrochemischen Prozesse prinzipiell zwischen an eine Oberfläche adsorbierten und im Überstand gelösten redoxaktiven Detektionslabel unterschieden werden. Oberflächenadsorbierte Detektionslabel werden im Allgemeinen schneller elektrochemisch umgesetzt (z. B. oxidiert oder reduziert) als redoxaktive Detektionslabel aus der Volumenphase, da letztere vor der elektrochemischen Umsetzung erst zur (Elektroden-) Oberfläche diffundieren müssen. Beispiele für elektrochemische oberflächensensitive Methoden sind die Amperometrie und die Chronocoulometrie.
Die Methode der Chronocoulometrie erlaubt es, oberflächennahe redoxaktive Komponenten von (identischen) redoxaktiven Komponenten in der Volumenphase zu unterscheiden und ist z. B. in Steel, A.B., Herne, T.M. und Tailov M.J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670 – 4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben.
Das Messsignal der Chronocoulometrie (transferierte Ladung Q in Abhängigkeit von der Zeit t) setzt sich aus drei Komponenten zusammen: einem diffusi ven Anteil, der durch die gelösten redoxaktiven Komponenten in der Volumenphase hervorgerufen wird und eine t^½-Abhängigkeit aufweist, einen ersten instantanen Anteil, der aus der Ladungsumverteilung in der Doppelschicht (dl, double layer) an der Elektrodenoberfläche resultiert und einen zweiten instantanen Anteil, der durch die Umsetzung redoxaktiver Komponenten bedingt ist, die an der Elektrodenoberfläche adsorbiert (immobilisiert) sind.
Im chronocoulometrischen Experiment ist die Ladung Q als Funktion der Zeit t durch die Cottrell-Gleichung gegeben:
wobei
n: Anzahl der Elektronen pro Molekül für die Reduktion
F: Faraday Konstante [C/mol]
A : Elektrodenfläche [cm²]
D₀: Diffusionskoeffizient [cm²/s] C * / 0 : Konzentration [mol/cm³]
Q_dl: Kapazitive Ladung [C]
nFAΓ₀: Ladungen, die bei der elektrochemischen Umsetzung der adsorbierten redoxaktiven Detektionslabel umgesetzt werden, wobei Γ₀ [mol/cm²] die Oberflächenbelegungsdichte des Detektionslabels darstellt.
Der Term Γ₀ steht somit für die Menge an Detektionslabel an der Elektrodenoberfläche. Im chronocoulometrischen Experiment wird bei t = 0 die Summe der Doppelschicht-Ladungen und des Oberflächenüberschusses erhalten.
Ein chronocoulometrisch detektiertes Verdrängungsassay, wie es in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird, soll am Beispiel eines 20 nt Sonden- Nukleinsäureoligomers als Ligaten erläutert werden. Die mit 20 nt Ligat-Oligonukleotiden modifizierte Arbeitselektrode wird mit einer definierten Menge an Signal-Liganden, z. B. einem 12 nt Signal-Nukleinsäureoligomer, das ein oder mehrere Redoxlabel trägt und zu einem möglichst oberflächennahen Bereich des Ligat-Oligonukleotids komplementär ist, in Kontakt gebracht, so dass eine Assoziation zwischen Ligat-Oligonukleotid und redox-markiertem ss-Nukleinsäureoligomer-Komplexbildner stattfinden kann. Danach wird die Arbeitselektrode anfangs auf ein Potential U₁ gesetzt, bei dem wenig bis gar keine Elektrolyse, also eine elektrochemische Änderung des Redoxzustands der Redoxmarkierung stattfinden kann. Dann wird die Arbeitselektrode durch einen Potentialsprung auf ein Potential U₂ gesetzt, bei dem die Elektrolyse der Redoxmarkierung im diffusionslimitierten Grenzfall stattfindet. Die transferierten Ladungen werden in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Anschließend wird die Probenlösung zugegeben, die das Ligand-Oligonukleotid enthalten soll oder kann, welches eine nt-Sequenz aufweist, die in einem Bereich zu den 20 nt der Ligat-Oligonukleotide komplementär ist. Nach Hybridisierung des Targets an die Ligat-Oligonukleotide und somit nach partieller Verdrängung der Signal-Liganden wird eine zweite elektrochemische Messung durchgeführt. Die Änderung (Abnahme) des instantanen Ladungssignals ist proportional zur Anzahl der verdrängten Signal-Oligonukleotide und ist somit proportional zur Anzahl der in der Untersuchungslösung vorhandenen Target-Oligonukleotide.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nachweiseinrichtung für die Detektion der Signal-Liganden an einem Messsubstrat eingerichtet, dessen modifizierte Oberfläche eine Mehrzahl von beabstandeten Teststellen aufweist, an die jeweils eine Art von Ligaten angebunden ist.
