DE10220935B3

DE10220935B3 - Verfahren für die biochemische Analytik von DNA und zugehörige Anordnung

Info

Publication number: DE10220935B3
Application number: DE10220935A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr. Stanzel; Mathias Prof. Dr. Sprinzl
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2022-05-11
Also published as: WO2003095673A3; AU2003239756A1; DE10393051D2; WO2003095673A2; US20050164199A1; AU2003239756A8

Abstract

Insbesondere zur Erfassung von DNA in der Medizin, Umwelt und/oder Kriminalistik ist es bekannt, ein System mit immobilisierter DNA als analytisches Werkzeug bei der Analyse von Nukleinsäure zu verwenden. Erfindungsgemäß wird die immobilisierte DNA mit einer biokatalytisch aktiven Markierung, beispielsweise ein Enzym, und einem die katalytische Aktivität reversibel hemmenden Substanz als Inhibitor versehen oder aber es wird neben der immobilisierten biokatalytischen Markierung eine DNA immobilisiert, die mit einer Substanz versehen ist, welche die katalytische Aktivität der Markierung reversibel hemmen kann. Alternativ dazu kann eine immobilisierte biokatalytisch aktive Markierung mit einer DNA als Fänger versehen werden, die eine Substanz als Inhibitor trägt, der die Aktivität der Markierung reversibel hemmen kann. In weiterer Alternative kann ein Komplex aus einem doppelsträngige DNA bindenden Molekül und einer Substanz als Inhibitor verwendet werden, die durch Wechselwirkung mit der immobilisierten biokatalytisch aktive Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann. In allen Fällen wechselwirkt in einem ersten Zustand der Inhibitor bzw. der Verbindung aus Inhibitor und doppelsträngige DNA bindenden Molekül mit der biokatalytisch aktiven Markierung und definiert den inaktiven Zustand des Systems. Beim Binden, insbesondere Hybridisieren, der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA wird aufgrund der Bildung des Doppelstranges die Wechselwirkung zwischen ...

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von DNA, wobei ein System mit immobilisierten DNA s als analytisches Werkzeug verwendet wird. Daneben bezieht sich die Erfindung auf die zugehörige Anordnung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die biochemische Analytik von DNA hat insbesondere in der Medizin und Umweltanalytik sowie der Forensik Bedeutung. Dabei werden eine als immobilisierte biokatalytisch aktive Markierung, insbesondere ein Enzym, eine immobilisierte DNA und als Inhibitor eine immobilisierte Substanz, die die Aktivität des Enzyms reversibel hemmen kann, als Werkzeuge für die Analyse von Nukleinsäuren angewandt.

Bei der Erfindung werden unter DNA (Deoxyribonucleic Acid) eine Desoxyribonukleinsäure und deren Strukturanaloga verstanden. Diese sind insbesondere PNA (Peptide Nucleic Acid), „Caged"-DNA, RNA (Ribonucleic Acid) und alle 2'-substituierten DNA-Abkömmlinge. Keine Anwendung findet die Erfindung auf Ribozyme. In diesem Zusammenhang wird auf die Veröffentlichung „Catalytic Molecular Beacons" in CHEMBIOCHEM 2001, 2, 411 – 415 verwiesen.

Ziel der aktuellen Entwicklung in der biochemischen Analytik ist eine molekulare Analyse auf der Ebene von DNA und/oder Genexpression, wobei letzteres insbesondere über die Analyse von cDNA (complementary DNA) erfolgt. Dies erlaubt eine Identifikation und Typisierung von Erbgut enthaltenden Krankheitserregern, wie Bakterien, Viren od. dgl., sowie die Klärung eventuell vorhandener Resistenzen. Weiterhin ist damit der Nachweis von Organismen in der Umweltanalytik, Lebensmitteltechnologie und Landwirtschaft zu führen. Darüber hinaus bietet diese Art der DNA-Analyse in der Medizin die Möglichkeiten einer schnellen Erbkrankheits-, Prädispositions- und/oder Tumordiagnostik sowie weiter in der Therapiekontrolle bei der medizinischen Behandlung.

Gemäß dem Stand der Technik wird immobilisierte DNA als analytisches Werkzeug bei der Sequenzanalyse von Nucleinsäuren angewandt. Dazu wird synthetische DNA von einer Länge bis zu 100 Nucleotidbausteinen (DNR-Oligonukleotide) über eine aktive Gruppe mit einer geeigneten Oberfläche kovalent verknüpft. Als Oberflächen können Silikate, Metallschichten, beispielsweise Gold od. dgl., oder auch verschiedene Polymerschichten dienen.

