Zur
qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von bestimmten Nukleinsäureanalyten
wie z.B. DNA ist die Verwendung von im wesentlichen planaren Systemen
bekannt, welche in der Fachwelt als Biosensoren bzw. Biochips bezeichnet
werden. Diese Biochips bilden einen Träger, auf dessen Oberfläche i.d.R.
eine Vielzahl von zumeist rasterartig angeordneten Detektionsbereichen
ausgebildet ist, wobei sich die einzelnen Bereiche bzw. Bereichsgruppen
jeweils durch ihre Spezifität
gegenüber
einem bestimmten nachzuweisenden Analyten voneinander unterscheiden.
Im Falle der Bestimmung von DNA-Analyten
befinden sich innerhalb der einzelnen Bereiche der Trägeroberfläche – direkt
oder indirekt immobilisiert – spezifische
Nukleinsäuresonden
wie z.B. Oligonukleotide oder cDNA in zumeist einzelsträngiger Form,
deren jeweilige Spezifität
gegenüber
der zu bestimmenden Nukleinsäure
im wesentlichen durch die Sequenzabfolge (Sondendesign) vorgegeben
ist. Die auf diese weise funktionalisierte Chipoberfläche wird
im Rahmen eines entsprechenden Nachweisverfahrens mit den zu bestimmenden DNA-Analyten
unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche im Falle des Vorhandenseins
der zuvor nachweisbar markierten Zielnukleinsäure(n) deren Hybridisierung
mit den immobilisierten Sondenmolekülen gewährleisten. Die qualtitative
und ggf. quantitative Detektion eines bzw. mehrer spezifisch gebildeter
Hybridisierungskomplexe erfolgt anschließend zumeist durch optophysikalische
Lumineszenzmessung und Zuordnung der erhaltenen Daten zu den jeweiligen
Detektionsbereichen, wodurch die Bestimmung z.B. der Anwesenheit
oder der Sequenz des bzw. der Nukleinsäureanalyten und ggf. deren Quantifizierung
ermöglicht
wird.
Neben
diesen lumineszenzgestützten
Verfahren wurden in den letzten Jahren Anstrengungen unternommen,
um DNA-Analytik ohne das Erfordernis der Verwendung von Lumineszenzmarkern
und ohne die dafür
erforderlichen Detektions- und Abbildungsmittel durchzuführen.
So
wurde beispielsweise versucht, zwischen den möglichen Zustandsformen eines
Einzelstranges und eines Doppelstranges mit Hilfe von Feldeffektransistoren
(E. Souteyrand et al., Direct detection of the hybridisation of
synthetic homooligomer DNA sequences by field effect, J. Phys. Chem.
B., 1001, 2980, 1997) oder mit Impedanzstrukturen zu unterscheiden
(s. z.B. P. Van Gerwen et al., Nanoscaled interdigital electrode
arrays for biochemical sensors, Sensors and Actuators, B 49, 73–80, 1998).
Ein
weiterer Ansatz des Standes der Technik betrifft die Nutzbarmachung
der enzymatischen Aktivität
der extrazellulären
Endonuklease von Serratia marcescens, wobei der enzymvermittelte
Abbau von DNA zu einer Veränderung
des pH-Wertes führt, welche
dann mit einem pH-Sensor gemessen werden kann (S. Reher, DNA-, RNA-Analytik
mit voltametrischen, potentiometrischen und optischen Methoden unter
Einsatz der extrazellulären
Endonuklease Serratia marcescens, ISBN 3-89825-030-X, 1999).
Des
weiteren existieren Veröffentlichungen, in
denen die Durchführung
der DNA-Analytik unter Verwendung bestimmter Markersubstanzen beschrieben
wird, wobei die Detektion aber nicht über optische Methoden erfolgt.
