EP1456417A2 - Verfahren zur bestimmung von nukleinsäureanalyten - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von nukleinsäureanalyten

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Publication number
EP1456417A2
EP1456417A2 EP02805308A EP02805308A EP1456417A2 EP 1456417 A2 EP1456417 A2 EP 1456417A2 EP 02805308 A EP02805308 A EP 02805308A EP 02805308 A EP02805308 A EP 02805308A EP 1456417 A2 EP1456417 A2 EP 1456417A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
sensor
sensors
analyte
solid phase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02805308A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Klapproth
Mirko Lehmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TDK Micronas GmbH
Original Assignee
TDK Micronas GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TDK Micronas GmbH filed Critical TDK Micronas GmbH
Publication of EP1456417A2 publication Critical patent/EP1456417A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS

Definitions

  • the present invention relates generally to a method and a device for determining nucleic acid analyzes.
  • the invention relates to the detection of the presence of such an analyte without the conventional use of optically detectable marker substances.
  • biosensors or biochips For the qualitative and / or quantitative determination of certain nucleic acid analytes such as DNA, the use of essentially planar systems is known, which are referred to in the art as biosensors or biochips. These biochips form a carrier, on the surface of which a plurality of detection regions, which are usually arranged in a grid-like manner, are usually formed, the individual regions or region groups each differing from one another in their specificity with respect to a specific analyte to be detected.
  • nucleic acid probes such as oligonucleotides or cDNA in mostly single-stranded form
  • sequence sequence probe design
  • the chip surface that is functionalized in this way is brought into contact with the DNA analytes to be determined as part of a corresponding detection method under conditions which, if the target nucleic acid (s) previously detected are present, ensure their hybridization with the immobilized probe molecules.
  • the qualitative and, if necessary, quantitative detection of one or more specifically formed hybridization complexes is then usually carried out by optophysical luminescence measurement and assignment of the data obtained to the respective detection areas, which enables the determination, for example, of the presence or the sequence of the nucleic acid analyzer (s) and, if necessary, their quantification.
  • Another approach of the prior art relates to the utilization of the enzymatic activity of the extracellular endonuclease of Serra tia marcescens, the enzyme-mediated degradation of DNA leading to a change in the pH, which can then be measured with a pH sensor (S. Reher , DNA, RNA analysis with voltametric, potentiometric and optical methods using the extracellular endonuclease Serra tia marcescens, ISBN 3- 89825-030-X, 1999).
  • a pH sensor S. Reher , DNA, RNA analysis with voltametric, potentiometric and optical methods using the extracellular endonuclease Serra tia marcescens, ISBN 3- 89825-030-X, 1999.
  • DNA analysis is described using certain marker substances, but the detection is not carried out by optical methods.
  • the object of the present invention is therefore to provide an improved method in which the disadvantages associated with the drift problem are overcome.
  • the object is achieved by the method according to the main claim.
  • the present invention relates to a method for determining a nucleic acid analyte by hybridizing the analyte to a suitable nucleic acid probe immobilized on a solid phase, in which
  • the analyte is determined on the basis of physical measurement data which are specifically related to an enzyme-related mass increase or decrease in the hybridization complex, the measurement of the data being carried out by at least one sensor which is an integral part of the solid phase.
  • This indirect approach enables the detection to be transferred to another time window and thus to a different frequency, which preferably comprises only a few seconds or minutes (see FIG. 1) while largely avoiding the drift problem.
  • determination used in the present context refers to any analysis of a nucleic acid and includes in particular the detection of the presence of a nucleic acid analyte in a sample to be investigated.
  • forms of use such as the determination of a nucleic acid sequence and the detection of mutations such as, in particular, SNPs are also included Procedure guaranteed thus a very wide range of possible uses, since it is based on all currently and future available determination or Detection techniques are applicable, which are based on the formation of a hybridization complex.
  • the enzyme causing the mass increase or decrease of the hybridization complex is selected from the group consisting of polymerases, ligases, ribozymes, quasi-catalytic nucleic acids, DNases / RNAses (exo- or endonucleases including restriction endonucleases), and RNase H, wherein a polymerase, in particular a polymerase having a 5 ⁇ - and / or 3 x -Exonukleasemodtician, is particularly preferred.
  • RNA-dependent DNA polymerases a mass increase depending on the given nature of the nucleic acid (RNA or DNA) can also take place according to the invention by using RNA-dependent DNA polymerases (reverse transcriptase) or RNA-dependent RNA polymerases (replicases) .
  • a mass increase can also be brought about by using appropriate polymerase-active ribozymes or quasi-catalytic RNAs.
  • polymerase-active ribozymes or quasi-catalytic RNAs for all polymerases (including ribozymes or quasi-catalytic RNAs) it is the invention that both thermostable and thermolabile enzymes can be used.
  • An enzymatically caused mass increase can also take place by means of ligases.
  • ligases including ribozymes or quasi-catalytic RNAs.
  • thermostable and thermolabile enzymes like can be used for all ligases (including ribozymes or quasi-catalytic RNA 's).
  • thermostable and thermolabile enzymes like can be used for all ligases (including ribozymes or quasi-catalytic RNA 's).
  • thermostable and thermolabile enzymes like can be used.
  • a decrease in mass can also be detected.
  • a decrease in mass by cleavage of the bound nucleic acids can be done by nucleases (RNases, DNases). Both 5 - and / or 3 ⁇ - exo- as well as endonucleases and RNase H can be used.
  • Ribozymes or quasi-catalytic RNAs with nuclease activity are also suitable. Ribozymes or quasi-catalytic RNAs generally act in a sequence-specific manner, the specificity being able to be adjusted according to the needs by means of the respective hybridization sequence.
  • the present invention accordingly reflects the situation found in most solid-phase-bound nucleic acid analyzes of the presence of a single-stranded nucleic acid probe immobilized on a solid phase (see FIG. 1A). Under suitable conditions, an at least partially at least double-stranded hybridization complex forms on this probe in the presence of a nucleic acid analyte which is essentially complementary to the probe sequence (see FIG. 1B).
  • an enzymatic step is initiated (see FIG. IC), the enzyme performance leading to a measurable change in the mass of this complex.
  • the polymerase activity mentioned above gives rise to pyrophosphate anions which are released in the polymerization of the nucleotide triphosphates in the single-stranded region of the hybridization complex and lead to local acidification and thus to a lowering of the pH.
  • a pH sensor or a pH detector e.g. pH-ISFET
  • this change in the pH value can be detected, if desired location-specifically (see Fig. 2).
  • the pyrophosphate ions released during a polymerization or ligation can also be detected indirectly, ie via a secondary enzyme cascade.