Letztere Technologie ist weit entwickelt und ermöglicht die spezifische Immobilisierung von DNA-Oligonukleotiden bestimmter Sequenz an Flächen mit einem Durchmesser von bis zu einigen μm bzw. in Volumina mit einem Inhalt von bis zu einigen n1. An diesen, mit den sog. DNA-Fängern („catcher") besetzten Flächen bzw. Volumina können dann komplementäre DNA-Moleküle aus der Probe gebunden werden. Die Spezifität dieser Bindung ist durch die Regel der komplementären Basenpaarung der DNA definiert. Bei einem Angebot von DNA-Molekülen mit verschiedener Sequenz in der Analyten-Lösung werden solche DNA-Moleküle an den „catcher" binden, welche am besten den Basenpaarungsregeln entsprechen und bei der Komplexbildung die größte Energie freisetzen.

Eine spezifische Auswahl – die sog. Stringenz – der äußeren Bedingungen – wie Temperatur, Innenstärke etc. – während der Bindung durch Hybridisierung führt dazu, dass selektiv nur die stabilsten Paarungen von „catcher" – und Analyt-DNA erhalten bleiben – also solche, die den Basenpaarungsregeln vollkommen entsprechen.

Letzteres ist die Grundlage der DNA-Analytik auf sog. DNA-Chips. Die generellen Vorteile einer solchen DNA-Analyse auf Chips ist in der starken Miniaturisierung, der Synchronisierung und der hohen Geschwindigkeit des gesamten Prozesses gegenüber herkömmlichen Methoden zu sehen. Aufgrund des geringeren Bedarfs an Reagenzien und Probenmaterial geht dies mit einer Kostenreduktion einher. Darüber hinaus führt der Einsatz von DNA-Chips zu einer Steigerung der Effizienz und der Präzision des DNA-Analysevorgangs.

Die verschiedenartigen DNA-Chips unterscheiden sich insbesondere durch die Wahl des Substrats, wie Kunststoff, Glas, Silizium etc., die Methode der Immobilisierung, z.B. Gold-Thiol-Koppelung, Immobilisierung in Gel od. dgl., der Technologie der Auftragung an die feste Oberfläche, wie on-line Synthese, Auf dispensieren od. dgl., und der Art der Detektion, insbesondere optisch und/oder elektrochemisch, der DNA-Wechselwirkungen.

Am meisten verbreitet sind die spektroskopischen Systeme, bei welchen die zu analysierende DNA mit einer fluoreszierenden Reportergruppe mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) oder SDA (Strand Displacement Amplification) versehen werden, wie es anhand der 1 schematisch verdeutlicht ist. Im Einzelnen stellen dort die Kreise die spektroskopischen Reportergruppen dar, welche direkt über PCR/SDA oder indirekt, über sogenannte fluoreszierende Signal-Oligonukleotide, die in einem sog. Sandwitch-Hybridisierungs-Assay eingeführt wurden mit der Analyt-DNA gekoppelt sind. Nach der Entfernung der nicht bindenden oder schwach bindenden Analyt-DNA durch Anlegen sog. stringenter Bedingungen, z.B. hohe Temperatur, niedere Innenstärke, organisches Lösungsmittel, können die Stellen, an welchen die Wechselwirkung stattgefunden haben, mit Fluoreszenzmikroskopie, Flächendetektoren oder einer CCD-Kamera sichtbar gemacht werden. Die Bereiche an der Oberfläche, an welcher die Wechselwirkung zwischen Fänger und Analyt-DNA stattgefunden hat, erscheinen als Flecke mit veränderten optischen Eigenschaften. Da die Position der unterschiedlichen „catcher"-DNA's auf dem Chip bekannt ist, kann die entsprechend komplementäre DNA in den Analytproben eindeutig identifiziert werden.

DNA-Chips mit einigen tausend verschiedenen Oligonucleotiden/cm² sind kommerziell zusammen mit optischer Detektion und Auswertesystemen erhältlich.

Bei optischen Detektionssystemen sind vergleichsweise komplizierte Lese- und Auswertegeräte notwendig, welche die Anwendung der DNA-Chip-Technologie augenblicklich in erster Linie auf spezialisierte Laboratorien einschränkt. Es ist zweifelhaft, ob die DNA-Analytik dieser Art in der Feldanalyse, z.B. in landwirtschaftlichen Betrieben, in der Lebensmittelindustrie, der Umweltanalytik oder produktionsbegleitender Analytik sowie beim niedergelassenen Arzt eine breite Anwendung finden kann. Bereits die Vorbereitung der Proben mittels PCR bzw. SDA und/oder die Einführung der spektroskopischen Reportergruppen in die Analyt-DNA's ist zeit und kostenintensiv und u.U. mit technologischen Problemen behaftet.