Der eine Ansatz betrifft die Markierung hybridisierter DNA mittels
eines elektronischen Labels und dessen Haftung an eine Edelmetallelektrode,
wobei dieses Bindungsereignis mit einer Elektrode ausgelesen wird.
(www.microsensor.com/TechnologySystem.html, Clinical micro sensors,2000).
Die andere Arbeit beschreibt die Kopplung eines kleinen paramagnetischen
Körpers
an ein DNA-Molekül,
wobei das Auslesen über
die Veränderung
des Magnetfeldes erfolgt (D.R. Baselt et al., A biosensor based
on magnetoresistance technology, Biosensors & Bioelectronics 1998, 13(7–8):731–9, 1998).
Obwohl
die vorgenannten Arbeiten Alternativen zur lumineszenzgestützten Nukleinsäureanalytik aufzeigen,
leiden sie aufgrund der häufig über mehrere
Stunden andauernden Hybridisierungsreaktion in Verbindung mit den
zur Detektion eingesetzten Sensoren an einer Messabweichung, die
in der Fachwelt als Drift bezeichnet wird. Diese Drift führt zu einem
zeitlich veränderten
Signal, welches häufig
nicht vom eigentlichen Signal unterschieden oder ausreichend abgegrenzt
werden kann, da sich letzteres in der selben Frequenzgrößenordnung
wie die Drift befindet. Darüber
hinaus ist es generell einfacher ein Signal auszulesen, das innerhalb
einer möglichst
kurzen Zeitdauer seine Signalhöhe
erreicht.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines verbesserten
Verfahrens, bei dem die mit der Drift-Problematik verbundenen Nachteile überwunden
werden.
Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das
Verfahren gemäß Hauptanspruch
gelöst.
Nach
einer Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung
eines Nukleinsäureanalyten
durch Hybridisierung des Analyten an eine geeignete, auf einer festen
Phase immobilisierte Nukleinsäuresonde,
bei dem man
- (a) den Nukleinsäureanalyten
zur Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen
mit der Nukleinsäuresonde
inkubiert, und
- (b) den Analyten bestimmt auf der Basis physikalischer Messdaten,
die spezifisch mit einer enzymbedingten Massenzu- oder abnahme des
Hybridisierungskomplexes im Zusammenhang stehen,
wobei
die Messung der Daten durch mindestens einen Sensor erfolgt, welcher
integraler Bestandteil der festen Phase ist.
Durch
diesen indirekten Lösungsansatz
gelingt es erfindungsgemäß, die Detektion
unter weitgehender Vermeidung der Drift-Problematik in ein anderes
Zeitfenster und damit in eine andere Frequenz zu überführen, welches
vorzugsweise nur wenige Sekunden oder Minuten umfasst (s. 1).
Bevorzugte
Ausführungsformen
dieses Verfahrens sind in den Unteransprüchen dargestellt.
Der
vorliegend verwendete Begriff „Bestimmung" bezieht sich auf
jedwede Analysierung einer Nukleinsäure und umfasst insbesondere
den Nachweis des Vorhandenseins eines Nukleinsäureanalyten in einer zu untersuchenden
Probe. Umfasst sind ferner Anwendungsformen wie die Ermittlung einer Nukleinsäuresequenz
und die Erfassung von Mutationen wie insbesondere SNP's. Das vorliegende
Verfahren gewährleistet somit
eine sehr große
Bandbreite an Einsatzmöglichkeiten,
da es auf alle derzeit und zukünftig
verfügbaren
Bestimmungs- bzw.
Nachweistechniken anwendbar ist, die auf der Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes
beruhen.
Nach
einer bevorzugten Ausführungsformen wird
das die Massenzu- oder abnahme des Hybridisierungskomplexes bewirkende
Enzym aus der Gruppe ausgewählt
bestehend aus Polymerasen, Ligasen, Ribozymen, quasi-katalytischen
Nukleinsäuren,
DNasen/RNAsen (Exo- bzw. Endonukleasen einschließlich Restriktionsendonukleasen),
und RNase H, wobei eine Polymerase, insbesondere eine Polymerase
mit einer 5'- und/oder 3'-Exonukleaseaktivität, besonders
bevorzugt ist.