  • a secondary enzyme cascade For example, ATP-sulfurylase and adenosine 5'-phosphosulfate (APS) are involved in the first of the secondary reactions.
  • the pyrophosphate PPi released during the incorporation of a nucleotide during the polymerization or during a ligation and the APS are converted to ATP by the ATP sulfurylase.
  • the ATP generated in this way can then catalyze further enzymatic reactions which are fed to the actual detection.
  • the ATP formed, the reaction of luciferin by the luciferase catalyze arises whereby a light emission which 'can be scanned with the inventive optical sensors.
  • a modified example of the method according to the invention relates to the loading of the nucleotide triphosphates to be used with magnetic beads (Baselt, loc. Cit., 1998) or with metal particles (Clinical micro sensors, loc. Cit., 2000). The result of this loading is that the reading is further enhanced by additional properties of the solid body bound to the nucleotide triphosphate.
  • dyes can be present on the nucleotide triphosphate, which can then be read out via an integrated photodiode.
  • the at least one sensor is therefore selected from the group consisting of electrode structures, field effect transistors, magnetic sensors, optical sensors and pH sensors in order to correspond to the wide range of applications of the present invention.
  • a particularly preferred embodiment relates to the combinatorial use of different sensors of the aforementioned type.
  • the signal intensity or sharpness and thus the reliability of a desired detection event could be optimized if a device suitable for the method according to the invention not only a probe-specific sensor, e.g. a field effect transistor, but also another type of probe-specific sensor, e.g. has a pH-ISFET.
  • the data obtained from this multiparametric measurement enable an even more precise evaluation of the enzyme-related signals.
  • the senor can be equipped with a heating element.
  • a heating element could consist, for example, of conductor tracks which are applied during the CMOS process and subsequently by the following Layers have been covered. In this way, temperature cycles could be carried out, which could be desirable, for example, for a PCR-supported application in the context of the method according to the invention.
  • an apparatus for performing the method according to the invention is provided.
  • This device comprises at least one solid phase, at least one nucleic acid probe immobilized directly or indirectly thereon, and at least one sensor for recording the physical measurement data, the sensor being an integral part of the solid phase and preferably being selected from the previously defined group consisting of electrode structures and field effect transistors , Magnetic sensors, optical sensors and pH sensors.
  • a large number of different nucleic acid probes are arranged in a grid-like manner with the formation of a microarray, with each immobilized nucleic acid probe or each specific detection area being particularly preferably assigned at least one sensor.
  • the measuring device known from EP-A-0 881 490 for measuring certain physiological as well as morphological parameters of at least one living cell to be examined can be used accordingly for the use according to the invention Modification can be used.
  • the device described already has a large number of sensors which are an integral part of a carrier device on which the material to be examined is immobilized.
  • the carrier unit of the device according to the invention essentially consists of a semiconductor material with an integrated detector layer, preferably comprising several detectors, with at least one of the sensors described above, optionally in combination, as detectors
  • the signal processing takes place at least partially within the sensor chip or chips used.
  • the sampled measurement data can be evaluated, for example, directly on the chip using analog circuits, for example by takes a value every millisecond, which then e.g. is also compared with a reference value of a previously performed measurement, which was also stored on the chip.
  • analog circuits for example by takes a value every millisecond, which then e.g. is also compared with a reference value of a previously performed measurement, which was also stored on the chip.
  • unspecific interference signals such as e.g. interfering with external signals.
  • the measurement field or point signal values can be detected sequentially, for example by detecting entire rows or columns of the sensor surface or parts thereof in succession (multiplex application ).
  • the electronic output signals of the detectors can be supplied to an external evaluation device by means of suitable circuit devices after an analog-digital conversion (see above).
  • the sensor chip surfaces such as those made of silicon dioxide
  • the sensor chip surfaces are dissolved in a solution of bifunctional molecules (so-called "linkers") which have, for example, a halosilane (for example chlorosilane) or Al oxysilane group for coupling to the carrier surface. immersed so that a self-organizing monolayer (SAM) is formed, through which the covalent bond between the sensor surface and the receptor is created.
  • linkers bifunctional molecules
  • halosilane for example chlorosilane
  • Al oxysilane group for coupling to the carrier surface.
  • glycidyltriethoxysilane can be coated, which can be done, for example, by immersion in a solution of 1% silane in toluene, slow extraction and immobilization by “baking” at 120 ° C.
  • a coating created in this way generally has a thickness of a few angstroms
  • the linker and receptor molecule (s) are coupled via a suitable further functional group, for example an amino or epoxy group, and suitable bifunctional linkers for coupling a large number of different receptor molecules, in particular also of biological origin, to a large number of support surfaces are well known to the person skilled in the art, see for example "Bioconjugate Techniques" by GT Hermanson, Academic Press 1996.
  • WO 00/43539 With regard to the formation of thin polymer layers as a coupling matrix for creating a functionalized surface, reference is made to WO 00/43539.
  • the nucleic acids provided according to the invention as probe molecules can then be applied and immobilized using conventional pressure equipment.
  • hybridizations with e.g. DNA can be performed. This can e.g. generated by PCR. When hybridizing, the DNA analyte now binds to the counter strand of the probe (if present) on the sensor. Positive hybridization events can now be detected using the method according to the invention.
  • the measurement of a location-specific mass increase can e.g. done by physical methods.
  • the location-specific change in the refractive index, the location-specific change in the electrical resistance or the electrical conductivity, the location-specific. Change in optical density or location-specific dichroic effects, etc. can be measured.
  • the general method according to the invention is suitable for a broad spectrum of fields of application, on the one hand between pure diagnostic detection of certain analytes in a sample to be analyzed and more complex derived modifications of the method for determining sequence data or information about functional ones. Connections can be distinguished in the context of corresponding genomics questions. However, this distinction is only for illustration and is in no way intended to limit the basically open applicability of the method according to the invention.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the determination of DNA sequences which were generated by means of parallel amplification by nested (PCR), preferably in a combined liquid-phase / solid-phase DNA microarray system, since in this way both the use of modified nucleotides and eg biotin, digoxiginin, and conventionally used fluorescent dyes and other marker substances can be dispensed with.
  • PCR nested
  • the nested PCR in the combined liquid-phase / solid-phase DNA microarray system has the same sensitivity as a conventional, ie carried out in the liquid phase, PCR, but at the same time ensures a higher specificity than conventional hybridization assays and Primer extension assays.
  • the signals from the sensor are recorded by a recording unit.
  • a recording unit has a very fast converter for converting analog detector signals into digital values that are stored.
  • the digital values are preferably evaluated in real time, but can also be delayed.
  • a conventional microprocessor can be used to evaluate the digital values.
  • FIG. 1 shows the schematic sequence of an embodiment of the method according to the invention.