Elektrochemische Verfahren, die DNA-DNA-Wechselwirkungen detektieren, bieten den Vorteil kleiner, robuster sog. „Handheld"-Geräte, die u.U. für einen Batteriebetrieb vor Ort geeignet sind. Die elektrochemische Bestimmung der DNA-Hybridisierung nutzt bisher meistens die Erhöhung der Leitfähigkeit der doppelsträngigen DNA nach der Hybridisierung. Technisch wenig ausgereift sind die auf der Änderung der Leitfähigkeit der DNA nach der Hybridisierung basierenden Analyseverfahren. Bei starken elektrischen Feldern kommt es hier zur DNA-Schädigung und damit zum Signalverlust. Außerdem wird die Leitfähigkeit der DNA mit der zunehmenden Länge der Doppelhelix stark eingeschränkt. Keine der bisher angewandten Methoden erlaubt eine quantitative Bestimmung der DNA-Hybridisierung.

Einen robusten Lösungsansatz die DNA-Hybridisierung einer elektrochemischen Messung zugänglich zu machen bieten sog. Redox(re)cycling-Tests. Dabei wird beispielsweise das Hybri disierungsereignis zwischen gebundener Fänger-DNA und mit Biotin markierter Analyt-DNA über eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung mit einem Enzym markiert. Durch die Aktivität des Biokatalysators, z.B. alkalische Phosphatase, wird dann ein redoxaktives Produkt, z.B. p-Aminophenol, gebildet, welches amperometrisch an geeigneten Elektroden, z.B. Goldelektroden umgesetzt werden kann. Durch die Wahl der speziellen Elektrodengeometrie, insbesondere Interdigitalelektroden, und der geringen Elektrodenabstände von z.B. < 1μm kann nach Anlegen geeigneter Potentiale ein Redoxcycling-Prozess in Gang kommen dessen Strom ein Maß für das DNA-Hybridisierungsereignis ist.

Davon ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren für eine DNA-labelfreie biochemische Analytik der DNA-DNA-Wechselwirkung anzugeben und zugehörige Anordnungen zu schaffen.

Die Aufgabe ist erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Art durch die Abfolge der Verfahrensschritte gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Weiterbildungen und Ausgestaltungen des Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Verfahrensansprüche. Speziell Patentanspruch 12 gibt die Realisierung der Erfindung als sog. Enzym-Schalter an. Eine zugehörige Anordnung ist im Patentanspruch 20 angegeben. Weiterbildungen dieser Anordnung sind Gegenstand der abhängigen Sachansprüche.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann vorteilhafterweise immobilisierte DNA als Fänger mit einem Enzym als biokatalytisch aktive Markierung und einer Substanz als Inhibitor versehen werden, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren katalytische Aktivität reversibel hemmen kann. Alternativ dazu kann in der Nähe des immobilisierten Enzyms eine DNA als Fänger immobilisiert werden, die mit einer Substanz als Inhibitor versehen ist, die durch Wechselwirkung mit dem Enzym dessen katalytische Aktivität reversibel hemmen kann. Alter nativ dazu kann ein immobilisiertes Enzym mit einer DNA als Fänger versehen werden, die ihrerseits eine Substanz als Inhibitor trägt, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann. In weiterer Alternative kann ein Komplex aus einem doppelsträngige DNA bindenden Molekül und einer Substanz als Inhibitor verwendet werden, die durch Wechselwirkung mit dem immobilisierten Enzym dessen Aktivität reversibel hemmen kann. Bei Hybridisierung von Analyt- und immobilisierter Fänger-DNA bindet dieser Komplex an den entstandenen Doppelstrang und steht daher für die Inhibition des Enzyms als biokatalytisch aktive Markierung nicht mehr zur Verfügung.

Bei allen angeführten Alternativen erlaubt in einem ersten inaktiven Zustand des Systems die Struktur der Fänger-DNA, d.h. deren partielle Einzel/Doppelsträngigkeit, die Wechselwirkung von Inhibitor und Biokatalysator. Beim Binden der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA auf Grund der Komplementarität hebt die Bildung dieses Doppelstrangs die Wechselwirkung zwischen Biokatalysator und Inhibitor auf bzw. führt zur Bindung des Inhibitors an den gebildeten Doppelstrang. Damit wird das System von dem ersten, inaktiven Zustand in einen zweiten, aktiven Zustand geschaltet.

Mit der Erfindung werden die wesentlichen Nachteile des Standes der Technik beseitigt. Die Erfindung sieht insbesondere die Nutzung eines schaltbaren Biokatalysators, nämlich des Enyzms vor, wobei die Aktivität des Biokatalysators über die Hybridisierung der Proben-DNA an die Fänger-DNA gesteuert und insbesondere geschaltet wird.

