EP1415003A2 - Vorrichtung zur analyse von nukleinsäure - Google Patents

Vorrichtung zur analyse von nukleinsäure

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EP1415003A2
EP1415003A2 EP02794485A EP02794485A EP1415003A2 EP 1415003 A2 EP1415003 A2 EP 1415003A2 EP 02794485 A EP02794485 A EP 02794485A EP 02794485 A EP02794485 A EP 02794485A EP 1415003 A2 EP1415003 A2 EP 1415003A2
Authority
EP
European Patent Office
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control
analysis
nucleic acid
analyte
amplification
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02794485A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Rudolf Mittermayr
Bernhard Ronacher
Florian Winner
Karl Zehethofer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lambda Labor fur Molekularbiologische Dna-Analysen GmbH
Original Assignee
Lambda Labor fur Molekularbiologische Dna-Analysen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lambda Labor fur Molekularbiologische Dna-Analysen GmbH filed Critical Lambda Labor fur Molekularbiologische Dna-Analysen GmbH
Publication of EP1415003A2 publication Critical patent/EP1415003A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00584—Control arrangements for automatic analysers
    • G01N35/00594—Quality control, including calibration or testing of components of the analyser
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
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    • G01N35/00594—Quality control, including calibration or testing of components of the analyser
    • G01N35/00693—Calibration
    • G—PHYSICS
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    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/028—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having reaction cells in the form of microtitration plates

Definitions

  • the invention relates to a device for analyzing at least one nucleic acid sequence, a method for amplifying nucleic acid sequences, a method for identifying nucleic acid sequences, an oligonucleotide primer and an analysis kit according to the features in the preambles of claims 1, 24, 28, 30 and 31 and the use of the device or the analysis kit according to claims 32 to 35.
  • Periodontitis an inflammatory disease of all parts of the periodontium caused by bacterial deposits with progressive loss of supporting tissue.
  • Periodontitis is a common problem that affects a large percentage of the population.
  • the disease can usually be treated well using antibiotics.
  • antibiotics Recently, however, the frequent and sometimes untargeted use of antibiotics to treat various diseases has led to an increase in the development of resistance in many bacteria.
  • a delayed bacteriological finding first requires broad-spectrum antibiotic therapy, which means more side effects for the patient and is more expensive.
  • further therapeutic measures may be necessary, which consequently results in reduced effectiveness, a protracted course of the disease and an inefficient one
  • Microbiological examinations enable the detection of physiological features with indicator media that e.g. B. indicate a change in pH, an exact determination of the type or type of bacteria.
  • indicator media e.g. B. indicate a change in pH, an exact determination of the type or type of bacteria.
  • the disadvantage that can be seen in microbiological analysis systems is that only live germs are to be detected, which requires careful sampling and a corresponding sample transport, and furthermore that the analysis takes several days to weeks.
  • Serological tests can detect protein components from bacteria that react with antibodies.
  • the use of monoclonal antibodies enables the detection of individual types and types of bacteria. Antibody-coupled enzyme reactions enable detection.
  • Such an identification system consists in that, as shown for example in US Pat. No. 4,741,999 A, the use of monoclonal antibodies serves for the detection and determination of the concentration of certain microorganisms relating to the etiology of human periodontal diseases.
  • a monoclonal antibody is specifically described for an antigen from Actinobacillus actinomycetemco-mitans. Actinobacillus actinomycetemcomitans mostly occurs in juvenile periodontitis.
  • the serological systems have the disadvantage that only a few epitopes of an antigen can be detected with monoclonal antibodies.
  • the number of available antibodies is therefore limited to certain types of bacteria.
  • WO 00/52203 A describes a method for identifying bacteria which describes the amplification of part of the 23S rDNA using the primer 5 'GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3' and the primer 5'-TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3 '.
  • the amplificate is hybridized with various oligonucleotides on a nylon membrane.
  • This method allows the identification of at least 8 types of bacteria in one test, the bacteria being selected from a group comprising bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Pneumococci and coagulase include negative staphylococci.
  • this system has the disadvantage that the 23S rDNA is variable and therefore suitable primary sequences for the bacterial genera and species to be analyzed have to be found in a few consensus areas to identify the bacterial genera and species. This in turn limits the number of types of bacteria that can be analyzed.
  • the species present is identified by sequence comparison.
  • a restriction analysis of the amplification product in the sense of an RFLP restriction fragment length polymorphism
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the main disadvantage of this system is that direct sequencing takes a long time and is expensive, and that RFLP does identify sequence variations but not many types of bacteria can be distinguished.
  • Another disadvantage is that the oligonucleotide primers only find complementary sequences in the genera Helicobacter and Wolinella, and therefore can only detect and analyze these two genera.
  • the object of the invention is therefore to provide a possibility for reproducible, quick and simple analysis of nucleic acid sequences. It is also a subtask of the
  • the object of the invention is achieved by the device according to the features in the characterizing part of claim 1.
  • the advantage of this device is that for the analysis of various analytes there are control systems on the device which go through the same process steps as the specific binding partners for the analyte and thus the user has the possibility of the quality of the analysis result via these without additional expenditure of time Assess or improve control systems. This is particularly advantageous if the individual process steps for the analysis of several people are possibly carried out at different locations and these do not communicate with each other. Unclear results can be traced back to possible sources of error.
  • Another advantage is that the process costs using the device are hardly or not increased compared to processes without controls.
  • the species-specific, amplified and hybridized analytes can be archived together with the quality controls, so that the process sequence can be checked at any time and the evaluation with consistent quality can be repeated.
  • the development according to claim 4 is advantageous, which provides a control option for the alignment of the device both during the evaluation and after the evaluation.
  • the evaluation device can already recognize the wrong orientation of the wearer.
  • the evaluation can be terminated immediately and thus the costs for this and / or subsequent process steps can be saved.
  • An embodiment according to claim 6 proves to be advantageous, according to which a complex error search can be carried out by specifically detecting an error in the amplification of the analyte
  • the analysis result can be limited to the amplification step and the entire analysis does not have to be searched for the source of the error.
  • the embodiment according to claim 7 also proves to be advantageous because mix-ups of samples to be analyzed, which took place before the start of the analysis, can be detected quickly. Furthermore, it proves advantageous that the source from which the at least one analyte originates can be determined, and thus the sample can still be assigned even after the analysis.
  • the further development according to claim 8 proves to be advantageous, whereby by connecting an at least one further specific binding partner to the analyte to be analyzed as well as to a further binding partner, the analyte to be identified can be detected if an additional further specific binding partner is present for the further analyte.
  • the signal of the analyte to be analyzed results from the difference between the detectable signals.
  • a further development according to claim 9 is also advantageous, wherein the binding of the same specific binding partner to two different analytes, which have a very similar structure, can be demonstrated.
  • a further binding partner that is specific only for the one analyte the presence of another but undesired analyte that also binds to the same binding partner can be identified.
  • detection of contamination of the sample with, for example, infectious material is made possible.
  • the analyzing or medical staff can be informed and warned at an early stage, thus minimizing the risk of infection and the possible consequential costs.
  • An embodiment according to claim 10 is also advantageous, according to which at least a semi-quantitative determination of the analyte in the original sample is made possible because the quantity and quality of the isolation can be determined by adding a precisely defined amount of a substance with behavior similar to that of the analyte.
  • the application of the specific binding partner to the carrier can be carried out immediately after this step but before the start of the analysis, after which the quality of the analysis can be ensured at a high level by the use of only perfect carriers and thus unnecessary costs by the use be avoided by faulty devices.
  • An embodiment according to claim 13 proves to be advantageous, according to which a uniform intensity of the signals can be guaranteed when evaluating the analysis and thus results do not falsify the result due to different intensities of the signals.
  • the surface of the device can check for unspecific deposits of analytes and thus a signal which arises from an unspecific binding of an analyte and would lead to a wrong result regarding the identification of the analyte.
  • the device can thus be used universally regardless of an expected concentration of the analyte. It is also advantageous that the different concentrations of the binding partners quantify the analytes, such as. B. gene expressions.
  • a configuration according to claim 18 is also advantageous, according to which the analysis can be carried out with greater certainty by arranging identical binding partners on the carrier in several analysis and / or control areas. Doubtful results in a certain analysis and / or control area can be confirmed or refuted by the result in at least one other analysis and / or control area.
  • a further advantage is that the multiple arrangement of the same positive controls, both in different and in the same concentrations, enables normalization to be carried out within or between different measurements. So z. For example, by calculating a correction factor, the measurements in the analysis areas of a device can be compared with one another on one or more other devices. Of course, the measurements in the analysis areas can also be made on the same
  • Device can be normalized by calculating a correction factor.
  • an embodiment according to claim 19 proves advantageous, according to which, for. B. defective spots on the carrier not recognized during the manufacture of the device and / or uneven evaluation conditions over at least one further analysis and / or control area on the device due to the non-adjacent arrangement of the same binding partner in at least one further analysis and / or control area of the wearer can be recognized or compensated.
  • nucleic acid sequences of many different types and types of bacteria can be analyzed simultaneously in any combination and thus a corresponding time saving or increased throughput can be realized in the laboratory.
  • a further development of the device according to claim 22 is advantageous, with which only an oligonucleotide primer or primer a quality control for various process steps, in particular the amplification, is available. Furthermore, by using at least one of these oligonucleotide sequences, the necessary steps for optimizing the successful amplification can be minimized.
  • different target nucleic acid sequences can be analyzed in an advantageous manner using only one oligonucleotide primer or primer pair, because by appropriately selecting the oligonucleotide sequences on the support, amplified target nucleic acid sequences simultaneously have complementary regions and can therefore hybridize.
  • the object of the invention is also independently achieved by a method according to the features in the characterizing part of claims 24 and 28.
  • the advantage of this is that several target nucleic acid sequences with only one primer sequence, in particular bacterial genera or species associated with periodontitis, can be amplified or identified simultaneously.
  • the process costs for the laboratory can be reduced and the feasibility of the method can be simplified, since the risk of confusion regarding different oligonucleotide primers for different target nucleic acid sequences is minimized.
  • the process can also be carried out by less experienced people.
  • the storage can be simplified and the costs for a laboratory caused thereby can be reduced by reducing the number of different reagents. Due to the greater consumption of a primer, the acquisition costs for chemicals can also be reduced and the larger sales of this primer can reduce the storage time and thus the risk of the same being unusable.
  • the further development according to claim 26 is also advantageous, because by using the gene sequences for the 16S rRNA with only one Prime ⁇ aar sequences different Bacterial species can be amplified.
  • the gene sequence for the 16S rRNA has on the one hand highly conserved consensus regions to which the oligonucleotide primers bind and on the other hand gene or species-specific regions in between.
  • the amplification of partial sequences of the genes which encode the 16S rRNA makes the use of many different oligonucleotide primer sequences and the optimization of the amplification conditions for the respective oligonucleotide primer sequence superfluous.
  • the hybridization products ie. H. the amplificate bound to the complementary oligonucleotide can generate a signal. This increases the degree of automation and thus a
  • the object of the invention is also achieved independently by an oligonucleotide primer according to the features in the characterizing part of claim 30.
  • the advantage of this is that amplification products, created by the amplification with this primer or a prime pair formed from them, hybridize to a carrier with a complementary oligonucleotide sequence for at least one positive control and / or target nucleic acid sequence and the resulting signal enables the method and / or quality to be checked identification of the types of bacteria is made possible.
  • the object of the invention is also achieved independently by an analysis kit according to the features in the characterizing part of claim 31.
  • the advantage of this is that the analysis kit contains both the device and the oligonucleotide primers for the simultaneous amplification of different types of bacteria.
  • the analysis result also contains results of the checks carried out during the analysis, so that any errors can be recognized before or with the analysis of the analytes and thus a lengthy research into the causes and, if necessary, a necessary optimization effort can be reduced.
  • the object of the invention is also independent through the use of the device solved according to the features in the characterizing part of claims 32 and 33.
  • the advantage of this is that analytes of bacterial species associated with periodontitis can be identified and thus an exact analysis of the associated germs can be achieved.
  • the object of the invention is also achieved independently by using the analysis kit according to the features in the characterizing part of claims 34 and 35. It has proven to be advantageous that a complete set for identifying various types of bacteria or different gene expression patterns is already available through the use of the analysis kit and that the components do not have to be purchased individually and coordinated with one another. A further advantage is that it can quickly detect germs associated with periodontitis, in particular periodontitis, and therefore the consequential costs of a primarily untargeted antibiotic therapy can be prevented.
  • FIG. 1 shows a device with binding partners, arranged in analysis or control areas in a schematically simplified representation.
  • This device comprises a carrier 1, preferably in the form of a plate, with a surface 2 on which a plurality of analysis areas 3 and a number of control areas 4 are arranged.
  • a carrier 1 preferably in the form of a plate
  • surface 2 on which a plurality of analysis areas 3 and a number of control areas 4 are arranged.
  • control areas 4 it is of course possible that in a minimal version only one analysis or control area 3, 4 or that an analysis area 3 and several control areas 4 or vice versa are arranged.
  • Alternative embodiments of the device are carrier 1 in a platelet-shaped configuration, with two recesses being formed on its surface, such as, for. B. Chambersli- des.
  • Another embodiment of the carrier 1 are microtitre plates according to dimensions in accordance with the recommendations of the SBS (Society of Biomolecular Screening).
  • the analysis area (s) 3 and / or the control area (s) 4 can be arranged on the surface 2 of the carrier 1 at any predetermined position.
  • a silanized glass support can preferably be used as the support 1. But it is it is also possible to form the carrier 1 from plastic, stone, metal, etc. or carriers which have been surface-treated with aldehyde, aminosilane, streptavidin, biotin, thiol, magnetic materials can also be used.
  • FIG. 1 shows only one example of the device according to the invention.
  • Other shapes such as e.g. B. a cube, a ball, or other cross-sections of the platelet-shaped formation, such as square, round, etc., can be used for the device.
  • these devices For example, possible at least approximately spherical devices with several analysis or To provide control areas 3,4 superficially, these devices subsequently being placed in a liquid sample solution to be analyzed. If necessary, these devices designed in this way can be provided with a layer of a magnetic material, so that the devices can be easily removed from the sample solution after the target nucleic acids have been bound.
  • the device is preferably in the form of a plate and the sample (s) to be examined is or are applied to this device.
  • the device with at least one cover layer on at least one of the surfaces 2 of the carrier 1 in order to protect the underlying surface 2 from unintended external influences, e.g. from scratches and thus destruction of surface areas.
  • This cover layer can also be arranged to be at least partially removable.
  • nucleic acid nucleic acid sequence and target nucleic acid sequence can be selected by a term from a group comprising nucleic acids, such as e.g. DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acids), proteins, e.g. Antibodies, epitopes, antigens, scaffold proteins, fusion proteins, in particular recombinant
  • Fusion proteins signal proteins, transmitters, enzymes, substrates, hormones, peptides, lipids, carbohydrates, such as mono-, di-, oligo- and polysaccharides, and their modified forms, etc., can optionally be replaced.
  • the term oligonucleotide can of course also be extended to include first or further binding partners, the binding partner being a molecule selected from a group comprising nucleic acids, such as eg DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acids), proteins, such as, for example, antibodies, epitopes, antigens, scaffold proteins, fusion proteins, in particular recombinant fusion proteins, signal proteins, transmitters, enzymes, substrates, hormones, peptides, lipids, carbohydrates, such as, for example, mono -, Di-, oligo- and polysaccharides, and their modified forms, etc., can represent.
  • the device according to the invention is preferably used in the analysis of analytes, in particular nucleic acids of bacterial species, in particular of those associated with periodontitis.
  • analytes in particular nucleic acids of bacterial species, in particular of those associated with periodontitis.
  • the invention also includes the amplification of the target nucleic acid sequence using a primer or Prime ⁇ aares and their hybridization to oligonucleotides in the analysis or. Control areas 3.4.
  • the device can be taken by various precautions, such as. B. Recesses in the surface can also be used directly for the amplification of nucleic acid sequences.
  • the device can, at least in some areas, include a device for increasing the temperature, e.g. comprise a heating layer, e.g. To enable temperature change programs.
  • oligonucleotides complementary to the target nucleic acid sequence and / or to the positive controls can preferably be attached to the support 1 in the analysis or control areas 3, 4 using a nanoplotter by piezoelectric contactless sample transfer.
  • other methods for oligonucleotide distribution can also be used, such as needle printers, ring and pin printers, electro addressing printers, top spoters, etc., or these can also be applied manually. Other methods are of course possible and are known to the person skilled in the art in this field.
  • the oligonucleotides can be used for the identification of different nucleic acid sequences, in particular of nucleic acid sequences of different types of bacteria. Ideally, the respective oligonucleotide sequence should contain only one bacterial species and their strains hybridize. As can be seen from WO 00/52203 A, several oligonucleotide sequences are sometimes necessary to identify individual bacterial species in order to identify the species specified in this document.
  • the invention can preferably be used for the identification of bacteria associated with periodontitis.
  • the device according to the invention preferably has several, for example 20 different, oligonucleotides therefor.
