DE19822108A1

DE19822108A1 - Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika

Info

Publication number: DE19822108A1
Application number: DE19822108A
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Gerbling; Frank-Roman Lauter; Lutz Grohmann
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2000-02-03
Also published as: EP1082465A2; DE19980848D2; JP2002514439A; WO1999058713A2; WO1999058713A3; AU5026099A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Detektionsverfahren und ein Testkit zur schnellen, ökonomischen Detektion von Keimen in pharmazeutischen und kosmetischen Produkten. Dabei werden spezifische Sonden und Primer eingesetzt, deren Replikation durch ein spezielles Indikatorsystem sichtbar gemacht wird, wobei ein Fluoreszenz-Farbstoff freigesetzt wird.

Description

Die Erfindung umfaßt Verfahren zum Nachweis mikrobieller Verunreinigungen nicht steriler Produkte, bevorzugt nach GMP-Richtlinien. Weiterhin umfaßt die Erfindung einen Testkit zum Nachweis mikrobieller Verunreinigungen und die Verwendung von Primersequenzen und Sondensequenzen zur Bestimmung von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika einschließlich ihrer Ausgangsstoffe und Zwischenprodukte.

Das Verfahren dient zur quantitativen Identifizierung von Bakterien durch Detektion spezifisch amplifizierter DNA-Sequenzen und soll als Ersatz entsprechender Methoden in der Europäischen Pharmakopöe, Abschnitt 2.6.12-13,1997 (EP) sowie weiteren nationalen Monographien wie zum Beispiel USP eingesetzt werden.

Die Herstellung von Arzneimitteln und Kosmetika nach GMP-Richtlinien beinhaltet chemische, physikalische und biologische Prüfungen zur Sicherstellung der Qualität. Bei Kosmetika muß der Hersteller dafür sorgen, daß von den Fertigprodukten keine Gesundheitsgefährdung ausgeht (EG Kosmetikverordnung, 76, 768 EWG (KOSVO), 6). Änderungsrichtlinie der EG KOSVO 93/35/EEC, 1993 und Forderungen des nationalen Rechts in Deutschland (LMBG § 24).

Bei Arzneimitteln sind die mikrobiologischen Reinheitsanforderungen wesentlich präziser und decken die Anforderungen der KOSVO mit ab (EP Abschnitt 2.6.12-13,1997).

Die Anforderungen beinhalten zwei Gruppen:

a) Die Zählung der gesamten lebensfähigen aeroben Bakterien und Pilze (Gruppe Gesamtkeimzahl) sowie
b) Den Abwesenheitsnachweis bestimmter Mikroorganismen: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Salmonellen und Enterobactriaceae (Gruppe Leitkeime).

Stand der Technik Keimzahlbestimmung mit Nährmedien

Als Methoden zur Zählung der gesamten lebensfähigen aeroben Bakterien (Gruppe Gesamtkeimzahl) werden in der EP konventionelle mikrobiologische Techniken beschrieben, die das Wachstum der nachzuweisenden Mikroorganismen in bestimmten Flüssignährmedien oder auf Agarplatten beinhalten. Im Handel sind zahlreiche entsprechende Fertigprodukte oder deren Ausgangsstoffe erhältlich.

Die Anwendung der in der EP beschriebenen Methoden zur Bestimmung der aeroben Keime (Gruppe Gesamtkeimzahl) hat folgende Nachteile:

- Die Effizienz ist niedrig, da hoher Zeitbedarf bis zum Ergebniserhalt (3-5 Tage) besteht.
- Die Ergebnisse sind unpräzise. Die Akzeptanzgrenzen dürfen um den Faktor 5 schwanken, EP, Abschnitt 2.6.12
- Die Testmethoden sind schlecht und nur im geringen Maße automatisierbar.
- Bedingt durch die Nährmedieneigenschaften können nur gut wachsende Mikroorganismen, nicht aber, wie gefordert, alle aeroben Mikroorganismen nachgewiesen werden.
- Die Lagerhaltungskosten sind für Medien und Brutschränke hoch.
- Bei Arzneimitteln mit bakteriostatischen Eigenschaften führt die Anwendung der EP-Methoden aufgrund der geringen Wiederfindung zugesetzter Testmikroorganismen teilweise zu nicht verwertbaren Ergebnissen.
- Umfangreiche Plastikabfälle fallen an.
- Die Energiekosten für Medienherstellung und Autoklavieren der anfallenden Abfälle sind hoch.
- Die Fertilitätsprüfung aller Medienchargen ist sehr aufwendig insbesondere wegen kurzer Haltbarkeiten von Fertigmedien.

