DE60221046T2

DE60221046T2 - Nachweis von sondenmolekülen, die auf einen aktiven bereich eines sensors gebunden sind

Info

Publication number: DE60221046T2
Application number: DE60221046T
Authority: DE
Inventors: Ulrich Bockelmann; Francois Pouthas
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2002-01-21
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2022-12-12
Also published as: US20060011911A1; EP1468277B1; ES2289176T3; DE60221046D1; JP4500547B2; EP1468277A1; WO2003062811A1; JP2005515475A; ATE366321T1; FR2835058B1; FR2835058A1; US7993825B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen zumindest eines Parameters, der für Sondenmoleküle repräsentativ ist, die auf Zonen eines Sensors fixiert sind.
Es ist bereits ein Verfahren zum Erfassen der Hybridisierung von DNA-Sequenzen mithilfe eines Feldeffekttransistors bekannt, wie es in dem Artikel von E. SOUTEYRAND und Mitarbeitern mit dem Titel "Direct Detection of the hybridization of synthetic Homo-Oligomer DNA Sequences by Field Effect", erschienen 1997 in J. Phys. Chem. B1997, 101, S. 2980 bis 2985 beschrieben ist. Ein Transistor vom Typ ISFET ("Ion-Sensitive Field Effect Transistor"), der bei dieser Art von Anwendung verwendbar ist, wurde in dem Artikel von Piet BERGVELD "Development, Operation and Application of the ISFET as a Tool for Electrophysiology", erschienen in IEEE Transactions on Biomedical Engineering, Volume BME-19 – Nr. 5, Sept. 1972, S. 342 bis 351, beschrieben. Angaben über die Herstellung solcher Transistoraufbauten finden sich in dem Artikel von V. KIESSLING und Mitarbeitern mit dem Titel "Extracellular Resistance in Cell Adhesion Measured with a Transistor Probe", erschienen in Langmuir 2000 16, S. 3517–3521. Eine Vorgehensweise zum Präparieren von Oberflächen schließlich wurde in dem Artikel von A. KUMAR und Mitarbeitern mit dem Titel "Silanized nucleid acids: a general platform for DNA immobilization", erschienen in Nucleid Acid Research 2000, Volume 28, Nr. 14, S. i bis vi, beschrieben.
Zwei Verfahren zur Fixierung der Sondenmoleküle auf der Oberfläche sind insbesondere im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar. Das erste besteht in einer direkten Synthese auf einem Feststoff, wie beispielsweise in dem Artikel von S. P. A. Fodor und Mitarbeitern mit dem Titel "Light-directed, spatially adressable parallel chemical synthesis", erschienen in Science 251, S. 767 bis 773 (1991), beschrieben ist. Das zweite ist die Fixierung der Moleküle ausgehend von einer Verdünnung.
Im Falle von Sensoren, die eine Mehrzahl von aktiven Zonen aufweisen, z.B. DNA-Chips oder Protein-Chips, gibt es gegenwärtig keine verfügbare Vorgehensweise, um auf einfache und relativ schnelle Weise kontrollieren zu können, auf welchen Zonen Sondenmoleküle effektiv fixiert wurden.
Die Patentschriften US 5,827,482 und US 6,331,274 sowie die am 26.06.2003 veröffentlichte Patentanmeldung EP 1 460 130 betreffen Verfahren zum Erfassen der Fixierung von Molekülen auf aktiven Zonen unter Verwendung eines Netzwerks von Feldeffekttransistoren. In diesen Schriften ist eine Fixierung des Potentials der Lösung, welche die aktiven Zonen bedeckt, nicht vorgesehen.
Die vorliegende Erfindung hat daher ein Verfahren zum Erfassen der Fixierung von Sondenmolekülen auf mindestens einer Zone eines Sensors oder einer Wechselwirkung, insbesondere zum Kontrollieren des lokalen Austrags und der Fixierung der Sondenmoleküle zur Aufgabe, um es insbesondere zu ermöglichen, um die Probleme, welche die in der Praxis häufig angetroffenen starken experimentellen Abweichungen bereiten, zumindest teilweise abzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Erfassen der Fixierung von Sondenmolekülen auf mindestens einer aktiven Zone eines Sensors oder einer Wechselwirkung gemäß der Definition in Anspruch 1.
Zwischen den Schritten a) und b) kann ein Spülen vorgesehen sein.
Gemäß einer besonderen Ausführungsweise ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es nach a) und vor b) die folgenden Schritten umfasst:

a1) Spülen
a2) Zugeben einer Lösung, welche Zielmoleküle enthält, die in der Lage sind, spezifisch mit den Sondenmolekülen eine Wechselwirkung einzugehen, wie z.B. eine Hybridisierung mit diesen, falls die Sondenmoleküle ADN sind, gegebenenfalls gefolgt von einem Spülen.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsweise ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es nach c) die folgenden Schritten umfasst:

d) Zugeben einer Elektrolytlösung, welche Zielmoleküle enthält, die in der Lage sind, spezifisch mit den Sondenmolekülen eine Wechselwirkung einzugehen, wie z.B. eine Hybridisierung mit diesen, falls die Sondenmoleküle DNA sind.
e) Messen von mindestens einem Punkt der Drain-Strom/Source-Gate-Spannung/Source-Drain-Spannung-Kennlinie von mindestens zwei der Transistoren einer zweiten Gruppe, die Zonen entsprechen, welche mit Sondenmolekülen und mit Zielmolekülen in Kontakt gebracht wurde, wie z.B. durch Anlegen einer beispielsweise konstanten Spannung zwischen dem Gate und der Source dieser Transistoren der zweiten Gruppe, deren Drain und Source polarisiert wurden, oder eines vorgegebenen, beispielsweise konstanten Stroms an die Source dieser Transistoren der zweiten Gruppe, um mittels Vergleich eine Erfassung von zumindest einer Wechselwirkung zu erhalten.