  • 3 oligonucleotides can be used to identify Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacteroides forsythus, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis), Campylobacter rec nucleatum, Peptostreptococcus micros, Po ⁇ hyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Treponema denticola and Veillonella parvula can be used.
  • oligonucleotides can also be used for the identification of different nucleic acid sequences, in particular of gene expression patterns of different organisms.
  • the oligonucleotides preferably consist of 10 to 120 nucleotides, but can also consist of 15 to 100 nucleotides, but in particular 20 to 50 nucleotides, for example 33 nucleotides.
  • the detection of short nucleic acid sequences of amplified DNA is a simple method and can therefore also be carried out on a much larger scale, e.g. to identify viral nucleic acid sequences or gene variations, etc., as described here.
  • the oligonucleotide sequences are synthesized de novo.
  • the oligonucleotides are modified at at least one end in such a way that they adhere to the support 1 in the analysis or control areas 3, 4, in particular bind chemically via this modified end.
  • the 5 'end can preferably be modified with the amino modifier C6 MMT (6- (4-monomethoxytritylamino) hexyl- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) phosphoramidite with the following structural formula.
  • C6 MMT 6- (4-monomethoxytritylamino) hexyl- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) phosphoramidite with the following structural formula.
  • NtvITN HC H2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH
  • MMT monomethoxytrityl and Pr isopropyl.
  • modifiers can also be used, e.g. Succinyl, DNP (2,4-dinitrophenyl), etc.
  • oligonucleotides In order to be able to apply the oligonucleotides to the analysis or control areas 3, 4, they are used in solution.
  • a solvent e.g. a Tris-EDTA buffer, or water can be used.
  • Other solvents that can be used are e.g. physiological sodium chloride solution (0.9% NaCl), PBS, alcohol dilutions, Tris buffer, DMSO in a concentration selected from a range with an upper limit of 30%, preferably 25%, in particular 20% and a lower limit of 1% , preferably 2%, especially 5% etc.
  • the oligonucleotides are added to the solvent in an amount such that they are present in a concentration in the range between 1 nM to 1 mM, for example 10 nM to 500 ⁇ M, preferably 100 nM to 500 ⁇ M. Concentrations in the
  • Range between 0.5 uM to 100 uM, in particular 1 uM to 50 uM proven.
  • binding partners can be presented in the same or different concentrations in the control areas 4. Binding partners can be applied, which control the orientation of the support 1, e.g. in an evaluation device, e.g. one
  • binding partners for the control areas 4 can be used, which allow an assessment of the quality of an amplification, e.g. PCR and / or hybridization of the analytes can be used.
  • a specific binding partner such as a nucleotide sequence or an antibody of a specific organism, is used to demonstrate the sample identity or type or matrix.
  • a specific variety or breed such as cattle, sheep, pigs, or birch, palm, fir, etc.
  • Identification can also be done by adding material to the sample such as. for example, nanoparticles, dyes, etc., which are differentiated at the control areas 4.
  • the identity can also result from a combination of different markers.
  • the same label is used for each analyte from the same sample. This is done either by directly marking the
  • Analytes with a substrate such as e.g. Enzyme, biotin, digoxigenin, radioactive labeling, fluorescent or chemiluminescent labels, chemical substances with a specific spectrum, e.g. Infrared, etc. or by adding a precisely defined molecule, the molecule having different characteristics for each sample of different origins and being clearly identifiable in the further analysis.
  • a substrate such as e.g. Enzyme, biotin, digoxigenin, radioactive labeling, fluorescent or chemiluminescent labels, chemical substances with a specific spectrum, e.g. Infrared, etc. or by adding a precisely defined molecule, the molecule having different characteristics for each sample of different origins and being clearly identifiable in the further analysis.
  • the infected host organism can be detected by proving the origin or the source from which viruses originate, for example. This is particularly important when identifying virus strains that affect different host organisms. By immobilizing a binding partner that makes a phylogenetic distinction, e.g. Complementary sequences to the Cytrom B gene, or by immobilizing cytochrome B corresponding antibodies, the different host organisms are detected. Both for the analysis and for the further procedure, it can be decisive from which source this virus was isolated in order to be able to take immediate measures, for example to prevent the pathogen from spreading further.
  • prions come from the nervous system of cattle or from sheep in order to be able to quarantine the affected farm from which the sick animal comes.
  • an individual-specific binding partner such as short tandem repeats (STR), variable number of tandem repeats (VNTR), single nucleotide polymorphism (SNP), etc.
  • STR short tandem repeats
  • VNTR variable number of tandem repeats
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the cross reaction can thus be detected and the two types can be distinguished from one another.
  • the same principle can also be used for antibodies which bind to two different antigens, a further antibody being present for the second antigen, from which it has been demonstrated that it is a specific binding partner only for the second type.
  • Specific binding partners for contamination can also be immobilized on the carrier.
  • a specific binding partner for, for example, highly infectious viruses By applying a specific binding partner for, for example, highly infectious viruses, the presence of these viruses in the sample, which also contains the analyte, can be detected, and medical personnel are therefore warned in good time of potential infection options after receiving the result of the analysis.
  • the immobilization of a specific binding partner for the isolation control makes it possible to determine the amount of analyte that was lost during the isolation.
  • the amount lost through the isolation work can be determined. It is important that the added substance is very similar to the analyte in its behavior in order to obtain a representative statement.
  • DNAse is free.
  • a specific binding partner is arranged on the carrier 1, which binds a normalization of the intensity of the signal, which is indicated by markings, such as by enzymatic marking, silver coloring or marking with gold particles, by fluorescence or chemiluminescent color substances, biotin, digoxigenin, radioactive labels, etc., are allowed.
  • markings such as by enzymatic marking, silver coloring or marking with gold particles, by fluorescence or chemiluminescent color substances, biotin, digoxigenin, radioactive labels, etc.
  • gold particles are applied to carrier 1 in a defined amount, which then serve as a crystallization point, analogous to the detection system, where, for example, the primer is via a biotin Streptavidin system is labeled with the gold particles. Accordingly, a defined number of binding sites for dendrimer signal amplification or for enzymatic or similarly effective catalytic signal amplification systems are applied to the carrier 1.
  • a specific binding partner for the hybridization control which is added, for example, only after the isolation or amplification of the analyte from the sample, is immobilized either parallel to each specific binding partner.
  • a hybridization control can also be available in which the specific binding partner for the analyte and the specific binding partner for the hybridization probe are coupled and are therefore present in the same amounts, the problem of the different ratio of the specific binding partner to the analyte and of the specific one Binding partner to the hybridization probe, if these are available separately, is eliminated.
  • a label e.g. a fluorescent or chemiluminescent label is covalently bound.
  • the first determination of the print quality takes place after the immobilization of the specific binding partners on the support 1 and after the hybridization an evaluation is carried out again using the hybridization probe. This procedure enables a separation into control for the printing process and into the control for hybridization.
  • Another embodiment variant marks the specific binding partner with three different markings, e.g. Fluorescence or chemiluminescence markings that result in different signals during detection.
  • one label is the control for the immobilization of the specific binding partner
  • the other label is a control for the hybridization
  • the third label is a control for the detection of the binding of the specific binding partner to the analyte.
  • Control areas 4 make it possible to compare results that were made on different devices or at different times even when the device has aged in the meantime (for example, the life of a PMT or CCD chip is limited). It can also Results are compared that are made with different parameter settings, such as voltage for the PMT, measurement time for the CCD chip, etc.
  • control areas 4 can also be applied so that the measuring function can be determined. This determines the sensitivity, sensitivity, detection limit, linearity or the dynamic range of the measurement function; this enables comparability between different device types.
  • These control areas 4 should of course be used for the markings used in each case. When using substances with a broader spectrum (wavelengths), the quality of the filters and other optical properties can also be compared.
  • the oligonucleotides for the orientation control can be present in concentrations in the range from 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, in particular in the range from 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably in a concentration of 10 ⁇ M.
  • the oligonucleotides for the amplification control can be in a concentration in the range between 0.1 nM to 0.5 mM, for example 1 nM to
  • the oligonucleotides for the hybridization control can be present in concentrations in the range between 0.1 nM to 500 ⁇ M, for example in the concentration range from 1 nM to 100 ⁇ M, in particular from 10 nM to 50 ⁇ M. Concentrations in the range between 25 nM to 25 ⁇ M, in particular 40 nM to 10 ⁇ M, have also proven to be advantageous.
  • oligonucleotides other than those specified above can be used for the control areas 4, e.g. Oligonucleotides as a positive control with a sequence complementary to the oligonucleotide primer sequence which is used for the amplification of the target nucleic acid sequence or oligonucleotides as a negative control with a sequence of other organisms which do not have the gene for coding the 16S rRNA.
  • the oligonucleotides can be present in the control areas 4 in dilution series, one concentration per control area 4 being used in each case.
  • the highest concentration of the oligonucleotides can be 500 ⁇ M, for example 250 ⁇ M, in particular 100 ⁇ M and preferably 10 ⁇ M.
  • a dilution series can comprise 2 to 24 concentrations, for example 3 to 20 concentrations, in particular 4 to 18 concentrations. 5 to 15, in particular 6 to, have also proven advantageous
  • the statements relating to the oligonucleotides for the control areas 4 can of course be appropriately transferred to the oligonucleotides for the analysis areas 3, so that only the corresponding concentrations or concentration ranges are given here.
  • the concentration of the oligonucleotides in the analysis areas 3 are in the range from 100 nM to 1 mM, for example from 1 ⁇ M to 500 ⁇ M, in particular from 10 ⁇ M to 100 ⁇ M and preferably from 25 ⁇ M to 45 ⁇ M.
  • the oligonucleotides are preferably selected in volumes from a range with a lower limit of 1 pl, in particular 10 pl, preferably 200 pl and with an upper limit of 5 ⁇ l, in particular 1 ⁇ l, preferably 0.3 ⁇ l, per analysis region 3 and / or Control area 4 applied.
  • the arrangement of the oligonucleotides on the carrier 1 can be predefined.
  • Each oligonucleotide can have an area of 50 to 500 ⁇ m in diameter, in particular from 200 to 250 ⁇ m.
  • the surface 2 of the device used for the analysis which e.g. B. can be designed as a slide for microscopy, an area of 0.1 cm 2 to 50
  • oligonucleotides with a low density enables simple hybridization conditions, such as. B. small temperature fluctuations, homogeneous buffer distribution, etc. and uncomplicated evaluation methods, because an overlap of signals is not normally expected.
  • the oligonucleotides consist of sequences which are complementary to certain partial sequences of the target sequence and / or are complementary to at least one positive control.
  • the oligonucleotide for the hybridization control serves as proof of quality for the hybridization.
  • a partial sequence of the bacteriophage genome is inserted as a linker sequence at the 3'-end and the 5'-end is modified with the amino modifier C6 MMT mentioned.
  • Any chemical compound which creates the necessary spatial distance and thus avoids any steric hindrances which may occur can also be used as a linker sequence.
  • the oligonucleotide for the orientation control can be used to determine or determine the orientation of the carrier 1 during the manufacture of the device or in later analysis steps. Furthermore, the orientation control for determining or setting the limits of the field to be evaluated, in particular defined by the analysis and control areas 3, 4, can be used on the carrier 1 and for checking the localization of the reading field. It can preferably be sequence-identical to the oligonucleotide of the hybridization control and additionally bears, for example, a label at the 3 'end, for example digoxigenin, biotin, radioactive labels, such as, for. B. 33 P, or fluorescent dyes to deliver a well evaluable signal even without hybridization.
  • the orientation control is preferably arranged in two control areas 4, which can be arranged at certain predefined locations on the support 1, for example during the application of these oligonucleotides.
  • the oligonucleotides for the control areas 4 and for the analysis areas 3 can be arranged in several areas of the device, for example in at least 2 areas, but also in 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 areas.
  • Oligonucleotides such as e.g. B. the orientation control and / or the PCR control and / or orientation control in the same analysis or control area 3.4, as the target nucleic acid sequence are present and by their different labeling such. B. different dye derivatives can be distinguished during the detection.
  • the oligonucleotides are hybridized with nucleic acid sequences of the target sequence and subsequently generate a signal. Since an oligonucleotide sequence is preferably arranged in several regions on the device, only those hybridized oligonucleotides for which more than one signal can be observed are preferably and positively evaluated, as a result of which the safety and the reproducibility of the result can be improved.
  • the negative control is a control area 4 on the surface 2 of the support 1, to which no oligonucleotide is bound. This makes it possible to detect non-specific adhesions of various nucleic acid sequences.
  • the oligonucleotides of the analysis areas 3 and / or control areas 4 are mixed with the hybridization control in a certain ratio before application to the support 1.
  • the ratio of the oligonucleotides to the hybridization control can be in a ratio of 1: 1 to 1: 100.
  • the mixing ratio of 1:10 has proven to be advantageous.
  • the hybridization control serves as a control of the hybridization that has taken place for each individual analysis and / or control area 4. False negative results can be excluded by means of the hybridization control.
  • the target nucleic acid sequence can be labeled with a different dye derivative than the hybridization probe sequence, and therefore the signal of the target nucleic acid sequence can be evaluated from the signal of the hybridization probe by z. B.
  • the hybridization probe is a nucleic acid sequence complementary to the hybridization control and can be labeled, for example, with various dye derivatives such as, for example, Cyl, Cy 2, Cy 3, Cy 4 and / or Cy 5. It is also advantageous that if there is no hybridization with a complementary target nucleic acid sequence, a signal, namely that of the hybridization probe, can be detected, whereby it can be ascertained that the missing signal has not occurred due to an analysis method error.
  • the unbound oligonucleotides are removed from the support 1.
  • the unbound Oligonucleotides can be removed by washing the carrier 1 in an SDS solution with a concentration in the range from 0.01% to 2%, in particular in the range from 0.1% to 1%, preferably in a concentration of 0.2% ,
  • the detergent remaining on the surface 2 of the carrier 1 is washed with a washing liquid, such as. B. water, PBS, TE, etc. removed.
  • the carrier 1 is dried with air and in a liquid such as.
  • Hydrogen-releasing reagents such as LiAlH 4 , Na BtLj, etc. are added to the solution in an amount of 0.001 g to 0.5 g, in particular 0.01 g to 0.25 g, preferably 0.01 g to 0.1 g Volume of 500 ml, preferably 100 ml, in particular 50 ml, added.
  • a volume of 40 ml, in particular 30 ml, has proven to be advantageous.
  • the different washing steps take place at a temperature in a range from 0 ° C. to 100 ° C., in particular from 10 ° C. to 98 ° C., preferably from 20 ° C. to 95 ° C.
  • DNA sequences of possible oligonucleotides of the target nucleic acid sequences or the positive controls from 5 'to 3' are listed:
  • Target organism Actinobacillus actinomycetemcomitans
  • Target organism Actinomyces odontolyticus
  • Target organism Actinomyces viscosus
  • Target organism Bacteroides forsythus
  • Target organism Campylobacter concisus
  • Target organism Capnocytophaga gingivalis
  • Target organism Eubacterium nodatum
  • Target organism Fusobacterium nucleatum
  • Target organism Peptostreptococcus micros
  • Target organism Porphyromonas gingivalis
  • Target organism Prevotella intermedia
  • Target organism Streptococcus constellatus
  • Target organism Streptococcus gordonii
  • Target organism Streptococcus mitis
  • Target organism Treponema denticola
  • Target organism Veillonella parvula
  • single-stranded nucleic acids can be used which are either obtained from double-stranded nucleic acid sequences by denaturation or which have already been produced from single-stranded nucleic acid sequences, advantageously by amplification with a primer gradient.
  • the primer gradient can represent a ratio of the forward primer to the reverse primer of 1: 100, preferably 1:50, in particular 1:10, and leads to an asymmetrical PCR. If only one primer is present during the amplification of the target nucleic acid sequence, single-stranded DNA molecules are produced, which are then available for hybridization on the DNA chip.
  • the target nucleic acid sequence is DNA or RNA isolated from a biological sample, such as. B. bacterial cells, viruses or eukaryotic cells. Tissue samples (blood cells, biopsies, etc.) and liquid samples (blood, saliva, urine, pleural or peritoneal fluid, etc.) can be used. All methods available can be used to isolate the nucleic acid. It is often desirable to amplify the target nucleic acid sequence before hybridization.
  • special new oligonucleotide primers of at least 15 base pairs in length, which are characterized in that they have newly defined consensus sequences for the 16S rRNA, were used for the analysis or identification of the above-mentioned types of bacteria
  • the DNA sequences of these primers comprise at least 15 nucleotides of the sequences listed below from 5 'to 3'.
  • the sequences of the primers and oligonucleotides which are mentioned here are given in the standard IUB / IUPC nucleic acid code.
  • the reverse primer listed above contains the symbol Y.
  • Y stands for C and T.
  • Y indicates nucleotide permutations in "wobble" regions of the sequences.
  • the reverse primer is therefore used as a degenerate primer set with C and T as suitable nucleotides for the Inko ⁇ oration provided in the Woobleregions.
  • the primers are marked for signal detection.
