WO2003095673A2 - Verfahren für die biochemische analytik von dna und zugehörige anordnung - Google Patents

Verfahren für die biochemische analytik von dna und zugehörige anordnung Download PDF

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WO2003095673A2
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catcher
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Manfred Stanzel
Mathias Sprinzl
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the invention relates to a method for the biochemical analysis of DNA ⁇ mix.
  • the invention relates to a corresponding arrangement for carrying out the procedural ⁇ proceedings.
  • the field of application of the invention is in particular medicine and environmental analysis as well as forensics.
  • An enzyme as an immobilized biocatalytically active label, an immobilized DNA and an immobilized substance (inhibitor), which can reversibly inhibit the activity of the enzyme, are used as tools for the analysis of nucleic acids.
  • DNA deoxiribonucleic acid
  • PNA peptide acidic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • the aim of the current developments is a molecular analysis at the level of DNA and / or gene expression, especially the latter via the analysis of cDNA (complementary DNA).
  • cDNA complementary DNA
  • this type of DNA analysis in medicine offers the possibility of rapid hereditary disease, pre- disposition and / or tumor diagnosis and therapy control.
  • immobilized DNA is used as an analytical tool in the sequence analysis of nucleic acids.
  • synthetic DNA with a length of up to 100 nucleotide building blocks (DNA oligonucleotides) is covalently linked via an active group with a suitable surface.
  • Silicates, metal layers, for example gold or the like, can be used as surfaces. , or also serve different polymer layers.
  • DNA oligonucleotides of a certain sequence on surfaces with a diameter of up to a few ⁇ m or in volumes with a content of up to a few nl.
  • Complementary DNA molecules from the sample can then be bound to these areas or volumes occupied by the so-called DNA catchers.
  • the specificity of this binding is defined by the rule of the complementary base pairing of the DNA of DNA molecules with different sequences in the analyte solution will bind to the "catcher" those DNA molecules which best correspond to the base pairing rules and release the greatest energy during the complex formation.
  • a specific selection, the so-called stringency, of the external conditions, such as temperature, ionic strength, etc., during the binding by hybridization means that selectively only the most stable pairings of "catcher" and analyte DNA are retained - that is, those which Base pairing rules fully match.
  • DNA analysis is the basis of DNA analysis on so-called DNA chips.
  • the general advantages of such DNA analysis on chips are the strong miniaturization, the synchronization and the high speed of the entire process. compared to conventional methods. Due to the lower need for reagents and sample material, this is accompanied by a cost reduction. In addition, the use of DNA chips leads to an increase in the efficiency and precision of the DNA analysis process.
  • the different types of DNA chips differ in particular in the choice of the substrate, such as plastic, glass, silicon etc., the method of immobilization, e.g. Gold-thiol coupling, immobilization in gel or the like , the technology of application to the solid surface, such as on-line synthesis, dispensing or the like, and the type of detection, in particular optically and / or electrochemically, of the DNA interactions.
  • the substrate such as plastic, glass, silicon etc.
  • the method of immobilization e.g. Gold-thiol coupling, immobilization in gel or the like
  • the technology of application to the solid surface such as on-line synthesis, dispensing or the like
  • the type of detection in particular optically and / or electrochemically, of the DNA interactions.
  • the DNA to be analyzed is provided with a fluorescent reporter group by means of PCR (Polymerase Chain Reaction) or SDA (Strand Displacement Amplification), as is illustrated schematically in FIG. 1.
  • the circles represent the spectroscopic reporter groups which are coupled to the analyte DNA directly via PCR / SDA or indirectly, via so-called fluorescent signal oligonucleotides, which were introduced in a so-called sandwitch hybridization assay.
  • stringent conditions e.g. high temperature, low ionic strength, organic solvent
  • the places where the interaction took place can be done with fluorescence microscopy, surface detectors or a CCD
  • Electrochemical methods that detect DNA-DNA interactions offer the advantage of small, robust so-called “handheld” devices, which may be suitable for battery operation on site.
  • the electrochemical determination of DNA hybridization has so far mostly used the increase in Conductivity of the double-stranded DNA after hybridization
  • redox cycling tests offer a robust solution to make DNA hybridization accessible to electrochemical measurements.
  • the hybridization event between bound capture DNA and biotin-labeled analyte DNA is detected via a biotin streptavidin Interaction with an enzyme marked.
  • the activity of the biocatalyst for example alkaline phosphatase, then forms a redox-active product, for example p-aminophenol, which can be converted amperometrically on suitable electrodes, for example gold electrodes.
  • a redox cycling process can be started after applying suitable potentials, the current of which is a measure of the DNA hybridization event.
  • the object is achieved in a method of the type mentioned at the outset by the sequence of the method steps according to claim 1.
  • Further developments and refinements of the method are the subject of the dependent method claims.
  • claim 13 specifies the implementation of the invention as a so-called enzyme switch.
  • An associated arrangement is specified in claim 21. Developments of this arrangement are the subject of the dependent claims.
  • immobilized DNA as a catcher can advantageously be provided with a biocatalytically active label and a substance as an inhibitor which can interactively inhibit its catalytic activity by interaction with the label.
  • a DNA in the vicinity of the immobilized biocatalytic label, a DNA can be immobilized as a catcher which is provided with a substance as an inhibitor which can interactively inhibit its catalytic activity by interaction with the biocatalytically active label.
  • an immobilized biocatalytically active label with a DNA be provided as a catcher, which in turn carries a substance as an inhibitor which, by interacting with the label, can reversibly inhibit its activity.
  • a complex of a double-stranded DNA-binding molecule and a substance can be used as an inhibitor which can interactively inhibit its activity by interaction with the immobilized biocatalytically active label.
  • this complex binds to the resulting double strand and is therefore no longer available for the inhibition of the biocatalytically active label.
  • the structure of the capture DNA i.e. their partial single / double strandedness, the interaction of inhibitor and biocatalyst.
  • the formation of this double strand cancels the interaction between the biocatalyst and inhibitor or leads to the binding of the inhibitor to the double strand formed.
  • the system is thus switched from the first, inactive state to a second, active state.
  • the essential disadvantages of the prior art are eliminated with the invention.
  • the invention particularly provides for the use of a switchable biocatalyst, namely the enzyme, the activity of the biocatalyst being controlled and in particular switched via the hybridization of the sample DNA to the capture DNA.
  • An arrangement for carrying out the method according to the invention comprises a carrier on which an enzyme is immobilized at one site, a capture DNA which is immobilized on site, an inhibitor which is covalently linked to the capture DNA and a substrate, in a first state the capture DNA via intramolecular hydrogen bonds is folded that the activity of the enzyme is inhibited by the inhibitor, and the substrate has not been converted, and wherein in a second state the capture DNA hybridizes with a DNA to be detected and is thereby folded such that the inhibitor is separated from the enzyme and the substrate is implemented.
  • an optical or electrochemical analysis of the nucleic acids can be carried out using a hybridization switch.
  • the electrochemical measurement can be carried out amperometrically, potentiometrically or conductometrically.