Die Nachweiseinrichtung weist mit Vorteil einen Kontaktkopf zur elektrischen Kontaktierung einer Mehrzahl von mit den beabstandeten Teststellen elektrisch verbundenen Kontaktflächen auf, der relativ zum Messsubstrat bewegbar ist. Beispielsweise kann das Messsubstrat ortsfest montiert sein und der Kontaktkopf wird zur Kontaktierung auf das Substrat zugefahren. Es liegt jedoch ebenfalls im Rahmen der Erfindung, den Kontaktkopf ortsfest zu montieren und das Messsubstrat motorisch oder von Hand in Kontakt mit dem Kontaktkopf zu bringen.
Zur Kontaktierung der Kontaktflächen weist der Kontaktkopf ein Prüfnadelarray mit elastischen Kontaktfedern auf, die um einen Federweg eindrückbar sind, um Toleranzen in dem Messsubstrat auszugleichen.
Die Nachweiseinrichtung ist mit Vorteil durch eine Amperometrie-, Chronocoulometrie- oder AC-Voltametrie-Nachweiseinrichtung gebildet. Sie weist bevorzugt einen Potentiostaten zum Anlegen verschiedener Potentiale, insbesondere eines Potentialsprungs an die modifizierte Oberfläche auf. Insbesondere ist vorteilhaft vorgesehen, mittels des Potentiostaten verschiedene Potentiale und insbesondere einen Potentialsprung an die mit den beabstandeten Teststellen elektrisch verbundenen Kontaktflächen anzulegen.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung weist die Nachweiseinrichtung eine Strom- oder Ladungsmesseinrichtung zur Messung des zwischen der modifizierten Oberfläche und einer Gegenelektrode fließenden Stroms oder der fließenden Ladung als Antwort auf einen Potentialsprung auf. Die Strom- oder Ladungsmesseinrichtung misst insbesondere den zwischen einer Teststelle und einer Gegenelektrode fließenden Strom oder die fließenden Ladung als Antwort auf einen Potentialsprung.
Die Strom- oder Ladungsmesseinrichtung ist mit Vorteil zur Abtastung der Strom- oder Ladungswerte eingerichtet. Bevorzugt ist dabei eine Abtastrate zwischen 50 kHz und 5 MHz, besonders bevorzugt zwischen 100 kHz und 2 MHz.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung weist die Nachweiseinrichtung Mittel zur Bestimmung der transferierten Ladung Q als Funktion der Zeit t aus dem gemessenen Strom auf. Diese Mittel können entfallen, wenn die Strom- oder Ladungsmesseinrichtung die zwischen der modifizierten Oberfläche bzw. einer Teststelle und der Gegenelektrode fließende Ladung direkt erfasst.
Weiter weist die Nachweiseinrichtung zweckmäßig Mittel zur Anpassung einer Geraden Q = a*(x–x₀) + b an den bestimmten oder gemessenen Ladungs-Zeit-Zusammenhang auf, wobei x = √t und x₀ eine Konstante zur Korrektur des Zeitnullpunktes ist, sowie Mittel zur Ausgabe des Achsenabschnitts b als Messwert des instantanen Ladungssignals.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung weist die Nachweiseinrichtung eine mit dem Kontaktkopf zusammenwirkende Multiplexeinrichtung auf, die zur Verringerung der kapazitiven Belastung jeweils nur eine Teilgruppe von Teststellen mit dem Potentiostaten und der Strom- oder Ladungsmesseinrichtung verbindet und die restlichen Teststellen durch Unterbrecher, wie Relais oder hochohmige Transistoren elektrisch abtrennt.
Die Messkammer weist vorteilhaft eine Temperaturregelung zur Einstellung einer Temperatur in der Messkammer auf, bevorzugt in einem Bereich zwischen etwa 0 °C und Zimmertemperatur.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Messkammer eine Referenzelektrode zur Definition angelegter Potentiale auf, insbesondere eine Ag/AgCl (sat. KCl) Elektrode.
Die Vergleichseinrichtung vergleicht die durch die Nachweiseinrichtung ermittelten Messwerte bevorzugt mit gespeicherten oder mit vorab gemessenen Referenzwerten. Die Referenzwerte können beispielsweise vom Hersteller ermittelt und der Vorrichtung fest einprogrammiert sein oder vor dem Inkon taktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche jeweils neu bestimmt werden.