  • markings can e.g. B. digoxigenin, biotin, radioactive labels such as 33 P, fluorescent dyes such as Cy 1, Cy 2, Cy 3, Cy 4, and / or Cy 5, etc. or a combination thereof. Any other marking system can also be used. Of course, this also applies to all the markings mentioned in this description.
  • the nucleotides used for the amplification can already be marked.
  • the oligonucleotides on the support 1 can also be labeled with digoxigenin, biotin, radioactive labels, such as P, fluorescent dyes, etc.
  • the marked reverse primer is therefore a component of each double-stranded amplicon, as well as the single-stranded amplicon produced by the asymmetric PCR.
  • primers can be used to amplify both gram-negative and gram-positive bacteria nucleotide sequences.
  • the amplified nucleic acid sequences can be used directly for the hybridization, which means that purification steps can be saved.
  • the oligonucleotides on the support 1 form stable hybrid duplex with complementary base pairing with the, in particular amplified, target sequence.
  • the carrier 1 can be selected over a period of time from a range with a lower limit of 1 minute, in particular 2 minutes and an upper limit of 30 minutes, in particular 20 minutes, preferably 5 Minutes, at a temperature selected from a range with a lower limit of 20 ° C, in particular 30 ° C, and an upper limit of 95 ° C, in particular 75 ° C, preferably at 60 ° C.
  • the labeled amplification products can be in different
  • Volumes selected from a range with a lower limit of 0.5 ⁇ l, in particular 1 ⁇ l, and an upper limit of 20 ⁇ l, in particular 15 ⁇ l, preferably in a volume of 5 ⁇ l for hybridization in a solution consisting of sodium citrate and / or NaCl can be used.
  • the applied to the carrier 1 solution with the amplificates can, for. B. with wax, oil, glass plates, etc., are layered over to ensure uniform conditions, such as maintaining a constant temperature and / or a constant air humidity.
  • the incubation can take place at temperatures in a range from 20 ° C. to 75 ° C., in particular from 30 ° C. to 70 ° C., and preferably at 50 ° C. to 60 ° C.
  • nucleic acid sequences which do not form a hybrid duplex are washed away under stringent conditions and the hybridized nucleic acid sequences which are analyzed remain on the support 1.
  • Nucleic acids are denatured by increasing the temperature or lowering the salt concentration of the buffer. Under low stringent conditions, such as low temperature and high salt concentration, duplexes even form which do not have an exactly complementary sequence. This reduces the specificity of hybridization under low stringent conditions. Under highly stringent conditions such as high temperature and low salt concentration in the buffer, the specificity of the hybridization is increased.
  • the unbound target sequences can be removed with a solution consisting of sodium citrate and / or NaCl in a first step at temperatures from 40 ° C. to 75 ° C., in particular from 45 ° C. to 70 ° C. and preferably at 50 ° C. to 60 ° ° C. In a further step, the same solution is used at temperatures to select from a range with a lower limit of 4 ° C., in particular 8 ° C., and an upper limit of 30 ° C., in particular 20
  • the hybridized nucleic acid sequences can be detected by means of the label which is introduced into the target nucleic acid sequences and or into the oligonucleotides.
  • the markers are preferably already incorporated into the target sequence during the amplification. It can e.g. B. during the PCR labeled primers or labeled nucleotides can be used. Alternatively, the marker can also be attached directly to the target sequence or after amplification, e.g. B. by nick translation or end marking, such as. B. Kinination of the nucleic acid sequence and subsequent ligation of a linker that connects the nucleic acid sequence with the marker.
  • Markings can be detected using spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical, chemical or the like methods.
  • the evaluation of the carrier 1 can take place, for example, by measuring the intensity of a certain light wavelength after excitation of a fluorescent molecule with at least approximately, preferably by means of a laser, generated monochromatic light.
  • the location data (coordinates), such as the location and the limits of the reading field, can also be coordinated with the measured intensities depending on the wavelength by means of the oligonucleotides for the orientation control on the read-in carrier 1.
  • the reader used is equipped with two different lasers. The lasers and photomultipliers are matched for the dye derivatives Cy3 and Cy5 used. Operation and software acquisition is part of the device operation.
  • the result of the hybridization is obtained by querying the light intensities measured with the reader in the
  • optical, electrical, electrochemical, magnetic, photochemical, photoelectric or enzymatic detection and measurement methods can also be used. These methods can of course also be combined with one another.
  • unlabeled binding partners or analytes can also be detected using surface plasmon resonance technology.
  • the production of a device according to the invention in the form of a DNA chip is described below.
  • the preparation of the DNA chip blank of the carrier 1 takes place at room temperature. All oligonucleotides to be applied are provided in a master plate in 150 ⁇ l portions for the nanoplotter. At the same time, this mast plate serves for storage. All DNA oligonucleotides are dissolved in 10% DMSO. 350 pl per oligonucleotide are applied per spot (location of the probe placement on the DNA chip). The resulting spot forms a circular area with a diameter of 300 ⁇ m and contains about 10 fmol oligonucleotide for the analysis areas 3 and 1 fmol oligonucleotide for the control areas 4.
  • the orientation control is carried out in a concentration of 100 ⁇ M, the hybridization control in a concentration of 0. 8 ⁇ M to 80 ⁇ M and the PCR control applied in a concentration of 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • the oligonucleotides are applied complementarily to the target sequences in the concentration of 100 ⁇ M of the corresponding oligonucleotide and 0.5 ⁇ M of the hybridization control. Excess oligonucleotides are washed off the DNA chip by washing for 5 minutes followed by a short swivel) in 0.1% SDS at 60 ° C. Immediately afterwards, the DNA chip is immersed in 94 ° C. warm H 2 O for 5 minutes.
  • the DNA chip After removing any water drops with an air spray, the DNA chip is completely dried at room temperature. A five-minute immersion bath in 0.01 g NaBH 4 per 40 ml PBS and 20 ml ethanol completes the process of covalently binding the oligonucleotides to the chip and deactivates unused reactive groups. Before storage, the DNA chip is immersed again in warm H 2 0 for 10 seconds and dried with compressed air. Storage is protected from light at 4 ° C.
  • the oligonucleotides for the positive control for determining the orientation of the support 1 can, for example, at the points of intersection of the first column with the first and last
  • the oligonucleotides for positive controls for hybridization can, for example, be arranged in decreasing concentration in the first column at the intersection with the second row starting from the penultimate row.
  • the oligonucleotides for the positive control for determining the quality of the PCR can, for example, in increasing concentration on
  • the negative control can be arranged, for example, beginning at the intersection of the last row with the second column up to the last column.
  • the oligonucleotides complementary to the target sequence are arranged alternately in every second analysis area 3, for example.
  • the analysis areas 3 extend, for example, from
  • oligonucleotides of the same nucleotide sequence which are complementary to the target sequence, occur with up to three repetitions in different analysis areas 3.
  • Total DNA is isolated from clinical samples. This is done using commercially available kits (e.g. QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the amplification of the target nucleic acid sequences can be carried out as described below as an implementation example. 1/10 to 1/1000 of the totally prepared DNA are amplified. For this, 2 ul 10-fold PCR buffer (100 mM Tris-HCl; pH 8.3; 500mM KC1;
  • the amplification takes place in a thermal cycler from Perkin Elmer (Gene Amp PCR System 9700). 0.2 ml MicroAmp ® reaction tubes are used.
  • the temperature steps required for the amplification proceed as follows. The first step is a 5 minute denaturation phase at 94 ° C, followed by 30 cycles with 40 seconds at 94 ° C, 60 seconds at 62 ° C and 40 seconds at 72 ° C. The cycles are followed by an extension phase of 5 minutes at 72 ° C.
  • An amplification product of approximately 300 base pairs is formed, depending on the sequence of the particular type of bacteria amplified.
  • the description of the amplification is not to be seen as restrictive, and alternative amplification conditions can of course also be selected.
  • the amplificate is used directly for hybridization or previously cleaned using commercially available kits (e.g. QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the DNA chip for the hybridization is pretreated as follows. A pre-incubation takes place for 10 minutes at 80 ° C and saturated air humidity. During this time, 10 ⁇ l of the hybridization solution (1 ⁇ SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate, pH 7) and 10 fmol / ⁇ l hybridization probe) are mixed with 10 ⁇ l PCR amplificate in a DNAse-free reaction vessel at room temperature. After the pre-incubation period, the hybridization mixture is pipetted into the hybridization area on the chip and immediately covered with a cover slip. Hybridization takes place during a 20 minute incubation at 50 ° C and saturated air humidity. detection
  • the cover slip is removed and the DNA chip is immediately immersed in a washing solution (1 ⁇ SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate, pH 7). After briefly swirling, the incubation is carried out at 40 ° C. for 2 minutes Any liquid residues are removed from the chip surface 2 with compressed air.
  • the dry DNA chip can be stored protected from light at room temperature for a few days until evaluation with the reader.
  • the DNA chip is inserted into the scanner (Genepix 4000A from Axon Instrument) and measured by excitation of the Cy3 and Cy5 dye molecules with monochromatic light.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von zumindest einem Analyten aus einer Probe, umfassend einen Träger (1) mit einer Oberfläche (2), auf welcher zumindest ein vordefinierbarer Analysebereich (3) und zumindest ein vordefinierbarer Kontrollbereich (4) angeordnet sind, wobei in dem vordefinierten Analysebereich (3) zumindest ein erster Bindungspartner immobilisiert ist, der spezifisch an zumindest einen Analyten bindet. In dem zumindest einen Kontrollbereich (4) ist zumindest ein weiterer Bindungspartner für zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Qualität der Analyse angeordnet.

Description

Vorrichtung zur Analyse von Nukleinsäure
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von zumindest einer Nukleinsäurese- quenz, ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, ein Verfahren zur Iden- tifikation von Nukleinsäuresequenzen, einen Oligonukleotidprimer und einen Analysekit entsprechend den Merkmalen in den Oberbegriffen der Ansprüche 1, 24, 28, 30 und 31 sowie die Verwendung der Vorrichtung bzw. des Analysekits entsprechend den Ansprüchen 32 bis 35.
Eine Vielzahl von Krankheiten wird durch bakterielle Infektionen verursacht, so unter ande- rem auch Parodontitis, insbesondere Periodontitis, eine entzündliche, durch bakterielle Beläge verursachte, Erkrankung aller Anteile des Parodontiums mit fortschreitendem Verlust von Stützgewebe. Parodontitis ist ein häufiges Problem, daß einen großen Prozentsatz der Bevölkerung betrifft. Durch den Einsatz von Antibiotika ist die Erkrankung in der Regel gut thera- pierbar. Allerdings führt gerade in letzter Zeit die häufige und teilweise ungezielte Verwen- düng von Antibiotika zur Behandlung diverser Erkrankungen zu einer Zunahme von Resistenzbildungen vieler Bakterien. Weiters erfordert ein verzögerter bakteriologischer Befund zunächst eine Breitspektrum-antibiotische Therapie, die für den Patienten mehr Nebenwirkungen bedeutet und teuerer ist. Außerdem können über den Umweg einer unspezifϊschen antibiotischen Therapie weitere therapeutische Maßnahmen erforderlich werden was demzu- folge eine verringerte Effektivität, einen protrahierten Krankheits verlauf und eine ineffiziente
Ausnützung der ohnehin im Gesundheitssystem begrenzt zur Verfügung stehenden Ressourcen bedeutet. Aus diesen Gründen ist der richtige bakteriologische Befund für die zielführende Therapie maßgebend. Die Identifikation der pathogenen Bakteriengattung bzw. -art führt sowohl zur Optimierung der Diagnose als auch zum gezielten Einsatz des entsprechen- den Antibiotikums. Auch der Zeitfaktor in der Diagnoseerstellung spielt für den Krankheitsverlauf eine wichtige Rolle. Aufwendige diagnostische Tests, die nur in speziell ausgestatteten Labors durchgeführt werden können, und eine langsame und ungenaue Diagnoseerstellung führen einerseits durch den Aufwand von hochqualifiziertem Personal für das Labor zu hohen Kosten andererseits durch die ungezielte Therapie der Erkrankung zu volkswirtschaftlichem Schaden. Es wird daher versucht die Methoden zur Identifikation von Bakteriengattungen und
-arten so einfach und so rasch wie möglich zu gestalten und trotzdem die Korrektheit der Ergebnisse zu gewährleisten. Undeutliche und somit nicht aussagekräftige Analyseergebnisse erfordern schlimmstenfalls die Wiederholung der Probenentnahme einschließlich deren erneute Analyse und steigern somit die Kosten und den Zeitaufwand. Um diese Vorkommnisse zu vermeiden, wurden im Stand der Technik bislang verschiedenste Lösungen vorgeschlagen. So dienen z. B. mikroskopische Untersuchungen zur schnellen Analyse. Sie lassen eine Beurteilung nach moφhologischen Merkmalen wie Form, Größe, Pseudozellverbänden, Färbeverhalten, Vorhandensein von Flagellen bzw. einer Kapsel und Sporenbildung zu. Eine Anwendung zur Beurteilung moφhologi scher Merkmale besteht darin, daß, wie beispielsweise in der WO 93/25903 A aufgezeigt, moφhologische Veränderungen von polymoφhonuklären
Leukozyten von Zahnpatienten nach Inkubation mit Porphyromonas gingivalis mit polymor- phonuklären Leukozyten von gesunden Personen verglichen und analysiert werden. Diesen Untersuchungsmethoden haftet jedoch der Nachteil an, daß Bakterienarten mit ähnlichen moφhologischen Merkmalen nur ungefähr klassifiziert werden können. Die Zuordnung der Bakterien mit ähnlichen moφhologischen Merkmalen hängt auch vom jeweiligen Laboranten ab und dadurch wird nur eine sehr ungenaue Analyse der Bakterienarten ermöglicht.
Mikrobiologische Untersuchungen ermöglichen durch den Nachweis physiologischer Merkmale mit Indikatormedien, die z. B. eine Änderung des pH- Werts anzeigen, eine genaue Be- Stimmung der Bakteriengattung bzw. -art. Der Nachteil, der in mikrobiologischen Analysesystemen zu sehen ist, ist daß nur Lebendkeime nachzuweisen sind, was eine sorgfältige Probenentnahme und einen entsprechenden Probentransport erfordert, und weiters, daß die Analyse mehrere Tage bis Wochen dauert.
Serologische Untersuchungen können Proteinbestandteile von Bakterien, welche mit Antikörpern reagieren, nachweisen. Die Verwendung von monoklonalen Antiköφern ermöglicht den Nachweis von einzelnen Bakteriengattungen und -arten. Antiköφer gekoppelte Enzym-Reaktionen ermöglichen die Detektion. Ein derartiges Identifikationssystem besteht darin, daß, wie beispielsweise in der US 4,741,999 A aufgezeigt, die Verwendung von monoklonalen Anti- köφern zur Detektion und Konzentrationsbestimmung bestimmter Mikroorganismen betreffend die Etiologie von humanen periodontalen Erkrankungen dient. Im speziellen wird ein monoklonaler Antiköφer spezifisch zu einem Antigen von Actinobacillus actinomycetemco- mitans beschrieben. Actinobacillus actinomycetemcomitans kommt meist bei juveniler Parodontitis vor. Den serologischen Systemen haftet jedoch der Nachteil an, daß mit monoklo- nalen Antiköφern nur einige wenige Epitope eines Antigens nachgewiesen werden können.
Die Anzahl der verfügbaren Antiköφer ist daher auf bestimmte Bakterienarten beschränkt.
Um diesen Nachteil auszuräumen wurden im Stand der Technik verschiedenste Systeme vorgeschlagen. Nukleinsäureuntersuchungen sind die modernsten und sichersten Methoden um spezies-spezifische Bakterien DNA Moleküle zu analysieren. Man unterscheidet zwischen Nachweismethoden direkt aus dem Untersuchungsmaterial und Methoden mit vorheriger Amplifikation. Die dazwischengeschaltete Amplifikation erhöht die Sensitivität der Methode und ermöglicht auch den Nachweis von geringen Bakterien DNA Mengen unabhängig von deren Vitalität.
So ist zum Beispiel in der WO 00/52203 A eine Methode zur Identifikation von Bakterien beschrieben, welche die Amplifikation eines Teils der 23S-rDNA unter Verwendung des Primers 5' GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3' und des Primers 5'-TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3' beschreibt. Das Amplifikat wird mit verschiedenen Oligonukleotiden auf einer Nylonmembran hybridisiert. Diese Methode erlaubt die Identifikation von mindestens 8 Bakterienarten in einem Test, wobei die Bakterien aus einer Gruppe ausgewählt sind, die Bakterien wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterokokkus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Pneumococci und Koagulase negative Staphylokokken umfassen. Diesem System haftet jedoch der Nachteil an, daß die 23S-rDNA variabel ist und zur Identifizierung der Bakteriengattungen und -arten daher in wenigen Konsensusbereichen geeignete Primär Sequenzen für die zu analysierenden Bakteriengattungen und -arten gefunden werden müssen. Dies schränkt wiederum die Anzahl der analysierbaren Bakterienarten ein.