Alternative Methoden zur Gesamtkeimzahlbestimmung im Handel sind: Geräte, die mittels Laserscan arbeiten wie z. B. CHEMSCAN (Chemunex):

- Diese Methode ist ungeeignet zum Nachweis von Mikroorganismen, die wie die Bakteriengattung Sarcina keine Einzelkolonien bilden.
- Außerdem eignet sich diese Methode nicht für feste und ölige Prüfprodukte.

Nachweis spezieller Mikroorganismen durch unterschiedliche Kultureigenschaften und spezielle Stoffwechselprodukte

Als Methoden zur Bestimmung spezieller Keime (Gruppe Leitkeime) werden in der EP mikrobiologische Techniken beschrieben, die zur Grobdifferenzierung das Wachstum der jeweiligen Mikroorganismen in bestimmten selektiven Nährmedien oder auf Agarplatten beinhalten. Anschließend werden zur Feindifferenzierung spezifische Stoffwechselreaktionen der jeweiligen Mikroorganismen wurde genutzt. Entsprechende Nachweissysteme, wie z. B. APILAB oder VITEK, sind weit verbreitet.

Die Anwendung der in der EP beschriebenen Methoden zur Bestimmung der speziellen Keime (Gruppe Leitkeime) hat die gleichen Nachteile, wie für die Anwendung der EP-geforderten Methoden zur Bestimmung der aeroben Keime (siehe oben). Ein zusätzlicher Nachteil ist, daß

- die Selektivität der Nachweismethoden auf Stoffwechselunterschiede beschränkt ist und damit nur unzureichende Differenzierungen zuläßt.

Nachweis spezieller Mikroorganismen durch ATP- Gehaltsbestimmung nach Vorkultivierung

Alternative Methoden im Markt sind: Mikrobiologische Schnelltests, beruhend auf einem Vitalnachweis durch ATP-Bestimmung (z. B. Firma Millipore) nach Vermehrung der Mikroorganismen in Nährmedien.

Nachteil:

- Speziesbestimmungen sind nicht möglich und
- die Meßergebnisse unterliegen hohen Schwankungen in Abhängigkeit des Vitalitätszustands und sind für unterschiedliche Bakteriengattungen sehr verschieden.

Nachweis spezieller Mikroorganismen nach Vorkultivierung mittels DNA-Sonden, Primern und PCR

Weitere alternative Methoden im Handel sind unterschiedliche PCR- Applikationen, die aber, wie z. B. bei Chen et al. 1997, J. Food Microbiol. 35, 239-250 auf die Prüfung von Lebensmitteln ausgerichtet sind und eventuell nicht die strengen GMP-Anforderungen an die Qualitätsprüfung von Arzneimitteln erfüllen.

- Die vorhandenen PCR-Applikationen sind in der Regel anfällig für Kontaminationen durch PCR-Produkte, sind wenig reproduzierbar und schwer quantifizierbar. Darüber hinaus sind sie zeitaufwendig, da bei den alternativen PCR-Verfahren in der Regel mehrere Hybridisierungsschritte zur Detektion des PCR-Produktes notwendig sind.
- Diese Technologien sind in der Regel außerdem nur begrenzt automatisierbar und störanfällig, da in der Regel zu mehreren Zeitpunkten der Applikation verschiedene Reagenzien zugegeben werden müssen.

Bei dem Verfahren gemäß der Patente US 4,800,159 und US 4,683,195 wird die zu amplifizierende Nukleinsäure, die einzelsträngig vorliegt oder einzelsträngig gemacht wird, mit einem molaren Überschuß zweier Oligonukleotidprimer unter Hybridisierungsbedingungen und in Gegenwart eines induzierenden Agens für die Polymerisation und Nukleotiden behandelt, wobei die Primer so gewählt werden, daß für jeden Strang ein zum Nukleinsäurenstrang komplementäres Verlängerungsprodukt des betreffenden Primers synthetisiert wird und daß ein Verlängerungsprodukt eines Primers, wenn es von seinem Komplement getrennt ist, als Matrize zur Synthese eines Verlängerungsproduktes des anderen Primers dienen kann. Nach Trennen der Verlängerungsprodukte von den Matrizen, an denen sie synthetisiert wurden, können die gebildeten Verlängerungsprodukte zur erneuten Umsetzung mit den Primern verwendet werden. Durch die zyklische Wiederholung der Schritte ergibt sich eine theoretisch exponentielle Vermehrung einer Nukleinsäuresequenz, die innerhalb der äußeren Hybridisierungspositionen der Primer liegt.