Neben
den DNA-abhängigen
DNA-Polymerasen kann eine Massenzunahme in Abhängigkeit der gegebenen Beschaffenheit
der Nukleinsäure (RNA
oder DNA) erfindungsgemäß auch durch
Verwendung von RNA-abhängigen
DNA-Polymerasen (reverse Transkriptase) bzw. RNA-abhängigen RNA-Polymerasen
(Replikasen) erfolgen. Eine Massenzunahme kann ferner durch den
Einsatz von entsprechenden polymeraseaktiven Ribozymen bzw. quasi-katalytischen
RNAs bewirkt werden. Für
alle Polymerasen (einschließlich
Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's) gilt erfindungsgemäß, dass sowohl
thermostabile wie auch thermolabile Enzyme eingesetzt werden können.
Eine
enzymatisch bewirkte Massenzunahme kann auch mittels Ligasen erfolgen.
In diesem Zusammenhang wird auch auf die erfindungsgemäß geeignete
Verwendung von ligaseaktiven Ribozymen bzw. quasi-katalytischen
RNA's hingewiesen.
Für alle Ligasen
(einschließlich
Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's) gilt, dass erfindungsgemäß sowohl thermostabile
wie auch thermolabile Enzyme eingesetzt werden können.
Im
Gegensatz zum Massezuwachs kann auch eine Masseabnahme detektiert
werden. Eine Masseabnahme durch Spaltung der gebundenen Nukleinsäuren kann
durch Nukleasen (RNasen, DNasen) erfolgen. Sowohl 5'- und/oder 3'- Exo- als auch Endonukleasen
sowie Rnase H können
Verwendung finden. Einzel- wie auch doppelstrangabhängige Enzyme
bzw. Enzyme mit beiden Aktivitäten
können eingesetzt
werden. Für
die Nukleasen gilt zudem, dass sequenzspezifische wie auch nicht
sequenzspezifische Enzyme eingesetzt werden können. Auch Ribozyme bzw. quasi-katalytische
RNA's mit Nukleaseaktivität sind geeignet.
Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's agieren i.d.R. sequenzspezifisch,
wobei die Spezifität
mittels der jeweiligen Hybridisierungssequenz entsprechend den Bedürfnissen eingestellt
werden kann.
Die
vorliegende Erfindung reflektiert demgemäß die bei den meisten Festphasen-gebundenen Nukleinsäureanalyten
anzutreffende Situation des Vorliegens einer an einer festen Phase
immobilisierten einzelsträngigen
Nukleinsäuresonde
(s. 1A). Unter geeigneten Bedingungen bildet sich
an dieser Sonde im Falle des Vorhandenseins eines zu der Sondensequenz
im wesentlichen komplementären Nukleinsäureanalyten
ein zumindest teilweise mindestens doppelsträngiger Hybridisierungskomplex aus
(s. 1B).
Erfindungsgemäß erfolgt
im Anschluss an die Ausbildung des Komplexes die Einleitung eines enzymatischen
Schrittes (s. 1C), wobei die Enzymleistung
zu einer messbaren Veränderung
der Masse dieses Komplexes führt.
Beispielsweise
kann im Falle des Vorliegens eines aus einer kürzeren DNA-Sonde und eines
im Vergleich dazu längeren
Nukleinsäureanalyten
bestehenden Hybridisierungskomplexes eine Polymerase eingesetzt
werden, welche unter geeigneten Bedingungen und in Anwesenheit der
vier Nukleotidtriphosphate (A; T; G; C) in der Lage ist, den durch
die längere
Analytennukleinsäure
bedingten einzelsträngigen
Bereich – zumindest
teilweise – aufzufüllen (s. 1C
und 1D). Bei einer unterstellten durchschnittlichen
Bindungsgeschwindigkeit, die in einer Größenordnung von tausend Basen
pro Minute liegt, erfolgt diese kontinuierliche Polymerisation innerhalb von
wenigen Minuten. Dieses Beispiel geht von einer unterschiedlichen
Länge der
beteiligten Hybridisierungspartner aus und ist auch auf den umgekehrten Fall
anwendbar, bei dem der Analyt im Vergleich zur Sonde eine kürzere Kettenlänge aufweist.