  • the nucleic acid probe (2) is covalently bound to the surface.
  • B After addition of the nucleic acid analyte (1), a hybridization complex is formed, usually over a period of several hours.
  • C By using a suitable enzyme, e.g. a polymerase, the single-stranded area of the complex is filled in the presence of the four nucleotides A, T, G and C (in the case of DNA) within a much shorter period of only a few minutes (D), which generates a signal much more quickly , which is read out by a sensor (4) as an integrated component of the solid phase.
  • a suitable enzyme e.g. a polymerase
  • FIG. 2 shows the principle of a preferred embodiment using a polymerase reaction, by means of which pyrophosphate anions (5) are released, which lead to a local change in the pH. This change can be detected by the integrated sensor (4).
  • FIG. 3 shows a field effect transistor produced as part of a CMOS process.
  • the field effect transistor consists, for example, of a pnp layer (6) in an n-well with a thin insulator (10) (eg 10 nm thermal oxide), which is located on the surface and to which the nucleic acid probe is applied directly or indirectly, which is then applied the hybridization comes into being.
  • the scratch protection (7) in the area of the field effect transistor is either sharp-edged or etched down in stages, so that the process of hybridization and the increase in mass (8) in a deepened area takes place.
  • the surfaces of the device can actively or passively influence the hybridization of the nucleic acid molecules by applying, for example, noble metal or hydrophobic / hydrophilic materials (9).
  • a measuring solution (11) such as 1 M NaHC0 3
  • the change in the dielectric properties on the gate is measured, which takes place by filling the single-stranded area of the hybridization complex.
  • the resulting shift in the flat band potential can be read out with the field effect transistor using a reference electrode (12) located in the solution.
  • the current between drain and source or the voltage between reference electrode and source can be recorded as a signal (see e.g. Palan et al., Fundamental Noise Limits of ISFET-Based Microsystems, poster article 4P26, • EUROSENSORS XIII (ISBN 90-76699 -02-X), pp. 169 ff., 1999).
  • FIG. 4 shows the voltage change sensed in the course of a parallel amplification on the basis of a so-called “nested on chip” PCR (NOC, see above) with an FET.
  • B the voltage curve of a single cycle (average number of cycles) in addition to the primer the template and from left to right the elongation of a primer. It can be seen from the illustration that the voltage increases as a function of the primer extension.
  • CMOS sensor is built on 5 or 6 '' wafers with a 1.2 ⁇ m
  • CMOS process manufactured. Each field effect transistor is located in an n-well on a p-type substrate. After the field oxidation, the drain and source regions are implanted. The thermal gate oxide with a thickness of approx. 10 nm is applied. The gate is protected by polysilicon during the following process steps. Then a silicon
  • the gate insulator is exposed to etching steps.
  • CMOS sensor Coating the CMOS sensor
  • the CMOS sensor prepared as above is coated with the silane by immersion in a solution of 1% GOPS (glycidoxypropyltriethoxysilane) and 0.1% triethylamine in toluene for a period of about 2 hours.
  • the chip is then removed from the solution and, after a short drop at 120 ° C., is fixed in the drying cabinet for a period of about 2 hours.
  • the chip coated in this way can be stored under exclusion of moisture until bioconjugation.
  • Bioconjugation with oligonucleotide probes Using conventional techniques, the chip coated as above is printed contact-free with 5'-amino-modified oligonucleotide probes.
  • the oligonucleotide probes are provided in a concentration of 5 ⁇ M dissolved in PBS buffer. After printing, the coupling reaction is continued at 50 ° C in a humid chamber. The chips are then rinsed with distilled water and then washed with methanol to dry. Any remaining solvent residues are finally removed by evaporation under the fume cupboard.
  • the reaction mix contains the following standard reagents (primer: 0.5 ⁇ M, dATP, dCTP, dGTP: 0, lmM, dTTP 0.08 mM, PCR buffer, MgCl 2 : 4mM, HotStarTaq (Perkin Elmer) 2 units (50 ⁇ l)
  • primer 0.5 ⁇ M, dATP, dCTP, dGTP: 0, lmM, dTTP 0.08 mM
  • PCR buffer MgCl 2 : 4mM
  • HotStarTaq Perkin Elmer 2 units
  • the above reaction mixture is in a buffer 5 x SSPE, 0.1% SDS (12 ⁇ l) under a cover slip for a period of 2 hours at 50 ° C. in the moist chamber on the chip hybridized. Then it is rinsed with 2 x SSPE 0.1% SDS and the chip is cleaned by washing in water.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nukleinsäureanalyten. Insbesondere betrifft die Erfindung den Nachweis des Vorhandenseins eines solchen Analyten ohne die herkömmliche Nutzung von optisch nachweisbaren Markersubstanzen.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäureanalyten
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung von Nukleinsäure- analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung den Nachweis des Vorhandenseins eines solchen Analyten ohne die herkömmliche Nutzung von optisch nachweisbaren Markersubstanzen.
Zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von bestimmten Nukleinsäureanalyten wie z.B. DNA ist die Verwendung von im wesentlichen planaren Systemen bekannt, welche in der Fachwelt als Biosensoren bzw. Biochips bezeichnet werden. Diese Biochips bilden einen Träger, auf dessen Oberfläche i.d.R. eine Vielzahl von zumeist rasterartig angeordneten Detektionsbereichen ausgebildet ist, wobei sich die einzelnen Bereiche bzw. Bereichsgruppen jeweils durch ihre Spezifität gegenüber einem bestimmten nachzuweisenden Analyten voneinander unterscheiden. Im Falle der Bestimmung von DNA- Analyten befinden sich innerhalb der einzelnen Bereiche der Trägeroberfläche - direkt oder indirekt immobilisiert spezifische Nukleinsäuresonden wie z.B. Oligonukleotide oder cDNA in zumeist einzelsträngiger Form, deren jeweilige Spezifität gegenüber der zu bestimmenden Nukleinsäure im wesentlichen durch die Sequenzabfolge (Sondendesign) vorgegeben ist. Die auf diese Weise funktionalisierte Chipoberfläche wird im Rahmen eines entsprechenden Nachweisverfahrens mit den zu bestimmenden DNA-Analyten unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche im Falle des Vorhandenseins der zuvor nachweisbar markierten Zielnuklein- s ure (n) deren Hybridisierung mit den immobilisierten Sondenmolekülen gewährleisten. Die qualtitative und ggf. quantitative Detektion eines bzw. mehrer spezifisch gebildeter Hybridisierungskomplexe erfolgt anschließend zumeist durch optophysikalische Lumineszenzmessung und Zuordnung der erhaltenen Daten zu den jeweiligen Detektionsbereichen, wodurch die Bestimmung z.B. der Anwesenheit oder der Sequenz des bzw. der Nukleinsäureanalyten und ggf. deren Quantifizierung ermöglicht wird.