Quantitativer Nachweis von Mikroorganismen-DNA durch eine spezielle Fluoreszenz-PCR-Technologie

Eine verfeinerte Methode ist das Verfahren gemäß Patent US 5,210,015 von Gelfand et al. Dabei wird eine Oligonukleotid-Sondenkonstruktion verwendet, die mit einem Teil des Nukleinsäurestrangs der Matrize hybridisiert, wobei die Oligonukleotidsonde so ausgewählt wird, daß sie zwischen die Primerpaare (Vorwärts- und Rückwärtsprimer) für die Amplifikation der diagnostischen Zielsequenz des jeweiligen Mikroorganismus paßt. Die Sondenkonstruktion und Synthese basiert auf der TaqMan-Technologie (Holland et al. 1993 und Lyamichez et al. 1993).

Chemische Grundlage dieser neuen Methode ist der 1991 erstmalig publizierte 5'-Nuklease PCR-Assay (Holland et al. 1991, PNAS USA 88: 7276). Kernstück dieser Methode ist die 5'-Nuklease-Aktivität der TaqPolymerase und der Einsatz von fluoreszenzmarkierten, sequenzspezifischen Gensonden. Diese Gensonden sind am 5'-Ende mit einem Fluorescein-Derivat (Reporter) und am 3'-Ende mit einem Rhodaminderivat (Quencher) markiert. Durch die räumliche Nähe beider Farbstoffe wird die Fluoreszenzstrahlung des Reporters von dem Quencherfarbstoff absorbiert. Während der Polymerasekettenreaktion (PCR) werden Reporter und Quencher durch die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq- Polymerase räumlich voneinander getrennt. Die Fluoreszenzstrahlung des Reporters wird nicht mehr gequencht und kann direkt gemessen und quantifiziert werden. Je mehr Sonden gespalten werden, desto höher ist die Fluoreszenz-Emission der Reportermoleküle. Die Menge an freigesetzter Emission ist der Menge der entstehenden PCR Produkte proportional und diese ist wiederum der Kopienzahl der in der PCR eingesetzten Gene proportional. Über die Genkopienzahl läßt sich die in der Analysenprobe vorhandene Organismenzahl berechnen. Die Methode ist extrem sensitiv, da während der PCR Reaktion eine Genvermehrung und somit eine Signalamplifikation stattfindet. Da verschiedene Reporterfarbstoffe am Markt zur Verfügung stehen, können interne Kontrollen und Standards bei jeder Reaktion mitgeführt werden. Darüber hinaus kann eine Probe auf das Vorhandensein mehrerer Gene/Organismen gleichzeitig untersucht werden. Zur Zeit stehen im Handel drei verschiedene Reporterfarbstoffe zur Verfügung.

Primerdefinition (inklusive deren Variationen)

Unter einem Primer wird ein Molekül verstanden, das an einem polymeren Grundgerüst eine Anzahl von Nukleotiden aufweist. Die Sequenz der Nukleobasen wird so gewählt, daß sie zu aufeinanderfolgenden Basen der zu amplifizierenden Nukleotidsequenz zu mehr als 80% komplementär sind. Dieses Molekül besitzt jeweils mindestens ein verlängerbares Ende. Unter Verlängerung wird insbesondere die enzymkatalysierte Ankopplung von Baseneinheiten unter Verwendung von Mononukleosid-Triphosphat-Einheiten oder Oligonukleotiden verstanden. Als Enzym wird bevorzugt eine DNA- Polymerase eingesetzt. Die Nukleinsäure, die Nukleotidsequenzen enthält, welche amplifiziert werden sollen, dient hierbei als Matrize für den spezifischen Einbau von Basen. Die Sequenz der Matrize bestimmt die Sequenz der an den Primer angehängten Basen. Als Primer werden Moleküle mit 15-30 Basen verwendet. Als verlängerbares Ende dient im Falle einer DNA-Polymerase bevorzugt das 3'-Ende. Besonders bevorzugt sind Primer, die vollständig homolog zu einer Teilsequenz der Zielnukleotidsequenzen SEQ. ID. NO. 1-5 sind (Beispiel 24).