Um diesen Nachteil auszuräumen, wird im Stand der Technik folgendes System vorgeschlagen. So ist z. B. aus der DE 199 44 168 AI eine Methode bekannt, welche ein Verfahren zum Genus-spezifischen Nachweis und der Speziesidentifizierung von Bakterien der Gattungen Helicobacter und Wolinella, welches auf Vermehrung eines speziellen Genfragmentes der für die Kodierung der 16S-rRNA und dessen weiterer Analyse basiert, beschreibt. Indem spezi- eile neue Oligonukleotidprimer von etwa 18 Basenpaaren Länge für das Verfahren verwendet werden, welche dadurch charakterisiert sind, daß sie in zwei neu beschriebenen Konsensussequenzen für das 16S-rRNA Gen hybridisieren, entstehen Amplifikationsprodukte nur dann, wenn Bakterien der Gattungen Helicobacter oder Wolinella in der Probe enthalten sind. Im Falle eines positiven Nachweises wird das resultierende Amplifikationsprodukt durch DNA- Sequenzierung analysiert. Durch Sequenzvergleich erfolgt die Identifizierung der vorliegenden Spezies. Alternativ kann für die Speziesidentifikation eine Restriktionsanalyse des Am- plifikationsproduktes im Sinne eines RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymoφhismus) verwendet werden. Aus dem Bandenmuster wird auf vorliegende Spezies geschlossen. Der Nachteil der in diesem System zu sehen ist, liegt vor allem darin, daß die direkte Sequenzie- rung lange dauert und teuer ist und mit RFLP zwar Sequenzvariationen identifiziert werden können aber nicht viele Bakterienarten unterschieden werden können. Ein weiterer Nachteil ist, daß die Oligonukleotidprimer nur komplementäre Sequenzen in den Gattungen Helicobacter und Wolinella finden, und daher nur diese beiden Gattungen nachweisen und analysieren können.
Ein weiterer Nachteil, der in all diesen Systemen zu sehen ist, liegt vor allem darin, daß Kontrollen zum Qualitätsnachweis der verschiedenen Analysen fehlen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit zur reproduzierbaren, schnellen und einfachen Analyse von Nukleinsäuresequenzen anzugeben. Es ist weiters eine Teilaufgabe der
Erfindung die Identifikation von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten zu ermöglichen.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch die Vorrichtung entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 1 gelöst. Der Vorteil dieser Vorrichtung liegt darin, daß für die Analyse verschiedener Analyten Kontrollsysteme auf der Vorrichtung vorhanden sind, welche dieselben Verfahrensschritte wie die spezifischen Bindungspartner für den Analyten durchlaufen und damit dem Anwender ohne zusätzlichen Zeitaufwand eine Möglichkeit zur Verfügung steht, die Qualität des Analyseergebnisses über diese Kontrollsysteme zu beurteilen bzw. zu verbessern. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die einzelnen Verfah- rensschritte zur Analyse von mehreren Personen, womöglich an verschiedenen Orten durchgeführt werden und diese nicht miteinander kommunizieren. Unklare Ergebnisse können dadurch auf mögliche Fehlerquellen zurückverfolgt werden. Ein weiterer Vorteil ist, daß die Verfahrenskosten unter Anwendung der Vorrichtung im Vergleich zu Verfahren ohne Kontrollen kaum bis nicht erhöht sind. Es ist weiters von Vorteil, daß für den Fall, daß die Vor- richtung für Nachkontrollen oder spätere Auswertungen archiviert wird, die speziesspezifischen, amplifizierten und hybridisierten Analyten zusammen mit den Qualitätskontrollen archiviert werden können, so daß jederzeit der Verfahrensablauf nachkontrollierbar ist und die Auswertung mit gleichbleibender Qualität wiederholt werden kann.
Vorteilhaft erweist sich weiters eine Weiterbildung nach Anspruch 2, wonach durch die Möglichkeit die Bindungspartner auf verschiedenen Trägern zu immobilisieren die Anschaffung von Bearbeitungs- und Auswertungsgeräten für nur eine Art von Träger obsolet wird und somit die Kosten für die Analyse deutlich reduziert werden, weil sowohl bereits bestehende Bearbeitungs- und Analysegeräte genützt werden können als auch bei einer Anschaffung neuer Geräte diese multipel einsetzbar sind. Dabei erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 3 als vorteilhaft, weil mit der gleichen Vorrichtung eine große Anzahl von unterschiedlichen Analyten nachgewiesen werden kann ohne die Vorrichtung anpassen zu müssen. Weiters ist von Vorteil, daß durch die Vielfältigkeit der Vorrichtung keine spezielle Einschulung des durchzuführenden Personals für die ver- schiedenen Analyten erforderlich ist und somit eine Vielzahl von Analyten von nur einer Person ausgewertet werden kann. Als vorteilhaft erweist sich weiters, daß mehrere Analyten auf einer Vorrichtung gleichzeitig ausgewertet werden können.
Von Vorteil ist dabei die Weiterbildung nach Anspruch 4, womit eine Kontrollmöglichkeit für die Ausrichtung der Vorrichtung sowohl während der Auswertung als auch nach der Auswertung gegeben ist. Die falsche Orientierung des Trägers kann bereits vom Auswertegerät erkannt werden. Die Auswertung kann sofort abgebrochen werden und somit können die Kosten für diesen und oder nachfolgende Verfahrensschritte eingespart werden.
Gemäß der Ausbildung nach Anspruch 5 erweist sich von Vorteil, daß die spezifische Bindung des zumindest ersten und/oder weiteren Bindungspartners an den Analyten, der die Probe unterzogen wird, nachprüfbar und nachvollziehbar ist.
Vorteilhaft erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 6, wonach durch den gezielten Nachweis eines Fehlers in der Amplifikation des Analyten eine aufwendige Fehlersuche nach
Vorliegen des Analyseergebnisses auf den Amplifikationsschritt beschränkt werden kann und nicht die gesamte Analyse auf die Fehlerquelle durchsucht werden muß.
Von Vorteil zeigt sich auch die Ausgestaltung nach Anspruch 7, weil Verwechslungen von zu analysierenden Proben, welche vor Beginn der Analyse stattgefunden haben, rasch nachgewiesen werden können. Des weiteren erweist sich von Vorteil, daß die Quelle, aus welcher der zumindest eine Analyt stammt, bestimmt werden kann, und somit auch nach der Analyse noch eine Zuordnung der Probe durchgeführt werden kann.
Die Weiterbildung nach Anspruch 8 erweist sich als vorteilhaft, wobei durch eine Anbindung eines zumindest weiteren spezifischen Bindungspartners an den zu analysierenden als auch an einen weiteren Bindungspartner der zu identifizierende Analyt nachweisbar ist, wenn für den weiteren Analyten noch ein zusätzlicher weiterer spezifischer Bindungspartner vorhanden ist. Aus der Differenz der detektierbaren Signale resultiert das Signal des zu analysierenden Analyten. Von Vorteil ist auch eine Weiterbildung nach Anspruch 9, wobei die Anbindung des gleichen spezifischen Bindungspartners an zwei verschiedene Analyten, die eine sehr ähnliche Struktur aufweisen, nachgewiesen werden kann. Durch die Verwendung eines weiteren nur für den einen Analyten spezifischen Bindungspartner kann die Präsenz eines weiteren ebenfalls an den gleichen Bindungspartner bindenden aber unerwünschten Analyten identifiziert werden. Weiters erweist sich von Vorteil, wonach der Nachweis einer Kontamination der Probe mit z.B. infektiösen Material ermöglicht wird. Das analysierende bzw. medizinische Personal kann frühzeitig informiert und gewarnt werden und somit das Infektionsrisiko und die eventuell daraus resultierenden Folgekosten minimiert werden.
Vorteilhaft ist auch eine Ausgestaltung nach Anspruch 10, wonach zumindest eine semiquantitative Bestimmung des Analyten in der Ursprungsprobe ermöglicht wird, weil durch die Zugabe einer genau definierten Menge eines Stoffes mit ähnlichem Verhalten wie der Analyt die Quantität und auch Qualität der Isolierung bestimmt werden kann.
Von Vorteil zeigen sich auch die Weiterbildung nach den Ansprüchen 11 und 14, wobei die Intensität des Signals mit einem Standard verglichen werden kann und somit eine Abglei- chung erfolgen und eine Relativierung und Normierung des Ergebnisses durchgeführt werden kann.
Gemäß Anspruch 12 kann das Aufbringen des spezifischen Bindungspartners auf den Träger unmittelbar nach diesem Schritt aber noch vor Beginn der Analyse durchgeführt werden, wonach durch die Verwendung nur einwandfreier Träger die Qualität der Analyse auf einem hohen Niveau sichergestellt werden kann und somit unnötige Kosten durch die Verwendung von fehlerhaften Vorrichtungen vermieden werden.
Vorteilhaft erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 13, wonach eine gleichmäßige Intensität der Signale bei der Auswertung der Analyse gewährleistet werden kann und somit Ergebnisse aufgrund unterschiedlicher Intensitäten der Signale das Ergebnis nicht verfäl- sehen.
Gemäß Anspruch 15 kann die Oberfläche der Vorrichtung auf unspezifische Anlagerungen von Analyten übeφriift und somit ein Signal, welches durch eine unspezifische Bindung eines Analyten entsteht, und zu einem falschen Ergebnis betreffend die Identifikation des Analyten führen würde, erkannt werden. Von Vorteil sind auch die Weiterbildungen der Vorrichtung nach den Ansprüchen 16 bzw. 17, womit die Intensität der durch die Auswertung entstandenen Signale in diversen Abstufungen vorliegt, da eine zu hohe Konzentrationen der Positivkontrollen eine Überlagerung der Signale verursachen würde, wodurch die Klarheit der Analyseergebnisse gefährdet ist. Damit kann die Vorrichtung unabhängig von einer zu erwartenden Konzentration des Analyten universell angewandt werden. Weiters ist von Vorteil, daß die unterschiedlichen Konzentrationen der Bindungspartner eine Quantifizierung der Analyten, wie z. B. von Genexpressionen, ermöglichen.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausgestaltung nach Anspruch 18, wonach durch die Anordnung identischer Bindungspartner auf dem Träger in mehreren Analyse- und/oder Kontrollbereichen die Analyse mit größerer Sicherheit erfolgen kann. Zweifelhafte Ergebnisse in einem bestimmten Analyse- und/oder Kontrollbereich können durch das Ergebnis in zumindest einem weiteren Analyse- und/oder Kontrollbereich bestätigt oder widerlegt werden. Weiters ist von Vorteil, daß durch die mehrfache Anordnung der gleichen Positivkontrollen, sowohl in unterschiedlichen als auch in gleichen Konzentrationen, eine Normierung innerhalb einer bzw. auch zwischen verschiedenen Messungen durchgeführt werden kann. So können z. B. durch Berechnung eines Korrekturfaktors die Messungen in den Analysebereichen einer Vorrichtung mit der auf einer bzw. mehreren anderen Vorrichtungen miteinander verglichen wer- den. Es können selbstverständlich auch die Messungen in den Analysebereichen auf derselben
Vorrichtung durch Berechnung eines Korrekturfaktors normiert werden.
Dabei erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 19 vorteilhaft, wonach z. B. während der Herstellung der Vorrichtung nicht erkannte, schadhafte Stellen am Träger und/oder un- gleichmäßige Auswertebedingungen über zumindest einen weiteren Analyse- und/oder Kontrollbereich auf der Vorrichtung durch die nicht benachbarte Anordnung des gleichen Bindungspartner in zumindest einem weiteren Analyse- und/oder Kontrollbereich des Trägers erkannt bzw. kompensiert werden können.
Gemäß den Ausgestaltungen in den Ansprüchen 20 und 21, können Nukleinsäuresequenzen vieler verschiedener Bakteriengattungen und -arten in beliebiger Kombination gleichzeitig analysiert und damit ein entsprechender Zeitgewinn bzw. ein erhöhter Durchsatz im Labor realisiert werden.
Von Vorteil ist dabei eine Weiterbildung der Vorrichtung nach Anspruch 22, womit mit nur einem Oligonukleotidprimer bzw. -primeφaar eine Qualitätskontrolle für verschiedene Verfahrensschritte, insbesondere der Amplifikation, zur Verfügung steht. Weiters können durch die Verwendung zumindest einer dieser Oligonukleotidsequenzen die erforderlichen Schritte für die Optimierung der erfolgreichen Amplifizierung minimiert werden.
Gemäß Anspruch 23 können auf vorteilhafte Weise unterschiedliche Zielnukleinsäuresequenzen unter Verwendung von nur einem Oligonukleotidprimer bzw. -primeφaar analysiert werden, weil durch die entsprechende Auswahl der Oligonukleotidsequenzen am Träger gleichzeitig amplifizierte Zielnukleinsäuresequenzen komplementäre Bereiche aufweisen und daher hybridisieren können.
Die Aufgabe der Erfindung wird jeweils eigenständig auch durch ein Verfahren entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 24 und 28 gelöst. Vorteilhaft daran ist, daß mehrere Zielnukleinsäuresequenzen mit nur einer Primersequenz, insbesondere von mit Parodontitis assoziierten Bakteriengattungen bzw. -arten, gleichzeitig amplifiziert bzw. identifiziert werden können. Damit können in der Folge die Verfahrenskosten für das Labor gesenkt und die Durchführbarkeit des Verfahrens vereinfacht werden, da die Verwechslungsgefahr betreffend unterschiedliche Oligonukleotidprimer für unterschiedliche Zielnukleinsäuresequenzen minimiert werden. Das Verfahren kann damit auch von weniger erfahrenen Perso- nen durchgeführt werden. Von Vorteil ist dabei weiters, daß die Lagerhaltung vereinfacht sowie die dadurch verursachten Kosten für ein Labor gesenkt werden können, indem die Anzahl unterschiedlicher Reagenzien gesenkt werden kann. Durch den größeren Verbrauch an einem Primer können weiters auch die Anschaffungskosten für Chemikalien gesenkt werden und kann durch den größeren Umsatz dieses Primers die Lagerdauer und damit die Gefahr der Unbrauchbarkeit desselben verringert werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens zur Amplifikation von zumindest einer Zielnu- kleinsäuresequenz sind in den Ansprüchen 25 bis 27 gekennzeichnet.
So ist bei einer Weiterbildung nach Anspruch 25 von Vorteil, daß mehrere Bakterienarten gleichzeitig amplifiziert werden können und dadurch sowohl Kosten, Zeit als auch Material eingespart werden können.
Von Vorteil ist aber auch die Weiterbildung nach Anspruch 26, weil durch Verwendung der Gensequenzen für die 16S-rRNA mit nur einem Primeφaar Sequenzen unterschiedlicher Bakterienarten amplifiziert werden können. Die Gensequenz für die 16S-rRNA besitzt einerseits hochkonservierte Konsensusregionen, an die die Oligonukleotidprimer binden und andererseits dazwischenliegende genus- oder artenspezifische Regionen. Durch die Amplifikation von Teilsequenzen der Gene, welche die 16S-rRNA kodieren, erübrigt sich die Verwendung vieler verschiedener Oligonukleotidprimersequenzen und die Optimierung der Amplifikati- onsbedingungen für die jeweilige Oligonukleotidprimersequenz.
Durch die Weiterbildung nach Anspruch 27 kann erreicht werden, daß die Hybridisierungs- produkte, d. h. das Amplifikat gebunden an das komplementäre Oligonukleotid, ein Signal erzeugen können. Dadurch wird die Erhöhung des Automatisierungsgrads und somit eine
Verringerung der Personalkosten erzielt.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausführung des Verfahrens zur Identifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz nach Anspruch 29, weil die Kontrolle und die Analyse auf nur einer Analysevorrichtung durchgeführt wird und sich daher aufwendige zusätzliche Kontrollen in womöglich einer anderen Analysevorrichtung erübrigen.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Oligonukleotidprimer entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 30 gelöst. Vorteilhaft daran ist, daß Amplifikationsprodukte, entstanden durch die Amplifikation mit diesem Primer bzw. einem aus diesen gebildeten Primeφaar, mit einer komplementären Oligonukleotidsequenz für zumindest eine Positivkontrolle und/oder Zielnukleinsäuresequenz an einen Träger hybridisieren und durch das entstandene Signal eine Qualitätsübeφriifung des Verfahrens und/oder eine Identifikation der Bakterienarten ermöglicht wird.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Analysekit entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 31 gelöst. Vorteilhaft ist daran, daß der Analysekit sowohl die Vorrichtung als auch die Oligonukleotidprimer für die gleichzeitige Amplifikation verschiedener Bakterienarten enthält. Das Analyseergebnis enthält parallel auch Er- gebnisse über die durchgeführten Kontrollen während der Analyse, so daß allfällige Fehler vor bzw. mit der Auswertung der Analyten erkannt werden können und damit eine langwierige Ursachenforschung und gegebenenfalls ein erforderlicher Optimierungsaufwand verringert werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung der Vorrichtung entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 32 und 33 gelöst. Vorteilhaft daran ist, daß Analyten von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten identifiziert werden können und somit eine genaue Analyse der assoziierten Keime erreicht werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung des Analysekits entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 34 und 35 gelöst. Von Vorteil erweist sich, daß durch die Verwendung des Analysekits bereits ein komplettes Set zur Identifikation diverser Bakterienarten oder verschiedener Genexpressionsmuster zur Verfügung steht und die Komponenten nicht einzeln gekauft und aufeinander abgestimmt werden müssen. Weiters ist von Vorteil, daß dadurch rasch der Nachweis von mit Parodontitis, insbesondere Periodontitis, assoziierten Keimen erfolgen kann und daher die Folgekosten einer primär ungezielten antibioti sehen Therapie verhindert werden können.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird diese anhand der nachfolgenden Fig. 1 näher erläutert, wobei diese in schematisch vereinfachter Darstellung eine Vorrichtung mit Bindungspartnern, angeordnet in Analyse- bzw. Kontrollbereichen zeigt.
Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Analyse zumindest eines Analyten. Diese Vorrichtung umfaßt einen Träger 1, vorzugsweise plättchenförmig, mit einer Oberfläche 2 auf der mehrere Analysebereiche 3 und mehrere Kontrollbereiche 4, angeordnet sind. Es ist aber selbstverständlich möglich, daß in einer Minimalausführung nur jeweils ein Analyse- bzw. Kontrollbereich 3,4 oder aber, daß ein Analysebereich 3 und mehrere Kontrollbereiche 4 bzw. umgekehrt angeordnet sind.
Alternative Ausführungsformen der Vorrichtung sind Träger 1 in plättchenförmiger Ausgestaltung, wobei an dessen Oberfläche 2 Vertiefungen ausgebildet sind, wie z. B. Chambersli- des.
Eine weitere Ausführungsform des Trägers 1 stellen Mikrotiteφlattten nach Abmessungen gemäß den Empfehlungen der SBS (Society of Biomolecular Screening) dar.
Der bzw. die Analysebereich(e) 3 und/oder der bzw. die Kontrollbereich(e) 4 können auf der Oberfläche 2 des Trägers 1 an jeder beliebigen, vordefinierbaren Stelle angeordnet sein.
Als Träger 1 kann vorzugsweise ein silanisierter Glasträger verwendet werden. Es ist aber auch möglich den Träger 1 aus Kunststoff, Stein, Metall, etc. zu bilden bzw. können mit Aldehyd, Aminosilan, Streptavidin, Biotin, Thiol, magnetischen Materialien oberflächenbehandelte Träger ebenfalls verwendet werden.
Es sei an dieser Stelle erwähnt, daß Fig. 1 nur ein Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt. Es können auch andere Formen, wie z. B. ein Würfel, eine Kugel, bzw. andere Querschnitte der plättchenförmigen Ausbildung, wie z.B. quadratische, runde, etc., für die Vorrichtung verwendet werden.
So ist z.B. möglich zumindest annähernd kugelförmige Vorrichtungen mit mehreren Analysebzw. Kontrollbereichen 3,4 oberflächlich zu versehen, wobei diese Vorrichtungen in der Folge in eine zu analysierende flüssige Probelösung gegeben werden. Gegebenenfalls können diese derart ausgebildeten Vorrichtungen mit einer Schicht aus einem magnetischen Material versehen sein, so daß die Entfernung der Vorrichtungen nach Anbindung der Zielnukleinsäu- ren aus der Probelösung einfach möglich ist.
Vorzugsweise ist die Vorrichtung jedoch plättchenförmig ausgebildet und wird bzw. werden die zu untersuchenden Probe(n) auf diese Vorrichtung aufgebracht.
Weiters ist es möglich die Vorrichtung mit zumindest einer Deckschicht auf zumindest einer der Oberflächen 2 des Trägers 1 zu versehen, um damit die darunter liegende Oberfläche 2 vor unbeabsichtigten, äußeren Einwirkungen zu schützen, z.B. vor Zerkratzungen und damit Zerstörungen von Oberflächenbereichen. Diese Deckschicht kann auch zumindest teilweise entfernbar angeordnet sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Analyse von vielen verschiedenen Analyten verwendet werden. Im nachfolgenden können die Begriffe Nukleinsäure, Nukleinsäuresequenz und Zielnukleinsäuresequenz durch einen Begriff ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Nukleinsäuren, wie z.B. DNA, RNA, PNA (Peptidnukleinsäuren), Proteine, wie z.B. Anti- köφer, Epitope, Antigene, Scaffold Proteine, Fusionsproteine, insbesondere rekombinante
Fusionsproteine, Signalproteine, Transmitter, Enzyme, Substrate, Hormone, Peptide, Lipide, Kohlenhydrate, wie z.B. Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, und deren modifizierten Formen, etc., wahlweise ersetzt werden. Selbstverständlich kann parallel dazu auch der Begriff Oligonukleotid auf ersten oder weiteren Bindungspartner ausgedehnt werden, wobei der Bindungspartner ein Molekül ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Nukleinsäuren, wie z.B. DNA, RNA, PNA (Peptidnukleinsäuren), Proteine, wie z.B. Antiköφer, Epitope, Anti- gene, Scaffold Proteine, Fusionsproteine, insbesondere rekombinante Fusionsproteine, Signalproteine, Transmitter, Enzyme, Substrate, Hormone, Peptide, Lipide, Kohlenhydrate, wie z.B. Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, und deren modifizierten Formen, etc., darstellen kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird vorzugsweise in der Analyse von Analyten, insbesondere Nukleinsäuren von Bakterienarten eingesetzt, insbesondere von mit Parodontitis assoziierten. Obwohl die folgende Beschreibung auf diese Ausführung der Vorrichtung be- schränkt wird, sei jedoch bemerkt, daß die Vorrichtung auch für andere Analyten und Nukleinsäuresequenzen verwendbar ist, und sind daher die folgenden Ausführungen für den Schutzumfang nicht limitierend zu verstehen.
Die Erfindung umfaßt auch die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz mit Hilfe eines Primers bzw. Primeφaares und deren Hybridisierung an Oligonukleotide in den Analysebzw. Kontrollbereichen 3,4.
Weiters kann die Vorrichtung durch verschiedene Vorkehrungen, wie z. B. Ausnehmungen in der Oberfläche auch direkt für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen verwendet wer- den. In diesem Fall kann die Vorrichtung zumindest bereichsweise eine Einrichtung zur Temperaturerhöhung, z.B. eine Heizschicht umfassen, um z.B. Temperaturwechselprogramme zu ermöglichen.
Die, insbesondere verschiedenen, zur Zielnukleinsäuresequenz und/oder zu den Positivkon- trollen komplementären Oligonukleotide können bevorzugt mit einem Nanoplotter durch piezoelektrische kontaktlose Probenübertragung auf dem Träger 1 in den Analyse- bzw. Kontrollbereichen 3,4 angebracht werden. Es können aber auch andere Verfahren zur Oligonu- kleotidverteilung verwendet werden wie Nadelprinter, Ring and Pinprinter, Elektro addressing Printer, Topspoter, etc. bzw. können diese auch manuell aufgetragen werden. Andere Verfah- ren sind selbstverständlich möglich und sind dem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann bekannt.
Die Oligonukleotide können für die Identifizierung verschiedener Nukleinsäuresequenzen, insbesondere von Nukleinsäuresequenzen verschiedener Bakterienarten, verwendet werden. Idealerweise soll die jeweilige Oligonukleotidsequenz mit nur einer Bakterienspezies und deren Stämmen hybridisieren. Wie aus der WO 00/52203 A hervorgeht sind für die Identifizierung der in diesem Dokument angegebenen Spezien manchmal mehrere Oligonukleotidsequenzen für die Unterscheidung einzelner Bakterienspezien notwendig.
Wie bereits erwähnt, kann die Erfindung vorzugsweise zur Identifikation von mit Parodontitis assoziierten Bakterien verwendet werden. Derzeit sind an die 100 verschiedene, diese Erkrankung des Mundraumes, verursachende Bakterienarten bekannt. Um eine möglichst effiziente Analyse derartiger Bakterien zu ermöglichen weist die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise mehrere, beispielsweise 20 verschiedene, Oligonukleotide dafür auf. So können in den Analysebereichen 3 Oligonukleotide für die Identifizierung von Actinobacillus actinomy- cetemcomitans, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacteroides forsythus, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis), Campylobacter rec- tus, Capnocytöphaga gingivalis, Eikenella corrodens, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Poφhyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mi- tis, Treponema denticola und Veillonella parvula verwendet werden.
In einer weiteren Anwendungsmöglichkeit können Oligonukleotide auch für die Identifizierung verschiedener Nukleinsäuresequenzen, insbesondere von Genexpressionsmustern ver- schiedener Organismen, verwendet werden.
Die Oligonukleotide bestehen bevorzugt aus 10 bis 120 Nukleotiden, können aber auch aus 15 bis 100 Nukleotiden, insbesondere aber aus 20 bis 50 Nukleotide, beispielsweise 33 Nukleotiden bestehen.
Die Detektion von kurzen Nukleinsäuresequenzen amplifizierter DNA ist eine einfache Methode und kann daher auch in viel größerem Umfang, z.B. zur Identifikation von viralen Nukleinsäuresequenzen oder von Genvariationen, etc., als hier beschrieben durchgeführt werden.
Die Oligonukleotidsequenzen werden de novo synthetisiert. Die Oligonukleotide sind an zumindest einem Ende derart modifiziert, daß sie am Träger 1 in den Analyse- bzw. Kontrollbereichen 3,4 anhaften, insbesondere chemisch über dieses modifizierte Ende binden. So kann vorzugsweise das 5 '-Ende mit dem Amino-Modifier C6 MMT (6-(4-Monomethoxytrityla- mino)hexyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite mit folgender Strukturformel modifiziert werden. NtvITN HC H2CH 2CH 2CH 2CH 2CH
I
0 I [Pr)2Ϊi - P-OCH2CH2CN
Darin bedeutet MMT Monomethoxytrityl und Pr Isopropyl.
Selbstverständlich können auch andere Modifier verwendet werden, wie z.B. Succinyl, DNP (2,4-Dinitrophenyl), etc.
Es ist aber auch möglich das 3'- Ende bzw. sowohl das 5'- als auch das 3 '-Ende der Oligonukleotidsequenzen derart zu modifizieren, daß die Anhaftung auf dem Träger 1 möglich wird.
Um die Oligonukleotide auf die Analyse- bzw. Kontrollbereiche 3,4 aufbringen zu können, werden diese in Lösung verwendet. Als Lösungsmittel können z.B. ein Tris-EDTA Puffer, oder Wasser verwendet werden. Andere verwendbare Lösungsmittel sind z.B. physiologische Natriumchloridlösung (0,9 % NaCl), PBS, Alkoholverdünnungen, Tris-Puffer, DMSO in einer Konzentration ausgewählt aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 30 %, vor- zugsweise 25 %, insbesondere 20% und einer unteren Grenze von 1 %, vorzugsweise 2 %, insbesondere 5 % etc.
Die Oligonukleotide werden dem Lösungsmittel in einer Menge zugesetzt, daß sie in einer Konzentration im Bereich zwischen 1 nM bis 1 mM, beispielsweise 10 nM bis 500 μM, vor- zugsweise 100 nM bis 500 μM vorliegen. Als vorteilhaft haben sich auch Konzentrationen im
Bereich zwischen 0,5 μM bis 100 μM, insbesondere 1 μM bis 50 μM erwiesen.
Die Bindungspartner können in gleichen oder verschiedenen Konzentrationen in den Kon- trollbereichen 4 vorgelegt werden. Dabei können Bindungspartner aufgebracht werden, die eine Orientierungskontrolle des Trägers 1, z.B. in einer Auswertevorrichtung, wie z.B. einem
Scanner, ermöglichen. Weiters können Bindungspartner für die Kontrollbereiche 4 verwendet werden, die eine Beurteilung der Qualität einer Amplifikation, wie z.B. einer PCR und/oder einer erfolgten Hybridisierung der Analyten verwendet werden.
Zum Nachweis der Probenidentität bzw. -art oder -matrix wird ein spezifischer Bindungspartner, wie z.B. eine Nukleotidsequenz oder ein Antiköφer eines bestimmten Organismus, wie z.B. Mensch, Tier oder Pflanze, oder für eine bestimmte Sorte oder Rasse, wie z.B. Rind, Schaf, Schwein, oder Birke, Palme, Tanne, etc. auf dem Träger 1 in einem vordefinierten Bereich immobilisiert. Die Identifizierung kann auch durch Zugabe von Material zur Probe wie. z.B. Nanopartikel, Farbstoffe, etc., welche an den Kontrollbereichen 4 unterschieden werden, erfolgen. Die Identität kann sich auch aus einer Kombination von unterschiedlichen Markern ergeben.
Alternativ kann zum Nachweis von Proben unterschiedlicher Matrices, wie z.B. aus Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Fäces, etc., für jeden Analyten aus der gleichen Probe die glei- ehe Markierung verwendet werden. Dies erfolgt entweder durch direkte Markierung des
Analyten mit einem Substrat wie z.B. Enzym, Biotin, Digoxigenin, radioaktive Markierung, Floureszenz- oder Chemilumineszenzmarkierungen, chemische Stoffe mit einem spezifischen Spektrum, wie z.B. Infrarot, etc. oder durch die Zugabe eines genau definierten Moleküls, wobei das Molekül für jede Probe unterschiedlichen Ursprungs andere Charakteristika auf- weist und in der weiteren Analyse eindeutig identifizierbar ist.
Mit dem Nachweis des Ursprungs bzw. der Quelle, aus welcher beispielsweise Viren stammen kann der infizierte Wirtsorganismus nachgewiesen werden. Dies ist vor allem bei der Identifikation von Virenstämmen, welche unterschiedliche Wirtsorganismen befallen, von großer Bedeutung. Durch die Immobilisierung eines Bindungspartners, welcher eine phyloge- netische Unterscheidung , wie z.B. komplementäre Sequenzen zum Cytrom B Gen, oder durch die Immobilisierung von Cytochrom B korrespondierenden Antiköφern werden die verschiedenen Wirtsorganismen nachgewiesen. Sowohl für die Analyse als auch für die weitere Vorgehensweise kann es entscheidend sein, aus welcher Quelle dieses Virus isoliert wur- de um eventuell sofort Maßnahmen ergreifen zu können um beispielsweise eine weitere Ausbreitung des Erregers zu verhindern.
Bei einer weiteren Anwendung ist von großer Bedeutung, ob Prionen aus dem Nervensystem von Rindern oder von Schafen stammen um rechtzeitig Quarantäne über den betroffenen Bauernhof verhängen zu können, von welchem das erkrankte Tier stammt. Durch die Immobilisierung des spezifischen Bindungspartners für Prionen in Kombination mit einem individuumspezifischen Bindungspartner, wie z.B. short tandem repeats (STR), variable number of tandem repeats (VNTR), Single nucleotide polymorphism (SNP), etc., wird nachgeweisen, von welchem Individuum der gleichen Spezies die Prionen stammen. Um Kreuzreaktionen eines spezifischen Bindungspartners mit mehreren Analyten ausschließen zu können, sind Kontrollen für Kreuzreaktionen auf der Vorrichtung angeordnet. Bei der Untersuchung von sehr nahe artverwandten Organismen kann es zu Kreuzreaktionen von spezifischen Bindungspartnern mit Analyten beider Arten kommen. Durch die Verwendung einer weiteren spezifischen Sonde, von der bekannt ist, daß sie nur an Analyten der einen Art bindet, kann somit die Kreuzreaktion nachgewiesen werden und die beiden Arten voneinander unterschieden werden. Das gleiche Prinzip ist auch für Antikörper anwendbar, die an zwei verschiedene Antigene binden, wobei hier für das zweite Antigen ein weiterer Antiköφer vorhanden ist, von dem nachgewiesen wurde, daß er ein spezifischer Bindungspartner nur für die zweite Art ist.
Auf dem Träger können des weiteren auch spezifische Bindungspartner für Kontaminationen immobilisiert sein. Durch das Aufbringen eines spezifischen Bindungspartners für beispielsweise hoch infektiöse Viren kann das Vorhandensein dieser Viren in der Probe, in welcher auch der Analyt enthalten ist, nachgewiesen werden und somit nach Erhalt des Ergebnisses der Analyse das medizinische Personal vor potentiellen Infektionsmöglichkeiten frühzeitig gewarnt wird.
Durch die Immobilisierung eines spezifischen Bindungspartners für die Isolierungskontrolle wird die Menge des Analyten, welche während der Isolierung verloren gegangen ist, bestimmbar. Durch die Zugabe einer genau definierten Menge eines Stoffes vor der Aufreinigung der Probe zu den Analyten kann die Menge, die durch die Isolierungsarbeit verloren gegangen ist, bestimmt werden. Wichtig dabei ist, daß der zugegebene Stoff in seinem Verhalten dem Analyten sehr ähnlich ist, um eine repräsentative Aussage zu erhalten. Bei der Zu- gäbe von DNA muß darauf geachtet werden, daß der Analyt in einer Probe vorliegt, welche
DNAse frei ist.