  • FIGS. 2/3, 4/5, 6/7 and 8/9 in each case systems with control of the enzyme activity by DNA hybridization, in which a double helix is formed
  • FIG. 10 shows a plan view of a transducer array with a magnification section to illustrate the structure and manufacture of the complete system
  • FIG. 11 shows a flow diagram of a measurement and FIG. 12 shows an electrochemical analysis system for switching functions corresponding to FIGS. 2/3, 4/5, 6/7 or 8/9.
  • FIGS. 2 to 9 The following description of the figures initially refers further to FIGS. 2 to 9.
  • the phenomenological foundations apply together.
  • a carrier 1 is present as a substrate. If an electrochemical selection process, in particular redox cycling, is used, the carrier 1 is on
  • Chip with integrated circuits which are not detailed here. Such circuits can be designed analog or digital.
  • Figures 2/3, 4/5, 6/7 and 8/9 each show a control of the biocatalytic activity by DNA hybridization and thus implement a switch.
  • DNA 10 in each case or 10 ', 10 being a so-called catcher DNA and 10 ⁇ being the DNA to be analyzed, a biocatalytically active label 20 and an inhibitor 30, the interaction of which is explained below using alternative examples.
  • the biocatalytically active label 20 is in particular an enzyme. But it can also be a ribozyme.
  • enzyme 20 is inactive.
  • the structure of the "catcher" 10 - ie the partial intramolecular DNA double strand through hydrogen bonds 40 - enables the interaction / reversible binding of the inhibitor 30 to the enzyme 20 as a biocatalytically active label and inhibits its activity.
  • the switch is in the inactive state ,
  • Catcher that the interaction of enzyme 20 and inhibitor 30 is weakened in such a way that inhibitor 30 falls off enzyme 20 - the active center of enzyme 20 is free and enzyme 20 is active.
  • the enzyme substrate 50 present in the environment can now fill the active center of the enzyme 20.
  • the enzyme 20 is converted and an optically or in particular electrochemically, ie amperometrically, potentiometrically, conductometrically, detectable product will result.
  • the enzyme 20 is' switched on ⁇ .
  • the enzyme is therefore active in FIGS. 3, 5 and 7.
  • the switch is in the active state.
  • FIGS. 2/3, 4/5, 6/7 and 6/9 relate to different variants of the binding / immobilization of biocatalytically active labeling and / or “catcher” DNA 10 and of the inhibitor 30.
  • both the biocatalytically active label 20 and the inhibitor 30 are bound to the capture DNA 10, which is fixed at a point 2 on the carrier 1, for example a chip.
  • the biocatalytically active marker 20 is immobilized at a point 3 on the chip 1 and both the catcher DNA 10 and the inhibitor 30 are coupled to it.
  • the catcher DNA 10 is bound to a first location 2 of the carrier 1, for example the chip, while the biocatalytically active label 20 is bound to a second location 3 of the carrier 1, for example the Chips, is bound.
  • the capture DNA 10 is fixed at location 2 and the bio-catalytic label at location 3 in the inactive state.
  • the catcher DNA 10 is free and single-stranded because, owing to the sequence of the “catcher”, no intramolecular hydrogen bonds 40 can be formed.
  • the inhibitor 30 has a so-called intercalator 60 , ie a molecule binding a double-stranded DNA.
  • the enzyme 20 can also be immobilized on the carrier 1 and the capture DNA 10 bound to it.
  • the capture DNA 10 can equally well be immobilized on the carrier 1 and the enzyme 20 bound to it.
  • the examples according to alternative figures 6/7 or 2/3 are authoritative.
  • an immobilization / integration into a polymeric gel matrix can also be used as a link between the “catcher” DNA 10 and / or the biocatalytic marker 20 on the chip 1 as a carrier.
  • the gel matrix can be a hydrogel that is located elsewhere is described.
  • the enzyme advantageously has the following properties:
  • Either the product or the substrate of the enzymatic reaction must be detectable optically or amperometrically.
  • the phosphatases, esterases and proteases which catalyze the formation of phenolates and quinone-type compounds are particularly suitable.
  • the enzyme should consist of a polypeptide chain to ensure immobilization of the polypeptide chains without loss of activity. - The enzyme should be sufficiently thermostable to have a
  • transducer surface 100 suitable for the redox (re) cycling method, circular analytical positions 101, 101 ',. , , available.
  • Structures with interdigital electrodes 110 and 120 are located at positions 101, 101 ', ..., which typically have a diameter of approximately 150 ⁇ m and have a spacing (so-called pitch) of approximately 200 ⁇ m.
  • the interdigital electrodes 110 and 120 are comb-shaped in a known manner with electrode fingers 111 and 121, which have a line and spacing width of no greater than 1 ⁇ m and advantageously consist of gold.
  • Readout contacts 160 are arranged on the side of the transducer surface 100.
  • a hydrogel which is not shown in detail, is applied to the analytical positions 101, 101 ', ..., into which the "catcher" DNA is covalently anchored via a 3' amino modification "End an SH group with which the inhibitor of the reporter enzyme, for example carboyl esterase, is covalently bound.
  • An alkyl trifluoromethyl ketone preferably a trifluoromethyl methyl ketone, serves as the reversible inhibitor of the esterase.
  • the "catcher" DNA and inhibitor are coupled in a suitable manner according to the following reaction:
  • the reporter enzyme preferably a thermostable enzyme, which consists of a polypeptide chain
  • the carboxylesterase from the thermoacidophilic Eubacterium Bacillus acidocaldarius (Manco, G., Adinolfi, E., Pisani, FM, Ottolina, G. Carrera, G. and Rossi, M. 1998, Biochem. J. 332, 203-212).
  • the fact that the X-ray structure of the enzyme is known is used for the covalent attachment of the enzyme (De Simone, G., Galdiero, S., Manco, G., Lang, D., Rossi, M., and Pedone , C. 2000, J. Mol. Biol. 303, 761-771).
  • This enables a suitable amino acid on the surface of the enzyme to be replaced by cysteine or an amino acid with an amino-functional residue, for example lysine, by means of targeted mutagenesis.
  • the enzyme is then bound directly to the gold surface of the interdigital electrodes via the SH group of the cysteine or else to the respective hydrogel matrix via the NH 2 group of the amino-functional residue.
  • Two adjacent analytical positions are shown which are equipped with different catcher DNA.
  • the catcher DNA of the respective analytical position is in a conformation in which the inhibitor can bind to the active center of the enzyme.
  • the enzyme is inactive, which means that the system is inactive according to FIG. 11a).
  • the esterase activity results from the following reaction:
  • an oxidative or reductive potential is applied to the different “fingers” 111 or 121 of the interdigital electrodes 110 or 120 of a single analytical position 101 from FIG. 10.
  • Stand and line widths then start a redox cycling process at the individual analytical positions at which p-aminophenol octanoyl ester was / is converted to p-aminophenol by enzymatic activity.
  • the redox cycling process means the oxidation of p-aminophenol on the positively polarized electrode to quinonimine and the reduction of quinonimine to p-aminophenol on the negatively polarized electrode.
  • the total flow of these redox reactions is a function of the amount of hybridized analyte DNA.