Sondendefinition (inklusive Variationen)

Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, das wie die Primer an einem polymeren Grundgerüst eine Anzahl von Nukleotiden aufweist. Dabei wird ein Sondenkonstruktionsverfahren gemäß Patent US 5,210,015, verwendet, das bereits oben beschrieben wurde. Die Nukleinsäuresonden der vorliegenden Erfindung sind 18-30 Nukleobasen lang. Spezifische Sequenzen erhält man durch Aussuchen einer mindestens 18 Basen langen Sequenz aus den jeweiligen Matritzen (SEQ. ID. NO. 1-5, Beispiel 24). Erfindungsgemäß sind daher Sonden bevorzugt, die zu mindestens 90% homolog zu einem Teil der jeweiligen Matritzen (SEQ. ID. NO. 1-5) sind. Besonders bevorzugt sind Sonden mit strenger Homologie.

Definition von Homologie

Gegenstand der Erfindung sind Nukleotidsequenzen, die zu mindestens 80%, bevorzugt zu 90% komplementär sind zu den Ziel-Nukleotidsequenzen SEQ. ID. NO. 1-5.

Die Homologie (in %) ergibt sich aus der Anzahl an identischen Purin- bzw. Pyrimidinbasen in einer gegebenen Nukleotidsequenz.

Definition von Hybridisieren

Hybridisieren liegt dann vor, wenn die folgenden Verfahrensschritte vorliegen, bevorzugt die folgenden Bedingungen.

Die erfindungsgemäßen Primer und Sonden binden an komplementäre Basen bevorzugt an komplementäre Nukleotidsequenzen im Erbgut der Zielorganismen aus der Gruppe Gesamtkeimzahl und an komplementäre Nukleotidsequenzen im Erbgut der Zielorganismen aus der Gruppe Leitkeime. Darüber hinaus binden sie bevorzugt nicht an Nukleinsäure-Sequenzen, die für andere Mikroorganismen spezifisch sind.

Definition von Arzneimittel

Diese Substanzen sind die in den Monographien der EP beschriebenen Wirkstoffe, Rohstoffe, Hilfsstoffe, und Zubereitungen, die zur Anwendung in der Humanmedizin und Veterinärmedizin bestimmt sind.

Definition von Kosmetika

Diese Substanzen sind nicht in den Monographien der Pharmakapöen beschrieben, sondern unterliegen den Richtlinien der KOSVO und des LMBG.

Sie umfassen Rohstoffe, Hilfsstoffe und Zubereitungen, die zur Anwendung an Menschen und Tieren bestimmt sind.

Definition von Mikroorganismus

Dieser Begriff umfaßt in erster Linie Organismen, die im menschlichen und tierischen Körper Krankheiten hervorrufen können und nur mikroskopisch wahrnehmbar sind. Sie sind in der Regel einzellig bzw. treten in lockeren Verbänden gleichartiger Zellen auf und werden aufgrund ihrer einfachen zellulären Organisation als Protisten bezeichnet. Ihre morphologischen und kulturell-biochemischen Merkmale, sowie ihre chemische Zusammensetzung, Antigen-Eigenschaften und genetischen Merkmale sind in der Literatur gut dokumentiert, z. B. in: Mikrobiologische Diagnostik, Burkhardt, 1992.

Definition von PCR-Reagenzien

PCR-Reagenzien sind Stoffe, die für eine PCR Reaktion mit maximaler Sensitivität und Spezifität notwendig sind, insbesondere DNA-Polymerase, Mg²⁺ Ionen wie z. B. MgCl₂, Kaliumsalze wie z. B. KCl, Additive wie z. B. Glycerin oder DMSO oder Formamid, Primer und Sonden, Desoxynukleotide, Puffersubstanz wie z. B. Tris-Base sowie optionale Zusätze in Form von passiven Fluoreszenzreferenz-Verbindungen wie z. B. das Fluoreszenzfarbstoff- Derivat ROX und z. B. 7-Deaza-2-deoxy-GTP als Ersatz von dGTP.

Aufgabe

Aufgabenschwerpunkt der vorliegenden Erfindung bildet die Entwicklung von Nachweisverfahren für Mikroorganismen, die erfahrungsgemäß häufig als Produktkontaminanten auftreten. Das sind insbesondere in Bezug auf die Gruppe der Leitkeime: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonellen Arten und in Bezug auf die Gruppe Gesamtkeimzahl: die Bakterien.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Reagenzien, Verfahren und die Verwendung von Substanzen, die den Nachweis mikrobieller Verunreinigungen nicht steriler Produkte zum Beispiel entsprechend Anforderungen der EP einfacher, präziser und effizienter gestalten. Dabei sollen weniger Komponenten als zum Beispiel entsprechend Anforderungen der EP enthalten sein. Eine weitere Aufgabe ist es, sehr sensitive und quantitative Nachweise für die geforderten Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen.