In diesem Falle kann es vorteihaft sein, das Sondesign so zu gestalten,
dass die Sonde eine Länge
von mindestens 100 Nukleotiden aufweist und der zu erwartende und
mittels Polymeraseaktivität
aufzufüllende
einzelsträngige
Bereich des Hybridisierungskomplexes möglichst dicht an die Sensoroberfläche heranreicht. Dieser
Vorteil lässt
sich auch erreichen, wenn die Sonde mit ihrem 3'-Ende immobilisiert wird und die Auffüllung des
einzelsträngigen
Bereichs in Richtung fester Phase erfolgt. Diese vorteilhaften Ausführungsformen
sind nicht nur auf Polymerasen sondern allgemein auf alle erfindungsgemäß geeigneten
Enzyme übertragbar
und können
vom Fachmann in Abhängigkeit
des gewünschten
Anwendungsbereiches leicht vollzogen werden.
Sofern
in der zu analysierenden Probe kein zur Sondensequenz komplementärer Analyt
vorhanden ist, so kommt es an dieser Stelle aufgrund unterschiedlicher
Bindungsenergien zu keiner Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes,
weshalb die anschließende
Enzymreaktion unterbleibt und keine enzymbedingten Messdaten erfasst
werden können.
Da
eine Hybridisierung ohne das Anlegen eines elektrischen Feldes gewöhnlich in
der Größenordnung
von mehreren Stunden abläuft,
wird die Dauer der Detektion erfindungsgemäß erheblich herabgesetzt, wodurch
ein sehr viel kürzeres
Zeitfenster entsteht, welches für
die Auslesung von Sensoren geeigneter ist.
Durch
die oben beispielhaft erwähnte
Polymeraseaktivität
entstehen Pyrophosphatanionen, die bei der Polymerisation der Nukleotidtriphosphate
im einzelsträngigen
Bereich des Hybridisierungskomplexes freigesetzt werden und zu einer
lokalen Ansäuerung
und damit zu einer Absenkung des pH-Wertes führen. Durch lokale Anordnung
eines pH-Sensors bzw. eines pH-Detektors
(z.B. pH-ISFET) kann diese Veränderung
des pH-Wertes, gewünschtenfalls
ortsspezifisch, detektiert werden (s. 2).
Erfindungsgemäß ist ferner
vorgesehen, dass die bei einer Polymerisation bzw. Ligation freigesetzten
Pyrophosphationen auch indirekt, d.h. über eine sekundäre Enzymkaskade
detektiert werden können.
An der ersten der sekundären
Reaktionen sind beispielsweise ATP-Sulfurylase und Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) beteiligt. In diesem
Fall wird das beim Einbau eines Nukleotids bei der Polymerisation
bzw. bei einer Ligation freigesetzte Pyrophosphat PPi und das APS
durch die ATP-Sulfurylase zu ATP umgesetzt. Das hierbei erzeugte
ATP kann dann weitere enzymatische Reaktionen katalysieren, die
der eigentlichen Detektion zugeführt
werden. Zum Beispiel kann das gebildete ATP die Umsetzung von Luciferin
durch die Luciferase katalysieren, wodurch eine Lichtemission entsteht,
welche mit den erfindungsgemäßen optischen
Sensoren abgetastet werden kann.