  • FIG. 12 illustrates the detection principle explained above with the aid of the redox cycling process and the principle of electrochemical evaluation.
  • a redox cycling process is shown on the surface of an individual analytical position 101 of the chip 1 separated by walls 15, wherein in addition to the symbols already explained, reference symbol 80 denotes the quinone imine and reference symbol 90 the p-aminophenol according to the above structural formula , Microelectrodes 5, 5 ⁇ are arranged on the chip 1 at a ⁇ m spacing.
  • microelectrodes 5, 5 ' are part of the interdigital electrodes 110 and 120 with the finger electrodes 111 and 121 of FIG. 10 and are subjected to different potentials. Redox currents down to the sub-nano-ampere range can be measured on the microelectrodes 5, 5 'via measuring electronics with current measuring devices 8 or 8'.
  • DNA can be evaluated electrochemically.
  • the main advantage of this procedure is that it allows the use of DNA samples without having to label them beforehand, i.e. a marker to modify.
  • the adjacent measurement positions in FIG. 12 correspond to the individual analytical positions 101, 101 ', ... from FIG 10. As described in detail there, they typically have a grid dimension of 200 ⁇ m, so that a large number of parallel measurements can be carried out on a chip 1.
  • microchips can be implemented for an easy-to-use hand-held device that can be used for the defined applications.
  • the exchangeable chips have a certain lifespan and can be programmed with different "catchers". Since this type of DNA chip is a single-use product, a very large number of different DNA chips can be expected There are no comparable, easy-to-use devices of this type on the market.

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Abstract

Insbesondere zur Erfassung von DNA in der Medizin, Umwelt und/oder Kriminalistik ist es bekannt, ein System mit immobilisierter DNA als analytisches Werkzeug bei der Analyse von Nukleinsäure zu verwenden. Erfindungsgemäß wird die immobilisierte DNA mit einer biokatalytisch aktiven Markierung, beispielsweise ein Enzym, und einem die katalytische Aktivität reversibel hemmenden Substanz als Inhibitor versehen oder aber es wird neben der immobilisierten biokatalytischen Markierung eine DNA immobilisiert, die mit einer Substanz versehen ist, welche die katalytische Aktivität der Markierung reversibel hemmen kann. Alternativ dazu kann eine immobilisierte biokatalytisch aktive Markierung mit einer DNA als Fänger versehen werden, die eine Substanz als Inhibitor trägt, der die Aktivität der Markierung reversibel hemmen kann. In weiterer Alternative kann ein Komplex aus einem doppelsträngige DNA bindenden Molekül und einer Substanz als Inhibitor verwendet werden, die durch Wechselwirkung mit der immobilisierten biokatalytisch aktive Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann. In allen Fällen wechselwirkt in einem ersten Zustand der Inhibitor bzw. der Verbindung aus Inhibitor und doppelsträngige DNA bindenden Molekül mit der biokatalytisch aktiven Markierung und definiert den inaktiven Zustand des Systems. Beim Binden, insb. Hybridisieren, der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA wird aufgrund der Bildung des Doppelstranges die Wechselwirkung zwischen biokatalytisch aktiven Markierung und Inhibitor gelöst. Damit wird das System vom ersten Zustand in einen zweiten Zustand, der den aktiven Zustand definiert, umgeschaltet. Bei der zugehörigen Anordnung ist ein Träger (1) mit integrierten Mikroelektroden (5, 5') vorhanden, in dem das Enzym entweder immobilisiert wird oder in der Nähe der Mikroelektroden (5, 5') in ein Polymernetzwerk eingeschlossen wird.

Description

Beschreibung
Verfahren für die biochemische Analytik von DNA und zugehöri¬ ge Anordnung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die bioche¬ mische Analytik von DNA. Daneben bezieht sich die Erfindung auf eine zugehörige Anordnung zur Durchführung dieses Verfah¬ rens .
Anwendungsgebiet der Erfindung ist insbesondere die Medizin und Umweltanalytik sowie die Forensik. Dabei werden ein Enzym als immobilisierte biokatalytisch aktive Markierung, eine immobilisierte DNA und eine immobilisierte Substanz (Inhibi- tor) , welche die Aktivität des Enzyms reversibel hemmen kann, als Werkzeuge zur Analyse von Nukleinsäuren verwendet.
Unter DNA (Desoxiribonucleic Acid) werden im vorliegenden Zusammenhang eine Desoxiribonuklein-Säure und deren Struktur- analoga verstanden. Diese sind insbesondere PNA (Peptidenuc- leic Acid) , „Caged'-DNA, RNA (Ribonucleic Acid) und alle 2 ' -substituierten DNA-Abkömmlinge.
Keine Anwendung findet die Erfindung auf Ribozyme. In diesem Zusammenhang wird auf die Veröffentlichung Catalytic Molecu- lar Beacons* in CHEMBIOCHEM 2001, 2, 411 - 415 verwiesen.
Ziel der aktuellen Entwicklungen ist eine molekulare Analyse auf der Ebene von DNA und/oder Genexpression, insbesondere letztere über die Analyse von cDNA (complementary DNA) . Dies erlaubt eine Identifikation und Typisierung von Erbgut enthaltenden Krankheitserregern, wie Bakterien, Viren od. dgl . , sowie die Klärung eventuell vorhandener Resistenzen. Weiterhin ist damit der Nachweis von Organismen in der Umweltanaly- tik, Lebensmitteltechnologie und Landwirtschaft zu führen.
Darüber hinaus bietet diese Art der DNA-Analyse in der Medizin die Möglichkeiten einer schnellen Erbkrankheits-, Prä- dispositions- und/oder Tumordiagnostik sowie der Therapiekontrolle .
Gemäß dem Stand der Technik wird immobilisierte DNA als ana- lytisches Werkzeug bei der Sequenzanalyse von Nucleinsäuren angewandt. Dazu wird synthetische DNA von einer Länge bis zu 100 Nucleotidbausteinen (DNA-Oligonukleotide) über eine aktive Gruppe mit einer geeigneten Oberfläche kovalent verknüpft . Als Oberflächen können Silikate, Metallschichten, beispiels- weise Gold od. dgl . , oder auch verschiedene Polymerschichten dienen.
Letztere Technologie ist weit entwickelt und ermöglicht die spezifische Immobilisierung von DNA-Oligonukleotiden bestimm- ter Sequenz an Flächen mit einem Durchmesser von bis zu einigen μm bzw. in Volumina mit einem Inhalt von bis zu einigen nl . An diesen, mit den sog. DNA-Fängern („catcher") besetzten Flächen bzw. Volumina können dann komplementäre DNA-Moleküle aus der Probe gebunden werden. Die Spezifität dieser Bindung ist durch die Regel der komplementären Basenpaarung der DNA definiert. Bei einem Angebot von DNA-Molekülen mit verschiedener Sequenz in der Analyten-Lösung werden solche DNA-Moleküle an den „catcher" binden, welche am besten den Basenpaarungsregeln entsprechen und bei der Komplexbildung die größte Energie freisetzen.