Lösung

Die Aufgabe wird gelöst durch:
Testkit zum Nachweis mikrobieller Verunreinigungen nicht steriler Produkte, insbesondere nach GMP-Richlinien, auch Kosmetika und Lebensmittel, umfassend mindestens ein DNA-Fragment, das die folgenden SEQ ID und Spacer (Abstandhalter) umfaßt:

a) einen Forward-Primer (SEQ ID_{Forward-Primer});
b) eine Sonde (SEQ ID_Sonde);
c) einen Reverse-Primer (SEQ ID_{Reverse-Primer});
d) gegebenenfalls einen Spacer zwischen Forward-Primer und Sonde,
e) gegebenenfalls einen Spacer zwischen Sonde und Reverse- Primer,
f) gegebenenfalls einen Spacer_upstream des Forward-Primers
g) gegebenenfalls einen Spacer_downstream des Reverse-Primers
- 1. wobei die SEQ ID [(SEQ ID_{Forward-Primer}); (SEQ ID_Sonde) und (SEQ ID_{Reverse-Primer})] auch Varianten umfassen, bei denen eine, zwei oder drei Nukleotide substituiert, deletiert und/ oder insertiert sind,
  dabei hat die Variante im wesentlichen dieselbe Funktion wie die Sequenz der SEQ ID [(SEQ ID_{Forward-Primer}) (SEQ ID_Sonde) und (SEQ ID_{Reverse-Primer})],
  bei Sonden die Funktion der Bindung an DNA und
  bei Primern die Funktion der Bindung an DNA und die Bereitstellung eines verlängerbaren 3' Endes für die DNA-Polymerase;
- 2. wobei die Spacer 0-40 Nukleotiden umfassen,
das DNA-Fragment genommen aus der Gruppe
h) für Staphylococus aureus
SEQ. ID. NO. 6 als Forward-Primer
SEQ. ID. NO. 7 als Sonde und
SEQ. ID. NO. 8 als Reverse-Primer
i) für Pseudomonas aeruginosa
SEQ. ID. NO. 9 als Forward-Primer
SEQ. ID. NO. 10 als Sonde und
SEQ. ID. NO. 11 als Reverse-Primer
j) für Escherichia coli
SEQ. ID. NO. 12 als Forward-Primer
SEQ. ID. NO. 13 als Sonde und
SEQ. ID. NO. 14 als Reverse-Primer
k) für Salmonella ssp.
SEQ. ID. NO. 15 als Forward-Primer
SEQ. ID. NO. 16 als Sonde und
SEQ. ID. NO. 17 als Reverse-Primer
l) für Bakterien
SEQ. ID. NO. 18 als Forward-Primer
SEQ. ID. NO. 19 als Sonde und
SEQ. ID. NO. 20 als Reverse-Primer

Vorteilhaft ist eine Kombination aus zwei mehr bevorzugt aus drei noch mehr bevorzugt aus vier und am meisten bevorzugt aus fünf Gesamtsequenzen. Bevorzugt mit PCR Reagenzien, Definition bereits im Text.

Mehr bevorzugt mit PCR Reagenzien und TaqMan. Definitionen bereits im Text.

Alle genannten Sequenzen sind in dem Beispiel 24 aufgeführt. Für eine erfolgreiche TaqMan-PCR werden an die Primer- und Sondensequenzen (Beispiel 24) folgende Anforderungen gestellt:

- Primer sollten zwischen 15-30 Basen lang sein.
- Sondensequenz muß sich zwischen Primer-Sequenzen auf der zu amplifizierende DNS befinden.
- Sonde sollte zwischen gegebenenfalls 18-30 Basen lang sein.
- Sonde sollte einen GC-Gehalt von 40-60% besitzen.
- Der Tm der Sonde (Schmelzpunkt) sollte um 5-10 C° über dem Tm der Primer liegen
- Am 5' Ende der Sonde sollte sich ein G befinden.
- In der Sondensequenz sollte nie mehr als 3 mal die selbe Base hintereinander folgen.
- Keine Komplementarität zwischen Sonde und Primern oder innerhalb der Primer und keine auffälligen Sekundärstrukturen innerhalb der Sonde und der Primer.