Das Verfahren kann eine Mehrzahl solcher Messungen von mindestens einem Punkt der Kennlinie anwenden, die zeitlich beabstandet sind. Dies ermöglicht eine räumlich und zeitlich zweifach vergleichende Messung.
Gemäß einer ersten Variante wird der Vergleich, insbesondere mittels differentieller Messung, zwischen mindestens zwei Transistoren durchgeführt, welche Zonen entsprechen, die in einer Elektrolytlösung gebadet sind, nachdem sie mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht wurden.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Variante wird dieser Vergleich, insbesondere mittels differentieller Messung, zwischen mindestens einem Transistor, welcher einer Zone entspricht, die in einer Elektrolytlösung gebadet ist, nach In-Kontakt-Bringen mit Sondenmolekülen, und mindestens einem Transistor, welcher einer Zone entspricht, die von der Elektrolytlösung gebadet ist, ohne vorher mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht worden zu sein, durchgeführt.
Die Sondenmoleküle sind beispielsweise DNA-, RNA- oder Proteinmoleküle.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit einer herkömmlichen Erfassung einer molekularen Wechselwirkung mittels Fluoreszenz kompatibel.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich noch deutlicher aus der Lektüre der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung.
Es zeigt:
1 zwei Feldeffekttransistoren eines Erfassungs-Chips, der eine Mehrzahl solcher Transistoren aufweist, die gemäß einem ein- oder zweidimensionalen Netzwerk von Transistoren organisiert sind;
2 eine detaillierte Draufsicht auf einen Erfassungs-Chips und die Anordnung der jeweils einem Feldeffekttransistor entsprechenden aktiven Zonen;
3 die elektrischen Drain-Verbindungen der Übertragungen des ein- oder zweidimensionalen Netzwerks, wobei 4 den Widerstand der verschiedenen elektrischen Drain-Verbindungen darstellt, Kurve A die berechneten Werte und die Kurve B die gemessenen Werte darstellt, und wobei die Abweichung zwischen den Kurven im Wesentlichen auf dem Kanalwiderstand beruht, der konstant ist.
5 eine Vorrichtung zum Austragen der Lösung auf ausgewählte aktive Zonen;
6 die Erfassung des Vorhandenseins von silanisierter DNA und von Poly-L-Lysin mit konstanten U_SG und U_SD mittels Variieren des Drain-Stroms I_SD; und
7 die Erfassung des Vorhandenseins von silanisierter DNA und von Poly-L-Lysin mit konstanten I_SD und U_SD mittels Erfassung der Variation der Spannung U_SG;
8A bis 8C die Ergebnisse von Versuchen, die unter verschiedenen Versuchsbedingungen durchgeführt wurden;
9A bis 9D eine elektronische Erfassung von DNA;
und 10A und 10B die Verwendung von Mikrofluidpassagen.
Die 1 bis 3 veranschaulichen einen Sensor, der ein Netzwerk von Feldeffekttransistoren auf einem Siliciumsubstrat aufweist. Ein Transistor T₁ oder T₂, der in 1 im Querschnitt dargestellt ist, ist mit einer Source-Zone S und einer Drain-Zone D versehen, die jeweils einen elektrischen Kontakt aufweisen und von einer Isolierschicht 1 bwz. 2, beispielsweise einem thermischen SiO₂-Oxid, überlagert sind. Der aktive Bereich 3 zwischen der Source S und dem Drain D bildet die Gate-Zone G des Transistors und weist eine Isolierschicht 4 mit einer geringen Dicke, z.B. eine Schicht von thermischem SiO₂-Oxid auf. Es ist auch möglich, kein Oxid auf diesem aktiven Bereich anzuordnen. Die aktive Oberfläche ist dann durch einen Abschnitt 4' des freiliegenden Substrats begrenzt.
Sondenmoleküle, z.B. Moleküle von einsträngiger DNA, sind mittels eines bekannten Verfahrens auf zumindest bestimmten der aktiven Oberflächen 4 oder 4' fixiert. Im Falle von DNA werden bevorzugt Feldeffekttransistoren vom N-Kanal-Verarmungstyp (bei denen die Ladungsträger die Elektronen sind, die mobiler sind und daher eine erhöhte Empfindlichkeit ergeben) mit einer negativen Gate-Polarisierung (d.h. das Elektrolyt ist in Bezug auf den Halbleiter negativ polarisiert) verwendet, wobei sich die DNA negativ lädt (bei einem Elektrolyt mit neutralem pH).
Das Anlegen einer Source-Drain-Spannung U_SD zwischen der Source S und dem Drain D (U_SD1 für T₁, und U_SD2 für T₂) und einer Gate-Source-Spannung U_GS zwischen dem Elektrolyt 6 und der Source S (z.B. mit einer einzelnen Ag/AgCl-Elektrode E) induziert ein zweidimensionales Gas von Ladungsträgern an der Si/SiO₂-Grenzfläche oder an der Si/Elektrolyt-Grenzfläche eines jeden Transistors. Daraus resultiert ein Drain-Strom I_D, der bei jedem Transistor im Wesentlichen von der Ladung an der SiO₂/Elektrolyt- oder Si/Elektrolyt-Grenzfläche abhängt. Diese Grenzfläche, die der Passage zwischen der Source S und dem Drain D gegenüberliegt, wird als aktive Oberfläche bezeichnet.
Der Strom I_D hängt von der Fixierung der Sondenmoleküle, z.B. der DNA-Moleküle, auf der aktiven Oberfläche 4 oder 4' ab.