Eine spezifische Auswahl, die sog. Stringenz, der äußeren Bedingungen, wie Temperatur, Ionenstärke etc., während der Bindung durch Hybridisierung führt dazu, dass selektiv nur die stabilsten Paarungen von „catcher" und Analyt-DNA erhalten bleiben - also solche, die den Basenpaarungsregeln vollkommen entsprechen.
Letzteres ist die Grundlage der DNA-Analytik auf sog. DNA- Chips. Die generellen Vorteile einer solchen DNA-Analyse auf Chips ist in der starken Miniaturisierung, der Synchronisierung und der hohen Geschwindigkeit des gesamten Prozesses ge- genüber herkömmlichen Methoden zu sehen. Aufgrund des geringeren Bedarfs an Reagenzien und Probenmaterial geht dies mit einer Kostenreduktion einher. Darüber hinaus führt der Einsatz von DNA-Chips zu einer Steigerung der Effizienz und der Präzision des DNA-Analyse-Vorgangs .
Die verschiedenartigen DNA-Chips unterscheiden sich insbesondere durch die Wahl des Substrats, wie Kunststoff, Glas, Silizium etc., die Methode der Immobilisierung, z.B. Gold- Thiol -Koppelung, Immobilisierung in Gel od. dgl . , der Technologie der Auftragung an die feste Oberfläche, wie on-line Synthese, Aufdispensieren od. dgl., und der Art der Detekti- on, insbesondere optisch und/oder elektrochemisch, der DNA- Wechselwirkungen .
Am meisten verbreitet sind die spektroskopischen Systeme, bei welchen die zu analysierende DNA mit einer fluoreszierenden Reportergruppe mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) oder SDA (Strand Displacement Amplification) versehen werden, wie es anhand der Figur 1 schematisch verdeutlicht ist. Im Einzelnen stellen dort die Kreise die spektroskopischen Reportergruppen dar, welche direkt über PCR/SDA oder indirekt, über sogenannte fluoreszierende Signal-Oligonukleotide, die in einem sog. Sandwitch-Hybridisierungs-Assay eingeführt wur- den mit der Analyt-DNA gekoppelt sind. Nach der Entfernung der nicht bindenden oder schwach bindenden Analyt-DNA durch Anlegen sog. stringenter Bedingungen, z.B. hohe Temperatur, niedere Ionenstärke, organisches Lösungsmittel, können die Stellen, an welchen die Wechselwirkung stattgefunden haben, mit Fluoreszenzmikroskopie, Flächendetektoren oder einer CCD-
Kamera sichtbar gemacht werden. Die Bereiche an der Oberfläche, an welcher die Wechselwirkung zwischen Fänger und Analyt-DNA stattgefunden hat, erscheinen als Flecke mit veränderten optischen Eigenschaften. Da die Position der unter- schiedlichen „catcher" DNA's auf dem Chip bekannt ist, kann die entsprechend komplementäre DNA in den Analytproben eindeutig identifiziert werden. DNA-Chips mit einigen tausend verschiedenen Oligonucleoti- den/cm2 sind kommerziell zusammen mit optischer Detektion und Auswertesystemen erhältlich.
Bei optischen Detektionssystemen sind vergleichsweise komplizierte Lese- und Auswertegeräte notwendig, welche die Anwendung der DNA-Chip-Technologie augenblicklich in erster Linie auf spezialisierte Laboratorien einschränkt. Es ist zweifel- haft, ob die DNA-Analytik dieser Art in der Feldanalyse, z.B. in landwirtschaftlichen Betrieben, in der Lebensmittelindustrie, der Umweltanalytik oder produktionsbegleitender Analytik sowie beim niedergelassenen Arzt eine breite Anwendung finden kann. Bereits die Vorbereitung der Proben mittels PCR bzw. SDA und/oder die Einführung der spektroskopischen Reportergruppen in die Analyt-DNA s ist zeit und kostenintensiv und u.U. mit technologischen Problemen behaftet.
Elektrochemische Verfahren die DNA-DNA - Wechselwirkungen de- tektieren bieten den Vorteil kleiner, robuster sog. „Hand- held"-Geräte, die für den u.U. Batteriebetrieb vor Ort geeignet sind. Die elektrochemische Bestimmung der DNA-Hybridisierung nutzt bisher meistens die Erhöhung der Leitfähigkeit der doppelsträngigen DNA nach der Hybridisierung. Technisch wenig ausgereift sind die auf der Änderung der Leitfähigkeit der
DNA nach der Hybridisierung basierenden Analyseverfahren. Bei starken elektrischen Feldern kommt es hier zur DNA-Schädigung und damit zum Signalverlust . Außerdem wird die Leitfähigkeit der DNA mit der zunehmenden Länge der Doppelhelix stark ein- geschränkt. Keine der bisher angewandten Methoden erlaubt eine quantitative Bestimmung der DNA-Hybridisierung.
Einen robusten Lösungsansatz die DNA-Hybridisierung einer elektrochemischen Messung zugänglich zu machen bieten sog. Redox(re) cycling-Tests . Dabei wird beispielsweise das Hybri- disierungsereignis zwischen gebundener Fänger-DNA und mit Bi- otin markierter Analyt-DNA über eine Biotin-Streptavidin- Wechselwirkung mit einem Enzym markiert. Durch die Aktivität des Biokatalysators, z.B. alkalische Phosphatase, wird dann ein redoxaktives Produkt, z.B. p-Aminophenol , gebildet, welches amperometrisch an geeigneten Elektroden, z.B. Goldelek- troden umgesetzt werden kann. Durch die Wahl der speziellen Elektrodengeometrie, insbesondere Interdigitalelektroden, und der geringen Elektrodenabstände von z.B. < lμm kann nach Anlegen geeigneter Potentiale ein Redoxcycling-Prozess in Gang kommen dessen Strom ein Maß für das DNA- Hybridisierungsereignis ist.
Davon ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren für eine DNA-labelfreie biochemische Analytik der DNA-DNA-Wechselwirkung anzugeben und zugehörige Anordnun- gen zu schaffen.
Die Aufgabe ist erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Art durch die Abfolge der Verfahrensschritte gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Weiterbildungen und Ausgestal- tungen des Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Verfahrensansprüche. Insbesondere Patentanspruch 13 gibt die Realisierung der Erfindung als sog. Enzym-Schalter an. Eine zugehörige Anordnung ist im Patentanspruch 21 angegeben. Weiterbildungen dieser Anordnung sind Gegenstand der abhängigen Sachansprüche.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann vorteilhafterweise immobilisierte DNA als Fänger mit einer biokatalytisch aktiven Markierung und einer Substanz als Inhibitor versehen werden, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren katalytische Aktivität reversibel hemmen kann. Alternativ dazu kann in der Nähe der immobilisierten biokatalytischen Markierung eine DNA als Fänger immobilisiert werden, die mit einer Substanz als Inhibitor versehen ist, die durch Wechselwirkung mit der biokatalytisch aktive Markierung deren katalytische Aktivität reversibel hemmen kann. Alternativ dazu kann eine immobilisierte biokatalytisch aktive Markierung mit einer DNA als Fänger versehen werden, die ihrerseits eine Substanz als Inhibitor trägt, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann. In weiterer Alternative kann ein Komplex aus einem doppelstrangige DNA bindenden Molekül und einer Substanz als Inhibitor verwendet werden, die durch Wechselwirkung mit der immobilisierten biokatalytisch aktive Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann. Bei Hybridisierung von Analyt- und immobilisierter Fänger-DNA bindet dieser Komplex an den entstandenen Doppel- sträng und steht daher für die Inhibition der biokatalytisch aktive Markierung nicht mehr zur Verfügung.