Neben diesen lumineszenzgestützten Verfahren wurden in den letzten Jahren Anstrengungen unternommen, um DNA-Analytik ohne das Erfordernis der Verwendung von Lumineszenzmarkern und ohne die dafür erforderlichen Detektions- und Abbildungsmittel durchzuführen .
So wurde beispielsweise versucht, zwischen den möglichen Zustandsformen eines Einzelstranges und eines Doppelstranges mit Hilfe von Feldeffektransistoren (E. Souteyrand et al . , Direct detection of the hybridisation of synthetic homo- oligomer DNA sequences by field effect, J. Phys . Chem. B., 1001, 2980, 1997) oder mit Impedanzstrukturen zu unterscheiden (s. z.B. P. Van Gerwen et al . , Nanoscaled interdigital electrode arrays for biochemical sensors, Sensors and Actuators, B 49, 73-80, 1998) .
Ein weiterer Ansatz des Standes der Technik betrifft die Nutzbarmachung der enzymatischen Aktivität der extrazellulären Endonuklease von Serra tia marcescens, wobei der enzymvermittelte Abbau von DNA zu einer Veränderung des pH- Wertes führt, welche dann mit einem pH-Sensor gemessen werden kann (S. Reher, DNA-, RNA-Analytik mit voltametrischen, potentiometrischen und optischen Methoden unter Einsatz der extrazellulären Endonuklease Serra tia marcescens, ISBN 3- 89825-030-X, 1999) . Des weiteren existieren Veröffentlichungen, in denen die Durchführung der DNA-Analytik unter Verwendung bestimmter Markersubstanzen beschrieben wird, wobei die Detektion aber nicht über optische Methoden erfolgt. Der eine Ansatz betrifft die Markierung hybridisierter DNA mittels eines elektronischen Labels und dessen Haftung an eine Edelmetallelektrode, wobei dieses Bindungsereignis mit einer „Elektrode ausgelesen wird. (www.microsensor.com/TechnologySystem.html, Clinical micro sensors ,2000). Die andere Arbeit beschreibt die Kopplung eines kleinen paramagnetischen Körpers an ein DNA-Molekül, wobei das Auslesen über die Veränderung des Magnetfeldes erfolgt (D.R. Baselt et al . , A biosensor based on magnetoresistance technology, Biosensors & Bioelectronics 1998, 13(7-8) -. 131-9 , 1998) .
Obwohl die vorgenannten Arbeiten Alternativen zur lumineszenzgestützten Nukleinsäureanalytik aufzeigen, leiden sie aufgrund der häufig über mehrere Stunden andauernden Hybridisierungsreaktion in Verbindung mit den zur Detektion eingesetzten Sensoren an einer Messabweichung, die in der Fachwelt als Drift bezeichnet wird. Diese Drift führt zu einem zeitlich veränderten Signal, welches häufig nicht vom eigentlichen Signal unterschieden oder ausreichend abgegrenzt werden kann, da sich letzteres in der selben Frequenzgrößenordnung wie die Drift befindet. Darüber hinaus ist es generell einfacher ein Signal auszulesen, das innerhalb einer möglichst kurzen Zeitdauer seine Signalhöhe erreicht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, bei dem die mit der Drift-Problematik verbundenen Nachteile überwunden werden. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß Hauptanspruch gelöst.
Nach einer Aus führungs form betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsäureanalyten durch Hybridisierung des Analyten an eine geeignete, auf einer festen Phase immobilisierte Nukleinsäuresonde, bei dem man
(a) den Nukleinsäureanalyten zur Ausbildung eines Hybridi- sierungskomplexes unter geeigneten Hybridisierungs- bedingungen mit der Nukleinsäuresonde inkubiert, und
(b) den Analyten bestimmt auf der Basis physikalischer Messdaten, die spezifisch mit einer enzymbedingten Massenzu- oder abnähme des Hybridisierungskomplexes im Zusammenhang stehen, wobei die Messung der Daten durch mindestens einen Sensor erfolgt, welcher integraler Bestandteil der festen Phase ist.
Durch diesen indirekten Lösungsansatz gelingt es erfindungsgemäß, die Detektion unter weitgehender Vermeidung der Drift-Problematik in ein anderes Zeitfenster und damit in eine andere Frequenz zu überführen, welches vorzugsweise nur wenige Sekunden oder Minuten umfasst (s. Fig. 1) .
Bevorzugte Aus führungsformen dieses Verfahrens sind in den ünteransprüchen dargestellt.
Der vorliegend verwendete Begriff „Bestimmung" bezieht sich auf jedwede Analysierung einer Nukleinsäure und umfasst insbesondere den Nachweis des Vorhandenseins eines Nukleinsäureanalyten in einer zu untersuchenden Probe, ümfasst sind ferner Anwendungs formen wie die Ermittlung einer Nukleinsäuresequenz und die Erfassung von Mutationen wie insbesondere SNP's. Das vorliegende Verfahren gewährleistet somit eine sehr große Bandbreite an Einsatzmöglichkeiten, da es auf alle derzeit und zukünftig verfügbaren Bestimmungsbzw. Nachweistechniken anwendbar ist, die auf der Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes beruhen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsformen wird das die Massenzu- oder abnähme des Hybridisierungskomplexes bewirkende Enzym aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Polymerasen, Ligasen, Ribozymen, quasi-katalytischen Nukleinsäuren, DNasen/RNAsen (Exo- bzw. Endonukleasen einschließlich Restriktionsendonukleasen) , - und RNase H, wobei eine Polymerase, insbesondere eine Polymerase mit einer 5λ- und/oder 3 x-Exonukleaseaktivität, besonders bevorzugt ist.
Neben den DNA-abhängigen DNA-Polymerasen kann eine Massenzunahme in Abhängigkeit der gegebenen Beschaffenheit der Nukleinsäure (RNA oder DNA) erfindungsgemäß auch durch Verwendung von RNA-abhängigen DNA-Polymerasen (reverse Transkriptase) bzw. RNA-abhängigen RNA-Polymerasen (Replikasen) erfolgen. Eine Massenzunahme kann ferner durch den Einsatz von entsprechenden polymeraseaktiven Ribozymen bzw. quasi-katalytischen RNAs bewirkt werden. Für alle Polymerasen (einschließlich Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's) gilt erfindungsgemäß, dass sowohl thermostabile wie auch thermolabile Enzyme eingesetzt werden können.