Bei der Erfindung erfolgt eine optische oder elektrochemische Analyse der Nukleinsäuren über einen Hybridisierungsschalter. Insbesondere die elektrochemische Messung kann amperometrisch, potentiometrisch oder konduktometrisch erfolgen. 5omit ergeben sich gegenüber dem Stand der Technik erhebliche nachfolgende Vorteile:

– es wird ein labelfreies Ausleseverfahren zur Analyse von DNA realisiert. Zur Detektion der Hybridisierung zwischen „catcher"-DNA und Analyt-DNA muss nämlich keinerlei Reportergruppe in die Analyt-DNA direkt oder indirekt über einen weiteren Hybridisierungsschritt mit einem Signal-Oligonukleotid als Signal-DNA eingeführt werden. Dies hat den Vorteil, dass bei ausreichender Konzentration der Analyt-DNA auf eine zeit- und kostenintensive PCR/SDA zur Einführung eines Labels als Reporters verzichtet werden kann. Auch kann eine sonst teilweise notwendige weitere Hybridisierung mit einer Signal-DNA zur Detektion der „catcher" Analyt-DNR Hybridisierung als Sandwich-Assay unterbleiben, was die Komplexität des biochemischen Nachweissystems deutlich vereinfacht und damit Fehlerquellen reduziert.
– Die Korrelation zwischen der Menge an entstandenem Enzym-Produkt und der Menge der doppelsträngigen „catcher" Analyt-DNA ermöglicht die quantitative Auswertung der Analyt-DNA-Konzentration in der Probe.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es zeigen jeweils in schematischer Darstellung
1 ein Analysesystem nach dem Stand der Technik,
2/3, 4/5, 6/7 und 8/9 jeweils Systeme mit Steuerung der Enzymaktivität durch DNA-Hybridisierung, bei denen es zur Bildung einer Doppelhelix kommt,
10 eine Draufsicht auf ein Transducer-Array mit Vergrößerungsausschnitt zur Verdeutlichung von Aufbau und Herstellung des Komplettsystems,
11 ein Ablaufschema einer Messung und
12 ein elektrochemisches Analyesystem für Schaltfunktionen entsprechend den 2/3, 4/5, 6/7 oder 8/9.
Gleiche Elemente haben in den Figuren gleiche Bezugszeichen. Die Figuren werden nachfolgend teilweise gemeinsam beschrieben.
Auf 1 wurde bereits eingangs bei der Diskussion des Standes der Technik hingewiesen. Bei einem nach dem optischen Prinzip arbeitenden DNA-Chip stellen die Kreise fluoreszierende Reportergruppen, welche mit der Analyt-DNA/Signal-DNA gekoppelt sind, dar. Die interessierenden Informationen werden durch optische Abfrage erhalten.
Die nachfolgende Figurenbeschreibung bezieht sich zunächst weiter auf die 2 bis 9. Die phänomenologischen Grundlagen gelten dazu gemeinsam.
In den 2 bis 9 ist jeweils ein Träger 1 als Substrat vorhanden. Kommt ein elektrochemisches Ausleseverfahren, insbesondere Redoxcycling, zum Einsatz, ist der Träger 1 ein Chip mit integrierten Schaltungen, die hier nicht im Einzelnen ausgeführt sind. Solche Schaltungen können analog oder digital ausgebildet sein.
Die 2/3, 4/5, 6/7 sowie 8/9 zeigen jeweils eine Steuerung der biokatalytischen Aktivität durch DNA-Hybridisierung und realisieren somit einen Schalter. Es sind jeweils DNA 10 bzw. 10', wobei 10 eine sog. Fänger-DNA („catcher") und 10' die zu analysierende DNA ist, eine biokatalytisch aktive Markierung 20 und ein Inhibitor 30 vorhanden, deren Zusammenwirken nachfolgend anhand alternativer Beispiele erläutert wird.
Die biokatalytisch aktive Markierung 20 ist ein Enzym.
In den 2, 4 und 6 ist das Enzym 20 inaktiv. Die Struktur des „catchers" 10 – d.h. der partielle intramolekulare DNA- Doppelstrang durch Wasserstoffbrücken 40 – ermöglicht die Wechselwirkung/reversible Bindung des Inhibitors 30 an das Enzym 20 als biokatalyisch aktive Markierung und hemmt dessen Aktivität. Der Schalter befindet sich im inaktiven Zustand.