Bei allen angeführten Alternativen erlaubt in einem ersten inaktiven Zustand des Systems die Struktur der Fänger-DNA, d.h. deren partielle Einzel/Doppelsträngigkeit, die Wechselwirkung von Inhibitor und Biokatalysator. Beim Binden der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA auf Grund der Komplemen- tarität hebt die Bildung dieses Doppelstrangs die Wechselwirkung zwischen Biokatalysator und Inhibitor auf bzw. führt zur Bindung des Inhibitors an den gebildeten Doppelstrang. Damit wird das System von dem ersten, inaktiven Zustand in einen zweiten, aktiven Zustand geschaltet.
Mit der Erfindung werden die wesentlichen Nachteile des Stan- des der Technik beseitigt. Die Erfindung sieht insbesondere die Nutzung eines schaltbaren Biokatalysators, nämlich des Enyzms vor, wobei die Aktivität des Biokatalysators über die Hybridisierung der Proben-DNA an die Fänger-DNA gesteuert und insbesondere geschaltet wird.
Eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst einen Träger, auf dem ein Enzym an einem Ort immobilisiert ist, eine Fänger-DNA, die am Ort immobilisiert ist, einen Inhibitor, der mit der Fänger-DNA kovalent ver- knüpft ist und ein Substrat, wobei in einem ersten Zustand die Fänger-DNA über intramolekulare Wasserstoffbrücken derart gefaltet ist, dass durch den Inhibitor die Aktivität des Enzyms gehemmt ist, und das Substrat nicht umgesetzt ist, und wobei in einem zweiten Zustand die Fänger-DNA mit einer nachzuweisenden DNA hybridisiert und dadurch derart gefaltet ist, dass der Inhibitor vom Enzym getrennt ist und das Substrat umgesetzt ist.
Bei der Erfindung kann eine optische oder elektrochemische Analyse der Nukleinsäuren über einen Hybridisierungsschalter erfolgen. Insbesondere die elektrochemische Messung kann am- perometrisch, potentiometrisch oder konduktometrisch erfolgen. Somit ergeben sich gegenüber dem Stand der Technik erhebliche nachfolgende Vorteile: es wird ein labelfreies Ausleseverfahren zur Analyse von DNA realisiert. Zur Detektion der Hybridisierung zwischen „catcher"-DNA und Analyt-DNA muss nämlich keinerlei Reportergruppe in die Analyt-DNA direkt oder indirekt über einen weiteren Hybridisierungsschritt mit einem Signal - Oligonukleotid als Signal -DNA eingeführt werden. Dies hat den Vorteil, dass bei ausreichender Konzentration der Analyt-DNA auf eine zeit- und kostenintensive PCR/SDA zur Einführung eines Labels als Reporters verzichtet werden kann. Auch kann eine sonst teilweise notwendige weitere Hybridisierung mit einer Signal-DNA zur Detektion der „catcher" Analyt-DNA Hybridisierung als Sandwich-Assay unterbleiben, was die Komplexität des biochemischen Nachweissystems deutlich vereinfacht und damit Fehlerquellen reduziert . - Die Korrelation zwischen der Menge an entstandenem Enzym- Produkt und der Menge der doppelsträngigen „catcher" Analyt-DNA ermöglicht die quantitative Auswertung der Analyt- DNA-Konzentration in der Probe.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei- spielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es zeigen jeweils in schematischer Darstellung Figur 1 ein Analysesystem nach dem Stand der Technik,
Figur 2/3, 4/5, 6/7 und 8/9 jeweils Systeme mit Steuerung der Enzymaktivität durch DNA-Hybridisierung, bei denen es zur Bildung einer Doppelhelix kommt,
Figur 10 eine Draufsicht auf ein Transducer-Array mit Vergrößerungsausschnitt zur Verdeutlichung von Aufbau und Herstellung des Komplettsystems,
Figur 11 ein Ablaufschema einer Messung und Figur 12 ein elektrochemisches Analyesystem für Schaltfunktionen entsprechend den Figuren 2/3, 4/5, 6/7 oder 8/9.
Gleiche Elemente haben in den Figuren gleiche Bezugszeichen. Die Figuren werden nachfolgend teilweise gemeinsam beschrie- ben.
Auf Figur 1 wurde bereits eingangs bei der Diskussion des Standes der Technik hingewiesen. Bei einem nach dem optischen Prinzip arbeitenden DNA-Chip stellen die Kreise fluoreszie- rende Reportergruppen, welche mit der Analyt-DNA/Signal-DNA gekoppelt sind, dar. Die interessierenden Informationen werden durch optische Abfrage erhalten.
Die nachfolgende Figurenbeschreibung bezieht sich zunächst weiter auf die Figuren 2 bis 9. Die phänomenologischen Grundlagen gelten dazu gemeinsam.
In den Figuren 2 bis 9 ist jeweils ein Träger 1 als Substrat vorhanden. Kommt ein elektrochemisches Ausleseverfahren, ins- besondere Redoxcycling, zum Einsatz, ist der Träger 1 ein
Chip mit integrierten Schaltungen, die hier nicht im Einzelnen ausgeführt sind. Solche Schaltungen können analog oder digital ausgebildet sein.
Die Figuren 2/3, 4/5, 6/7 sowie 8/9 zeigen jeweils eine Steuerung der biokatalytischen Aktivität durch DNA-Hybridisierung und realisieren somit einen Schalter. Es sind jeweils DNA 10 bzw. 10', wobei 10 eine sog. Fänger-DNA („catcher") und 10λ die zu analysierende DNA ist, eine biokatalytisch aktive Markierung 20 und ein Inhibitor 30 vorhanden, deren Zusammenwirken nachfolgend anhand alternativer Beispiele erläutert wird.
Die biokatalytisch aktive Markierung 20 ist insbesondere ein Enzym. Sie kann aber auch ein Ribozym sein.
In den Figuren 2, 4 und 6 ist das Enzym 20 inaktiv. Die Struktur des „catchers" 10 - d.h. der partielle intramolekulare DNA- Doppelstrang durch Wasserstoffbrücken 40 - ermöglicht die Wechselwirkung/reversible Bindung des Inhibitors 30 an das Enzym 20 als biokatalyisch aktive Markierung und hemmt dessen Aktivität. Der Schalter befindet sich im inaktiven Zu- stand.