Für weitere Details, Merkmale und vorteilhafte Ausgestaltungen des Verdrängungsassays der Hauptanmeldung wird auf die Offenbarung der 101 41 691.1 verwiesen, deren Inhalt insoweit in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Merkmale und Details der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung der Ausführungsbeispiele und den Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Dabei sind nur die für das Verständnis der Erfindung wesentlichen Elemente dargestellt. Es zeigt
1 eine schematische Darstellung der Detektion von Komplexbildungsereignissen mittels Verdrängungsassay;
2 eine chronocoulometrische Messung der sequenzspezifischen Hybridisierung eines 20mer-Nukleinsäure-Ligaten mit komplementärem Gegenstrang (Ligand) durch Detektion der durch die Hybridisierung verdrängten ferrocenmarkierten Tetramer-Signal-Liganden;
3 einen Biochip zur Durchführung eines Verdrängungsassays;
4 ein schematisches Blockschaltbild einer Messvorrichtung nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
5 den Potentialverlauf an einer Arbeitselektrode bei Durchführung eines Verdrängungsassays; und
6 die Abhängigkeit der transferierten Ladung Q von √t nach dem Potentialsprung von 5.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Zunächst wird mit Bezug auf die 1 und 2 das Prinzip eines Verdrängungsassays zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen am Beispiel der Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen kurz erläutert. Für eine ergänzende Darstellung wird auf die Hauptanmeldung 101 41 691.1 verwiesen, deren Offenbarung insoweit in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
In 1 bezeichnet das Bezugszeichen A ein Array mit über geeignete Linker x immobilisierten Ligat-Nukleinsäureoligomeren (zwei Test-Sites), B ein Array inkubiert mit einer Lösung von Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden, C ein Array mit an Ligat-Nukleinsäureoligomeren assoziierten Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden, D ein Array mit spezifischer Komplexierung eines Test-Sites mit Target und E ein Array mit spezifischer Komplexierung eines Ligat-Nukleinsäureoligomeren mit Target und mit an einen Ligat-Nukleinsäureoligomeren assoziierten Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden. Das Bezugszeichen 101 bezeichnet dabei ein Ligat-Nukleinsäureoligomer 1, 102 ein Ligat-Nukleinsäureoligomer 2, 103 einen Signal-Nukleinsäureoligomer-Ligand, 104 ein Detektionslabel, z. B. Ferrocen, 105 eine Oberfläche, z. B. Gold und 106 einen Nukleinsäureoligomer-Liganden. Weiter stellt ➀ die Zugabe eines Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden, ➁ die Hybridisierung, ➂ die Dissoziation und Entfernen der Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden und anschließende Zugabe des Nukleinsäu reoligomer-Liganden, ➃ die Zugabe des Nukleinsäureoligomer-Liganden und OO die Zugabe der Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden dar.
Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybriden durch das Verdrängungsassay anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Ligat-Nukleinsäureoligomere unterschiedlicher Sequenz mit einer Immobilisierungstechnik an verschiedene Teststellen (206 in 3) eines Träger gebunden. Mit der Anordnung der Ligat-Nukleinsäureoligomere bekannter Sequenz an definierten Positionen der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Nukleinsäureoligomer-Liganden oder einer (fragmentierten) Ligand-DNA detektierbar sein, um z. B. Mutationen im Nukleinsäureoligomer-Liganden aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäureoligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz verknüpft. Der DNA-Chip kann auch mit einem einzigen Ligat-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Ligat-Nukleinsäureoligomere werden beispielsweise Nukleinsäureoligomere wie DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente der Basenlänge 8 bis 25 verwendet.
Die so bereitgestellte Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden wird mit einer Lösung einer bestimmten Menge von Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden, z. B. mit Redox-Label markierten Nukleinsäureoligomeren inkubiert, die nur zu einem bestimmten Sequenzabschnitt des Ligat-Oligonukleotids hybridisierbar sind, nicht aber zur gesamten Sequenz des Ligat-Oligonukleotids. Dabei kommt es zur Ausbildung von Hybriden aus Ligat-Nukleinsäureoligomer und den Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden im Bereich komplementärer Sequenzen. Nach der Hybridisierung zwischen Ligat und Signal-Ligand wird in einer chronocoulometrischen Referenzmessung der oberflächenimmobilisierte Anteil der Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden bestimmt.
Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Ligand-Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden, assoziierten Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden und überstehender Lösung (mit freien, nicht oberflächenadsorbierten Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden) gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Ligand-Nukleinsäureoligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Ligat-Nukleinsäureoligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen (bzw. weiteren Bereichen als das Signal-Oligonukleotid) komplementär sind. Die ursprünglich assoziierten Signal-Oligonukleotide werden, zumindest teilweise, verdrängt.
Nach der Hybridisierung zwischen Ligat und Ligand wird in einer zweiten chronocoulometrischen Messung der Anteil der verbliebenen oberflächenimmobilisierten Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden bestimmt. Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten Bereichen komplementären) Ligand-Oligonukleotide. Diese Vorgehensweise entspricht dem Verfahrensweg ➀, ❷, ➃ der 1.