Eine enzymatisch bewirkte Massenzunahme kann auch mittels Ligasen erfolgen. In diesem Zusammenhang wird auch auf die erfindungsgemäß geeignete Verwendung von ligaseaktiven Ribozymen bzw. quasi-katalytischen RNA s hingewiesen. Für alle Ligasen (einschließlich Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's) gilt, dass erfindungsgemäß sowohl thermostabile wie auch thermolabile Enzyme eingesetzt werden können. Im Gegensatz zum Massezuwachs kann auch eine Masseabnahme detektiert werden. Eine Masseabnahme durch Spaltung der gebundenen Nukleinsäuren kann durch Nukleasen (RNasen, DNasen) erfolgen. Sowohl 5 - und/oder 3Λ- Exo- als auch Endonukleasen sowie Rnase H können Verwendung finden. Einzel- wie auch doppelstrangabhängige Enzyme bzw. Enzyme mit beiden Aktivitäten können eingesetzt werden. Für die Nukleasen gilt zudem, dass sequenzspezifische wie auch nicht sequenzspezifische Enzyme eingesetzt werden können. Auch Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's mit Nukleaseaktivität sind geeignet. Ribozyme bzw. quasi-katalytische RNA's agieren i.d.R. sequenzspezifisch, wobei die Spezifität mittels der jeweiligen Hybridisierungssequenz entsprechend den Bedürfnissen eingestellt werden kann.
Die vorliegende Erfindung reflektiert demgemäß die bei den meisten Festphasen-gebundenen Nukleinsäureanalysen anzutreffende Situation des Vorliegens einer an einer festen Phase immobilisierten einzelsträngigen Nukleinsäuresonde (s. Fig. 1A) . Unter geeigneten Bedingungen bildet sich an dieser Sonde im Falle des Vorhandenseins eines zu der Sondensequenz im wesentlichen komplementären Nukleinsäureanalyten ein zumindest teilweise mindestens doppelsträngiger Hybridisierungskomplex aus (s . Fig. 1B) .
Erfindungsgemäß erfolgt im Anschluss an die Ausbildung des Komplexes die Einleitung eines enzy atischen Schrittes (s. Fig. IC), wobei die Enzymleistung zu einer messbaren Veränderung der Masse dieses Komplexes führt.
Beispielsweise kann im Falle des Vorliegens eines aus einer kürzeren DNA-Sonde und eines im Vergleich dazu längeren Nukleinsäureanalyten bestehenden Hybridisierungskomplexes eine Polymerase eingesetzt werden, welche unter geeigneten Bedingungen und in Anwesenheit der vier Nukleotidtriphosphate (A; T; G; C) in der Lage ist, den durch die längere Analyten- nukleinsäure bedingten einzelsträngigen Bereich - zumindest teilweise - aufzufüllen (s. Figuren IC und 1D) . Bei einer unterstellten durchschnittlichen Bindungsgeschwindigkeit, die in einer Größenordnung von tausend Basen pro Minute liegt, erfolgt diese kontinuierliche Polymerisation innerhalb von wenigen Minuten. Dieses Beispiel geht von einer unterschiedlichen Länge der beteiligten Hybridisierungspartner aus und ist auch auf den umgekehrten Fall anwendbar, bei dem der Analyt im Vergleich zur Sonde eine kürzere Kettenlänge aufweist. In diesem Falle kann es vorteihaft sein, das Sondesign so zu gestalten, dass die Sonde eine Länge von mindestens 100 Nukleotiden aufweist und der zu erwartende und mittels Polymeraseaktivität aufzufüllende einzelsträngige Bereich des Hybridisierungskomplexes möglichst dicht an die Sensoroberfläche heranreicht. Dieser Vorteil lässt sich auch erreichen, wenn die Sonde mit ihrem 3λ-Ende immobilisiert wird und die Auffüllung des einzelsträngigen Bereichs in Richtung fester Phase erfolgt. Diese vorteilhaften Ausführungsformen sind nicht nur auf Polymerasen sondern allgemein auf alle erfindungsgemäß geeigneten Enzyme übertragbar und können vom Fachmann in Abhängigkeit des gewünschten Anwendungsbereiches leicht vollzogen werden.
Sofern in der zu analysierenden Probe kein zur Sondensequenz komplementärer Analyt vorhanden ist, so kommt es an dieser Stelle aufgrund unterschiedlicher Bindungsenergien zu keiner Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes, weshalb die anschließende Enzymreaktion unterbleibt und keine enzymbedingten Messdaten erfasst werden können. Da eine Hybridisierung ohne das Anlegen eines elektrischen Feldes gewöhnlich in der Größenordnung von mehreren Stunden abläuft, wird die Dauer der Detektion erfindungsgemäß erheblich herabgesetzt, wodurch ein sehr viel kürzeres Zeitfenster entsteht, welches für die Auslesung von Sensoren geeigneter ist.
Durch die oben beispielhaft erwähnte Polymeraseaktivität entstehen Pyrophosphatanionen, die bei der Polymerisation der Nukleotidtriphosphate im einzelsträngigen Bereich des Hybridisierungskomplexes freigesetzt werden und zu einer lokalen Ansäuerung und damit zu einer Absenkung des pH-Wertes führen. Durch lokale Anordnung eines pH-Sensors bzw. eines pH- Detektors (z.B. pH-ISFET) kann diese Veränderung des pH- Wertes, gewünschtenfalls ortsspezifisch, detektiert werden (s. Fig. 2) .
Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, dass die bei einer Polymerisation bzw. Ligation freigesetzten Pyrophosphationen auch indirekt, d.h. über eine sekundäre Enzymkaskade detektiert werden können. An der ersten der sekundären Reaktionen sind beispielsweise ATP-Sulfurylase und Adenosin- 5 ' -phosphosulfat (APS) beteiligt. In diesem Fall wird das beim Einbau eines Nukleotids bei der Polymerisation bzw. bei einer Ligation freigesetzte Pyrophosphat PPi und das APS durch die ATP-Sulfurylase zu ATP umgesetzt. Das hierbei erzeugte ATP kann dann weitere enzymatische Reaktionen katalysieren, die der eigentlichen Detektion zugeführt werden. Zum Beispiel kann das gebildete ATP die Umsetzung von Luciferin durch die Luciferase katalysieren, wodurch eine Lichtemission entsteht, welche mit den erfindungsgemäßen optischen Sensoren abgetastet ' werden kann. Ein modifiziertes Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Beladung der einzusetzenden Nukleotidtriphosphate mit magnetischen Kügelchen (Baselt, a.a.O., 1998) oder mit Metallpartikel (Clinical micro sensors, a.a.O., 2000). Diese Beladung hat zur Folge, dass die Auslesung noch durch zusätzliche Eigenschaften des an das Nukleotidtriphosphat gebundenen Festkörpers verstärkt wird. Des weiteren können sich Farbstoffe am Nukleotidtriphosphat befinden, die dann über eine integrierte Photodiode ausgelesen werden können.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird daher der mindestens eine Sensor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektrodenstrukturen, Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren, optischen Sensoren und pH-Sensoren, um dem breiten Anwendungsspektrum der vorliegenden Erfindung zu entsprechen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft die kombinatorische Verwendung unterschiedlicher Sensoren der zuvor genannten Art. Beispielsweise könnte die Signalintensität bzw. -schärfe und damit die Verlässlichkeit eines gewünschten Detektionsereignisses optimiert werden, wenn eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Vorrichtung nicht nur einen sondenspezifischen Sensor, wie z.B. einen Feldeffekttransistor, sondern zusätzlich noch eine andere Art sondenspezifischen Sensor, wie z.B. einen pH-ISFET, aufweist. Die aus dieser multiparametrischen Messung erhaltenen Daten ermöglichen gewünschtenfalls eine noch exaktere Auswertung der enzymbedingten Signale.