Durch die Hybridisierung der „catcher"-DNA 10 mit der Analyt- DNA 10* wird ein DNA-Doppelstrang aus „catcher"-DNA 10 und Analyt-DNA 10 λ gebildet. Dies geschieht, weil die Bildung dieses DoppelStranges auf Grund der höheren Anzahl von sich ausbildenden Basenpaarungen, d.h. die Wasserstoffbrücken 40, energetisch günstiger ist, als die Bildung des partiellen, intramolekularen „catcher"-DNA Doppelstranges, der nur einige wenige Wasserstoffbrücken aufweist. Die Bildung dieses Dop- pelstrangs bewirkt eine so starke Konformationsänderung im
„catcher", dass die Wechselwirkung von Enzym 20 und Inhibitor 30 derart geschwächt wird, dass der Inhibitor 30 vom Enzym 20 abfällt - das aktive Zentrum des Enzyms 20 ist frei und das Enzym 20 ist aktiv.
Das in der Umgebung vorhandene Enzym-Substrat 50 kann nun das aktive Zentrum des Enzyms 20 füllen. Das Enzym 20 wird umgesetzt und ein optisch oder insbesondere elektrochemisch, d.h. amperometrisch, potentiometrisch, konduktometrisch, detek- tierbares Produkt wird entstehen. Das Enzym 20 ist 'eingeschaltet λ . In den Figuren 3, 5 und 7 ist das Enzym also aktiv. Der Schalter befindet sich im aktiven Zustand.
Die in den Figuren 2/3, 4/5, 6/7 sowie 6/9 dargestellten Al- ternativen beziehen sich auf unterschiedliche Varianten der Bindung/Immobilisierung von biokatalytisch aktiver Markierung und/oder „catcher"-DNA 10 sowie des Inhibitors 30.
In Figur 2 und Figur 3 ist an die Fänger-DNA 10, die an einer Stelle 2 des Trägers 1, bspw. Chip, fixiert ist, sowohl die biokatalytisch aktive Markierung 20 als auch der Inhibitor 30 gebunden .
Gemäß Figur 4 und Figur 5 ist in einer Alternative zu Figur 2/3 die biokatalytisch aktive Markierung 20 an einer Stelle 3 des Chips 1 immobilisiert und daran sowohl die Fänger-DNA 10 als auch der Inhibitor 30 gekoppelt.
Gemäß Figur 6 und Figur 7 ist in einer anderen Alternative die Fänger-DNA 10 an einer ersten Stelle 2 des Trägers 1, bspw. Des Chips, gebunden, während die biokatalytisch aktive Markierung 20 an einer zweiten Stelle 3 des Trägers 1, bspw. des Chips, gebunden ist.
Gemäß Figur 8 und Figur 9 ist in einer weiteren Alternative im inaktiven Zustand die Fänger-DNA 10 am Ort 2 und die bio- katalytische Markierung am Ort 3 fixiert. In Figur 8 ist die Fänger-DNA 10 frei und einzelsträngig, da auf Grund der Sequenz des „catchers" keine intramolekularen Wasserstoffbrü- cken 40 ausgebildet werden können. An den Inhibitor 30 ist, im Unterschied zu den vorher geschilderten Alternativen ein sog. Interkalator 60, d.h. ein eine doppelstrangige DNA bindendes Molekül, gebunden.
In Figur 9 bindet eine Analyt-DNA 10 λ unter Ausbildung der
Wasserstoffbrücken 40 an die Fänger-DNA 10. Durch die Ausbildung des DNA-Doppelstranges bindet nunmehr die Verbindung bzw. der Komplex aus Interkalator 60 und Inhibitor 30 an den Doppelstrang. Das Enzym 20 ist somit frei zugänglich für das Substrat 50 und aktiv.
Beim Beispiel gemäß den Figuren 8/9 kann auch das Enzym 20 auf dem Träger 1 immobilisiert und daran der Fänger-DNA 10 gebunden sein. Ebenso gut kann die Fänger-DNA 10 auf dem Träger 1 immobilisiert und daran das Enzym 20 gebunden sein. Diesbezüglich sind die Beispiele gemäß den alternativen Figu- ren 6/7 oder 2/3 maßgebend.
Generell kann als Anbindung der „catcher" -DNA 10 und/oder der biokatalytischen Markierung 20 an den Chip 1 als Träger auch jeweils eine Immobilisierung/Einbindung in eine polymere Gel- matrix verwendet werden. Die Gelmatrix kann ein Hydrogel sein, das an anderer Stelle beschrieben wird.
Die kovalente Immobilisierung der biokatalytisch aktiven Markierung, d.h. des Enzyms, erfolgt in allen Fällen spezifisch über eine geeignete Aminosäureseitenkette. Vorteilhafterweise weist das Enzym folgende Eigenschaften auf :
Entweder das Produkt oder das Substrat der enzymatischen Reaktion muss optisch oder amperometrisch detektierbar sein. Geeignet sind besonders die Phosphatasen, Esterasen und Proteasen, welche die Bildung von Phenolaten und Verbindungen des Chinon-Typs katalysieren.
Das Enzym sollte aus einer Polypeptidkette bestehen, um die Immobilisierung der Polypeptidketten ohne Aktivitätsverlust zu gewährleisten. - Das Enzym sollte ausreichend thermostabil sein, um eine
DNA-DNA-Hybridisierung in breiten Temperaturbereichen zu ermöglichen. Enzyme aus thermophilen Organismen erfüllen meistens diese Bedingung. Thermostabile Enzyme können bei Raumtemperaturen niedrige spezifische Aktivität aufweisen. Dieses Problem kann man mit gerichteter Mutagenese lösen. Um eine gezielte Immobilisierung und die Steuerung der Enzymaktivität in breiten Temperaturbereichen zu ermögli- chen, sollte ein Expressionssystem für die Expression des Enzyms aus rekombinanten Plasmid vorhanden sein.
Anhand Figur 10 wird die Herstellung eines als mxn-Array mit m Spalten und n Zeilen ausgebildeten Transducersystems beschrieben: Auf einem für das Redox (re) cycling-Verfahren geeigneten Transducerflache 100 sind über Barrieren 150 getrennt kreisförmigen analytischen Positionen 101, 101 ', . . . vorhanden. Auf den Positionen 101, 101', ..., die typischer- weise einen Durchmesser von ca. 150μm haben und untereinander einen Abstand (sog. Pitch) von ca. 200μm besitzen, befinden sich Strukturen mit Interdigitalelektroden 110 bzw. 120. Die Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 sind in bekannter Weise kammartig mit Elektrodenfingern 111 bzw. 121, die eine Li- nien- und Abstandbreite von nicht größer als lμm aufweisen und vorteilhafterweise aus Gold bestehen, ausgebildet. An der Transducerflache 100 sind seitlich Auslesekontakte 160 angeordnet .
Auf den analytischen Positionen 101, 101', ... wird ein nicht im Einzelnen dargestelltes Hydrogel aufgebracht, in das die „catcher"-DNA über eine 3 ' -Amino-Modifikation kovalent verankert ist. Die „catcher"-DNA trägt am 5 "-Ende eine SH-Gruppe, mit welcher der Inhibitor des Reporterenzyms, z.B. Carboyl- esterase, kovalent gebunden ist. Als reversibler Inhibitor der Esterase dient ein Alkyl-trifluoromethylketon, vorzugsweise ein Trifluoromethylmethylketon.