Ein
modifiziertes Beispiel für
das erfindungsgemäße Verfahren
betrifft die Beladung der einzusetzenden Nukleotidtriphosphate mit
magnetischen Kügelchen
(Baselt, a.a.O., 1998) oder mit Metallpartikel (Clinical micro sensors,
a.a.O., 2000). Diese Beladung hat zur Folge, dass die Auslesung
noch durch zusätzliche
Eigenschaften des an das Nukleotidtriphosphat gebundenen Festkörpers verstärkt wird. Des
weiteren können
sich Farbstoffe am Nukleotidtriphosphat befinden, die dann über eine
integrierte Photodiode ausgelesen werden können.
Nach
einer bevorzugten Ausführungsform wird
daher der mindestens eine Sensor ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Elektrodenstrukturen, Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren,
optischen Sensoren und pH-Sensoren, um dem breiten Anwendungsspektrum
der vorliegenden Erfindung zu entsprechen.
Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
betrifft die kombinatorische Verwendung unterschiedlicher Sensoren
der zuvor genannten Art. Beispielsweise könnte die Signalintensität bzw. -schärfe und
damit die Verlässlichkeit
eines gewünschten
Detektionsereignisses optimiert werden, wenn eine für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignete Vorrichtung nicht nur einen sondenspezifischen Sensor,
wie z.B. einen Feldeffekttransistor, sondern zusätzlich noch eine andere Art
sondenspezifischen Sensor, wie z.B. einen pH-ISFET, aufweist. Die
aus dieser multiparametrischen Messung erhaltenen Daten ermöglichen
gewünschtenfalls
eine noch exaktere Auswertung der enzymbedingten Signale.
Des
weiteren kann der Sensor mit einem Heizelement ausgestattet sein.
Ein derartiges Element könnte
beispielsweise aus Leiterbahnen bestehen, die während des CMOS-Prozesse aufgebracht und
anschließend
von den folgenden Schichten abgedeckt worden sind. Hierdurch könnten Temparaturzyklen
gefahren werden, was z.B. für
eine PCR-gestützte Anwendung
im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
gewünscht
sein könnte.
Da
eine schubweise Zugabe von Analyten bei den Sensoren sogenannte
Zugabepeaks hervorrufen kann ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße Verfahren
kontinuierlich (im Durchfluss) betrieben wird.
Nach
einem weiteren Aspekt wird eine Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
bereitgestellt.
Diese
Vorrichtung umfasst mindestens eine feste Phase, mindestens eine
darauf direkt oder indirekt immobilisierte Nukleinsäuresonde,
sowie mindestens einen Sensor zur Erfassung der physikalischen Messdaten,
wobei der Sensor integraler Bestandteil der festen Phase ist und
vorzugsweise ausgewählt
ist aus der zuvor definierten Gruppe bestehend aus Elektrodenstrukturen,
Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren, optischen Sensoren und pH-Sensoren.
Nach
einer bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäuresonden unter Ausbildung
eines Mikroarrays rasterartig angeordnet, wobei jeder immobilisierten
Nukleinsäuresonde
bzw. jedem spezifischen Detektionsbereich besonders bevorzugt mindestens
ein Sensor zugeordnet ist.
Die
aus der EP-A-0 881 490 bekannte Messeinrichtung zur Messung bestimmter
physiologischer wie auch morphologischer Parameter mindestens einer
zu untersuchenden lebenden Zelle kann für den erfindungsgemäßen Einsatz
nach entsprechender Modifikation verwendet werden. Die beschriebene Einrichtung
weist bereits eine Vielzahl von Sensoren auf, die integraler Bestandteil
einer Trägereinrichtung sind,
auf welcher das zu untersuchende Material immobilisiert ist.