Wie die 2 und 3 zeigen, sind n Strukturen vom Feldeffekttransistor-Typ in ein Siliciumsubstrat integriert, das mit einem Isoliermaterial (SiO₂ oder dergleichen) bedeckt ist und mittels der elektrischen Kontaktanschlüsse von Source 10 und Drain (D₁, ... D_n) mit geeigneten Anschlüssen (Metallisierung oder bevorzugt dotierten leitfähigen Bereichen) versehen ist. Anders als bei einem standardmäßigen MOS-Transistoraufbau ist keine metallische Gate-Elektrode vorhanden. Dies entspricht dem Aufbau vom Typ ISFET ("Ion-Sensitive Field Effect Transistor"). Man verwendet bevorzugt ein Substrat des Typs SOI (Silicon-On-Insulator), das eine höhere Empfindlichkeit zur Verfügung stellt.
Die verschiedenen Aufbauten befinden sich in einem geringen seitlichen Abstand zueinander, und ihre aktiven Oberflächen sind mit der gleichen Messlösung in Kontakt. Eine typische seitliche Abmessung in der derzeitigen Mikroelektronik ist geringer als ein Mikrometer. In der Technik der DNA-Chips, wie sie in der vorliegenden Erfindung angewendet wird, beträgt die seitliche Abmessung 5–10 μm für eine direkte Synthese auf dem Feststoff und 50–100 μm im Falle einer Fixierung der Moleküle ausgehend von einer Verdünnung.
Bei der vorliegenden parallelen Messungskonfiguration stehen mehrere Felder mit verschiedenen Typen von immobilisierten Sondenmolekülen mit der gleichen Messlösung in Kontakt, und mindestens ein Transistoraufbau befindet sich unter jedem Feld. Die Anwendung mehrerer Transistoren pro Feld ist in Anbetracht der vorausgehend genannten Abmessungen möglich und ermöglicht eine Redundanz bei der Erfassung.
Eine Elektrode E (z.B. Ag/AgCl) wird dazu verwendet, das Potential der Messlösung 6 (Elektrolyt) in Bezug auf den Siliciumaufbau, den sie bedeckt, zu fixieren, und den Arbeitspunkt der Sensoren (Transistoren) zu fixieren. Das Potential des Elektrolyts 6 kann in bestimmten Fällen gleich Null sein. Die Messlösung 6, welche die Sensoren umspült, enthält Ionen in einer Konzentration, die eine ausreichende Leitfähigkeit ergibt und nicht zu einer übermäßig starken Abschirmung an den aktiven Oberflächen führt. Ihr pH-Wert ist bevorzugt neutral.
Das Verfahren zum Erfassen der Molekülerkennungen basiert auf einem Lösungsansatz mittels Vergleich, der insbesondere differentiell ist. Die Messung wird unter paralleler Verwendung mehrerer Transistoraufbauten durchgeführt. Die Messung kann in Bezug auf die verschiedenen Typen von aufgepfropften Molekülen differentiell sein und gegebenenfalls mehrere Transistoren pro Molekültyp umfassen. Es ist auch möglich, Signale vor/nach der Reaktion zu vergleichen, welche die Molekülerkennung (und/oder die Entwicklung während dieser Reaktion) offenbart.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Empfindlichkeit eines einzelnen Sensors gegen den pH und die Ionenstärke und die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit einer Variabilität von einem einzelnen Transistors zum anderen (einschließlich des Transistoraufbaus und der Qualität der Fixierung der Sonden) zu umgehen.
Ein Verfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise wendet die folgenden Schritte an:

a) homogene Behandlungen der gesamten Isoliermaterialoberfläche zur Vorbereitung der Fixierung der Sondenmoleküle;
b) lokales Aufpfropfen von verschiedenen Typen von Sondenmolekülen auf zumindest bestimmte der einzelnen aktiven Oberflächen;
c) homogene Spülvorgänge;
d) elektronische Messung: Zugeben des Messelektrolyts, Eintauchen der Elektrode und Messen der Transistoren (z.B. eines oder mehrerer Punkte der Kennlinie I_D als Funktion von U_SD und U_SG), und Vergleichen der gemäß den Transistoren erhaltenen Resultate;
e) homogene Spülvorgänge;
f) und schließlich Zugeben der Lösung von Zielmolekülen in Gegenwart von Elektrolyt und Erkennungsreaktion;
g) homogene Spülvorgänge;
h) elektronische Messung wie (d).

Falls die Schritte f) bis h) angewendet werden, ist es möglich, auf c) und d) zu verzichten, d.h. nur eine elektronische Messung vorzunehmen.
Bestimmte Transistoren, die nicht mit Sondenmolekülen zusammengebracht wurden (oder auch ein einzelner Transistor) können als Kontrollen dienen. Man misst ihre Charakteristiken nach Zugabe des Messelektrolyts, das beispielsweise die Gesamtheit der Transistoren umspült.
Das Aufpfropfen der Sondenmoleküle wird mittels Austrag von Mikrotröpfchen mit einem Durchmesser von ca. 100 μm auf die aktiven Oberflächen der Transistoren mithilfe von metallischen Mikroschreibern durchgeführt, die im Handel verfügbar sind.
Wie 3 zeigt, weist das Netzwerk von n Transistoren (z.B. n = 96 Transistoren) n Drain-Verbindungen D₁, D₂ ... D_n auf, sowie 2 Verbindungen (nicht dargestellt), die der gemeinsamen Source äquivalent sind. Die Reihenwiderstände R_c, die diesen Verbindungen zugeordnet sind, besitzen Werte, die von der Indexzahl 1 ... n des Drain abhängen.
Die Werte dieser Widerstände R_c, die beispielsweise mittels Dotieren von Silicium hergestellt wurden, sind nicht vernachlässigbar.