Alternativ können nach der Referenzmessung die Assoziate aus Ligat-Nukleinsäureoligomer und Signal- Nukleinsäureoligomer-Ligand an der Oberfläche, z. B. durch Temperaturerhöhung, dissoziiert und sämtliche Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden oder nur die Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden in der überstehenden Lösung durch Waschen entfernt werden, so dass nach der Referenzmessung die ursprünglich eingesetzte Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden zur Verfügung steht. Das Entfernen der Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden aus den Assoziaten mit den Ligat-Nukleinsäureoligomeren erfolgt im Allgemeinen durch Herausnehmen der modifizierten Oberfläche aus der die Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden enthaltenden Lösung und anschließendem Waschen der modifizierten Oberflä che. Dehybridisierende Bedingungen können dabei beim Waschen der modifizierten Oberfläche und/oder vor dem Entfernen der modifizierten Oberfläche aus der die Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden enthaltenden Lösung eingestellt werden. Im nächsten Schritt wird dann die Probenlösung mit Ligand-Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden gegeben und die möglicherweise vorhandenen Ligand-Oligonukleotide können unter beliebigen, dem Fachmann bekannten Stringenzbedingungen an die Ligat-Oligonukleotide hybridisiert werden. Im Idealfall kann durch das Einstellen der Stringenzbedingungen erreicht werden, dass ausschließlich komplementäre Ligand-Oligonukleotide an den Ligat-Oligonukleotiden hybridisiert bleiben, wohingegen "Ligand-Oligonukleotide", die ein oder mehrere Mismatches aufweisen, dehybridisieren. Überschüssige Untersuchungslösung mit nicht angebundenen Nukleinsäureoligomer-Liganden wird durch Waschen mit geeigneten Pufferlösungen entfernt. Anschließend wird – wie zur Durchführung der Referenzmessung – erneut mit der eine bestimmte Menge an Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden enthaltenden Lösung inkubiert und in der zweiten Messung der Anteil der noch an die Ligat-Oligonukleotide assoziierenden Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden bestimmt. Dies entspricht dem Verfahrensweg ➀, ❷, ➃, ➃ der 1.
In einer weiteren Alternative kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z. B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist. Dabei werden zunächst die Hybridisierung mit Nukleinsäureoligomer-Liganden und anschließend der Schritt ➃ durchgeführt (vgl. 1, Verfahrensweg mit dem Schritt ➃). In diesem Fall wird zunächst die Probenlösung mit Ligand-Oligonukleotiden zur Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden gegeben und gegebenenfalls unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Anschließend wird eine Lösung zugegeben, die eine bestimmte Menge an Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden enthält. Dann wird mit Hilfe einer Messung der Anteil an Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden bestimmt, der an die Ligat-Oligonukleotide assoziiert vorliegt, und die erhaltenen Werte mit dem bekannten Referenzsignal verglichen.
2 zeigt eine chronocoulometrische Messung der sequenzspezifischen Hybridisierung eines 20mer-Nukleinsäure-Ligaten mit komplementärem Gegenstrang (Ligand) durch Detektion der durch die Hybridisierung verdrängten ferrocenmarkierten Tetramer-Signal-Liganden. Die Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo erfolgt dabei in 3 Teilabschnitten, nämlich durch Darstellung der leitfähigen Oberfläche, Derivatisierung der Oberfläche mit dem Ligat-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt). Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Ligat-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen).
Zur Inkubation wird ein modifiziertes 20 by Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAG CGG ATA ACA CAG TCA CC-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Die Goldoberfläche eines Test-Sites wird mit einer ca. 5×10^–5 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0.1 molar in Wasser, pH 7.5) benetzt und 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S-Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt (Inkubationsschritt).
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Elektrode mit einer ca. 10^–5 bis 10^–1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7 – 7.5) oder mit einem anderen Thiol oder Disulfid (geeigneter Kettenlänge) komplett benetzt und 2 – 24h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S-Bindung.
Zur chronocoulometrischen Messung in Anwesenheit und Gegenwart von Ligand-Oligonukleotid wird das oben beschriebene HO-(CH₂)₂-SS-(CH₂)₂-modifizierte Oligonukleotid (Sequenz TAG CGG ATA ACA CAG TCA CC) auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (500 mM K₂HPO₄/KHP₂O₄ pH 7), Nachbelegung mit 1 mM Propanthiol in Wasser).