Trotz dieser allgemeinen Richtlinien für das Design von Primern und Sonden (Livak et al. 1995, Guidelines for designing Taqman fluorogenic probes for the 5' Nuclease assays, Perkin Eimer Research News) muß die optimale Primer- und Sondenkombination für jede TaqMan-PCR-Anwendung neu experimentell bestimmt werden. Es konnte in einer Reihe von Beispielen (Beispiel 25) gezeigt werden, daß obwohl oben genannten Richtlinien eingehalten wurden, kein optimales TaqMan PCR System entwickelt werden konnte. Auf der anderen Seite ist man durch die Sequenzcharakteristika der diagnostischen Zielsequenz des jeweiligen Organismus (z. B. hoher GC Gehalt, stark repetitive Sequenzen oder konservierte Sequenzbereiche) ggf. gezwungen, Primer- und Sondensequenzen auszuwählen, die nicht den oben genannten Designrichtlinien entsprechen. Konsequenz dieser Einschränkungen zu den Richtlinien ist, daß zum Erreichen der notwendigen Spezifität und Sensitivität eines TaqMan-PCR-Tests die Auswahl der diagnostischen Zielsequenz aus dem Genom des zu detektierenden Mikroorganismus und die experimentelle Determinierung der optimalen Primer- und Sondensequenzen essentiell ist.

d. PCR-Reaktionsbedingungen einschließlich TaqMan Puffer

Die Spezifität und Sensitivität eines TaqMan-PCR Tests wird neben den Primer- und Sondensequenzen (a-c) durch folgende Parameter bestimmt:

a) Höhe der Denaturierungstemperatur in den ersten PCR-Zyklen
b) Höhe der Annealingtemperatur während der Amplifikationsphase der PCR
c) Anzahl der PCR Zyklen
d) Einsatz von PCR-Additiven wie Glycerin und/oder Formamid
e) Einsatz von 7-Deaza-2-deoxy-GTP neben GTP bei Genen mit hohem G/C Gehalt
f) Höhe der Mg⁺⁺-Ionen-Konzentration im PCR-Puffer
g) Konzentration der Primer und Sonde
h) Menge an Taq-DNA-Polymerase
i) Abstand des cis-orientierten Primers zur Sonde

Alle diese Parameter wurden bei der Entwicklung hier aufgeführten TaqMan- PCR Tests experimentell berücksichtigt (Daten nicht gezeigt).

Beschreibung der Nukleinsäuren, die als diagnostische Zielsequenzen eingesetzt werden

Unter den Nukleinsäuren, die zur Verwendung des Amplifikationsverfahren und Nachweisverfahrens für die oben genannten Zielorganismen verwendet werden können, werden insbesondere genomische Nukleinsäuren verstanden.

Genomische Nukleinsäure-Sequenzen enthalten unter anderem auch die Gene bzw. Genfragmente, die für eine bestimmte Mikroorganismenart, -gattung, -familie oder -abteilung charakteristisch sind. Die Nukleinsäure-Sequenzen können in einen PCR-Test als diagnostische Zielsequenzen für einen spezifischen Nachweis dieser Art, Gattung, Familie oder Abteilung eingesetzt werden.

Für den Nachweis der oben genannten Zielorganismen wurden folgende Zielsequenzen ausgewählt:

Organismus/nen
Genbezeichnung
(i) Staphylococus aureus	cap 8
(ii) Pseudomonas aeruginosa	alg Q
(iii) Escherichia coli	mur A
(iv) Salmonella ssp.	inv A
(v) Bakterien	16S r RNA

Die Gene, aus denen die diagnostischen Zielsequenzen ausgewählt wurden, werden in den Beispielen detailliert beschrieben.

Verfahren

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere Arzneimitteln oder Kosmetika, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Einsetzen von Primern und fluoreszenzmarkierten Sonden mit den entsprechenden Sequenzen und deren Variationen,
- a) für Staphylococus aureus
  SEQ. ID. NO. 6 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 7 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 8 als Reverse-Primer
- b) für Pseudomonas aeruginosa
  SEQ. ID. NO. 9 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 10 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 11 als Reverse-Primer
- c) für Escherichia coli
  SEQ. ID. NO. 12 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 13 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 14 als Reverse-Primer
- d) für Salmonella ssp.
  SEQ. ID. NO. 15 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 16 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 17 als Reverse-Primer
- e) für Bakterien
  SEQ. ID. NO. 18 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 19 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 20 als Reverse-Primer
b) Vervielfältigen der DNA mit PCR; und
c) Bestrahlung mit spezifischen Wellenlängen, die den Fluoreszenzfarbstoff anregen,
d) Messung und Quantifizierung der Emission des angeregten Fluoreszenzfarbstoffes.

Die Erfindung umfaßt ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Herstellung der Sonden auf der TaqMan-Detektionstechnologie beruht.