Zur Kontrolle der Bestimmung der Qualität und Quantität der Signalintensivierung ist am Träger 1 ein spezifischer Bindungspartner angeordnet, welcher eine Normierung der Intensität des Signals, welches durch Markierungen, wie z.B. durch enzymatische Markierung, Silberfärbung oder Markierung mit Goldpartikel, durch Floureszenz- bzw. Chemilumineszentfarb- stoffe, Biotin, Digoxigenin, radioaktive Markierungen, etc., erzielt werden, erlaubt. Um beispielsweise den Verstärkungsfaktor von Silberfärbung abschätzen zu können, bringt man z.B. Goldpartikel in einer definierten Menge am Träger 1 auf, die dann als Kristallisations- punkt dienen, analog zum Detektionssystem, wo beispielsweise der Primer über ein Biotin- Streptavidin-System mit den Goldpartikeln gelabelt wird. Entsprechend wird eine definierte Anzahl von Bindungsstellen für eine Dendrimer-Signalverstärkung bzw. für enzymatische oder ähnlich wirksame katalytische Signalverstärkungssysteme am Träger 1 aufgebracht.
Um die Qualität der Hybridisierung zu bestimmen, wird entweder parallel zu jedem spezifischen Bindungspartner auch ein spezifischer Bindungspartnern für die Hybridisierungskon- trolle, welche beispielsweise erst nach der Isolierung bzw. Amplifikation des Analyten aus der Probe zugegeben wird, immobilisiert. Andererseits kann auch eine Hybridisierungskon- trolle zur Verfügung stehen, bei welcher der spezifische Bindungspartner für den Analyten und der spezifische Bindungspartner für die Hybridisierungssonde gekoppelt sind und somit in den gleichen Mengen vorliegen, wobei das Problem des unterschiedlichen Verhältnisses vom spezifischen Bindungspartner zum Analyten und vom spezifischen Bindungspartner zur Hybridisierungssonde, wenn diese getrennt vorliegen, eliminiert wird.
Um die Effektivität der Immobilisierung des spezifischen Bindungspartners auf dem Träger 1 zu übeφriifen wird an den spezifischen Bindungspartner eine Markierung, z.B. eine Floureszenz- oder Chemilumineszenzmarkierung kovalent gebunden. Die erste Bestimmung der Printqualität erfolgt bereits nach der Immobilisierung der spezifischen Bindungspartner auf dem Träger 1 und nach der Hybridisierung wird ein weiteres Mal eine Auswertung mittels der Hybridisierungssonde durchgeführt. Durch diese Vorgangsweise kann eine Trennung in Kontrolle für den Printvorgang und in die Kontrolle für die Hybridisierung erfolgen.
Eine weitere Ausführungsvariante stellt eine Markierung des spezifischen Bindungspartners mit drei unterschiedlichen Markierungen, wie z.B. Floureszenz- oder Chemilumineszenzmar- kierungen dar, die in unterschiedlichen Signalen bei der Detektion resultieren. Beispielsweise ist eine Markierung die Kontrolle für die Immobilisierung des spezifischen Bindungspartners, die weitere Markierung eine Kontrolle für die Hybridisierung und die dritte Markierung eine Kontrolle für den Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners an den Analyten.
Eine weitere Möglichkeit, um die Qualität der Analyse bestimmen zu können, wird durch das
Anbringen einer Markierungskontrolle, welche immer in der gleichen Konzentration auf dem Träger 1 immobilisiert wird, und somit interassay Schwankungen nachgewiesen werden können. Kontrollbereiche 4 erlauben es Ergebnisse zu vergleichen, die auf unterschiedlichen Geräten bzw. zu verschiedenen Zeiten auch, wenn inzwischen das Gerät gealtert ist, gemacht wurden (z.B. die Lebensdauer eines PMT oder CCD Chips ist begrenzt). Es können auch Er- gebnisse verglichen werden die mit unterschiedlichen Parametereinstellungen gemacht werden, wie z.B. Spannung beim PMT, Messzeit beim CCD-Chip, etc.
Alternativ kann auch eine Verdünnungsreihe der Kontrollbereiche 4 aufgebracht, damit die Meßfunktion bestimmt werden kann. Dadurch wird die Empfindlichkeit, Sensitivität, Detekti- onslimit, Linearität bzw. der dynamische Bereich der Meßfunktion bestimmt; dies ermöglicht eine Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Gerätetypen. Diese Kontrollbereiche 4 sollten natürlich für die jeweils verwendeten Markierungen verwendet werden. Bei der Verwendung von Substanzen mit einem breiteren Spektrum (Wellenlängen) kann auch die Qualität der Filter, und andere optische Eigenschaften abgeglichen werden.
Die Oligonukleotide für die Orientierungskontrolle können in Konzentrationen im Bereich von 1 μM bis 100 μM, insbesondere im Bereich von 1 μM bis 50 μM, vorzugsweise in einer Konzentration von 10 μM vorliegen. Die Oligonukleotide für die Amplifikationskontrolle können in Konzentration im Bereich zwischen 0,1 nM bis 0,5 mM, beispielsweise 1 nM bis
100 μM, vorliegen. Als vorteilhaft haben sich auch Konzentrationen im Bereich zwischen 5 nM bis 50 μM, insbesondere 10 nM bis 10 μM erwiesen. Die Oligonukleotide für die Hybri- disierungskontrolle können in Konzentrationen im Bereich zwischen 0,1 nM bis 500 μM, beispielsweise im Konzentrationsbereich von 1 nM bis 100 μM, insbesondere von 10 nM bis 50 μM vorliegen. Als vorteilhaft haben sich auch Konzentrationen im Bereich zwischen 25 nM bis 25 μM, insbesondere 40 nM bis 10 μM, erwiesen.
Es können weiters noch andere als die oben angegebenen Oligonukleotide für die Kontrollbereiche 4 verwendet werden, wie z.B. Oligonukleotide als Positivkontrolle mit einer Sequenz komplementär zur Oligonukleotidprimersequenz, welche für die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird oder Oligonukleotide als Negativkontrolle mit einer Sequenz von anderen Organsimen, die das Gen für die Kodierung der 16S-rRNA nicht besitzen.
Die Oligonukleotide können in den Kontrollbereichen 4 in Verdünnungsreihen vorliegen, wo- bei jeweils eine Konzentration pro Kontrollbereich 4 verwendet wird. Dazu hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Konzentration der Oligonukleotide mit einem Faktor ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1,5, insbesondere 1,75, und einer oberen Grenze von 10, insbesondere 5, vorzugsweise mit einem Faktor 3 für die Hybridisierungskontrolle und/oder einem Faktor ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1,25, ins- besondere 1,5, und einer oberen Grenze von 10, insbesondere 5, vorzugsweise mit einem Faktor 2 für die PCR-Kontrolle zwischen aufeinanderfolgenden Konzentrationen zu verringern. Die höchste Konzentration der Oligonukleotide kann 500 μM, beispielsweise 250 μM, insbesondere 100 μM und vorzugsweise 10 μM betragen. Eine Verdünnungsreihe kann 2 bis 24 Konzentrationen umfassen, wobei beispielsweise 3 bis 20 Konzentrationen, insbesondere 4 bis 18 Konzentrationen vorliegen. Als vorteilhaft haben sich auch 5 bis 15, insbesondere 6 bis
11, Konzentrationen erwiesen. Die Positivkontrollen können auch in logarithmischen Verdünnungsreihen vorliegen.
Die Ausführungen zu den Oligonukleotiden für die Kontrollbereiche 4 können selbstverständ- lieh auf die Oligonukleotide für die Analysebereiche 3 entsprechend übertragen werden, so daß hier nur mehr die entsprechenden Konzentrationen bzw. Konzentrationsbereiche angegeben werden. Die Konzentration der Oligonukleotide in den Analysebereichen 3 liegen im Bereich von 100 nM bis 1 mM, beispielsweise von 1 μM bis 500 μM, insbesondere von 10 μM bis 100 μM und vorzugsweise von 25 μM bis 45 μM.
Die Oligonukleotide werden vorzugsweise in Volumina ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 pl, insbesondere 10 pl, vorzugsweise 200 pl und mit einer oberen Grenze von 5 μl, insbesondere 1 μl, vorzugsweise 0,3 μl, pro Analysebereich 3 und/oder Kontrollbereich 4 aufgetragen.
Die Anordnung der Oligonukleotide auf dem Träger 1 ist vordefinierbar. Jedes Oligonukleotid kann eine Fläche von 50 bis 500 μm Durchmesser einnehmen, insbesondere von 200 bis 250μm.
Vorzugsweise weist die für die Analyse verwendete Oberfläche 2 der Vorrichtung, die z. B. als Objektträger für die Mikroskopie ausgebildet sein kann, eine Fläche von 0,1 cm2 bis 50
9 9 9 9 cm beispielsweise 0,5 cm bis 40 cm , vorzugsweise 1 cm bis 30 cm auf. Als vorteilhaft
9 9 9 haben sich auch Flächen im Bereich zwischen 1,5 cm bis 20 cm , insbesondere 2 cm bis 15 cm2 erwiesen.
Eine bevorzugte Anordnung der Oligonukleotide mit einer geringen Dichte ermöglicht einfache Hybridisierungsbedingungen, wie z. B. geringe Temperaturschwankungen, homogene Pufferverteilung, etc. und unkomplizierte Auswertemethoden, weil eine Überlappungen von Signalen normalerweise nicht zu erwarten ist. Die Oligonukleotide bestehen aus Sequenzen die komplementär zu bestimmten Teilsequenzen der Zielsequenz sind und/oder komplementär zu zumindest einer Positivkontrolle sind.
Das Oligonukleotid für die Hybridiserungskontrolle dient als Qualitätsnachweis für die Hybridisierung. Beispielsweise ist eine Teilsequenz des Bakteriophagengenoms als Linkersequenz am 3'- Ende insertiert und das 5'- Ende mit dem erwähnten Amino-Modifier C6 MMT modifiziert. Als Linkersequenz kann aber auch jede beliebige chemische Verbindung, die den notwendigen räumlichen Abstand erzeugt und somit eventuell auftretende sterische Hinderungen vermeidet.
Das Oligonukleotid für die Orientierungskontrolle kann für die Bestimmung bzw. Festlegung der Ausrichtung des Trägers 1 während der Herstellung der Vorrichtung bzw. in späteren Analyseschritten dienen. Weiters kann die Orientierungskontrolle zur Bestimmung bzw. Festlegung der Grenzen des auszuwertenden Feldes, insbesondere durch die Analyse- und Kontrollbereiche 3,4 definiert, am Träger 1 und zur Übeφriifung der Lokalisation des Lesefeldes dienen. Es kann vorzugsweise sequenzidentisch mit dem Oligonukleotid der Hybridi- sierungskontrolle sein und trägt zusätzlich beispielsweise eine Markierung am 3' - Ende, z.B. Digoxigenin, Biotin, radioaktive Markierungen, wie z. B. 33P, oder Floureszenzfarbstoffe, um auch ohne erfolgter Hybridisierung ein gut auswertbares Signal zu liefern. Die Orientierungs- kontrolle ist vorzugsweise in zwei Kontrollbereichen 4 angeordnet, die an bestimmten, z.B. während der Auftragung dieser Oligonukleotide, vordefinierbaren Stellen des Trägers 1 angeordnet sein können.
Die Oligonukleotide für die Kontrollbereiche 4 und für die Analysebereiche 3 können in meh- reren Bereichen der Vorrichtung angeordnet sein, beispielsweise an zumindest 2 Bereichen, aber auch an 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Bereichen.
Durch die mehrfache Anordnung der gleichen Positivkontrollen, sowohl in unterschiedlichen als auch in gleichen Konzentrationen kann eine Normierung innerhalb einer bzw. auch zwi- sehen verschiedenen Messungen durchgeführt werden. So können z. B. durch Berechnung eines Korrekturfaktors die Messungen in den Analysebereichen einer Vorrichtung mit der auf einer bzw. mehreren anderen Vorrichtungen miteinander verglichen werden. Es können selbstverständlich auch die Messungen in den Analysebereichen auf derselben Vorrichtung durch Berechnung eines Korrekturfaktors normiert werden. Um die Problematik zu umgehen, daß man nur das Signal messen kann, man aber eigentlich nur an der Analytkonzentration interessiert ist wird im folgenden ein Berechnungsbeispiel, wobei die Analytkonzentration durch eine Kalibrationsfunktion mit der Signalstärke verbunden ist, in vereinfachter Form dargestellt.
Ein zusätzliches Signal kann von einem Kreuzreaktanten stammen. Daraus folgt: Signal
(Analyt) = Kalibrationsfunktion [Analytkonzentration] + Signal(Kreuzreaktanten). Das Signal einer Kreuzreaktion bezieht sich immer auf den gegebenen Analyten und kann sogar von mehreren Kreuzreaktanten stammen.
Ein einfaches additives Modell bestimmt, daß (Signal der Kreuzreaktanten für den Analyt a) = Summe [Kai * Signal (Kreuzreaktant /)], wobei Kai ein Selektivitätskoeffizient, der angibt in welchem Maße der Kreuzreaktant i, zum Signal des Analyten a beiträgt, ist. Dieser Koeffizient muß für jede Kombination von Analyten neu festgelegt werden.
Wenn man nun in erster Näherung eine einfache lineare Kalibrationsfunktion annimmt und
Kreuzreaktanten vernachlässigt, ergibt sich folgende Gleichung: Signal (Analyt) = K* Analytkonzentration +Offset. Der Faktor K setzt sich aus einer Menge von Faktoren zusammen, die von den einzelnen Analyseschritten herführen, wie z.B. K = Isolationseffizienz * PCR-Effizi- enz * Hybridisierungseffizienz * Labelingeffizienz * Signal-Amplifikationsausbeute * Print- qualität * Meßfunktion
Im Gegensatz dazu hofft man bei Genexpresssionsexperimenten durch die Verhältnisbildung von zwei unter gleichen Bedingungen durchgeführten Analysen die Unterschiede, die sich durch die unterschiedlichen Effizienzen der einzelnen Schritte ergeben, zu kompensieren, wie z.B. Signal (Analyt (A))/(Analyt (B)) = [K* Analytkonzentration (A)]/ [^Analytkonzentration (B)] =Analytkonzentration(A)/Analytkonzentration(B).
Es hat sich aber in der Praxis gezeigt, daß sich so nicht alle Unterschiede kompensieren lassen. Durch die Bestimmung der Effizienz der einzelnen Schritte lassen sich komplexere Mo- delle erstellen, wodurch auch bei Genexpressionsexperimenten eine Verbesserung in der Normierung bzw. Quantifizierung möglich wird.
Da bei der Anwendung von Microarrays in der Genotypisierung keine Referenzproben vorliegen, ist die Kontrolle der einzelnen Schritte von größter Bedeutung. Es können Oligonukleotide, wie z. B. die Orientierungskontrolle und/oder die PCR-Kontrolle und/oder Orientierungskontrolle im selben Analyse- bzw. Kontrollbereich 3,4, wie die Zielnukleinsäuresequenz vorliegen und durch ihre unterschiedliche Markierung wie z. B. verschiedene Farbstoff derivate, während der Detektion unterschieden werden.
Die Oligonukleotide werden mit Nukleinsäuresequenzen der Zielsequenz hybridisiert und erzeugen in der Folge ein Signal. Da vorzugsweise eine Oligonukleotidsequenz in mehreren Bereichen auf der Vorrichtung angeordnet ist, werden vorzugsweise und nur jene hybridisierten Oligonukleotide als positiv gewertet, für die mehr als ein Signal beobachtet werden kann, wo- durch die Sicherheit und die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses verbessert werden kann.
Die Negativkontrolle ist ein Kontrollbereich 4 auf der Oberfläche 2 des Trägers 1, an den kein Oligonukleotid gebunden ist. Dies ermöglicht unspezifische Adhäsionen diverser Nukleinsäuresequenzen zu detektieren.
Die Oligonukleotide der Analysebereiche 3 und/oder Kontrollbereiche 4 werden vor dem Auftragen auf den Träger 1 mit der Hybridisierungskontrolle in einem bestimmten Verhältnis vermischt. Das Verhältnis der Oligonukleotide zu der Hybridierungskontrolle kann in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:100 liegen. Vorteilhaft hat sich das Mischungsverhältnis von 1:10 erwiesen. Die Hybridisierungskontrolle dient als Kontrolle der erfolgten Hybridisierung für jeden einzelnen Analyse- und/oder Kontrollbereich 4. Falsch negative Ergebnisse können mittels der Hybridisierungskontrolle ausgeschlossen werden. Zur Unterscheidung bei der späteren Detektion kann beispielsweise die Zielnukleinsäuresequenz mit einem anderen Farbstoffderivat markiert sein als die Hybridisierungssondensequenz, und daher kann bei der Aus- wertung das Signal der Zielnukleinsäuresequenz vom Signal der Hybridisierungssonde durch z. B. eine andere Farbe unterschieden werden. Die Hybridisierungssonde ist eine Nuklein- säuresequenz komplementär zur Hybridisierungskontrolle und kann beispielsweise mit verschiedenen Farbstoffderivaten wie beispielsweise Cyl, Cy 2, Cy 3, Cy 4 und/oder Cy 5 markiert sein. Von Vorteil ist dabei auch, daß bei fehlender Hybridisierung mit einer komplemen- tären Zielnukleinsäuresequenz ein Signal, nämlich das der Hybridisierungssonde delektiert werden kann, wodurch festgestellt werden kann, daß das fehlende Signal nicht aufgrund eines Analyseverfahrensfehlers zustande gekommen ist.