Nach Zugabe von komplementären zweifach ferrocengelabelten Nukleinsäure-Tetrameren (10 μM) wird ein Potentialsprungexperiment durchgeführt. Die durch chronocoulometrische Messung erhaltenen Werte sind in der Kurve 1 der 2 dargestellt. Nach Zugabe des komplementären Targets (5 μM) wird das Potentialsprungexperiment wiederholt. Die durch die anschließend wiederholte chronocoulometrische Messung erhaltenen Werte sind in der Kurve 2 der 2 dargestellt.
Der Durchmesser der verwendeten Goldelektrode betrug für die beispielhafte Messung der 2 6 mm, d.h. für die Immobilisierung der Ligat-Nukleinsäureoligomeren stand eine Fläche von 0.28 cm² zur Verfügung. Aus den Integralen der Kurven 1 und 2 der 2 ergibt sich eine Differenz von 70 × 10^–8 C (0,7 μC). Dieser Wert entspricht 2,5 μC/cm² bzw. 1.6 × 10¹³ Elektronen/cm². Bei Annahme einer maximalen Belegung mit Ligat-Oligonukleotiden, also einer Belegung mit 7 × 10¹² Ligat-Oligonukleotiden pro cm², wurden somit im Mittel mindestens ca. 2.2 Elektronen pro Ligat-Oligonukleotid umgesetzt, d.h. 2.2 Ferrocenlabel durch Hybridisierung des Ligat-Nukleinsäureoligomeren mit dem Nukleinsäureoligomer-Liganden verdrängt. Im Mittel sind somit 1.1 Tetramere von dem Ligat-Oligonukleotid verdrängt worden.
3 zeigt einen Biochip 200 zur Durchführung eines Verdrängungsassays. Der gezeigte Biochip 200 besteht aus einer isolierenden Trägerplatte aus Glas, oder Kunststoff (z.B. eine in der Elektroindustrie gebräuchliche Leiterplatte), die ein Leiterbild mit Leiterbahnen 202 und Anschlusskontaktflächen 204 trägt. Eine Mehrzahl von auf den Leiterbahnen angeordneten Teststellen 206 zum Aufbringen von Biomolekülen bilden gemeinsam die modifizierbare Oberfläche des Biochips 200. Der Biochip enthält 100 Kontaktflächen 204, darunter 96 Target-Kontaktflächen, von denen jeweils zwei benachbarte mit einer Teststelle elektrisch verbunden sind, zwei Kontaktstellen für die Gegenelektrode 208 und zwei Kontaktstellen für die interne Referenzelektrode 210.
Die Leiterbahnen 202 sind jeweils etwa 100 um breit und mit einem Abstand von etwa 200 μm (Mitte-Mitte) auf dem Biochip 200 angeordnet. Sie enden in den Kontaktflächen 204 aus galvanischem Feingold und einer Ausdehnung von 610 μm × 610 μm (24 mil × 24 mil). Die quadratischen Teststellen 206 auf den Leiterbahnen 202 weisen eine Ausdehnung von etwa 60 μm × 60 μm auf.
Das Layout der erfindungsgemäßen Messvorrichtung in der 4 in einem schematischen Blockschaltbild dargestellt. Die Messvorrichtung 300 enthält eine Messkammer 310, die zur Durchführung eines Verdrängungsassays beispielsweise einen oben beschriebenen Biochip 200 mit einer modifizierten Oberfläche aufnimmt. Der Biochip 200 kann dabei von Hand in die Messkammer 310 eingebracht, oder über eine Motorsteuerung 305 ein- und ausgefahren werden.
Im Ausführungsbeispiel weist die Messkammer 310 ein Volumen von etwa 100 μl auf. Die Flüssigkeitszufuhr erfolgt über eine Elektrolytflasche 320 und eine H₂O-Flasche 322 jeweils mit aufgeschraubtem Septum 324. Ein Piercingnadeldevice mit zwei Nadeln (Air in/Liquid out) wird für beide Flaschenarten benutzt. Der Druckausgleich in den Flaschen erfolgt über ein Ventil, wobei im Ausführungsbeispiel ein Belüftungsfilter 326 gegen Keime eingesetzt ist. Der Füllstand der Flaschen 320 und 322 wird mit einem kapazitiven Füllstandsensor 328 überwacht. Im Waste-Kreislauf 330 wird keine Füllstandsdetektion durchgeführt.
Die Temperatur in der Messkammer 310 ist über einen Peltierkühler 302 in einem Bereich zwischen etwa 0 °C und Zimmertemperatur einstellbar. Überwacht wird die momentane Temperatur von einem Temperaturfühler 304. Ein weiterer kapazitiver Füllstandssensor 306 erfasst den Füllstand in der Messkammer 310. Zur genauen Einstellung der angelegen Potentiale ist die Messkammer 310 weiter mit einer Hamilton Ag/AgCl Referenzelektrode 308 ausgestattet.