Zu diesem Zweck werden die Widerstände R_c für die Drain-Verbindung aus den geometrischen Längen und Querschnitten der dotierten Linien berechnet, deren Widerstand bekannt ist. Die Berechnung wird mit einer Messung des Widerstandes als Funktion der Indexzahl des Drain durch Anlegen einer Gleichspannung verglichen (z.B. U_SD = 0,1 V und U_SG = 2 V). Dies ermöglicht den Erhalt einer Kompensationskurve, die beispielhaft in 4 angegeben ist.
Eine Anlage wie die in 5 dargestellte kann für die Durchführung des Verfahrens verwendet werden: auf einem Tisch 10 ist eine Plattform 12 angeordnet, die eine Steuervorrichtung mit einem Mikrocontroller für einen Tisch 11 umfasst, welcher eine Ver schiebung in drei zueinander senkrechten Richtungen X, Y, Z durchführt. Ein Chip 15, der das Netzwerk von n Transistoren umfasst, ist auf einem Träger 14 angeordnet. Eine andere Plattform 20 mit einem Tisch 21, welcher eine Verschiebung in den drei Richtungen X, Y, und Z durchführt, wird verwendet, um einen Ausleger 22 zu verschieben, der einen Mikroschreiber oder eine Pipette 23 trägt, um den Austrag der Mikrotröpfchen zumindest auf bestimmten der n Transistoren durchzuführen. Ein Objektiv 17 und/oder eine Kamera, das/die mit einem Bildschirm 19 gekoppelt sind, ermöglichen die Beobachtung des Austrags der Mikrotröpfchen und eine Steuerung der Operationen.
Messungen des Drain-Stroms I_D werden beispielsweise mit U_SG = 1 V und U_SD = 0,9 V und einem ausgetragenen Elektrolyt mit einem neutralen pH durchgeführt, das aus KCl mit einem Anteil von 0,1 Millimol pro Liter besteht. Da die Sources der Transistoren (P-Kanal-Speichertransistoren) untereinander verbunden sind, kann die Source-Spannung oder die Gate-Spannung als Spannungsbezug (z.B. die Massespannung) dienen.
Eine Anwendung des Verfahrens wird nun in Verbindung mit 6 beschrieben.
Vor diesen Messungen wird eine globale Behandlung der Oberfläche der Si/SiO₂-Struktur mittels Inkubation während 1–2 Minuten in Sulfochromsäure und Spülen unter einem Strom von entionisiertem Wasser, daraufhin Inkubation während 3 bis 5 Minuten in einer NaOH-Lösung (60 μl NaOH 16N, 420 μl Ethanol und 220 μl Wasser), und schließlich Spülen unter einem Strom von entionisiertem Wasser durchgeführt.
Die Differenz zwischen zwei Messungen, die vor einem lokalen Austrag, jedoch vor und nach einem Spülen mit Wasser durchgeführt wurden, ist mit kleinen Quadraten in 6 dargestellt. Die Kreuze stellen die Differenz zwischen einer nach dem lokalen Austrag von zwei verschiedenen Lösungen durchgeführten Messung und einer vor dem Austrag durchgeführten Messung (der vor dem Spülen mit Wasser durchgeführten Messung) dar.
Mit einer im Handel erhältlichen Spitze 23 (Telechem SMP3B), die auf die in 5 dargestellte Vorrichtung 22 montiert ist, wird eine Lösung 1 auf die Transistoren 5–7 (mit Kontakt zwischen Spitze und Oberfläche), die Transistoren 19–21 und die Transistoren 33–37, und eine Lösung 2 auf die Transistoren 66–69, die Transistoren 76–79 und die Transistoren 87–89 ausgetragen.

Lösung 1: 0,5 μl in Position 5' thiolmodifiziertes 20-mer-Oligonucleotid 1 nMol/μl, 9 μl Natriumacetat 30 mM mit pH-Wert 4,3, 0,5 μl Mercaptosilan 5 mM in Natriumacetat, die man vor dem Austrag eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur reagieren lässt.
Lösung 2: Poly-L-Lysin (0,01% endgültige Konzentration Gewicht/Volumen "w/v" (P8920, Sigma)) in einem 0,1 × PBS-Puffer mit pH-Wert 7.

Nach den lokalen Austrägen wird die Probe 15 Minuten lang in Feuchtatmosphäre und anschließend 5 Minuten bei 50°C getrocknet.
Das Poly-L-Lysin ist in dem Messelektrolyt (neutraler pH) aufgrund der ionisierten Aminogruppen positiv. Die Verringerung des Stroms, der an den Austrägen von Poly-L-Lysin zu beobachten ist, ist mit der Adsorption einer positiven Ladung an der Oberfläche kompatibel.
Bei Lösung 1 reagiert die Silan-Modifikation an der DNA mit den OH-Gruppen von SiO₂, und die DNA ist in der Lösung negativ geladen.
Die Lösungen 1 und 2 ergeben daher Signale mit entgegengesetzten Vorzeichen.
Eine andere Anwendung des Verfahrens wird nun in Verbindung mit 7 beschrieben.
Es wird die Differenz des Oberflächenpotentials ΔU_SG gemessen, das der Messung vor/nach Austrag entspricht. Für die Bestimmung von ΔU_SG wird die bidimensionale Charakteristik, z.B. I_D (U_SG, U_SD), gemessen, und die intrinsischen Charakteristiken der 96 Transistoren werden durch numerische Korrektur als Funktion der Widerstände R_c der Drain-Leitungen in Serie bestimmt. Die Modifikation des Zustandes der SiO₂-Grenzfläche induziert eine Änderung der intrinsischen Charakteristik, die einer Verschiebung ΔU_SG bei konstanter U_SD und bei konstanten Drain-Strom I_D entspricht. Diese Verschiebung ermöglicht den direkten Erhalt einer unabhängigen Messung des Arbeitspunktes des Transistors, anders als bei der Änderung ΔI_D des Stroms, die in 6 dargestellt ist. Der Wert ΔU_SG ermöglicht in erster Annäherung eine Quantifizierung der Änderung der SiO₂/Flüssigkeit-Grenzfläche, die durch den lokalen Austrag induziert wird. Gemäß einer Variante wird U_SG so variiert, dass I_D konstant gehalten wird.