Kern der Erfindung

Kern der Erfindung ist die Kombination bestimmter ausgewählter Sonden/Primer-Paare, die Mikroorganismen zufriedenstellend detektieren können. Die Optimierung der Sonden/Primer-Paare und der PCR Reaktionsbedingungen auf Sensitivität und Eignung zur GMP-konformen Produktprüfung nach EP, 2.6.12-13: Microbial contamination of products not required to comply with the test for sterility (1997) ist ebenfalls wesentlich. Dabei wird eine PCR-Technologie nach den US-Patenten US 4,800,159 und US 4,683,195 verwendet. Dabei findet insbesondere die TaqMan-Technologie Anwendung, die in dem US-Patent 5,210,015 beschrieben ist, welches am 11. Mai 1993 als Patent herausgegeben worden ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren oder dem erfindungsgemäßen Testkit handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der Fluoreszenz-PCR Technologie (TaqMan) für die oben genannten Zielmikroorganismen.

Vorteile

Die erfindungsgemäßen Verfahren und die Testkits sind denen in der EP vorgeschriebenen Analysenmethoden in vielen Punkten weit überlegen (für Kosmetika wird z. Zt. noch keine vorgeschriebene Methode gefordert) und sollen diese, nach Validierung des Verfahrens mit dem jeweiligen Prüfprodukt, vollständig ersetzen. Die Möglichkeit, andere Analysenmethoden zu benutzen, wird in der EP (General Notices) explizit zugelassen, wenn sie die gleichen Ergebnisse wie die vorgeschriebenen Methoden ergeben.

Insbesondere hat das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Vorteile:

(A) Kit und Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen der Gruppe Gesamtkeimzahl

Erstmals können durch Anwendung dieses Kits und Verfahrens ohne vorhergehende Kultivierung alle kontaminierenden Bakterien, deren Sequenz in der NIH Datenbase, USA, Stand 11.1997, beschrieben sind, analytisch bestimmt werden. Dabei werden lebende und nicht-vermehrungsfähige Bakterien quantitativ und sehr präzise mit einer Sensitivität von 1-3 Bakterien im Prüfprodukt erfaßt. Konsequenz der Anwendung ist eine deutliche erhöhte Produktsicherheit für den Verbraucher, da:

- Sporen und schwer kultivierbare Bakterien, von denen eine Gesundheitsgefährdung ausgehen kann, erfaßt werden können,
- Nicht-vermehrungsfähige Bakterien, die schwer nachweisbare Toxine enthalten, ebenfalls erfaßt werden können,
- Kontaminierende DNA bakterieller Herkunft, deren Abwesenheit zur Zeit schon in Biologicals und Produkten aus der rDNA-Technologie gezeigt werden muß, (EP,1997 und USP 1995) in allen Prüfprodukten einfach und effizient nachgewiesen werden kann.
- Außerdem gibt es für die Anwendung keine besonderen Sicherheitsauflagen, da keine Komponenten des Kits einer Gefahrstoffverordnung unterliegen.

(B) Alle beanspruchten Kits und Verfahren

- Die Anwendung hat ökonomische Vorteile für Verbraucher und Hersteller, da die bisherigen Verfahren um mehrere Tage zeitaufwendiger sind und häufig den zeitbestimmenden Schritt in der Freigabeanalytik darstellen. Schnelle Ergebnisse zur mikrobiologischen Sicherheit eines biologisch anfälligen Prüfprodukts führen zur Senkung der Kosten in Entwicklung und Produktion wie z. B. niedrigere Lagerhaltungskosten oder schnellerer Response auf variable Marktanfragen und damit insgesamt zur Senkung der Gestehungskosten, die in preiswertere Produkte einmünden.
- Die Anwendung hat ökologische Vorteile, da die Reduktion von Analysenzeit und Analysenmaterial (Plastik und Medien) die erheblichen Energiekosten deutlich erniedrigt.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die entwickelten PCR-Schnelltests zur Detektion der Zielmikroorganismen, inklusive aller Sequenzvariationen und Targetsequenzen

a) Staphylococus aureus (Beispiele 1-5)
b) Pseudomonas aeruginosa (Beispiele 6-9)
c) Escherichia coli (Beispiele 10-13)
d) Salmonella ssp. (Beispiele 14-17)
e) Bakterien (Beispiele 18-23)
f) Target-Sonden und Primersequenzen (Beispiel 24)
g) Sequenzvariationen (Beispiel 25)
h) Entwicklungssequenzen Sonden und Primer mit nicht zufriedenstellender Testspezifität/Sensitivität (Beispiel 26)

Beispiel 1 DNA-Freisetzung nach Voranreicherung

Je 100 µl-Aliquote der jeweiligen Mikroorganismen-Kultur wurde zur Freisetzung der DNS lysiert (Makino et al. Applied Environ. Microbiol. 3745-3747, 1995). Die DNS wurde von Proteinen und sonstigen PCR-Inbibitoren gereinigt und dann in PCR Amplifikationsexperimenten eingesetzt.