Die
Trägereinheit
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
besteht im wesentlichen aus einem Halbleitermaterial mit einer integrierten,
vorzugsweise mehrere Detektoren umfassenden Detektorschicht, wobei
als Detektoren mindestens einer der zuvor beschriebenen Sensoren,
gegebenenfalls in Kombination (s.o.), eingearbeitet ist. Ferner
kann die Trägereinheit
Heizelemente aufweisen, um während
einer Anwendung unterschiedliche Temperaturen bereitstellen zu können (s.o.).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Signalverarbeitung zumindest
teilweise innerhalb des bzw. der eingesetzten Sensorchips.
Nach
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die abgetasteten Messdaten
beispielsweise direkt auf dem Chip mit analogen Schaltungen ausgewertet
werden, indem man z.B. jede Millisekunde einen Wert aufnimmt, der
dann z.B. auch mit einem Referenzwert einer zuvor durchgeführten Messung,
welcher ebenfalls auf dem Chip gespeichert wurde, verglichen wird.
Darüber
hinaus wird auf diese Weise ermöglicht,
dass man unspezifische Störsignale
wie z.B. eingestreute externe Signale herausrechnen kann.
Sofern
die Sensoroberfläche
das Design einer Microarray-Anordnung
aufweist, bei der eine Vielzahl von Detektionsfeldern auszuwerten
sind, kann die Detektion der Messfeld- bzw. -punktsignalwerte sequentiell
erfolgen, indem z.B. ganze Zeilen oder Spalten der Sensoroberfläche bzw.
Teile derselben nacheinander detektiert werden (Multiplexanwendung).
Beispielsweise
können
die elektronischen Ausgangssignale der Detektoren mittels geeigneter Schaltungseinrichtungen
nach einer Analog-Digitalumsetzung einer externen Auswerteeinrichtung
zugeführt
werden (s.o.).
Um
mit dieser Schicht aus Sensoren das erfindungsgemäße Verfahren
durchführen
zu können, kann
sie nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit einer kopplungsfähigen Substanz
beschichtet werden. Typischerweise werden hierzu die Sensor-Chip-Oberflächen, wie
z.B. solche aus Siliziumdioxid, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen (sog. "Linker"), die beispielsweise
eine Halogensilan- (z.B. Chlorsilan-) oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung
an die Trägeroberfläche aufweisen,
getaucht, sodass sich eine sich selbst organisierende Monoschicht
(SAM) bildet, durch welche die kovalente Bindung zwischen Sensoroberfläche und
Rezeptor erzeugt wird. Beispielsweise kann mit Glycidyltriethoxysilan
beschichtet werden, was z.B durch Eintauchen in eine Lösung von
1% Silan in Toluol, langsames Herausziehen und Immobilisieren durch „Backen" bei 120° C erfolgen
kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im allgemeinen
eine Dicke von wenigen Ångström aus. Die
Kopplung zwischen Linker und Rezeptormoleküle(n) erfolgt über eine
geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino-
oder Epoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung
einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Molekülen, insbesondere
auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind
dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson,
Academic Press 1996. Hinsichtlich der Ausbildung dünner Polymerschichten
als Kopplungsmatrix zur Schaffung einer funktionalisierten Oberfläche wird
auf die WO 00/43539 verwiesen.
Die
als Sondenmoleküle
erfindungsgemäß vorgesehenen
Nukleinsäuren
können
anschließend mittels
gängiger
Druckgeräte
aufgebracht und immobilisiert werden.
Auf
derart hergestellten Oberflächen
können nun
unter Anwendung etablierter Verfahren Hybridisierungen mit z.B.
DNA durchgeführt
werden. Diese kann z.B. mittels PCR erzeugt werden. Beim Hybridsieren
bindet nun der DNA-Analyt an den auf dem Sensor vorhandenen Gegenstrang
der Sonde (sofern vorhanden). Positive Hybridisierungsereignisse können nun
unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen
werden.