Durch die Hybridisierung der „catcher"-DNA 10 mit der Analyt-DNA 10' wird ein DNA-Doppelstrang aus „catcher"-DNA 10 und Analyt-DNA 10' gebildet. Dies geschieht, weil die Bildung dieses Doppelstranges auf Grund der höheren Anzahl von sich ausbildenden Basenpaarungen, d.h. die Wasserstoffbrücken 40, energetisch günstiger ist, als die Bildung des partiellen, intramolekularen „catcher"-DNA Doppelstranges, der nur einige wenige Wasserstoffbrücken aufweist. Die Bildung dieses Doppelstrangs bewirkt eine so starke Konformationsänderung im „catcher", dass die Wechselwirkung von Enzym 20 und Inhibitor 30 derart geschwächt wird, dass der Inhibitor 30 vom Enzym 20 abfällt – das aktive Zentrum des Enzyms 20 ist frei und das Enzym 20 ist aktiv.
Das in der Umgebung vorhandene Enzym-Substrat 50 kann nun das aktive Zentrum des Enzyms 20 füllen. Das Enzym 20 wird umgesetzt und ein optisch oder insbesondere elektrochemisch, d.h. amperometrisch, potentiometrisch, konduktometrisch, detektierbares Produkt wird entstehen. Das Enzym 20 ist 'eingeschaltet'.
In den 3, 5 und 7 ist das Enzym also aktiv. Der Schalter befindet sich im aktiven Zustand.
Die in den 2/3, 4/5, 6/7 sowie 6/9 dargestellten A1-ternativen beziehen sich auf unterschiedliche Varianten der Bindung/Immobilisierung von biokatalytisch aktiver Markierung und/oder „catcher"-DNA 10 sowie des Inhibitors 30.
In 2 und 3 ist an die Fänger-DNA 10, die an einer Stelle 2 des Trägers 1, bspw. Chip, fixiert ist, sowohl die biokatalytisch aktive Markierung 20 als auch der Inhibitor 30 gebunden.
Gemäß 4 und 5 ist in einer Alternative zu 2/3 die biokatalytisch aktive Markierung 20 an einer Stelle 3 des Chips 1 immobilisiert und daran sowohl die Fänger-DNA 10 als auch der Inhibitor 30 gekoppelt.
Gemäß 6 und 7 ist in einer anderen Alternative die Fänger-DNA 10 an einer ersten Stelle 2 des Trägers 1, bspw. Des Chips, gebunden, während die biokatalytisch aktive Markierung 20 an einer zweiten Stelle 3 des Trägers 1, bspw. des Chips, gebunden ist.
Gemäß 8 und 9 ist in einer weiteren Alternative im inaktiven Zustand die Fänger-DNA 10 am Ort 2 und die biokatalytische Markierung am Ort 3 fixiert. In 8 ist die Fänger-DNA 10 frei und einzelsträngig, da auf Grund der Sequenz des „catchers" keine intramolekularen Wasserstoffbrücken 40 ausgebildet werden können. An den Inhibitor 30 ist, im Unterschied zu den vorher geschilderten Alternativen ein sog. Interkalator 60, d.h. ein eine doppelsträngige DNA bindendes Molekül, gebunden.
In 9 bindet eine Analyt-DNA 10^` unter Ausbildung der Wasserstoffbrücken 40 an die Fänger-DNA 10. Durch die Ausbildung des DNA-Doppelstranges bindet nunmehr die Verbindung bzw. der Komplex aus Interkalator 60 und Inhibitor 30 an den Doppelstrang. Das Enzym 20 ist somit frei zugänglich für das Substrat 50 und aktiv.
Beim Beispiel gemäß den Figuren 8/9 kann auch das Enzym 20 auf dem Träger 1 immobilisiert und daran der Fänger-DNA 10 gebunden sein. Ebenso gut kann die Fänger-DNA 10 auf dem Träger 1 immobilisiert und daran das Enzym 20 gebunden sein. Diesbezüglich sind die Beispiele gemäß den alternativen 6/7 oder 2/3 maßgebend.
Generell kann als Anbindung der „catcher"-DNA 10 und/oder der biokatalytischen Markierung 20 an den Chip 1 als Träger auch jeweils eine Immobilisierung/Einbindung in eine polymere Gelmatrix verwendet werden. Die Gelmatrix kann ein Hydrogel sein, das an anderer Stelle beschrieben wird.
Die kovalente Immobilisierung der biokatalytisch aktiven Markierung, d.h. des Enzyms, erfolgt in allen Fällen spezifisch über eine geeignete Aminosäureseitenkette. Vorteilhafterweise weist das Enzym folgende Eigenschaften auf:

– Entweder das Produkt oder das Substrat der enzymatischen Reaktion muss optisch oder amperometrisch detektierbar sein. Geeignet sind besonders die Phosphatasen, Esterasen und Proteasen, welche die Bildung von Phenolaten und Verbindungen des Chinon-Typs katalysieren.
– Das Enzym sollte aus einer Polypeptidkette bestehen, um die Immobilisierung der Polypeptidketten ohne Aktivitätsverlust zu gewährleisten.
– Das Enzym sollte ausreichend thermostabil sein, um eine DNA-DNA-Hybridisierung in breiten Temperaturbereichen zu ermöglichen. Enzyme aus thermophilen Organismen erfüllen meistens diese Bedingung. Thermostabile Enzyme können bei Raumtemperaturen niedrige spezifische Aktivität aufweisen. Dieses Problem kann man mit gerichteter Mutagenese lösen.
– Um eine gezielte Immobilisierung und die Steuerung der Enzymaktivität in breiten Temperaturbereichen zu ermöglichen, sollte ein Expressionssystem für die Expression des Enzyms aus rekombinanten Plasmid vorhanden sein.

Anhand 10 wird die Herstellung eines als m_xn-Array mit m Spalten und n Zeilen ausgebildeten Transducersystems beschrieben: Auf einem für das Redox(re)cycling-Verfahren geeigneten Transducerfläche 100 sind über Barieren 150 getrennt kreisförmigen analytischen Positionen 101, 101',... vorhanden. Auf den Positionen 101, 101',..., die typischerweise einen Durchmesser von ca. 150μm haben und untereinander einen Abstand (sog. Pitch) von ca. 200μm besitzen, befinden sich Strukturen mit Interdigitalelektroden 110 bzw. 120. Die Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 sind in bekannter Weise kammartig mit Elektrodenfingern 111 bzw. 121, die eine Linien- und Abstandbreite von nicht größer als 1μm aufweisen und vorteilhafterweise aus Gold bestehen, ausgebildet. An der Transducerfläche 100 sind seitlich Auslesekontakte 160 angeordnet.
Auf den analytischen Positionen 101, 101',... wird ein nicht im Einzelnen dargestelltes Hydrogel aufgebracht, in das die „catcher"-DNA über eine 3'-Amino-Modifikation kovalent verankert ist. Die „catcher"-DNA trägt am 5'-Ende eine SH-Gruppe, mit welcher der Inhibitor des Reporterenzyms, z.B. Carboylesterase, kovalent gebunden ist. Als reversibler Inhibitor der Esterase dient ein Alkyl-trifluoromethylketon, vorzugsweise ein Trifluoromethylmethylketon.
Die Koppelung von „catcher"-DNA und Inhibitor erfolgt in geeigneter Weise nach folgender Reaktion: Oligonucleotid-5'-linker-SH + Br-CH₂-CO CF₃ → Oligonucleotid-5'-linker-S-CH₂-CO CF₃
Neben dem Komplex aus „catcher"-DNA und Inhibitor wird auf jeder analytischen Position das Reporterenzym, vorzugsweise ein thermostabiles Enzym, welches aus einer Polypeptidkette besteht, verankert. Vorteilhafterweise wird für diesen Zweck die Carboxylesterase aus den thermoacidophilen Eubakterium Bacillus acidocaldarius (Manco, G., Adinolfi, E., Pisani, F.M., Ottolina, G. Carrera, G. and Rossi, M. 1998, Biochem. J. 332, 203–212) gewählt. Für die kovalente Anbindung des Enzyms nutzt man die Tatsache aus, dass die Röntgenstruktur des Enzyms bekannt ist (De Simone, G., Galdiero, 5., Manco, G., Lang, D., Rossi, M., and Pedone, C. 2000, J. Mol. Biol. 303, 761–771). Dies ermöglicht mittels gezielter Mutagenese eine geeignete Aminosäure an der Oberfläche des Enzym durch Cystein oder eine Aminosäure mit einem aminofunktionellen Rest, z.B. Lysin, zu ersetzen. Über die SH-Gruppe des Cysteins wird dann das Enzym direkt auf die Goldoberfläche der Interdigitalelektroden gebunden oder aber über die NH₂-Gruppe des aminofunktionellen Restes an die jeweilige Hydrogelmatrix.
Zum Betrieb des Schalters entsprechend dem Ablaufschema gemäß 11 mit den Teilschritten a), b), c) und d) gilt folgendes: Gezeigt sind zwei nebeneinander liegende, benachbarte analytische Positionen, die mit unterschiedlicher Catcher-DNA ausgerüstet sind. Im Grundzustand des Systems liegt nach Befüllung mit einer geeigneten Pufferlösung die Catcher-DNA der jeweiligen analytischen Position in einer Konformation vor, bei der die Bindung des Inhibitors ins aktiven Zentrum des Enzyms möglich ist. Das Enzym ist inaktiv, es liegt also ein inaktiver Zustand des Systems entsprechend 11a) vor.