Des weiteren kann der Sensor mit einem Heizelement ausgestattet sein. Ein derartiges Element könnte beispielsweise aus Leiterbahnen bestehen, die während des CMOS-Prozesse aufgebracht und anschließend von den folgenden Schichten abgedeckt worden sind. Hierdurch könnten Temparaturzyklen gefahren werden, was z.B. für eine PCR- gestützte Anwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens gewünscht sein könnte.
Da eine schubweise Zugabe von Analyten bei den Sensoren sogenannte Zugabepeaks hervorrufen kann ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße Verfahren kontinuierlich (im Durchfluss) betrieben wird.
Nach einem weiteren Aspekt wird eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt.
Diese Vorrichtung umfasst mindestens eine feste Phase, mindestens eine darauf direkt oder indirekt immobilisierte Nukleinsäuresonde, sowie mindestens einen Sensor zur Erfassung der physikalischen Messdaten, wobei der Sensor integraler Bestandteil der festen Phase ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der zuvor definierten Gruppe bestehend aus Elektrodenstrukturen, Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren, optischen Sensoren und pH-Sensoren.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäure- sonden unter Ausbildung eines Mikroarrays rasterartig angeordnet, wobei jeder immobilisierten Nukleinsäuresonde bzw. jedem spezifischen Detektionsbereich besonders bevorzugt mindestens ein Sensor zugeordnet ist.
Die aus der EP-A-0 881 490 bekannte Messeinrichtung zur Messung bestimmter physiologischer wie auch morphologischer Parameter mindestens einer zu untersuchenden lebenden Zelle kann für den erfindungsgemäßen Einsatz nach entsprechender Modifikation verwendet werden. Die beschriebene Einrichtung weist bereits eine Vielzahl von Sensoren auf, die integraler Bestandteil einer Trägereinrichtung sind, auf welcher das zu untersuchende Material immobilisiert ist.
Die Trägereinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht im wesentlichen aus einem Halbleitermaterial mit einer integrierten, vorzugsweise mehrere Detektoren umfassenden Detektorschicht, wobei als Detektoren mindestens einer der zuvor beschriebenen Sensoren, gegebenenfalls in Kombination
(s.o.), eingearbeitet ist. Ferner kann die Trägereinheit
Heizelemente aufweisen, um während einer Anwendung unterschiedliche Temperaturen bereitstellen zu können (s.o.).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Signalverarbeitung zumindest teilweise innerhalb des bzw. der eingesetzten Sensorchips.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die abgetasteten Messdaten beispielsweise direkt auf dem Chip mit analogen Schaltungen ausgewertet werden, indem man z.B. jede Millisekunde einen Wert aufnimmt, der dann z.B. auch mit einem Referenzwert einer zuvor durchgeführten Messung, welcher ebenfalls auf dem Chip gespeichert wurde, verglichen wird. Darüber hinaus wird auf diese Weise ermöglicht, dass man unspezifische Störsignale wie z.B. eingestreute externe Signale herausrechnen kann.
Sofern die Sensoroberfläche das Design einer Microarray- Anordnung aufweist, bei der eine Vielzahl von Detektions- feldern auszuwerten sind, kann die Detektion der Messfeldbzw, -punktsignalwerte sequentiell erfolgen, indem z.B. ganze Zeilen oder Spalten der Sensoroberfläche bzw. Teile derselben nacheinander detektiert werden (Multiplexanwendung) . Beispielsweise können die elektronischen Ausgangssignale der Detektoren mittels geeigneter Schaltungseinrichtungen nach einer Analog-Digitalumsetzung einer externen Auswerteeinrichtung zugeführt werden (s.o.).
Um mit dieser Schicht aus Sensoren das erfindungsgemäße Verfahren durchführen zu können, kann sie nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit einer kopplungsfähigen Substanz beschichtet werden. Typischerweise werden hierzu die Sensor-Chip-Oberflächen, wie z.B. solche aus Siliziumdioxid, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen (sog. "Linker"), die beispielsweise eine Halogensilan- (z.B. Chlorsilan-) oder Al oxysilangruppe zur Kopplung an die Trägeroberfläche aufweisen, getaucht, sodass sich eine sich selbst organisierende Monoschicht (SAM) bildet, durch welche die kovalente Bindung zwischen Sensoroberfläche und Rezeptor erzeugt wird. Beispielsweise kann mit Glycidyltriethoxysilan beschichtet werden, was z.B durch Eintauchen in eine Lösung von 1% Silan in Toluol, langsames Herausziehen und Immobilisieren durch „Backen" bei 120° C erfolgen kann. Eine auf diese Weise geschaffene Beschichtung weist im allgemeinen eine Dicke von wenigen Ängström aus. Die Kopplung zwischen Linker und Rezeptormoleküle (n) erfolgt über eine geeignete weitere funktioneile Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder Epoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Molekülen, insbesondere auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press 1996. Hinsichtlich der Ausbildung dünner Polymerschichten als Kopplungsmatrix zur Schaffung einer funktionalisierten Oberfläche wird auf die WO 00/43539 verwiesen. Die als Sondenmoleküle erfindungsgemäß vorgesehenen Nukleinsäuren können anschließend mittels gängiger Druckgeräte aufgebracht und immobilisiert werden.
Auf derart hergestellten Oberflächen können nun unter Anwendung etablierter Verfahren Hybridisierungen mit z.B. DNA durchgeführt werden. Diese kann z.B. mittels PCR erzeugt werden. Beim Hybridsieren bindet nun der DNA-Analyt an den auf dem Sensor vorhandenen Gegenstrang der Sonde (sofern vorhanden) . Positive Hybridisierungsereignisse können nun unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden.