Die 8A bis 8C zeigen differentielle Messungen, die vor und nach Austrag von poly-L-Lysin durchgeführt wurden (8A), als Funktion der KCl-Konzentration durchgeführt wurden (8B), und als Funktion der Konzentration von ausgetragenem Poly-L-Lysin durchgeführt wurden.
In 8A sind die Variationen ΔI_D des Drain-Stroms I_D in der Ordinate für jeden der Transistoren 60 bis 96 angegeben, die in der Abszisse identifiziert sind (U_SG = 1 V, U_SD = 0,9 V, und Elektrolyt KCl mit 0,1 mM). Die Differenzen ΔI_D zwischen zwei Messungen, die vor einem lokalen Austrag durchgeführt wurden, zwischen denen aber ein Spülen mit Wasser liegt, sind durch Kreise dargestellt. Die Differenzen ΔI_D, die Messungen entsprechen, welche vor und nach einem lokalen Austrag von Poly-L-Lysin durchgeführt wurden, sind durch Sterne dargestellt. Nach dem lokalen Austrag wird die Probe 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur in feuchtem Medium stehen gelassen, bevor bei 50°C 5 Minuten lang getrocknet wird. Die Verdünnung C_o von Poly-L-Lysin beträgt letztlich 0,01% Gewicht/Volumen "W/V" final (P8920, Sigma) in einem 0,1 × PBS-Puffer mit pH-Wert 7.
In 8B werden die Differenzen ΔU_SG der Source-Gate-Spannung U_SG an einem Teil der Transistoren eines Netzwerks von 62 FET-Transistoren mit U_SD = 1,2 V und I_D = 50 μA gemessen. Die Unterschiede zwischen einer Bezugsmessung (vor dem lokalen Austrag und mit einer KCl-Konzentration von 0,01 mM durchgeführt) und von zwei Messreihen (nach dem lokalen Austrag von Poly-L-Lysin und mit verschiedenen KCl-Konzentrationen durchgeführt) sind durch Kreise und Sterne dargestellt. Hierbei wurde ein lokaler Austrag von Poly-L-Lysin in zwei unterschiedlichen Zonen mit der gleichen Verdünnung C_o wie im Falle der 8A durchgeführt. Bei jeder der zwei Messreihen wird die Konzentration von KCl in dem Messpuffer zwischen 0,01 mM und 100 mM variiert, wobei die Werte 0,1 mM, 1 mM und 10 mM durchlaufen werden. Zwischen den beiden Messreihen wird die Oberfläche mit Wasser gespült. Es wird eine beträchtliche Empfindlichkeit der Erfassung von Poly-L-Lysin bei KCl-Konzentrationen zwischen 0,01 mM und 1 mM festgestellt, und ausserhalb dieser Werte verringert sich die Höhe der Spitzen progressiv.
8C zeigt die Variationen ΔU_SG der Spannung U_SG in Abhängigkeit von der Konzentration an ausgetragenem Polymer (Poly-L-Lysin), nämlich 2C_o, C_o, C_o/2, C_o/4, C_o/8 in einem 0,1 × PBS-Puffer pH 7, wobei C_o den Wert hat, der für die Messungen von 8A angegeben wurde. Die Messbedingungen sind wie folgt: U_SD = 1 V, I_D = 100 μA, und eine Konzentration von 0,01 mM für KCl. Diese Messungen zeigen, dass es bei den gewählten Versuchsbedingungen nicht von Vorteil ist, die Konzentration über C_o hinaus zu erhöhen.
Die 9A bis 9D zeigen die elektronische Erfassung von DNA. Die Spannungen U_SG und die Variationen ΔU_SG der Spannung U_SG entsprechen einem Betriebspunkt U_SD = 1 V, I_D = 100 μA und einer KCl-Konzentration von 0,01 mM. Sie werden ausgehend von der Charakteristik I_D (U_SG, U_SD) erhalten und sind auf den Kurven abgetragen, wobei in der Abszisse die Nummern der FET-Transistoren (1 bis 96) angegeben sind.
Die Sterne stehen für die Messung mit anfänglicher Behandlung der Oberfläche mit Natriumhydroxid, wie vorausgehend in Verbindung mit 6 angegeben ist. Die Kreise stehen für die Messung nach Inkubation von Poly-L-Lysin über das gesamte Netzwerk. Um eine Immobilisierung der DNA zu ermöglichen, wird das Netzwerk von FET-Transistoren 30 Minuten lang in einer Verdünnung von Poly-L-Lysin (Konzentration C_o) inkubiert. Anschließend wird ohne Durchführung von vorausgehendem Trocknen mit Wasser gespült und daraufhin an der Luft getrocknet. Die Inkubation führt zu Verschiebungen der Spannung U_SG um einen Wert von 97 ± 50 mV (statistisch über 67 präparierte Oberflächen), welche die Variationen zwischen Transistoren in dem elektronischen Signal verringern. Diese Verschiebungen sind mit denjenigen kompatibel, die bei den Werten beobachtet wurden, die in Verbindung mit 8C an lokalen Austrägen bei der gleichen Konzentration gemessen wurden. Die Quadrate stehen für die Messungen nach lokalem Austrag von Oligonucleotiden (5' Cy-5-modifzierte 20-mer-Oligonucleotide, Konzentration 50 μM in entionisiertem Wasser) um die Transistoren Nr. 30, 60 und 90. Als Grauwerte und über 9A ist die Mikrofluoreszenzabbildung der drei vorgenannten DNA-Punkte dargestellt.