Die Koppelung von „catcher"-DNA und Inhibitor erfolgt in ge- eigneter Weise nach folgender Reaktion:
Oligonucleotid -5 '-linker-SH + Br-CH2-CO CF3 ► Oligonucleotid -5 '-_inker-S-CH2-CO CF3
Neben dem Komplex aus „catcher"-DNA und Inhibitor wird auf jeder analytischen Position das Reporterenzym, vorzugsweise ein thermostabiles Enzym, welches aus einer Polypeptidkette besteht, verankert. Vorteilhafterweise wird für diesen Zweck die Carboxylesterase aus den thermoacidophilen Eubakterium Bacillus acidocaldarius (Manco, G. , Adinolfi, E., Pisani, F.M., Ottolina, G. Carrera, G. and Rossi, M. 1998, Biochem. J. 332, 203-212) gewählt. Für die kovalente Anbindung des En- zyms nutzt man die Tatsache aus, dass die Rδntgenstruktur des Enzyms bekannt ist (De Simone, G. , Galdiero, S., Manco, G. , Lang, D., Rossi, M. , and Pedone, C. 2000, J. Mol. Biol . 303, 761-771) . Dies ermöglicht mittels gezielter Mutagenese eine geeignete Aminosäure an der Oberfläche des Enzym durch Cy- stein oder eine Aminosäure mit einem aminofunktionellen Rest, z.B. Lysin, zu ersetzen. Über die SH-Gruppe des Cysteins wird dann das Enzym direkt auf die Goldoberfläche der Interdigitalelektroden gebunden oder aber über die NH2-Gruppe des aminofunktionellen Restes an die jeweilige Hydrogelmatrix.
Zum Betrieb des Schalters entsprechend dem Ablaufschema gemäß Figur 11 mit den Teilschritten a) , b) , c) und d) gilt folgendes : Gezeigt sind zwei nebeneinander liegende, benachbarte analytische Positionen, die mit unterschiedlicher catcher-DNA ausgerüstet sind. Im Grundzustand des Systems liegt nach Be- füllung mit einer geeigneten Pufferlösung die catcher-DNA der jeweiligen analytischen Position in einer Konformation vor, bei der die Bindung des Inhibitors ins aktiven Zentrum des Enzyms möglich ist. Das Enzym ist inaktiv, es liegt also ein inaktiver Zustand des Systems entsprechend Figur 11a) vor.
Nach Zugabe von zu analysierender DNA und stringentem Waschen wird nur an der/den analytischen Positionen, wo es aufgrund der Komplementär!tat zwischen „catcher"-DNA und Analyt-DNA- Spezies zur Ausbildung eines stabilen Nucleinsäure-Doppel- stranges kommt - und zwar in Figur 11 die linke der beiden analytischen Positionen - eine so starke Konformationsänderung im „catcher" bewirkt, dass die Wechselwirkung von Enzym und Inhibitor derart geschwächt wird, dass der Inhibitor vom Enzym abfällt. Das aktive Zentrum des Enzyms ist dann frei, das Enzym ist aktiv und es liegt also ein aktiver Zustand des Systems entsprechend Figur 11b) vor. Nach Zugabe von geeignetem Enzymsubstrat, vorteilhafterweise dem p-Amino-phenol-octanoylester gemäß Schritt (c), kann das Substrat das aktive Zentrum des Enzyms an den/der analyti- sehen Position (en) - und zwar in Figur 11 die linke Position
- füllen, bei denen - wie aus Teilfigur 11b) ersichtlich - eine Hybridisierung von Analyt- und „catcher"-DNA entsprechend Schritt (d) stattgefunden hat. Nur an diesen Positionen
- und zwar in Figur 11 die linke Position - wird das Substrat umgesetzt und es kann das amperometrisch detektierbare Produkt p-Aminophenol entstehen.
Die Esteraseaktivität ergibt sich aus nach folgender Reaktion:
C7H15—
Figure imgf000016_0001
p-Aminophenol-octanoyl-ester p-Aminophenol
-2e;-2H
Figure imgf000016_0002
Chinonimin
Zur Verstärkung des Signals legt man an die unterschiedlichen „Finger" 111 bzw. 121 der Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 einer einzelnen analytischen Position 101 aus Figur 10 ein oxidatives bzw. reduktives Potential an. Auf Grund der Ab- Stands- und Linienbreiten kommt dann ein Redox-Cycling- Prozess an den einzelnen analytischen Positionen in Gang an denen durch enzymatische Aktivität p-Aminophenol-octanoyl- ester zu p-Aminophenol umgesetzt wurde/wird. Unter dem Redox- cycling-Prozess ist die Oxidation von p-Aminophenol an der positiv polarisierten Elektrode zu Chinonimin und die Reduktion von Chinonimin zu p-Aminophenol an der negativ polarisierten Elektrode zu verstehen. Der Gesamtström dieser Redoxreaktionen ist eine Funktion der Menge an hybridisierter Ana- lyt-DNA.
Figur 12 verdeutlicht das oben erläuterte Detektionsprinzip mit Hilfe des Redoxcycling-Prozesses und das Prinzip der elektrochemischen Auswertung. Im Einzelnen ist ein Redox- Cycling-Prozess an der Oberfläche einer einzelnen durch Wände 15 abgetrennten, analytischen Position 101 des Chips 1 dargestellt, wobei neben den bereits erläuterten Symbolen Bezugs- zeichen 80 das Chinonimin und Bezugszeichen 90 das p-Aminophenol entsprechend obiger Strukturformel bedeuten. Auf dem Chip 1 sind Mikroelektroden 5, 5Λ im μm-Abstand angeordnet.
Die Mikroelektroden 5, 5' sind Teil der Interdigitalelektroden 110 bzw. 120 mit den Fingerelektroden 111 bzw. 121 der Figur 10 und werden mit unterschiedlichen Potentialen beaufschlagt. Über eine Messelektronik mit Strommessgeräten 8 bzw. 8' können an den Mikroelektroden 5, 5' Redoxströme bis in den Sub-Nano-Ampere-Bereich gemessen werden.
Es ergibt sich ein zeitabhängiges Messsignal I = g(t), dessen Steigung S = f (DNA) von der zu analysierenden DNA abhängig ist. Somit ist eine Vorgehensweise realisiert, mit der die
DNA elektrochemisch ausgewertet werden kann. Der wesentliche Vorteil dieser Vorgehensweise ist, dass sie den Einsatz von DNA-Proben erlaubt, ohne sie vorher mit einem Label, d.h. einer Markierung, zu modifizieren.
Die benachbarten Messpositionen in Figur 12 entsprechen den einzelnen analytischen Positionen 101, 101', ... aus Figur 10. Wie dort im Einzelnen beschrieben, weisen sie typischerweise ein Rastermass von 200μm auf, so dass auf einem Chip 1 eine Vielzahl paralleler Messungen ausführbar sind.