Bei der Durchführung eines Verdrängungsassays ist der Biochip 200 der 3 derart in der Messkammer angeordnet, dass nur der untere Bereich des Biochips mit der modifizierten Oberfläche von dem wässrigen Medium bedeckt ist. Der obere Bereich des Biochips mit den Kontaktflächen 204 ragt aus dem Flüssigkeitspegel nach oben heraus. Diese werden von einem beweglichen Kontaktkopf 340 elektrisch kontaktiert. Der Kontaktkopf 340 weist dazu ein Prüfnadelarray mit einer Mehrzahl elastischer Kontaktfedern auf. Nach Beladen der Messkammer mit dem Biochip 200 fährt der Kontaktkopf motorisch auf den Biochip 200, bis die Kontaktfedern um maximal ihren Federweg von etwa 0,4 mm eingedrückt sind. Die Andruckkraft auf die Kontaktflächen 204 liegt dann bei etwa 40 N. Durch die Elastizität der Kontaktfedern können so vorhandene Chiptoleranzen ausgeglichen werden.
Zur Weiterleitung elektrischer Signale sind die Kontaktfedern des Kontaktkopfes 340 mit einem Translatorboard 350 verbunden. Das Translatorboard 350 ist im Ausführungsbeispiel für 96 Ausgänge (je zwei für die 48 Kontaktflächen des Biochips 200, bzw. je ein Ausgang für einen alternativen Biochip mit 96 Teststellen) mit einem gemeinsam geschalteten Kontakt ausgelegt. Je ein weiterer Ausgang ist für die Gegenelektrode 208 und die interne Referenzelektrode 210 vorgesehen. Daneben sind in bekannter Weise ein Ausgang für Masse (GND) und die Abschirmung (Shield) vorgesehen.
Die 96 Leitungskanäle sind auf dem Translatorboard 350 in sechs Gruppen von je 8 × 2 Eingängen, die durch 8 Doppelrelais geschaltet werden, zusammengefasst, wobei zur Verringerung der kapazitiven Belastung die mengefasst, wobei zur Verringerung der kapazitiven Belastung die jeweils nicht angesprochenen Gruppen durch Relais abgetrennt werden. Ein gemeinsames weiteres Relais schaltet zwischen den beiden Kanälen der Doppelrelais um. Im Ausführungsbeispiel arbeitet das Translatorboard 350 rein passiv, enthält also keinen Verstärker.
Ein Potentiostat 360 dient dem Anlegen verschiedener Potentiale an eine oder mehrere der Kontaktflächen 204 relativ zur Referenzelektrode 308. Die Stromantwort der Teststellen 206 auf einen angelegten Potentialsprung wird über eine Strommesseinrichtung 370 erfasst. Ein Mikrocontroller 380 leitet die gemessenen Stromwerte zur Auswertung an eine Rechen-, Steuer- und Auswerteeinheit 390 weiter. Der Mikrocontroller 380 übernimmt auch die Steuerung der verschieden I/O Sensoren, Motoren, der Heizung und der Ventile (unter Bezugszeichen 385 zusammengefasst). Der Mikrokontroller 380, der Potentiostat 360 und andere elektrische Komponenten werden durch ein Schaltnetzteil 395 mit geringem Grundrauschen mit Strom versorgt.
Die Durchführung eines beispielhaften Verdrängungsassays wird nun am Beispiel einer der 48 Arbeitselektroden mit Bezug auf 5 und 6 näher erläutert. Die mit einer Sonde und einem Thiol belegte und mit einer Testlösung hybridisierte Arbeitselektrode des Biochips 200 wird zunächst in eine Signaloligolösung eingetaucht und nach einer vorbestimmten Inkubationsdauer, beispielsweise 10 min gemessen.
Die Arbeitselektrode kann beispielsweise mit 20 nt Ligat-Oligonukleotiden modifiziert sein. Als Signal-Nukleinsäureoligomer-Ligand wird dann beispielsweise ein 12 nt Signal-Nukleinsäureoligomer-Ligand verwendet, der ein oder mehrere Redoxlabel trägt und zu einem möglichst oberflächennahen Bereich des Ligat-Oligonukleotids komplementär ist, so dass eine Assoziation zwischen Ligat-Oligonukleotid und redox-markiertem ss-Nukleinsäureoligomer-Komplexbildner stattfinden kann.
Dann wird, wie in 5 gezeigt, die Arbeitselektrode auf ein Potential U₁ bezogen auf die Referenzelektrode gesetzt. Das Potential U₁ ist so gewählt, dass wenig bis gar keine Elektrolyse der Redoxmarkierung stattfindet. Bei Ferrocenmodifizierten Ligat-Oligonukleotiden wird beispielsweise U₁ = 0.1 V gegen Ag/AgCl (sat. KCl) gewählt. Zum Zeitpunkt t₀ beginnt die Messung mit der Abtastung des fließenden Stroms zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode. Die Stromwerte werden dabei im Ausführungsbeispiel mit einer Abtastrate von 500 kHz erfasst und ausgelesen.