9B zeigt die elektronische Erfassung und die Erfassung mittels Fluoreszenz von Cy5-modifizierten Oligonucleotiden. Die durch Sterne dargestellten Punkte wurden mit der Differenz ΔU_SG zwischen zwei elektronischen Messungen erhalten, die vor und nach 4 lokalen Austrägen mit verschiedenen DNA-Konzentrationen durchgeführt wurden (Ref. = 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM). Sie zeigen die Variation ΔU_SG der Spannung U_SG, die in den Charakteristiken der Transistoren zu beobachten ist und auf den lokalen Austrägen von DNA beruht. Die Quadrate zeigen die Intensität der Fluoreszenz, die an den getrockneten FET-Transistoren gemessen wurde, sobald die elektronische Messung mit Elektrolyt durchgeführt worden war. Es ist anzumerken, dass die gleiche elektronische Erfassung mit Oligonucleotiden des gleichen Typs erhalten wird, die jedoch nicht modifiziert sind.
9C zeigt die Erfasung von doppelsträngiger DNA nach makroskopischem Austrag von zwei Produkten auf zwei Zonen A und B der FET-Transistoren. Mit einer Mikropipette werden 0,15 μl, die in zwei Röhrchen A und B entnommen wurden, auf zwei jeweilige Bereichen des Netzwerkes von Feldeffekttransistoren FET ausgetragen. Das Netzwerk wurde vorausgehend mit Poly-L-Lysin bedeckt, um die DNA zu immobilisieren, und gemessen, um als Bezug zu dienen. Zone A (Transistoren 1 bis 20) von 9C wurde mit der Lösung aus dem Röhrchen A bedeckt, und Zone B (Transistoren 50 bis 90) mit der Lösung aus dem Röhrchen B, wobei zwischen ihnen ein mittiger, nicht abgedeckter Bereich (Transistoren 21 bis 49) belassen wurde. Es wird 15 Minuten lang ohne Trocknen inkubiert, daraufhin mit Wasser gespült, und anschließend werden die Transistoren des Netzwerkes gemessen. Die Transistoren 1 bis 20 (Zone A) wurden mit einer Lösung inkubiert, welche Produkte einer Reaktion mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) enthielt, welche in Röhrchen A gemäß der nachfolgend beschriebenen Prozedur erhalten wurden. In dieser Zone wird eine Verschiebung nach unten bezogen auf die Zone B (Transistoren 50 bis 90) und bezogen auf die besagte nicht-inkubierte Zone zwischen A und B festgestellt. Die in der Zone B verwendete Bezugslösung wurde nämlich so gewählt, dass keine doppelsträngige DNA entstand (Röhrchen B gemäß der nachfolgend beschriebenen Prozedur).
In 9D, in dem Bereich MUT (Transistoren 1 bis 35), auf den eine Lösung ausgetragen wurde, die ausgehend von DNA, die eine Mutation trägt, durch PCR-Verstärkung unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen erhalten wurde, wird eine Abwärtsverschiebung von ΔU_SG beobachtet, während in dem Bezugsbereich WT, bei dem die Ausgangs-DNA die Mutation nicht trägt, keine solche Verschiebung beobachtet wird.
Bei dem Versuch von 9C wendet die Methode der PCR-Verstärkung eines DNA-Fragments mit 1009 Basenpaaren DNA des Bakteriophagen λ an, verdaut durch das Enzym BstEII unter Verwendung von zwei Primern:
5'-CCG CGA ACT GAC TCT CCG CC
und 5'-CAG GCG GCA GGG CTG ACG TT.
Das PCR-Protokoll wird auf einem handelsüblichen Thermozykler durchgeführt:

– Initiierung während 3 Minuten bei 94°C,
– 30 Zyklen Denaturierung/Hybridisierung/Extension von 30 Sekunden bei 94°C/30 Sekunden bei 57°C/und 2 Minuten bei 72°C.

Ein abschließender PCR-Schritt wird 3 Minuten lang bei 72°C durchgeführt.
Bei einem Volumen von 50 Mikrolitern verwendet man 10 Nanogramm λ-DNA verdaut mit BstEII, 20 Picomol für jeden der Primer, und die vier dNTP besitzen jeweils eine endgültige Konzentration von 50 μM. Es werden 0,5 Mikroliter TAQ-Polymerase (1 U/μl) von Roche Diagnostics in den Standardpuffer für die PCR-Reaktion (mit TAQ-Polymerase versehen) eingesetzt. Dies entspricht dem Präparat von Röhrchen A für die Zone A. In dem Bezugsröhrchen B (das der Zone B entspricht), wird eines der vier dNTP, nämlich das dTTP, mit dCTP so ersetzt, dass die gleiche Gesamtkonzentration an dNTP beibehalten wird, was die Synthese des Produktes von doppelsträngiger DNA inhibiert.
Die PCR-Produkte werden in beiden Fällen zwei Mal über "QIAQUICK"-Kolonnen der Fa. QIAGEN gereinigt und mit einem Tris-Cl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 mit einer Konzentration von 10 mM eluiert.