Die Messung eines ortsspezifischen Massezuwachses kann z.B. durch physikalische Methoden erfolgen. Beispielsweise kann die ortsspezifische Änderung des Brechungsindexes, die ortsspezifische Änderung des elektrischen Widerstandes bzw. der elektrischen Leitfähigkeit, die ortsspezifische . Änderung der optischen Dichte oder auch ortsspezifische dichroische Effekte, etc. gemessen werden.
Grundsätzlich ist das allgemeine erfindungsgemäße Verfahren für ein breites Spektrum an Anwendungsgebieten geeignet, wobei zwischen reinem diagnostischen Nachweis bestimmter Analyten in einer zu analysierenden Probe einerseits und komplexer abgeleiteten Modifikationen des Verfahrens zur Ermittlung von Sequenzdaten oder Informationen über funktionelle . Zusammenhänge im Rahmen entsprechender Genomik-Fragestellungen unterschieden werden kann. Diese Unterscheidung dient jedoch nur der Veranschaulichung und soll die grundsätzlich offene Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens in keiner Weise beschränken. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesonders geeignet zur Bestimmung von DNA-Sequenzen, die mittels paralleler Amplifikation durch verschachtelte (nested) PCR, vorzugsweise in einem kombinierten Flüssigphasen/Festphasen- DNA-Microarraysystem erzeugt wurden, da auf diese Weise sowohl auf die Verwendung modifizierter Nukleotide wie z.B. Biotin, Digoxiginin, als auch auf herkömmlich eingesetzte Fluoreszenzfarstoffe und andere Markersubstanzen verzichtet werden kann. Die verschachtelte PCR im kombinierten Flüssig- phasen/Festphasen-DNA-Microarraysystem (s. Fig. 4) besitzt die gleiche Empfindlichkeit .wie eine konventionelle, d.h. in flüssiger Phase durchgeführte, PCR, gewährleistet aber gleichzeitig eine höhere Spezifität als herkömmliche Hybri- disierungsassays und Primer-Extensionassays . Dieser Vorteil resultiert daraus, dass die dem System Pri er/Proben- DNA/Polymerase eigene Spezifität in bezug auf die Amplifikation zusätzlich noch durch die spezifische Wechselwirkung zwischen dem an den festen Träger immobilisierten inneren PCR-Primer (der somit auch die Funktion einer Sonde ausübt) und dem Amplikon deutlich erhöht wird. Insgesamt resultiert so eine Spezifität, die z.B. derjenigen eines 5'- Exonuklease-Assays (z.B. unter Verwendung von TaqMan™- Poly erase) überlegen ist.
Die Signale des Sensors werden durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen. Eine Aufnähmeeinheit besitzt einen sehr schnellen Konverter zur Umwandlung analoger Detektorsignale in digitale Werte, die gespeichert werden. Eine Auswertung der digitalen Werte wird vorzugsweise in Echtzeit vorgenommen, kann jedoch auch zeitlich verzögert erfolgen. Zur Auswertung der digitalen Werte kann ein gewöhnlicher Mikroprozessor verwendet werden. Die Erfindung und vorteilhafte Ausgestaltungen werden nun anhand der Figuren der Zeichnung näher erläutert:
Fig. 1 zeigt den schematischen Ablauf einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. (A) Die Nukleinsäuresonde (2) wird kovalent an die Oberfläche gebunden. (B) Nach Zugabe des Nukleinsäureanalyten (1) kommt es, gewöhnlich in einem Zeitraum von mehreren Stunden, zur Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes. (C) Durch den Einsatz eines geeigneten Enzyms, wie z.B. einer Polymerase, wird der einzelsträngige Bereich des Komplexes in Anwesenheit der vier Nukleotide A, T, G und C (im Falle von DNA) innerhalb eines sehr viel kürzeren Zeitraums von nur wenigen Minuten aufgefüllt (D), wodurch sehr viel schneller ein Signal generiert wird, welches von einem Sensor (4) als integriertem Bestandteil der festen Phase ausgelesen wird.
Die Figur 2 zeigt das Prinzip einer bevorzugten Ausführungsform unter Anwendung einer Polymerasereaktion, durch welche Pyrophosphatanionen (5) freigesetzt werden, die zu einer lokalen Veränderung des pH-Wertes führen. Diese Veränderung kann vom integrierten Sensor (4) erfasst werden.
Die Figur 3 zeigt einen im Rahmen eines CMOS-Prozesses hergestellten Feldeffekttransistor. Der Feldeffekttransistor besteht z.B. aus einer p-n-p Schicht (6) in einer n-Wanne mit einem dünnen Isolator (10) (z.B. 10 nm thermisches Oxid), der sich an der Oberfläche befindet und auf den direkt oder indirekt die Nukleinsäuresonde aufgebracht wird, die dann die Hybrisisierung eingeht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kratzschutz (7) im Bereich des Feldeffekttransistors entweder scharfkantig oder stufenweise heruntergeätzt, sodass der Vorgang der Hybrisisierung und des Massenzuwachses (8) in einem vertieften Bereich stattfindet. Die Oberflächen der Vorrichtung können durch Aufbringung von z.B. Edelmetall oder hydro-phoben/hydrophilen Materialien (9) die Hybrdisierung der Nukleinsäuremoleküle aktiv oder passiv beeinflussen. In einer Messlösung (11), wie z.B. 1 M NaHC03, erfolgt die Messung der Veränderung der dielektrischen Eigenschaften auf dem Gate, die durch das Auffüllen des einzelsträngigen Bereichs des Hybridisierungskomplexes stattfinden. Die hierdurch bewirkte Verschiebung des Flachbandpotentials kann mit dem Feldeffektransistor unter Verwendung einer sich in der Lösung befindlichen Referenzelektrode (12) ausgelesen werden. Als Signal können z.B. der Strom zwischen Drain und Source oder die Spannung zwischen Referenzelektrode und Source aufgenommen werden (s. z.B. B. Palan et al., Fundamental Noise Limits of ISFET-Based Microsystems, Poster-Beitrag 4P26, • EUROSENSORS XIII (ISBN 90-76699-02-X) , S. 169 ff., 1999).