Zum Zeitpunkt t1, im Ausführungsbeispiel zum Teilpunkt t₁ = t₀ + 1 ms, erzeugt der Potentiostat einen Potentialsprung an der Arbeitselektrode, bei dem das angelegte Potential sprunghaft auf einen Wert U₂ erhöht wird, bei dem die Elektrolyse der Redoxmarkierung im diffusionslimitierten Grenzfall stattfindet. Bei Ferrocen-modifizierten ss-Nukleinsäureoligomer-Komplexbildner wird beispielsweise U₂ = 0,5 V gegen Ag/AgCl (sat. KCl) gewählt. Die Stromwerte werden nach dem Potentialsprung für einige ms oder einige zehn ms bis zu einem Zeitpunkt t2 abgetastet. Im Ausführungsbeispiel ist t₂ = t₀ + 12 ms gewählt. Je nach Art der eingesetzten Signaloligos kann auch eine längere Messzeit erforderlich sein.
Aus dem Stromsignal I(t) wird dann durch Integration über die Zeit die transferierte Ladungsmenge Q(t) bestimmt. Anschließend wird die Ladungs-Zeit-Kurve auf den Zeitpunkt des Potentialsprungs t, als Zeitnullpunkt korrigiert. Nach einer Transformation t → x = √t zeigt die transformierte Ladungs-Zeit-Kurve Q(x) im diffusionsbegrenzten Teil im Wesentlichen lineares Verhalten. Dieser Bereich wird durch eine Gerade Q = a*(x-x₀) + b gefittet. Der Achsenabschnitt b bei dem Zeitnullpunkt x = x₀ stellt dann gerade den gewünschten Messwert für das instantane Ladungssignal dar. Dies ist in der Darstellung der 6 illustriert.
Anschließend wird die Probenlösung zugegeben, die potentiell ein Ligand-Nukleinsäureoligomer (Target) enthält, das eine nt-Sequenz aufweist, die in einem Bereich zu den 20 nt der Ligat-Oligonukleotide komplementär ist. Nach Hybridisierung des Targets an die Ligat-Oligonukleotide und somit nach partieller Verdrängung der Signal-Nukleinsäureoligomer-Liganden wird eine zweite elektrochemische Messung durchgeführt und erneut das instantane Ladungssignal b_Probe bestimmt. Die Änderung des instantanen Ladungssignals |b – b_Probe| ist proportional zur Anzahl der verdrängten Signal-Oligonukleotid-Liganden und ist somit proportional zur Anzahl der in der Untersuchungslösung vorhandenen Target-Oligonukleotide.
Alternativ zum einfachen Sprungexperiment nach 5 kann den Spannungen U₁ und U₂ jeweils eine Wechselspannung kleiner Amplitude (z.B. 10 mV) überlagert werden und die jeweils übertragene Ladung mittels dem elektrochemischen Verfahren ACV (alternating current voltammetry) bestimmt werden. Die Frequenz der Wechselspannung wird vorzugsweise in einem Bereich gelegt, in dem nur die Redoxmarkierungen der am Ligat gebundenen Signal-Liganden elektrolysiert werden und kapazitive Einflüsse nur einen geringen Einfluss haben, beispielsweise bei etwa 250 Hz. Auf diese Weise erhält man ebenfalls ein oberflächensensitives elektrochemisches Signal, das proportional zu der Anzahl der oberflächengebundenen Signal-Liganden ist. Die Abnahme dieses Signals durch Zugabe einer Untersuchungslösung mit Target-Oligonukleotiden ist ebenfalls proportional zur Anzahl der verdrängten Signal-Oligonukleotid-Liganden und somit proportional zur Anzahl der in der Untersuchungslösung vorhandenen Target-Oligonukleotide.
Es versteht sich, dass die Arbeitselektroden des Biochips 200 bevorzugt verschiedene Modifikationen aufweisen, um eine parallele Detektion verschiedener potentieller Ligat-Ligand-Assotiationsereignisse in einer Probensubstanz zu ermöglichen.
Während die Erfindung insbesondere mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsbeispiele gezeigt und beschrieben worden ist, versteht sich für den Fachmann, dass Änderungen in Gestalt und Einzelheiten gemacht werden können, ohne von dem Gedanken und Umfang der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend soll die Offenbarung der vorliegenden Erfindung nicht einschränkend sein. Statt dessen soll die Offenbarung der vorliegenden Erfindung den Umfang der Erfindung veranschaulichen, der in den nachfolgenden Ansprüchen dargelegt ist.