Mit den anhand der vorstehend beschriebenen Beispiele können Mikrochips für ein einfach zu bedienendes Handgerät realisiert werden, welches für die definierten Anwendungen einsetzbar ist. Die auswechselbaren Chips haben eine bestimmte Lebensdauer und können mit unterschiedlichen „catcher" pro- grammiert werden. Da es sich bei dieser DNA Chip-Art um ein Einwegprodukt handelt, kann mit einem Bedarf von sehr hohen Stückzahlen unterschiedlicher DNA-Chips gerechnet werden. Auf dem Markt existieren keine vergleichbaren, einfach anwendbaren Geräte dieses Typs .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von DNA, wobei ein System mit immo- bilisierten DNA's als analytisches Werkzeug verwendet wird, mit folgenden Maßnahmen: es wird ein System mit einer Fänger-DNA, einem Inhibitor und einem Enzym als biokatalytischen Markierung verwendet, - in einem ersten inaktiven Zustand des Systems erlaubt die Fänger-DNA die Wechselwirkung von Inhibitor und Enzym, beim Binden der zu analysierenden DNA an die Fänger-DNA wird auf Grund der Komplementarität ein Doppelstrang gebildet und es wird die Wechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor aufgehoben und/oder verhindert, damit wird das System von dem ersten inaktiven Zustand in einen zweiten, aktiven Zustand geschaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n - z e i c h n e t , dass die Wechselwirkung von Inhibitor und
Biokatalysator durch die Struktur der Fänger-DNA (partielle Doppel/Einzel-Strängigkeit) ermöglicht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n - z e i c h n e t , dass als Fänger-DNA immobilisierte DNA verwendet wird und dass die immobilisierte DNA mit der biokatalytisch aktiven Markierung und als Inhibitor einer Substanz, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren katalytische Aktivität reversibel hemmen kann, versehen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass eine immobilisierte biokatalytische Markierung verwendet wird und dass in der Nähe der immobilisierten biokatalytischen Markierung eine DNA als Fänger immo- bilisiert wird, die mit einer Substanz als Inhibitor versehen ist, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren katalytische Aktivität reversibel hemmen kann.
5. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass eine immobilisierte biokatalytische Markierung verwendet und dass die immobilisierte biokataly- tisch aktive Markierung mit einer DNA als Fänger versehen wird, die ihrerseits eine Substanz als Inhibitor trägt, die durch Wechselwirkung mit der Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann.
6. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass ein Komplex aus einem, eine doppelstrangige DNA bindenden Molekül und einer Inhibitorsubstanz, die durch Wechselwirkung mit der immobilisierten biokatalytisch aktive Markierung deren Aktivität reversibel hemmen kann, verwendet wird, wobei bei Hybridisierung von immobilisierter Fänger-DNA und Analyt-DNA der Komplex an den entstandenen Doppelstrang gebunden wird und somit für die Inhibition der biokatalytisch aktive Markierung nicht mehr zur Verfügung steht .
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass der Inhibitor eine reversibel an das Enzym bindende und die enzymati- sche Aktivität hemmende Substanz ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die zu analysierende DNA durch Hybridisierung mit der immobilisierten DNA wegen der Komplementarität der einzelsträngigen DNA's einen Doppelstrang, d.h. eine Doppel-Helix, bildet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass der erste, inaktive Zustand und der zweite, aktive Zustand des Sys- tems und dessen Wechsel vom ersten in den zweiten Zustand zusammen eine Schaltfunktion realisieren.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Schaltfunktion des Systems durch die Hybridisierung der zu analysierenden DNA an die immobilisierte DNA als Fänger er- folgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass eine Abfrage des Zustandes der Schaltfunktion des Systems durch eine Bestimmung der Ak- tivität des Biokatalysators erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, g e k e n n z e i c h n e t mit folgenden Maßnahmen: es wird ein Enzym verwendet, - das Enzym bildet einen einschaltbaren Schalter, das Signal des Enzym-Schalters wird optisch oder elektrochemisch ausgelesen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass der Enzym-Schalter über die Hybridisierung von Fänger-DNA und zu analysierender DNA unter stringenten Bedingungen gesteuert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei ein Produkt synthetisiert wird, das optisch oder elektrochemisch detektierbar ist, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass das Enzym die Umsetzung eines nicht detektier- baren Substrates in ein optisch oder elektrochemisch detek- tierbares Produkt katalysiert.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das elektrochemische Auslesen amperometrisch, potentiometrisch, konduktometrisch erfolgt .
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Messwerte des Enzym-Schalters digital ausgegeben und direkt ablesbar sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Analyt- DNA-Konzentration durch Korrelation zwischen der Menge des freigesetzten Enzymproduktes und der Menge an hybridisierter, d.h. gebundener, zu analysierender DNA erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass durch Wechselwirkung des Inhibitors mit dem Enzym der Enzymschalter ausgeschaltet wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym inaktiviert wird, sofern der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und dass bei Vorliegen einer Doppelhelix zwischen Fänger-DNA und zu analy- sierenden-DNA auf Grund des Doppelstranges der Inhibitor für das Enzyms unzugänglich ist und das Enzym aktiv ist.
20. Anordnung, umfassend einen Träger (1), auf dem ein Enzym (20) an einem Ort (3) immobilisiert ist, eine Fänger-DNA (10), die am Ort (3) immobilisiert ist, einen Inhibitor (30), der mit der Fänger-DNA (10) kovalent verknüpft ist, ein Substrat, wobei in einem ersten Zustand die Fänger-DNA (10) über intramolekulare Wasserstoffbrücken (40) derart gefaltet ist, dass durch den Inhibitor (30) die Aktivität des Enzyms (20) gehemmt ist, und das Substrat nicht umgesetzt ist, und wobei in einem zweiten Zustand die Fänger-DNA (10) mit einer nachzuweisenden DANN (10 Λ) hybridisiert und dadurch derart gefaltet ist, dass der Inhi- bitor (30) vom Enzym (20) getrennt ist und das Substrat (50) umgesetzt ist.
21. Anordnung nach Anspruch 20, d a d u r c h g e ¬ k e n n z e i c h n e t , dass der Träger (1) integrierte Mikroelektroden (5, 5 ) umfasst, wobei das Enzym entweder im Träger (1) immobilisiert wird oder in der Nähe der Mikroelektroden (5, 5 ) in ein Polymernetzwerk eingeschlossen oder immobilisiert ist.
22. Anordnung nach Anspruch 21, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Polymernetzwerk die Aktivität des Enzyms nicht stört und für die zu analysierende Analyt-DNA durchlässig ist.
23. Anordnung nach Anspruch 22, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Produkt und/oder das Substrat der enzymatischen Reaktion optisch oder elektrochemisch, insbesondere amperometrisch, potentiometrisch oder konduktometrisch, detektierbar ist.
24. Anordnung nach Anspruch 20, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym eine Phosphatase, Esterase oder Protease ist.
25. Anordnung nach Anspruch 24, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym aus einer Polypep- titkette besteht und dass die Immobilisierung der Polypeptit- kette ohne Aktivitätsverlust des Enzyms erfolgt.
26. Anordnung nach Anspruch 25, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym thermostabil ist.
27. Anordnung nach Anspruch 26, d a d u r c h g e - k e n n z e i c h n e t , dass das Enzym durch ein Expressionssystem, umfassend mindestens ein rekombinantes Plasmid, herstellbar ist.
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