Die Figur 4 zeigt die im Verlauf einer parallelen Amplifikation auf der Basis einer sogenannten „Nested On Chip" PCR (NOC, s.o.) mit einem FET abgetastete Spannungsveränderung. In A ist die Spannungsänderung an einer Sondenposition über den Verlauf einer ganzen NOC dargestellt. Die X-Achse gibt die Anzahl der Zyklen an, während auf der Y- Achse die gemessenen Spannung angegeben ist. Unterhalb der X- Achse sind die an die Sondenposition gekoppelten Primermoleküle (=Sondenmoleküle) symbolisiert: In den ersten Zyklen sind nur wenige Primer elongiert, gefolgt von einer starken exponentiellen Zunahme in den mittleren Zyklen und einer zunehmenden Sättigung (weitgehend alle Primer elongiert) in den späten Zyklen. Die Kurve zeigt, wie mit Zunahme der Masse an der Sondenposition die gemessene Spannung ansteigt. In B ist der Spannungsverlauf eines einzigen Zyklus (mittlerer Zyklenzahl) dargestellt. Zusätzlich zum Primer sind hier auch das Template und von links nach rechts die Elongation eines Primers dargestellt. Aus der Darstellung ist ersichtlich, dass die Spannung in Abhängigkeit von der Primerverlängerung ansteigt.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert.
Herstellung eines erfindungsgemäßen Sensorchips Der CMOS-Sensor wird auf 5 oder 6'' Wafern mit einem 1,2 μm
CMOS-Prozess gefertigt. Jeder Feldeffektransistor befindet sich in einer n-Wanne auf p-Substrat. Nach der Feldoxidation folgt die Implantation der Drain- und Source Regionen. Das thermische Gateoxid mit einer Dicke von ca. 10 nm wird aufgebracht. Das Gate wird durch Polysilizium während der folgenden Prozessschritte geschützt. Dann wird ein Silizium-
Dioxid-Layer- mit Hilfe eines CVD-Prozesses aufgebracht und strukturiert. Aluminium wird aufgesputtert und ebenfalls strukturiert. Eine .Passivierung wird durch einen Si3N4-PECVD- Nitrid und einen CVD-Si02-Layer erreicht. Bei den nächsten
Ätzschritten wird der Gateisolator freigelegt.
Beschichtung des CMOS-Sensors Der wie oben hergestellte CMOS-Sensor wird durch Tauchen in eine Lösung von 1% GOPS (Glycidoxypropyltriethoxysilan) und 0,1% Triethylamin in Toluol für eine Zeitdauer von ca. 2 Stunden mit dem Silan beschichtet. Anschließend wird der Chip aus der Lösung entnommen und nach kurzem Abtropfen bei 120° C für eine Zeitdauer von etwa 2 Stunden im Trockenschrank fixiert.
Gewünschtenfalls kann der so beschichtete Chip bis zur Biokonjugation unter Feuchtigkeitsausschluß gelagert werden. Biokonjugation mit Oligonukleotidsonden Unter Anwendung herkömmlicher Techniken wird der wie oben beschichtete Chip mit 5'- aminomodifizierten Oligonukleotidsonden kontaktlos bedruckt. Die Oligonukleotidsonden werden hierfür in einer Konzentration von 5 μM in PBS-Puffer gelöst bereitgestellt. Nach dem Bedrucken wird die Kopplungsreaktion bei 50 °C in einer feuchten Kammer fortgesetzt. Anschließend werden die Chips mit destilliertem Wasser gespült und sodann zum Trocknen mit Methanol gewaschen. Etwaige verbleibende Lösungsmittelreste werden abschließend durch Verdunsten unter dem Abzug entfernt.
Probengewinnung Aus humanen DNA-Isolaten werden mittels PCR Fragmente des Haemochromatosegens amplifiziert. Bei der Amplifikation werden geeignete Primersequenzen verwendet, wie sie z.B. im US-Patent 5,712,098 beschrieben sind.
Im Reaktionsmix befinden sich folgende Standardreagenzien (Primer: 0,5 μM, dATP, dCTP, dGTP: 0,lmM, dTTP 0,08 mM, PCR- Puffer, MgCl2: 4mM, HotStarTaq (Perkin Eimer) 2 Einheiten (50 μl) . Bei der PCR-Reaktion (35 Zyklen, 5 min 95°C, 30 sek 95°C, 30 sek 60°C, 30 sek 72°C, 7 min 72°C) werden die vorhandenen Nukleotide in die neu zu synthetisierende DNA eingebaut. Anschließend wird durch Zugabe von T7 Genβ-Exonuklease (100 Einheiten/ 50 μl PCR-Ansatz) und Erhitzten des Ansatzes ( 30 min 37°, 10 min 85°) Einzelstrang-DNA generiert.
Hybridisierung Der obige Reaktionsansatz wird in einem Puffer 5 x SSPE, 0,1% SDS (12 μl) unter einem Deckgläschen für eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 50° C in der feuchten Kammer auf dem Chip hybridisiert. Anschließend wird mit 2 x SSPE 0,1% SDS gespült und der Chip durch Waschen in Wasser gereinigt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsäureanalyten durch Hybridisierung des Analyten an eine geeignete, auf einer festen Phase immobilisierte Nukleinsäuresonde, bei dem man
(a) den Nukleinsäureanalyten zur Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes unter geeigneten Hybridisierungs- bedingungen mit der Nukleinsäuresonde inkubiert, und (b) den Analyten bestimmt auf der Basis chemisch/physikalischer Messdaten, die spezifisch mit einer enzymbedingten Massenzu- oder abnähme des Hybridisierungskomplexes im Zusammenhang stehen,
wobei die Messung der Daten durch mindestens einen Sensor erfolgt, welcher integraler Bestandteil der festen Phase ist.
2. Verfahren nach .Anspruch 1, bei dem die Schritte (a) und (b) kontinuierlich (im Durchfluss) erfolgen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das die Massenzu- oder abnähme des Hybridisierungskomplexes bewirkende Enzym aus der Gruppe bestehend aus Polymerasen, Ligasen, Ribozymen, quasi-katalytischen Nukleinsäuren, DNasen/RNAsen, und RNase H, ausgewählt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem als Enzym eine Polymerase ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Polymerase eine 5λ- und/oder 3 -Exonukleaseaktivität aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der mindestens eine Sensor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Elektrodenstrukturen, Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren, optischen Sensoren, pH-Sensoren, und Kombinationen derselben.
7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend 'mindestens eine feste Phase, mindestens eine darauf direkt oder indirekt immobilisierte Nukleinsäuresonde, sowie mindestens einen Sensor zur Erfassung der chemisch/physikalischen Messdaten, wobei der Sensor integraler Bestandteil der festen Phase ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der der mindestens eine Sensor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Elektrodenstrukturen, Feldeffekttransistoren, Magnetsensoren, optischen Sensoren, pH-Sensoren, und Kombinationen derselben.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, bei der eine Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäuresonden unter Ausbildung eines Mikroarrays rasterartig angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei der jeder immobilisierten Nukleinsäuresonde mindestens ein
Sensor zugeordnet ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, welche zusätzlich mindestens ein Heizelement umfasst, das dem mindestens einen Sensor zugeordnet ist.
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