Claims

Vorrichtung zum elektrochemischen Nachweis von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, insbesondere zur Durchführung des Verdrängungsassays nach zumindest einem der Verfahrensansprüche der Patentanmeldung 101 41 691.1, mit – einer Messkammer (310) zur Aufnahme eines Messsubstrats (200) mit einer modifizierten Oberfläche, bei der die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Ligaten besteht, – einer Zufuhreinrichtung (320–328) zum Zuführen von Signal-Liganden und einer Probe zu der modifizierten Oberfläche des Messubstrats (200), – einer Nachweiseinrichtung (340–370) zur Detektion der Signal-Liganden mit einer oberflächensensitiven, elektrochemischen Detektionsmethode, und – einer Vergleichseinrichtung zum Vergleichen der durch die Nachweiseinrichtung ermittelten Messwerte mit Referenzwerten.
Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) für die Detektion der Signal-Liganden an einem Messsubstrat (200) eingerichtet ist, dessen modifizierte Oberfläche eine Mehrzahl von beabstandeten Teststellen (206) aufweist, an die jeweils eine Art von Ligaten angebunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) einen Kontaktkopf (340) zur elektrischen Kontaktierung einer Mehrzahl von mit den beabstandeten Teststellen (206) elektrisch verbundenen Kontaktflächen (204) aufweist, der relativ zum Messsubstrat (200) bewegbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kontaktkopf (340) zur Kontaktierung der Kontaktflächen (204) ein Prüfnadelarray mit elastischen Kontaktfedern aufweist, die um einen Federweg eindrückbar sind, um Toleranzen in dem Messsubstrat (200) auszugleichen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) durch eine Amperometrie-, Chronocoulometrie- oder AC-Voltametrie-Nachweiseinrichtung gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) einen Potentiostaten (360) zum Anlegen verschiedener Potentiale, insbesondere eines Potentialsprungs an die modifizierte Oberfläche aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 4 bis 6, soweit direkt oder indirekt auf Anspruch 3 rückbezogen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) einen Potentiostaten (360) zum Anlegen verschiedener Potentiale, insbesondere eines Potentialsprungs an die mit den beabstandeten Teststellen (206) elektrisch verbundenen Kontaktflächen (204) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) eine Strom- oder Ladungsmesseinrichtung (370) zur Messung des zwischen der modifizierten Oberfläche und einer Gegenelektrode fließenden Stroms oder der fließenden Ladung als Antwort auf einen Potentialsprung aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 oder 3 bis 8, soweit direkt oder indirekt auf Anspruch 2 rückbezogen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) eine Strom- oder Ladungsmesseinrichtung (370) zur Messung des zwischen einer Teststelle (206) und einer Gegenelektrode (208) fließenden Stroms oder der fließenden Ladung als Antwort auf einen Potentialsprung aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Strom- oder Ladungsmesseinrichtung (370) zur Abtastung der Strom- oder Ladungswerte, bevorzugt mit einer Abtastrate von 50 kHz bis 5 MHz, besonders bevorzugt von 100 kHz bis 2 MHz eingerichtet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) Mittel zur Bestimmung der transferierten Ladung Q als Funktion der Zeit t aus dem gemessenen Strom aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) Mittel zur Anpassung einer Geraden Q = a*(x-x₀) + b an den bestimmten oder gemessenen Ladungs-Zeit-Zusammenhang aufweist, wobei x = √t und x₀ eine Konstante zur Korrektur des Zeitnullpunktes ist, sowie Mittel zur Ausgabe des Achsenabschnitts b als Messwert des instantanen Ladungssignals.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, soweit direkt oder indirekt auf Anspruch 7 und 9 rückbezogen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (340–370) eine mit dem Kontaktkopf (340) zusammenwirkende Multiplexeinrichtung (350} aufweist, die zur Verringerung der kapazitiven Belastung jeweils nur eine Teilgruppe von Teststellen (206) mit dem Potentiostaten (360) und der Strom- oder Ladungsmesseinrichtung (370) verbindet und die restlichen Teststellen (206) durch Unterbrecher, wie Relais oder hochohmige Transistoren elektrisch abtrennt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (310) eine Temperaturregelung zur Einstellung einer Temperatur in der Messkammer (310), bevorzugt zwischen etwa 0 °C und Zimmertemperatur aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (310) eine Referenzelektrode (308) zur Definition angelegter Potentiale aufweist, insbesondere eine Ag/AgCl (sat. KCl) Elektrode.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Vergleichseinrichtung die durch die Nachweiseinrichtung (340–370) ermittelten Messwerte mit gespeicherten oder vorab gemessenen Referenzwerten vergleicht.