Die
Messung eines ortsspezifischen Massezuwachses kann z.B. durch physikalische
Methoden erfolgen. Beispielsweise kann die ortsspezifische Änderung
des Brechungsindexes, die ortsspezifische Änderung des elektrischen Widerstandes
bzw. der elektrischen Leitfähigkeit,
die ortsspezifische Änderung
der optischen Dichte oder auch ortsspezifische dichroische Effekte,
etc. gemessen werden.
Grundsätzlich ist
das allgemeine erfindungsgemäße Verfahren
für ein
breites Spektrum an Anwendungsgebieten geeignet, wobei zwischen
reinem diagnostischen Nachweis bestimmter Analyten in einer zu analysierenden
Probe einerseits und komplexer abgeleiteten Modifikationen des Verfahrens
zur Ermittlung von Sequenzdaten oder Informationen über funktionelle
Zusammenhänge
im Rahmen entsprechender Genomik-Fragestellungen unterschieden werden
kann. Diese Unterscheidung dient jedoch nur der Veranschaulichung
und soll die grundsätzlich
offene Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens in keiner Weise
beschränken.
Beispielsweise
ist das erfindungsgemäße Verfahren
insbesonders geeignet zur Bestimmung von DNA-Sequenzen, die mittels
paralleler Amplifikation durch verschachtelte (nested) PCR, vorzugsweise
in einem kombinierten Flüssigphasen/Festphasen-DNA-Microarraysystem
erzeugt wurden, da auf diese Weise sowohl auf die Verwendung modifizierter Nukleotide
wie z.B. Biotin, Digoxiginin, als auch auf herkömmlich eingesetzte Fluoreszenzfarstoffe
und andere Markersubstanzen verzichtet werden kann. Die verschachtelte
PCR im kombinierten Flüssigphasen/Festphasen-DNA-Microarraysystem
(s. 4) besitzt die gleiche Empfindlichkeit wie eine
konventionelle, d.h. in flüssiger
Phase durchgeführte,
PCR, gewährleistet
aber gleichzeitig eine höhere
Spezifität als
herkömmliche
Hybridisierungsassays und Primer-Extensionassays. Dieser Vorteil
resultiert daraus, dass die dem System Primer/Proben-DNA/Polymerase eigene
Spezifität
in bezug auf die Amplifikation zusätzlich noch durch die spezifische
Wechselwirkung zwischen dem an den festen Träger immobilisierten inneren
PCR-Primer (der somit auch die Funktion einer Sonde ausübt) und
dem Amplikon deutlich erhöht
wird. Insgesamt resultiert so eine Spezifität, die z.B. derjenigen eines
5'-Exonuklease-Assays
(z.B. unter Verwendung von TaqManTM-Polymerase) überlegen
ist.
Die
Signale des Sensors werden durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen.
Eine Aufnahmeeinheit besitzt einen sehr schnellen Konverter zur
Umwandlung analoger Detektorsignale in digitale Werte, die gespeichert
werden. Eine Auswertung der digitalen Werte wird vorzugsweise in
Echtzeit vorgenommen, kann jedoch auch zeitlich verzögert erfolgen. Zur
Auswertung der digitalen Werte kann ein gewöhnlicher Mikroprozessor verwendet
werden.
Die
Abk. „M", „mM" und „μM" stehen im Folgenden
für die
Einheiten mol/l, mmol/l bzw. μmol/l.
Die
Erfindung und vorteilhafte Ausgestaltungen werden nun anhand der
Figuren der Zeichnung näher
erläutert:
1 zeigt
den schematischen Ablauf einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
(A) Die Nukleinsäuresonde
(2) wird kovalent an die Oberfläche gebunden. (B) Nach Zugabe
des Nukleinsäureanalyten
(1) kommt es, gewöhnlich
in einem Zeitraum von mehreren Stunden, zur Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes.