Nach Zugabe von zu analysierender DNA und stringentem Waschen wird nur an der/den analytischen Positionen, wo es aufgrund der Komplementarität zwischen „catcher"-DNA und Analyt-DNA-Spezies zur Ausbildung eines stabilen Nucleinsäure-Doppelstranges kommt – und zwar in 11 die linke der beiden analytischen Positionen – eine so starke Konformationsänderung im „catcher" bewirkt, dass die Wechselwirkung von Enzym und Inhibitor derart geschwächt wird, dass der Inhibitor vom Enzym abfällt. Das aktive Zentrum des Enzyms ist dann frei, das Enzym ist aktiv und es liegt also ein aktiver Zustand des Systems entsprechend 11b) vor.
Nach Zugabe von geeignetem Enzymsubstrat, vorteilhafterweise dem p-Amino-phenol-octanoylester gemäß Schritt(c), kann das Substrat das aktive Zentrum des Enzyms an den/der analytischen Position en) – und zwar in 11 die linke Position – füllen, bei denen – wie aus Teilfigur 11b) ersichtlich – eine Hybridisierung von Analyt- und „catcher"-DNA entsprechend Schritt(d) stattgefunden hat. Nur an diesen Positionen – und zwar in 11 die linke Position – wird das Substrat umgesetzt und es kann das amperometrisch detektierbare Produkt p-Aminophenol entstehen.
Die Esteraseaktivität ergibt sich aus nach folgender Reaktion:
Zur Verstärkung des Signals legt man an die unterschiedlichen „Finger" 111 bzw. 121 der Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 einer einzelnen analytischen Position 101 aus 10 ein oxidatives bzw. reduktives Potential an. Auf Grund der Abstands- und Linienbreiten kommt dann ein Redox-Cycling-Prozess an den einzelnen analytischen Positionen in Gang an denen durch enzymatische Aktivität p-Aminophenol-octanoylester zu p-Aminophenol umgesetzt wurde/wird. Unter dem Redoxcycling-Prozess ist die Oxidation von p-Aminophenol an der positiv polarisierten Elektrode zu Chinonimin und die Reduktion von Chinonimin zu p-Aminophenol an der negativ polarisierten Elektrode zu verstehen. Der Gesamtstrom dieser Redoxreaktionen ist eine Funktion der Menge an hybridisierter Analyt-DNA.
12 verdeutlicht das oben erläuterte Detektionsprinzip mit Hilfe des Redoxcycling-Prozesses und das Prinzip der elektrochemischen Auswertung. Im Einzelnen ist ein Redox- Cycling-Prozess an der Oberfläche einer einzelnen durch Wände 15 abgetrennten, analytischen Position 101 des Chips 1 dargestellt, wobei neben den bereits erläuterten Symbolen Bezugszeichen 80 das Chinonimin und Bezugszeichen 90 das p-Aminophenol entsprechend obiger Strukturformel bedeuten. Auf dem Chip 1 sind Mikroelektroden 5, 5' im μm-Abstand angeordnet. Die Mikroelektroden 5, 5' sind Teil der Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 mit den Fingerelektroden 111 bzw. 121 der 10 und werden mit unterschiedlichen Potentialen beaufschlagt. Über eine Messelektronik mit Strommessgeräten 8 bzw. 8' können an den Mikroelektroden 5, 5' Redoxströme bis in den Sub-Nano-Ampere-Bereich gemessen werden.
Es ergibt sich ein zeitabhängiges Messsignal I = g(t), dessen Steigung S = f(DNA) von der zu analysierenden DNA abhängig ist. Somit ist eine Vorgehensweise realisiert, mit der die DNA elektrochemisch ausgewertet werden kann. Der wesentliche Vorteil dieser Vorgehensweise ist, dass sie den Einsatz von DNA-Proben erlaubt, ohne sie vorher mit einem Label, d.h. einer Markierung, zu modifizieren.
Die benachbarten Messpositionen in 12 entsprechen den einzelnen analytischen Positionen 101, 101',... aus 10. Wie dort im Einzelnen beschrieben, weisen sie typischerweise ein Rastermasse von 200μm auf, so dass auf einem Chip 1 eine Vielzahl paralleler Messungen ausführbar sind.
Mit den anhand der vorstehend beschriebenen Beispiele können Mikrochips für ein einfach zu bedienendes Handgerät realisiert werden, welches für die definierten Anwendungen einsetzbar ist. Die auswechselbaren Chips haben eine bestimmte Lebensdauer und können mit unterschiedlichen „catcher" programmiert werden. Da es sich bei dieser DNA Chip-Art um ein Einwegprodukt handelt, kann mit einem Bedarf von sehr hohen Stückzahlen unterschiedlicher DNA-Chips gerechnet werden. Auf dem Markt existieren keine vergleichbaren, einfach anwendbaren Geräte dieses Typs.