Die für die Mutation spezifische PCR-Verstärkung, die im Rahmen des Versuchs entsprechend 9D verwendet wurde, geht von einem Fragment des Humangens CX-26 (Zugriffscode M 86849, Chromosom 13q11-12) aus. Dieses Gen wird ausgehend von genomischer DNA verstärkt, die von einem oder mehreren Patienten stammt. Die PCR-Methode wendet Zyklierungsbedingungen und -Primer an, die in den Artikeln von F. DENOYELLE und Mitarbeitern beschrieben sind und für das erste "Prelingual Deafness: high prevalence of a 30delG mutation in the connexin 26 gene", erschienen in Human Molecular Genetics, 1997, Vol. 6, No. 12, S. 2173 bis 2177, und für das zweite "Clinical features of the prevalent form of childhood deafness, DFNB1, due to a connexin-26 gene defect: implications for genetic counselling", erschienen in THE LANCET, Vol. 353, 17.04.1999, S. 1298 bis 1303, verwendet wurden. Man verwendet eine Pwo-Polymerase (der Fa. Roche Diagnostics) in einem PCR-Puffer mit MgSO₄ mit 1,5 mM. Die Primer sind GAP1F und CONNR (s. den zweiten vorstehend genannten Artikel von F. DENOYELLE, S. 1299 rechte Spalte vorletzter Absatz), und die Versuchsbedingungen sind diejenigen des ersten vorstehend genannten Artikels von dem gleichen Autor (S. 2177). Man verwendete eine endgültige Konzentration von 0,6 μM für jeden der Primer und von 0,2 mM für jede der dNTPs.
Die PCR-Produkte werden über "QIAQUICK"-Kolonnen der Fa. QIAGEN gereinigt und dienen nach einer (10.000-fachen) Verdünnung als Ausgangs-DNA in der Reaktion, die für die anschließend stattfindende Mutation spezifisch ist.
Die PCR-Verstärkung ist so gewählt, dass die die Erfassung der Mutation 35delG (oder 30delG) in dem Gen CX26 mithilfe der für diese Mutation spezifischen Primer ermöglicht wird. Die Zyklierungsbedingungen und die Sequenzen der Primer sind in dem Artikel von G. LUCOTTE und Mitarbeitern mit dem Titel "PCR test for dagnosis of the common GJB2 (connexin 26) 35delG mutation on dried blond spots and determination of the carrier frequency in France" angegeben, der in Molecular and Cellular Probes (2001) 15, S. 57 bis 59, veröffentlicht wurde. Man verwendet 20 Picomol von jedem der Primer-Oligonucleotide für ein endgültiges Volumen von 50 μl.
Die zwei für die Mutation spezifischen Primer (s. den vorgenannten Artikel von LUCOTTE, S. 58, rechte Spalte, M-Primer und N-Primer) und ein gemeinsamer Primer (C-Primer) werden verwendet, um die PCR-Produkte von 197 Basenpaaren zu synthetisieren. Es werden zwei spezifische PCR-Reaktionen an jeder DNA-Probe durchgeführt, wobei die erste dieser Reaktionen mit dem ersten spezifischen Primer durchgeführt wird und ein Produkt ergibt, wenn die Mutation in der Ausgangs-DNA vorhanden ist. Die zweite Reaktion wird mit dem zweiten spezifischen Primer durchgeführt und ergibt ein Produkt, wenn die Mutation in der Ausgangs-DNA nicht vorhanden ist. Dies ermöglicht eine Bestimmung, ob eine Probe im Hinblick auf diese Mutation normal, heterozygot oder homozygot ist.
Für ein Volumen von 50 μl Reaktionsmedium in einem Standard-PCR-Puffer wird ein Mikroliter DNA verwendet, der aus der vorstehend beschriebenen Vorverstärkung stammt, 30 Picomol von jedem der Primer, dTNPs mit einem Anteil von 100 μM und 1 Mikroliter Polymerase TAQ (1 U/μl) von Roche Diagnosis. Die PCR-Produkte werden zweimal über "QIAQUICK"-Kolonnen der Fa. QIAGEN gereinigt und mit einem Tris-Cl-Puffer mit 10 mM und pH-Wert 8,5 eluiert. Für die Röhrchen WT und MUT wurde das gleiche Paar von Primern verwendet: C-Primer und M-Primer. Der einzige Unterschied liegt in der Ausgangs-DNA.
Die 10A und 10B zeigen eine integrierte Schaltung mit Transistoren T, die in einer Linie (bzw. mehreren Linien angeordnet sind). Zwei (z.B. parallele) Mikrofluidpassagen C₁ und C₂ eines Substrats 30 ermöglichen es, einen oder mehrere Feldeffekttransistoren T in Kontakt mit der Lösung zu bringen, die in einer Passage C₁ und/oder C₂ zirkuliert. Das Material eines Substrats 30, das die Mikrofluidpassagen (oder Kapillaren) aufweist, kann ein PDMS (Polydimethylsiloxan) oder ein anderes Polymer, ein Glas, Silicium, usw. sein.
Somit ist es möglich, differentielle Messungen ausgehend von zwei Lösungen durchzuführen, die in den beiden Passagen C₁ und C₂ zirkulieren. Es ist auch möglich, auf einem gleichen Substrat 30 eine große Anzahl solcher Mikrofluidpassagen herzustellen, wobei das Substrat, in dem sie ausgeführt werden, fest mit dem Halbleitersubstrat verbunden ist, in das die Feldeffekttransistoren FET integriert sind. Es ist auch möglich, eine Variation im Inneren einer gegebenen Passage zu messen. Diese Variation kann über den Verlauf der Zeit stattfinden. Es ist ausserdem möglich, verschiedene Lösungen an einem gegebenen Ort in eine Kapillare zu injizieren, und das Profil der Konzentrationen bleibt entlang der Passage, selbst in einer Entfernung vom Injektionspunkt, unverändert. Hierzu wird auf den Artikel von Paul J. A. KENIS et al., mit dem Titel "Microfabrication inside Capillaries Using Multiphase Laminar Flow Patterning", erschienen in SCIENCE, Vol. 285, 02.07.1999, S. 83–85 (insbesondere 1A) verwiesen.
Eine Analysemethode unter Anwendung von Mikrofluidtechniken ist in dem Artikel "Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system" von Eric T. LAGALLY und Mitarbeitern, erschienen in Sensors and Actuators B 63 (2000), S. 138–146, beschrieben.