Nach erfolgter Anbringung der Oligonukleotide in den Kontroll- bzw. Analysebereichen 3,4 werden die nicht gebundenen Oligonukleotide vom Träger 1 entfernt. Die nicht gebundenen Oligonukleotide können durch Waschen des Trägers 1 in einer SDS-Lösung mit einer Konzentrationen im Bereich von 0,01 % bis 2 %, insbesondere im Bereich von 0,1 % bis 1 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,2 %, entfernt werden. Das auf der Oberfläche 2 des Trägers 1 verbleibende Detergens wird mit einer Waschflüssigkeit, wie z. B. Wasser, PBS, TE, etc. entfernt. Der Träger 1 wird mit Luft getrocknet und in eine Flüssigkeit, wie z.
B. Wasser, NaCl, vorzugsweise Ethanol und/oder PBS, getaucht. Wasserstoffabgebende Reagenzien wie z.B. LiAlH4, Na BtLj, etc. werden der Lösung in einer Menge von 0,001 g bis 0,5 g, insbesondere 0,01 g bis 0,25 g, vorzugsweise 0,01 g bis 0,1 g in einem Volumen von 500 ml, vorzugsweise 100 ml, insbesondere 50 ml, zugesetzt. Als vorteilhaft hat sich ein Volumen von 40 ml, insbesondere 30 ml, erwiesen. Die unterschiedlichen Waschschritte laufen bei einer Temperatur in einem Bereich von 0 °C bis 100 °C, insbesondere von 10 °C bis 98 °C, vorzugsweise von 20 °C bis 95 °C, ab.
Im folgenden sind DNA Sequenzen von möglichen Oligonukleotiden der Zielnukleinsäurese- quenzen bzw. der Positivkontrollen von 5' nach 3' aufgelistet:
Zielorganismus: Actinobacillus actinomycetemcomitans
SEQ ID No 3 TCGATTTGGGGATTGGGGTTTAGCCCTGGTGCC
Zielorganismus: Actinomyces odontolyticus
SEQ ID No 4 GGCACTAGGTGTGGGGGCCACCCGTGGTTTCTG
Zielorganismus: Actinomyces viscosus
SEQ ID No 5 GGCACTAGGTGTGGGGGGCCTTTTCCGGGTCTT
Zielorganismus: Bacteroides forsythus
SEQ ID No 6 ATTACTAGGAGTTTGCGATATAGTGTAAGCTCT
Zielorganismus: Campylobacter concisus
SEQ ID No 7 TATACTAGTTGTTGCTAAGCTAGTCTTGGCAGT Ziel Organismus: Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis)
SEQ ID No 8 TATACCGGTTGTTGCTGTGCTAGTCACGGCAGT
Zielorganismus: Campylobacter rectus
SEQ ID No 9 TATACTAGTTGTTGCTTCGCTAGTCGAGGCAGT
Zielorganismus: Capnocytophaga gingivalis
SEQ ID No 10 GATACTAGCTGTTTGGCGCAAGCTGAGTGGCTA
Ziel Organismus: Eikenella corrodens
SEQ ID No 11 TCGATTAGCTGTTGGGCAACTTGATTGCTTAGT
Zielorganismus: Eubacterium nodatum
SEQ ID No 12 AGCACTAGGTGTCGGGCTCGCAAGAGTTCGGTG
Zielorganismus: Fusobacterium nucleatum
SEQ ID No 13 ATTACTAGGTGTTGGGGGTCGAACCTCAGCGCC
Zielorganismus: Peptostreptococcus micros
SEQ ID No 14 AGTGCTAGGTGTTGGGAGTCAAATCTCGGTGCC
Zielorganismus: Porphyromonas gingivalis
SEQ ID No 15 ATTACTAGGAGTTTGCGATATACCGTCAAGCTT
Zielorganismus: Prevotella intermedia
SEQ ID No 16 GATGCCCGCTGTTAGCGCCTHGCGCTAGCGGCT Zielorganismus: Prevotella nigrescens
SEQ ID No 17 GATGCCCGCCGTTGGCCCTGCCTGCGGCCAAGC
Zielorganismus: Streptococcus constellatus
SEQ ID No 18 AGTGCTAGGTGTTAGGTCCTTTCCGGGACT AG
Ziel Organismus: Streptococcus gordonii
SEQ ID No 19 AGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAG
Zielorganismus: Streptococcus mitis
SEQ ID No 20 AGTGCTAGGTGTTAGACCCTTTCCGGGGTTTAG
Zielorganismus: Treponema denticola
SEQ ID No 21 T ACACTAGGTGTCGGGGC AAGAGCTTCGGTGCC
Zielorganismus: Veillonella parvula
SEQ ID No 22 GGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTTCTG
PCR-Kontrolle
SEQ ID No 23 TCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCT
Hybridisierungs- und Orientierungskontrolle
SEQ ID No 24 ACGTCAGCCACCATTACATCCGGTGAGCAGTCA
Hybridisierungssonde
SEQ ID No 25 GACTGCTCACCGGATGTAATGG Zur Hybridisierung können einzelsträngige Nukleinsäuren verwendet werden, die entweder durch Denaturierung aus doppelsträngigen Nukleinsäuresequenzen gewonnen werden oder bereits einzelsträngig vorliegende Nukleinsäuresequenzen, vorteilhafterweise durch Amplifikation mit einem Primergradienten, entstanden sind. Der Primergradient kann ein Verhältnis des Vorwärtsprimers zum Rückwärtsprimer von 1:100, vorzugsweise 1 :50, insbesondere 1:10, darstellen und führt zu einer asymmetrischen PCR. Ist nämlich während der Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz nur mehr ein Primer vorhanden kommt es zur Herstellung einzel- strängiger DNA Moleküle, die dann für die Hybridisierung am DNA Chip zur Verfügung stehen.
Die Zielnukleinsäuresequenz ist DNA oder RNA isoliert aus einer biologischen Probe, wie z. B. Bakterienzellen, Viren oder auch Eukaryontenzellen. Es können sowohl Gewebsproben (Blutzellen, Biopsien, etc.) als auch Flüssigkeitsproben (Blut, Speichel, Harn, Pleura- oder Peritonealflüssigkeit, etc.) verwendet werden. Zur Isolierung der Nukleinsäure können sämtli- ehe zur Verfügung stehende Methoden verwendet werden. Es ist oft wünschenswert die Zielnukleinsäuresequenz vor der Hybridisierung zu amplifizieren.
Zur Analyse bzw. Identifikation von oben angeführten Bakterienarten wurden nach der Erfindung spezielle, neue Oligonukleotidprimer von zumindest 15 Basenpaaren Länge, welche da- durch charakterisiert sind, daß sie in neu definierten Konsensussequenzen für das 16S-rRNA
Gen der amplifizierten Zielnukleinsäuresequenzen hybridisieren, verwendet.
Die DNA Sequenzen dieser Primer umfassen zumindest 15 Nukleotide der unten von 5' nach 3' aufgelisteten Sequenzen.
Vorwärtsprimer
SEQ ID No 1 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG
Rückwärtsprimer
SEQ ID No 2 CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT
Die Sequenzen der Primer und Oligonukleotide, welche hier angef hrt werden, sind im Stan- dard IUB/IUPC Nukleinsäurecode angegeben. Der oben angeführte Rückwärtsprimer enthält das Symbol Y. In Übereinstimmung mit der Standardterminologie für die Verwendung von degenerierten Sequenzen steht Y für C und T. Y zeigt Nukleotidpermutationen in „Wobble" Regionen der Sequenzen an. Der Rückwärtsprimer wird daher als degeneriertes Primerset mit C und T als geeignete Nukleotide für die Inkoφoration in den Woobleregionen zur Verfügung gestellt.
Die Primer, insbesondere der Rückwärtsprimer, sind für die Signaldetektion markiert. Diese Markierungen können z. B. Digoxigenin, Biotin, radioaktive Markierungen, wie z.B. 33P, Floureszenzfarbstoffe wie Cy 1, Cy 2, Cy 3, Cy 4, und/oder Cy 5, etc. oder Kombination dar- aus sein. Auch jedes andere Markierungssystem kann verwendet werden. Dies trifft selbstverständlich auch für sämtliche in dieser Beschreibung genannten Markierungen zu. Es können beispielsweise auch die für die Amplifikation verwendeten Nukleotide bereits markiert sein. Selbstverständlich können auch die Oligonukleotide am Träger 1 mit Digoxigenin, Biotin, radioaktiven Markierungen, wie z.B. P, Floureszenzfarbstoffen, etc. markiert werden. Der markierte Rückwärtsprimer ist somit Bestandteil jedes doppelsträngigen als auch durch die asymmetrische PCR entstandenen einzelsträngigen Amplifikate.
Mit diesen Primern können sowohl Nukleotidsequenzen gramnegativer als auch grampositiver Bakterien amplifiziert werden. Die amplifizierten Nukleinsäuresequenzen können direkt für die Hybridisierung verwendet werden, wodurch Reinigungsschritte eingespart werden können.
Die Oligonukleotide am Träger 1 bilden mit der, insbesondere amplifizierten, Zielsequenz stabile Hybridduplex durch komplementäre Basenpaarung. Um eine gleichmässige und spezi- fische Hybridisierung am Träger 1 zu erzielen, kann der Träger 1 über eine Zeitperiode ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 Minute, insbesondere 2 Minuten und einer oberen Grenze von 30 Minuten, insbesondere 20 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei einer Temperatur, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 20 °C, insbesondere 30 °C, und einer oberen Grenze von 95 °C, insbesondere 75 °C, vorzugsweise bei 60 °C, vorinkubiert werden. Die markierten Amplifikationsprodukte können in verschiedenen
Volumina ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 μl, insbesondere 1 μl, und einer oberen Grenze von 20 μl, insbesondere 15 μl, vorzugsweise in einem Volumen von 5 μl für die Hybridisierung in einer Lösung, bestehend aus Natriumeitrat und/oder NaCl, verwendet werden. Die auf den Träger 1 aufgebrachte Lösung mit den Amplifikaten kann, z. B. mit Wachs, Öl, Glasplättchen etc., überschichtet werden um gleichmässige Bedingungen, wie beispielsweise eine konstante Temperatur und/oder eine konstante Luftfeuchtigkeit, aufrecht zu erhalten. Die Inkubation kann bei Temperaturen in einem Bereich von 20 °C bis 75 °C, insbesondere von 30 °C bis 70 °C, und vorzugsweise bei 50 °C bis 60 °C für eine Zeitperiode von 1 Minute bis 4 Stunden, beispielsweise 3 Minuten bis 3 Stunden, vorzugsweise von 5 Minuten bis 1 Stunde, und insbesondere von 10 Minuten bis 15 Minuten, durchgeführt werden. Die Nukleinsäuresequenzen, die keine Hybridduplex bilden werden unter stringenten Bedingungen weggewaschen und die hybridisierten Nukleinsäuresequenzen, die analysiert werden, bleiben auf dem Träger 1.
Nukleinsäuren werden durch Erhöhung der Temperatur oder Erniedrigung der Salzkonzentration des Puffers denaturiert. Unter niedrig stringenten Bedingungen, wie niedrige Temperatur und hohe Salzkonzentration, bilden sich sogar Duplex, welche keine exakt komplementäre Sequenz haben. Dadurch wird die Spezifität der Hybridisierung unter niedrig stringenten Bedingungen reduziert. Unter hoch stringenten Bedingungen, wie hoher Temperatur und niedri- ger Salzkonzentration im Puffer, wird die Spezifität der Hybridisierung erhöht. Das Entfernen der nicht gebundenen Zielsequenzen kann mit einer Lösung, bestehend aus Natriumeitrat und/ oder NaCl in einem ersten Schritt bei Temperaturen von 40 °C bis 75 °C, insbesondere von 45 °C bis 70 °C und vorzugsweise bei 50 °C bis 60 °C erfolgen. In einem weiteren Schritt wird mit der gleichen Lösung bei Temperaturen ausgewählt aus einem Bereich mit einer unte- ren Grenze von 4 °C, insbesondere 8 °C, und einer oberen Grenze von 30 °C, insbesondere 20
°C gewaschen. Es können sowohl die Hybridisierung als auch die anschließenden Waschschritte unter gleichen, hoch stringenten Bedingungen erfolgen um eine hohe Spezifität und somit eindeutige Auswertbarkeit zu erzielen.
Die hybridisierten Nukleinäuresequenzen können mittels der Markierung, die in die Zielnu- kleinsäuesequenzen und oder in die Oligonukleotide eingebracht werden, detektiert werden. Vorzugsweise werden die Marker bereits während der Amplifikation in die Zielsequenz in- koφeriert. Es können z. B. während der PCR markierte Primer oder markierte Nukleotide verwendet werden. Alternativ kann der Marker aber auch direkt an die Zielsequenz oder nach der Amplifikation angebracht werden, z. B. durch Nick-Translation oder End-Markierung, wie z. B. Kinasierung der Nukleinsäuresequenz und anschließende Ligation eines Linkers, der die Nukleinsäuresequenz mit dem Marker verbindet. Markierungen können mit spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunchemischen, elektrischen, optischen, chemischen oder dgl. Methoden detektiert werden. Die Auswertung des Trägers 1 kann, z.B. durch Intensitätsmessung einer bestimmten Lichtwellenlänge nach Anregung eines fluoreszierenden Moleküls mit zumindest annähernd, bevorzugt mittels eines Lasers erzeugten, monochromatischem Licht erfolgen. Bei dieser Messung können die Ortsdaten (Koordinaten), wie die Lokalisation und die Grenzen des Lesefel- des auch mittels der Oligonukleotide für die Orientierungskontrolle am eingelesenen Träger 1 mit den gemessenen Intensitäten je nach Wellenlänge koordiniert werden. Das verwendete Lesegerät ist mit zwei unterschiedlichen Lasern ausgerüstet. Die Laser und die Photomulti- plier sind für die verwendeten Farbstoffderivate Cy3 und Cy5 abgestimmt. Die Bedienung und softwaremässige Erfassung ist Teil der Gerätebedienung. Das Ergebnis der Hybridisie- rung ergibt sich durch die Abfrage der mit dem Lesegerät gemessenen Lichtintensitäten in den
Analyse- bzw. Kontrollbereichen 3,4.
Abhängig von der Markierung der spezifischen Bindungspartner bzw. des Analyten können auch optische, elektrische, elektrochemische, magnetische, photochemische, photoelektrische oder enzymatische Detektions- bzw. Meßmethoden verwendet werden. Diese Methoden können selbstverständlich auch miteinander kombiniert werden. Beispielsweise können mittels der Oberflächenplasmonresonanztechnologie auch unmarkierte Bindungspartner bzw. Analyten nachgewiesen werden.
Ausführungsbeispiel
Im folgenden wird die Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in Form eines DNA-Chips beschrieben. Die Präparation des DNA-Chip-Rohlings des Trägers 1 erfolgt bei Raumtemperatur. Alle aufzubringenden Oligonukleotide werden in einer Masterplatte in 150 μl Portionen für den Nanoplotter bereitgestellt. Gleichzeitig dient diese Masteφlatte der Lagerung. Alle DNA Oligonukleotide sind in 10 % DMSO gelöst. Es werden pro Spot (Ort der Sonden Platzierung am DNA Chip) 350 pl je Oligonukleotid aufgebracht. Der dabei entstandene Spot formt eine Kreisfläche mit 300 μm Durchmesser und enthält etwa 10 fmol Oligonukleotid für die Analysebereiche 3 bzw. die 1 fmol Oligonukleotid für die Kontrollbereiche 4. Die Orientierungskontrolle wird in einer Konzentration von 100 μM, die Hybridisierungskontrolle in einer Konzentration von 0,8 μM bis 80 μM und die PCR Kontrolle in einer Konzentration von 0,1 nM bis 100 μM aufgebracht. In die Analysebereiche 3 werden der Oligonukleotide komplementär zu den Zielsequenzen in der Konzentration von 100 μM des entsprechenden Oligonukleotids und 0,5 μM der Hybridisierungskontrolle aufgetragen. Über- schüssige Oligonukleotide werden vom DNA Chip durch 5 Minuten Waschen (eintauchen gefolgt von kurzem Schwenken) in 0,1 % SDS bei 60 °C. Unmittelbar danach wird der DNA Chip für 5 Minuten in 94 °C warmes H20 getaucht. Nach Entfernen von etwaigen Wassertropfen mittels Luftspray wird der DNA Chip bei Raumtemperatur vollständig getrocknet. Ein fünf Minuten lang dauerndes Tauchbad in 0,01 g NaBH4 pro 40 ml PBS und 20 ml Ethanol vervollständigt den Vorgang der kovalenten Bindung der Oligonukleotide am Chip und deaktiviert unbenutzte reaktive Gruppen. Der DNA Chip wird vor der Lagerung nochmals für 10 Sekunden in 95 °C warmes H20 getaucht und mit Druckluft getrocknet. Die Lagerung erfolgt lichtgeschützt bei 4 °C.