Claims

Verfahren zum Nachweis von DNA, wobei ein System mit immobilisierten DNA als analytisches Werkzeug verwendet wird, mit folgenden Maßnahmen: – es wird ein System mit einer Fänger-DNA, einem Inhibitor und einem Enzym verwendet, – in einem ersten inaktiven Zustand des Systems erlaubt die Fänger-DNA die Wechselwirkung von Inhibitor und Enzym, – beim Binden der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA wird auf Grund der Komplementarität ein Doppelstrang gebildet und es wird die Wechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor aufgehoben und/oder verhindert, – damit wird das System von dem ersten, inaktiven Zustand in einen zweiten, aktiven Zustand geschaltet, wobei das Enzym kein Nukleinsäure-Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung von Inhibitor und Enzym durch die Struktur der Fänger-DNA aufgrund deren partieller Doppel-/Einzel-Strängigkeit ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Fänger-DNA immobilisierte DNA verwendet wird und dass die immobilisierte DNA mit dem Enzym und mit einer Substanz, die durch Wechselwirkung mit dem Enzym dessen katalytische Aktivität reversibel hemmen kann, als Inhibitor versehen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein immobilisiertes Enzym verwendet wird und dass in der Nähe des immobilisierten Enzyms eine DNA als Fänger immobilisiert wird, die mit einer Substanz als Inhibitor versehen ist, die durch Wechselwirkung mit dem Enzym dessen katalytische Aktivität reversibel hemmen kann.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein immobilisiertes Enzym verwendet und dass das immobilisierte Enzym mit einer DNA als Fänger versehen wird, die ihrerseits eine Substanz als Inhibitor _ trägt, die durch Wechselwirkung mit dem Enzym dessen Aktivität reversibel hemmen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Komplex aus einem, eine doppelsträngige DNA bindenden Molekül und einer Inhibitorsubstanz, die durch Wechselwirkung mit dem Enzym dessen Aktivität reversibel hemmen kann, verwendet wird, wobei bei Hybridisierung von immobilisierter Fänger-DNA und Analyt-DNA der Komplex an den entstandenen Doppelstrang gebunden wird und somit für die Inhibition des Enzyms nicht mehr zur Verfügung steht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Inhibitor eine reversibel an das Enzym bindende und die enzymatische Aktivität hemmende Substanz verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu analysierende DNA durch Hybridisierung mit der immobilisierten DNA wegen der Komplementarität der einzelsträngigen DNAs einen Doppelstrang, bzw. eine Doppel-Helix, bildet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste, inaktive Zustand und der zweite, aktive Zustand des Systems und dessen Wechsel vom ersten in den zweiten Zustand zusammen eine Schaltfunktion realisieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schaltfunktion des Systems durch die Hybridisierung der zu analysierenden DNA an die immobilisierte DNA als Fänger erfolgt .
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Abfrage des Zustandes der Schaltfunktion des Systems durch eine Bestimmung der Aktivität des Biokatalysators erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass das Enzym einen einschaltbaren Schalter bildet und dass das Signal des Enzym-Schalters optisch oder elektrochemisch ausgelesen wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Enzym-Schalter über die Hybridisierung von Fänger-DNA und zu analysierender DNA unter stringenten Bedingungen gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei ein Produkt synthetisiert wird, das optisch oder elektrochemisch detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die Umsetzung eines nicht detektierbaren Substrates in ein optisch oder elektrochemisch detektierbares Produkt katalysiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrochemische Auslesen des Enzym-Schalters amperometrisch, potentiometrisch oder konduktometrisch erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Messwerte des Enzym-Schalters digital ausgegeben und direkt ablesbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt-DNA-Konzentration durch Korrelation zwischen der Menge des freigesetzten Enzymproduktes und der Menge an hybridisierter, gebundener, zu analysierender DNA erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass durch Wechselwirkung des . Inhibitors mit dem Enzym der Enzymschalter ausgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym inaktiviert wird, sofern der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und dass bei Vorliegen einer Doppelhelix zwischen Fänger-DNA und zu analysierenden-DNA auf Grund des Doppelstranges der Inhibitor für das Enzyms unzugänglich ist und das Enzym aktiv ist.
Anordnung, umfassend einen Träger (1) auf dem ein Enzym (20) an einem Ort (3) immobilisiert ist, eine Fänger-DNA (10), die am Ort (3) immobilisiert ist, einen Inhibitor (30), der mit der Fänger-DNA (10) kovalent verknüpft ist, ein Substrat (50), wobei in einem ersten Zustand – die Fänger-DNR(10) über intramolekulare Wasserstoffbrücken (40) derart gefaltet ist, dass durch den Inhibitor (30) die Aktivität. des Enzyms (20) gehemmt ist und das Substrat (50) nicht umgesetzt ist, und wobei in einem zweiten Zustand – die Fänger-DNA (10) mit einer nachzuweisenden DNA (10') hybridisiert und dadurch derart gefaltet ist, dass der Inhibitor (30) vom Enzym (20) getrennt ist und das Substrat (50) umgesetzt ist, wobei das Enzym kein Nukleinsäure-Enzym ist.
Anordnung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1) integrierte Mikroelektroden (5, 5') umfasst, wobei das Enzym entweder im Träger (1) immobilisiert wird oder in der Nähe der Mikroelektroden (5, 5') in ein Polymernetzwerk eingeschlossen oder immobilisiert ist.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymernetzwerk die Aktivität des Enzyms nicht stört und für die zu analysierende Analyt-DNA durchlässig ist.
Anordnung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt und/oder das Substrat der enzymatischen Reaktion optisch oder elektrochemisch, insbesondere amperometrisch, potentiometrisch oder konduktometrisch, detektierbar ist.
Anordnung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Phosphatase, Esterase oder Protease ist.
Anordnung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus einer Polypeptidkette besteht und dass die Immobilisierung der Polypeptidkette ohne Aktivitätsverlust des Enzyms erfolgt ist.
Anordnung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym thermostabil ist.
Anordnung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym durch ein _ Expressionssystem, enthaltend mindestens ein rekombinantes Plasmid, herstellbar ist.