Claims

Verfahren zum Erfassen der Fixierung von Sondenmolekülen auf aktiven Zonen eines Sensors oder einer Wechselwirkung, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor aus einem Netzwerk von Feldeffekttransistoren (T₁, T₂, ...) besteht, mit jeweils einer Source-Zone (S), einer Drain-Zone (D), sowie einer Gate-Zone, welche eine besagte aktive Zone (3) darstellt, auf der die Fixierung oder die Wechselwirkung erfasst werden soll, indem das Potential einer Messlösung, welche die aktiven Zonen (3) bedeckt, mithilfe einer in die Messlösung (E) eingetauchten Gate-Elektrode festgelegt wird, sowie dadurch, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen von bestimmten der Zonen (3) mit Sondenmolekülen, um deren Fixierung zu bewirken, b) Baden zumindest derjenigen Zonen, die mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht wurden, in einer Elektrolytlösung (6), c) Messen von mindestens einem Punkt der Drain-Strom/Source-Gate-Spannung/Source-Drain-Spannung-Kennlinie von mindestens zwei der Transistoren einer ersten Gruppe, die mindestens einer aktiven Zone (3) entspricht, welche mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht wurde, um daraus mittels Vergleich zwischen mindestens zwei solchen Messungen, die für zwei verschiedene Zonen erhalten wurden, eine Fixierung oder eine Wechselwirkung abzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Messen von mindestens einem Punkt der Kennlinie das Anlegen einer gegebenen Spannung (U_DS) zwischen dem Drain und der Source von zumindest den zwei Transistoren der ersten Gruppe sowie das Anlegen einer gegebenen Spannung (U_GS) zwischen dem Gate und der Source dieser Transistoren der ersten Gruppe anwendet.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zwischen a) und b) einen Spülschritt umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nach a) und vor b) die folgenden Schritte umfasst: a1) Spülen a2) Zugeben einer Lösung, welche Zielmoleküle enthält, die in der Lage sind, spezifisch mit den Sondenmolekülen eine Wechselwirkung einzugehen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nach c) die folgenden Schritte umfasst: d) Zugeben einer Elektrolytlösung (6), welche Zielmoleküle enthält, die in der Lage sind, spezifisch mit den Sondenmolekülen eine Wechselwirkung einzugehen. e) Messen von mindestens einem Punkt der Drain-Strom/Source-Gate-Spannung/Source-Drain-Spannung-Kennlinie von mindestens zwei der Transistoren einer zweiten Gruppe, die mindestens einer aktiven Zone (3) entspricht, welche mit Sondenmolekülen und mit Zielmolekülen in Kontakt gebracht wurde, um mittels Vergleich eine Erfassung von zumindest einer Wechselwirkung zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei e) die Messung von mindestens einem Punkt der Kennlinie das Anlegen einer gegebenen Spannung (U_DS) zwischen dem Drain und der Source der Transistoren von zumindest den zwei Transistoren der zweiten Gruppe und das Anlegen einer gegebenen Spannung (U_GS) zwischen dem Gate und der Source dieser Transistoren der zweiten Gruppe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mehrzahl solcher Messungen von mindestens einem Punkt der Kennlinie anwendet, die zeitlich beabstandet sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich mittels differentieller Messung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich zwischen Messungen durchgeführt wird, die an mindestens zwei Transistoren vorgenommen werden, welche Zonen (3) entsprechen, die in einer Elektrolytlösung (6) gebadet sind, nachdem sie mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleich zwischen Messungen durchgeführt wird, die an mindestens einem Transistor, welcher einer Zone (3) entspricht, die in einer Elektrolytlösung (6) gebadet ist, nachdem sie mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht wurde, um diese zu fixieren, sowie an mindestens einem Transistor, welcher einer Zone entspricht, die von der Elektrolytlösung (6) gebadet ist, ohne mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht worden zu sein, vorgenommen werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle DNA-, RNA- oder Proteinmoleküle sind.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle DNA-Moleküle sind, sowie dadurch, dass die Feldeffekttransistoren vom N-Kanal-Verarmungstyp mit einer negativen Gate-Vorspannung sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Erfassung mittels Vergleich zwischen zwei Zonen anwendet, die jeweils mindestens einen besagten Feldeffekttransistor aufweisen, wobei die erste Zone von einer Lösung gebadet ist, die ausgehend von einer enzymologischen Reaktion erhalten wird, welche ein erfassungsfähiges Produkt ergibt, das für das Vorliegen oder das Nichtvorliegen einer Mutation in einer ersten DNA-Probe spezifisch ist, und die zweite Zone von einer Lösung gebadet ist, die ausgehend von einer enzymologischen Reaktion erhalten wird, welche ein DNA-Produkt ergibt, das für das Vorliegen oder das Nichtvorliegen einer Mutation in einer zweiten DNA-Probe spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite DNA-Probe von zwei Patienten stammen, sowie dadurch, dass die enzymologische Reaktion bei den beiden Proben die gleiche ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite DNA-Probe identisch sind und von dem gleichen Patienten stammen, sowie dadurch, dass die enzymologische Reaktion in der ersten Zone unter experimentellen Bedingungen durchgeführt wird, welche bei Nichtvorliegen einer Mutation in der ersten Probe ein DNA-Produkt ergeben, sowie dadurch, dass die enzymologische Reaktion in der zweiten Zone unter experimentellen Bedingungen durchgeführt wird, welche bei Vorliegen einer Mutation in der zweiten Probe ein DNA-Produkt ergeben.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es das Zirkulieren einer Lösung durch mindestens eine Mikrofluidpassage umfasst, um die Lösung mit mindestens einem besagten Feldeffekttransistor (T₁, T₂, ...) in Kontakt zu bringen.