(C) Durch den Einsatz eines geeigneten Enzyms, wie z.B. einer Polymerase,
wird der einzelsträngige
Bereich des Komplexes in Anwesenheit der vier Nukleotide A, T, G
und C (im Falle von DNA) innerhalb eines sehr viel kürzeren Zeitraums
von nur wenigen Minuten aufgefüllt
(D), wodurch sehr viel schneller ein Signal generiert wird, welches
von einem Sensor (4) als integriertem Bestandteil der festen
Phase ausgelesen wird.
Die 2 zeigt
das Prinzip einer bevorzugten Ausführungsform unter Anwendung
einer Polymerasereaktion, durch welche Pyrophosphatanionen (5)
freigesetzt werden, die zu einer lokalen Veränderung des pH-Wertes führen. Diese
Veränderung
kann vom integrierten Sensor (4) erfasst werden.
Die 3 zeigt
einen im Rahmen eines CMOS-Prozesses hergestellten Feldeffekttransistor. Der
Feldeffekttransistor besteht z.B. aus einer p-n-p Schicht (6)
in einer n-Wanne mit einem dünnen
Isolator (10) (z.B. 10 nm thermisches Oxid), der sich an der
Oberfläche
befindet und auf den direkt oder indirekt die Nukleinsäuresonde
aufgebracht wird, die dann die Hybrisisierung eingeht. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist der Kratzschutz (7) im Bereich des Feldeffekttransistors
entweder scharfkantig oder stufenweise heruntergeätzt, sodass
der Vorgang der Hybrisisierung und des Massenzuwachses (8)
in einem vertieften Bereich stattfindet. Die Oberflächen der
Vorrichtung können
durch Aufbringung von z.B. Edelmetall oder hydro-phoben/hydrophilen Materialien
(9) die Hybrdisierung der Nukleinsäuremoleküle aktiv oder passiv beeinflussen.
In einer Messlösung
(11), wie z.B. 1 M NaHCO3, erfolgt
die Messung der Veränderung
der dielektrischen Eigenschaften auf dem Gate, die durch das Auffüllen des einzelsträngigen Bereichs
des Hybridisierungskomplexes stattfinden. Die hierdurch bewirkte
Verschiebung des Flachbandpotentials kann mit dem Feldeffektransistor
unter Verwendung einer sich in der Lösung befindlichen Referenzelektrode
(12) ausgelesen werden. Als Signal können z.B. der Strom zwischen
Drain und Source oder die Spannung zwischen Referenzelektrode und
Source aufgenommen werden (s. z.B. B. Palan et al., Fundamental
Noise Limits of ISFET-Based Microsystems, Poster-Beitrag 4P26, EUROSENSORS
XIII (ISBN 90-76699-02-X), S. 169 ff., 1999).
Die 4 zeigt
die im Verlauf einer parallelen Amplifikation auf der Basis einer
sogenannten „Nested
On Chip" PCR (NOC,
s.o.) mit einem FET abgetastete Spannungsveränderung. In A ist die Spannungsänderung
an einer Sondenposition über den
Verlauf einer ganzen NOC dargestellt. Die X-Achse gibt die Anzahl
der Zyklen an, während
auf der Y-Achse
die gemessenen Spannung angegeben ist. Unterhalb der X-Achse sind die an
die Sondenposition gekoppelten Primermoleküle (=Sondenmoleküle) symbolisiert:
In den ersten Zyklen sind nur wenige Primer elongiert, gefolgt von
einer starken exponentiellen Zunahme in den mittleren Zyklen und
einer zunehmenden Sättigung
(weitgehend alle Primer elongiert) in den späten Zyklen. Die Kurve zeigt,
wie mit Zunahme der Masse an der Sondenposition die gemessene Spannung
ansteigt. In B ist der Spannungsverlauf eines einzigen Zyklus (mittlerer
Zyklenzahl) dargestellt. Zusätzlich
zum Primer sind hier auch das Template und von links nach rechts
die Elongation eines Primers dargestellt. Aus der Darstellung ist
ersichtlich, dass die Spannung in Abhängigkeit von der Primerverlängerung
ansteigt.