Im folgenden wird ein Beispiel für eine mögliche Anordnung der Oligonukleotide aufgezeigt.
Es können aber auch beliebig anders gewählte Anordnungsvarianten für das Design des DNA Chips verwendet werden.
Die Oligonukleotide für die Positivkontrolle zur Bestimmung der Orientierung des Trägers 1 können beispielsweise an den Kreuzungspunkten der ersten Spalte mit der ersten und letzten
Reihe und am Kreuzungspunkt der letzten Spalte mit der letzten Reihe angeordnet sein. Die Oligonukleotide für Positivkontrollen zur Hybridisierung können beispielsweise in absteigender Konzentration in der ersten Spalte am Kreuzungspunkt mit der zweiten Reihe beginnend bis zur vorletzten Reihe, angeordnet sein. Die Oligonukleotide für die Positivkontrolle zur Be- Stimmung der Qualität der PCR können beispielsweise in aufsteigender Konzentration am
Kreuzungspunkt der ersten Reihe mit der zweiten Spalte beginnend bis zur letzten Spalte, angeordnet sein. Die Negativkontrolle kann, beispielsweise beginnend am dem Kreuzungspunkt der letzten Reihe mit der zweiten Spalte bis zur letzten Spalte, angeordnet sein. Die Oligonukleotide komplementär zur Zielsequenz sind beispielsweise alternierend in jedem zweiten Analysebereich 3 angeordnet. Die Analysebereiche 3 erstrecken sich beispielsweise vom
Kreuzungspunkt der zweiten Reihe mit der zweiten Spalte bis zum Kreuzungspunkt der vorletzten Reihe mit der letzten Spalte. Die Oligonukleotide gleicher Nukleotidsequenz, welche komplementär zur Zielsequenz sind, kommen mit bis zu drei Wiederholungen in verschiedenen Analysebereichen 3 vor.
DNA Extraktion
Aus klinischen Proben wird die totale DNA isoliert. Dies geschieht unter Verwendung von kommerziell angebotenen Kits (z. B. QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen folgend. PCR Amplifikation
Die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenzen kann wie folgend als Durchführungsbeispiel beschrieben, durchgeführt werden. 1/10 bis 1/1000 der total präparierten DNA werden amplifiziert. Dazu werden 2 μl lOfach PCR Puffer (100 mM Tris-HCl; pH 8,3; 500mM KC1;
15 mM MgCl2 und 0,01% Gelatine; Sigma), 2 μl 25 mM MgC12 (Sigma); 0,2 μl dNTP's Mix (25 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Vorwärtsprimer zu einer Endkonzentration von 0,05 μM und Rückwärtsprimer zu 0,5 μM zugegeben. Zusätzlich wird Escherichia coli DNA mit einer Endkonzentration von 10000 Kopien 20 μl und 1 Unit Taq Polymerase (Sigma) zu- gesetzt und mit H O auf ein Endvolumen von 19,5 μl aufgefüllt. Die DNA, gelöst in einem
Volumen von 0,5 μl wird zuletzt dem Reaktionsmix zugesetzt. Die Amplifikation erfolgt in einem Thermocycler der Firma Perkin Eimer (Gene Amp PCR System 9700). Es werden 0,2 ml MicroAmp® Reaktionsröhrchen verwendet. Die für die Amplifikation nötigen Temperaturschritte laufen wie folgt ab. Der erste Schritt ist eine 5 Minuten lange Denaturierungs- phase mit 94 °C, dann folgen 30 Zyklen mit 40 Sekunden bei 94 °C, 60 Sekunden bei 62 °C und 40 Sekunden bei 72°C. Den Zyklen folgt eine Extensionsphase mit 5 Minuten bei 72 °C. Es entsteht ein Amplifikationsprodukt von ungefähr 300 Basenpaaren, abhängig von der Sequenz der jeweilig amplifizierten Bakterienart. Die Amplifikationsbeschreibung ist nicht beschränkend zu sehen, und es können selbstverständlich auch alternative Amplifikationsbe- dingungen gewählt werden. Das Amplifikat wird direkt zur Hybridisierung eingesetzt oder vorher unter Verwendung von kommerziell angebotenen Kits (z. B. QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen folgend, gereinigt.
Hybridisierung
Um eine gleichmässige und spezifische Hybridisierung am DNA Chip zu gewährleisten wird der DNA Chip für die Hybridisierung wie folgt vorbehandelt. Es erfolgt 10 Minuten eine Vorinkubation bei 80 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Bei Raumtemperatur werden innerhalb dieser Zeit 10 μl der Hybridisierungslösung (lfach SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumeitrat, pH 7) und 10 fmol/μl Hybridisierungssonde) mit 10 μl PCR Amplifikat in einem DNAse-freien Reaktionsgefäß gemischt. Nach Ablauf der Vorinkubationszeit wird das Hybridisierungsgemisch in das Hybridisierungsareal am Chip pipettiert und unverzüglich mit einem Deckglas bedeckt. Die Hybridisierung erfolgt während einer 20 Minuten langen Inkubation bei 50 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Detektion
Nach erfolgter Hybridisierung wird das Deckglas entfernt und der DNA Chip unverzüglich in eine Waschlösung (lx SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumeitrat, pH 7) getaucht. Nach kurzem Schwenken folgt 2 Minuten die Inkubation bei 40 °C. Der Waschvorgang erfolgt weitere 3 Mal bei Raumtemperatur. Mit Druckluft werden etwaige Flüssigkeitsrückstände von der Chip Oberfläche 2 entfernt. Der trockene DNA Chip kann lichtgeschützt bei Raumtemperatur einige Tage bis zur Auswertung mit dem Lesegerät gelagert werden. Der DNA Chip wird in den Scanner (Genepix 4000A von Axon Instrument) eingelegt und durch Anregung der Cy3 und Cy5 Farbstoffmoleküle mit monochromatischem Licht gemessen.
Dieses Ausführungsbeispiel ist nicht beschränkend zu sehen und es können selbstverständlich die darin angegebenen Reagenzien in Konzentrationen, ausgewählt aus den jeweiligen in der Beschreibung genannten Bereichen bzw. alternative Reagenzien hierzu, enthalten sein.
Der Ordnung halber sei abschließend darauf hingewiesen, daß zum besseren Verständnis des Aufbaus der Vorrichtung zur Analyse von Zielnukleinsäuresequenzen, diese bzw. deren Bestandteile teilweise unmaßstäblich und/oder vergrößert und/oder verkleinert dargestellt wurden.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden.
Bezugszeichenaufstellung
Träger Oberfläche Analysebereich Kontrollbereich

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zur Analyse zumindest eines Analyten aus einer Probe umfassend einen Träger mit einer Oberfläche, auf welcher zumindest ein vordefinierbarer Analysebereich und zumindest ein vordefinierbarer Kontrollbereich angeordnet sind, wobei in dem vordefinierten Analysebereich zumindest ein erster Bindungspartner immobilisiert ist, der spezifisch an zumindest einen Analyten bindet, dadurch gekennzeichnet, daß in dem zumindest einen Kontrollbereich (4) zumindest ein weiterer Bindungspartner für zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Qualität der Analyse immobilisiert ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger plättchenförmig, wie z.B. in Form eines Objektträgers, plättchenförmig mit Vertiefungen, wie z.B. in Form von Chamberslides, oder in Form einer Mikrotiterplatte nach Abmessungen gemäß den Empfehlungen der SBS (Society of Biomolecular Screening) ausgebildet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt und/oder der spezifische Bindungspartner aus einer Gruppe umfassend Nukleinsäuren, wie z.B. DNA, RNA, PNA (Peptidnukleinsäuren), Proteine, wie z.B. Antiköφer, Epitope, Antigene, Scaffold Proteine, Fusionsproteine, insbesondere rekombinante Fusions- proteine, Signalproteine, Transmitter, Enzyme, Substrate, Hormone, Peptide, Lipide, Kohlenhydrate, wie z.B. Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, und deren modifizierten Formen ausgewählt ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Orientierung des Trägers (1) in einer
Analysevorrichtung ausgebildet ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis der Bindung des zumindest einen Analyten an den ersten und/oder weiteren Bindungspartner ausgebildet ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Qualität der Amplifikation, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Transkription vermittelte Amplifikation (TMA), Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR), Q-beta Replikase Amplifizie- rung, NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), Einzelstrang-Displacement Am- plifizierung oder Amplicon-Vektoren, ausgebildet ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis des Ursprungs der Probe, aus welcher der
Analyt nachgewiesen wird, und/oder des zumindest einen Analyten ausgebildet ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung von Kreuzreaktionen des zumindest einen Analyten mit einem weiteren Analyten und/oder dem zumindest ersten und/oder dem zum zumindest weiteren Bindungspartner ausgebildet ist.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis von Kontaminationen der Probe, aus welcher der zumindest eine Analyt nachgewiesen wird, und/oder des zumindest einen Analyten ausgebildet ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis der Effizienz der Isolierung des zumindest einen Analyten ausgebildet ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Intensitätsverstärkung des Detektions- signals ausgebildet ist.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zur Bestimmung der Immobilisierungseffektivität des ersten und/oder weiteren Bindungspartners ausgebildet ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis der Effizienz der Markierung des ersten und/ oder weiteren Bindungspartners ausgebildet ist.
14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Kontrolle zum Nachweis der Sensitivität und Linearität des Detekti- onssystems (Kalibration) ausgebildet ist.
15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger (1) in einem vorbestimmbaren Bereich der Oberfläche (2) zumindest eine Negativkontrolle angeordnet ist.
16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt und/oder die zumindest eine Kontrolle als Verdünnungsreihen mit unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, wobei jeweils eine Konzentration der Ver- dünnungsreihe in einem vorbestimmbaren Analyse- bzw. Kontrollbereich (3, 4) vorliegt.
17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationen des zumindest einen Bindungspartners in der Verdünnungsreihe mit einem Faktor, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1,5, insbesondere 2, vorzugsweise 3, und einer oberen Grenze von 100, insbesondere 30, vorzugsweise mit einem Faktor 10 abnehmen.
18. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine vorbestimmbare Konzentration des zumindest einen Bindungspartners und/ oder des zumindest weiteren Bindungspartners mehrfach in unterschiedlichen Analysebereichen (3) bzw. Kontrollbereichen (4) auf dem Träger (1) vorliegen.
19. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Bindungspartner für die Analyten und daß zumindest ein weiterer Bindungspart- ner für die Kontrolle auf dem Träger (1) in Spalten und Reihen angeordnet sind, wobei insbesondere jeweils unterschiedliche Bindungspartner für die Analyten in nebeneinander liegenden Bereichen und die weiteren Bindungspartner für die Kontrollen in gleichen und/oder in verschiedenen Konzentrationen in nebeneinander liegenden Bereichen der Spalten und Reihen angeordnet sind.
20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere der ersten Bindungspartner in mehreren Analysebereichen angeordnet sind, wobei die Bindungspartner spezifisch für zumindest ein mit Parodontitis, insbesondere Periodontitis, assoziiertes Bakterium ausgewählt sind.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Parodontitis, insbesondere Periodontitis, assoziierte Bakterium aus einer Gruppe umfassend Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacteroides forsythus, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis), Campylo- bacter rectus, Capnocytophaga gingivalis, Eikenella corrodens, Eubacterium nodatum, Fuso- bacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Poφhyromonas gingivalis, Prevotella in- termedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Treponema denticola oder Veillonella parvula ausgewählt ist.
22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der zumindest einen Positivkontrolle aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisierbar ist, die mittels zumindest einem Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5 '- CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3 ' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz 5'- GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG - 3' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz 5 '- CCCAACAYYTC ACGACACGAGCTGACGACAGCCAT - 3 ' amplifizierbar ist.
23. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielnukleinsäuresequenz aus Sequenzen ausgewählt ist, die mit zumindest einem Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5 '-AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3 ' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5'- CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz 5'- GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG - 3' und/oder einem Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz
5'- CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT - 3' amplifizierbar ist.
24. Verfahren zur Amplifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz, insbesondere mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Transkrip- tion vermittelte Amplifikation (TMA), Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR), Q-beta Repli- kase Amplifizierung, Einzelstrang-Displacement Amplifizierung oder Amplicon-Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß zur Amplifikation zumindest ein Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5'- AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3' und/oder ein Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz
5'- CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3' und/oder ein Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz 5'- GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG - 3' und/oder ein Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA- Sequenz 5'- CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT - 3' verwendet wird.
25. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Zielnukleinsäuresequenzen für verschiedene Bakterienarten gleichzeitig amplifiziert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zielnuklein- säuresequenz des Gens für eine 16S-rRNA der Bakterienarten oder Teilsequenzen daraus amplifiziert werden.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß für die Amplifikation Digoxigenin-, Biotin-, radioaktive Markierungen, wie z. B. 33P, Floureszenz- farbstoff-markierte Oligonukleotidprimer bzw. Nukleotide und/oder Markierungen, die mit optischen, elektrischen, elektrochemischen, magnetischen, photochemischen, photoelektrischen oder enzymatischen Detektionsverfahren nachgewiesen werden, verwendet werden.
28. Verfahren zur Identifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz umfas- send die Schritte Probenaufbereitung, Amplifikation, Markierung, Hybridisierung komplementärer Sequenzen an ein Oligonukleotid und Detektion des Hybridisierungssignals, dadurch gekennzeichnet, daß Amplifikate erzeugt werden, die mittels einer Amplifikation mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15 hergestellt werden.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate an zumindest ein Oligonukleotid für zumindest eine Positivkontrolle und zumindest eine Zielnukleinsäuresequenz auf demselben Träger binden.
30. Oligonukleotidprimer mit einer Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz aus einer Gruppe bestehend aus den Se- quenzen 5'-AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3',
5'- CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3', aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz
5'- GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG - 3 'oder aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der DNA-Sequenz
5'- CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT - 3' umfaßt.
31. Analysekit umfassend eine Vorrichtung zur Analyse und zumindest einen Oligonukleotidprimer zur Amplifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz, dadurch ge- kennzeichnet, daß die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und/oder der Oligonukleotidprimer nach Anspruch 30 gebildet ist.
32. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 für die Identifikation von Analyten.
33. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 für die Identifikation von Analyten von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten und/oder für die Identifikation von Analyten zum Nachweis von Genexpressionsmustern und/oder für die Identifikation von Analyten zum Nachweis von Single Nucleotide Polymoφhism (SNPs).
34. Verwendung des Analysekits nach Anspruch 31 für die Identifikation von Analyten.
35. Verwendung des Analysekits nach Anspruch 31 für die Identifikation von Analyten von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten und/oder für die Identifikation von Analyten zum Nachweis von Genexpressionsmustern und/oder für die Identifikation von Analyten zum
Nachweis von Single Nucleotide Polymoφhism (SNPs).
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US20040121335A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents associated with host versus graft and graft versus host rejections
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
EP1578399A4 (de) 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc Verfahren für die rasche identifikation von pathogenen bei tier und mensch
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8288523B2 (en) 2003-09-11 2012-10-16 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
DE10357677A1 (de) 2003-12-10 2005-07-14 Greiner Bio-One Gmbh Primer und Sonden zum Nachweis genitaler HPV-Genotypen
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
WO2005117270A2 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
EP1869180B1 (de) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Zusammensetzung zur Verwendung bei der Identifikation von Polyomaviren
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
US8026084B2 (en) 2005-07-21 2011-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
WO2007024840A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Critical Therapeutics, Inc. Method of quantitating nucleic acids by flow cytometry microparticle-based array
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
AT505850B1 (de) * 2007-10-10 2009-09-15 Greiner Bio One Gmbh Nachweis von mit parodontitis assoziierten keimen
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8534447B2 (en) 2008-09-16 2013-09-17 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
EP2488656B1 (de) 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Mehrfache verschiebungsverstärkung
AT512416B1 (de) 2012-02-13 2013-10-15 Greiner Bio One Gmbh Anordnung und verfahren zum nachweis von mikroorganismen in einem kulturgefäss

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006704A1 (en) * 1988-01-11 1989-07-27 Microprobe Corporation Oligonucleotide probes for detection of periodontal pathogens
CA2150986C (en) * 1994-06-17 1999-11-02 Mary Kathryn Meyer Oligonucleotide primers and probes for detection of bacteria
US6054278A (en) * 1997-05-05 2000-04-25 The Perkin-Elmer Corporation Ribosomal RNA gene polymorphism based microorganism identification
DE19822108A1 (de) * 1998-05-12 2000-02-03 Schering Ag Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika
DE19944168A1 (de) * 1999-09-15 2000-03-23 Ulrich Bohr Verfahren zum Genus-spezifischen Nachweis und zur Speziesidentifizierung von Bakterien der Gattungen Helicobacter und Wolinella

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03014382A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003014382A3 (de) 2003-10-23
ATA12472001A (de) 2003-03-15
AT411174B (de) 2003-10-27
AU2002332940A1 (en) 2003-02-24
WO2003014382A2 (de) 2003-02-20
WO2003014382A8 (de) 2004-04-08
WO2003014382B1 (de) 2004-02-12

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