Beispiel 2 Nachweis von Staphylococcus aureus

Der Nachweis von S. aureus erfolgte durch erfindungsgemäße artspezifische Amplifikation von cap-8 Gensequenzen (SEQ. ID. NO. 1, siehe Beispiel 24). Das cap-8 Gencluster verschlüsselt Proteine, die bei der Biosynthese der Kapsel von S. aureus beteiligt sind. Die Kapsel umhüllt die Oberfläche dieser Bakterien und stellt einen Schutzmechanismus gegen die Abwehrmechanismen der Wirtsorganismen dar. Die molekulare Zusammensetzung der Kapsel ist für S. aureus spezifisch und stellt sozusagen einen molekularen Fingerabdruck dieser Staphylococcen-Art dar. Der (open reading frame O) ORF-O des cap-8 Genclusters ist in den verschiedenen Serotypen von S. aureus konserviert (Sau und Lee 1996, J. Bacteriol. 178, 2118-2126). Die DNA-Sequenzen aus dem ORF-O des cap-8 Genclusters (SEQ. ID. NO. 1) wurden als diagnostische DNA- Sequenzen zur Synthese von artspezifischen DNA-Primern und Sonden ausgewählt.

Als Resultat von DNA-Sequenzdatenbank-Vergleichen und praktischen Optimierungsarbeiten, unter Verwendung verschiedener Primer- und Sondenkombinationen, wurden folgende cap-8 spezifische DNA-Sequenzen als optimale Primer-/Sonden Kombination bestimmt:

1. PCR-Sonde

20 mer 5'-TAMRA- CCT GGT CCA GGA GTA GGC GG 3'-FAM
(Sonde cap-8 # 15460*, als reverse complement einsetzen) SEQ. ID. NO. 7

Sonden wurden von der Firma PE Applied Biosystems Division, Weiterstadt, Deutschland hergestellt. Es handelt sich um einzelsträngige Oligonukleotide, die am 5' Ende mit einem Fluoreszenzderivat (FAM = 6-carboxyfluorescein) und am 3' Ende mit einem Rhodaminderivat (TAMRA = 6-carboxytetramethylrhodamine) modifiziert worden. Synthese und Reinigung erfolgte entsprechend der Vorschriften von PE-Applied Biosystems.

2. PCR-Primer

24 mer: 5' -AGA TGC ACG TAC TGC TGA AAT GAG -3'
(Primer cap-8 forward # 15297*) SEQ. ID. NO. 6

26 mer: 5' -GTT TAG CTG TTG ATC CGT ACT TTA II-3'
(Primer cap-8 reverse # 15485* als reverse complement einsetzen) SEQ. ID. NO. 8

*Die Positionen beziehen sich auf die in der von Sau and Lee (1996, J. Bacteriol. 178, 2118-2126) publizierten cap-8 DNS Sequenz.

Synthese und Reinigung der PCR Primer Oligonukleotide erfolgte durch die Firma PE Applied Biosystems und nach deren Protokollen.

Beispiel 3 PCR-Bedingungen für den Nachweis von Staphylococcus aureus

Nach Variation von Primer- und Sondenkonzentration, und MgCl₂ Konzentration ergaben sich folgende Bedingungen als optimal:
Alle Komponenten wurden von der Firma PE Applied Biosystems, Weiterstadt, bezogen. Herstellung der TaqMan-PCR-Reaktionsgemische, Durchführung der PCR Reaktionen und Bedienung der PCR Heizblocks bzw. des Fuoreszenz- Detektors (PE ABD Modell 7700 oder Modell LS50B) erfolgte nach Anweisungen des Geräteherstellers (User's Manual, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, PE Applied Biosystems 1997, bzw. Users Manual, PE ABI LS50 B).

Folgende Komponenten wurden in einem PCR Reaktionsgefäß (PE Applied Biosystems Best. Nr. N8010580) gemischt:

Für eine optimale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist darauf zu achten, daß bei jedem PCR-Lauf möglichst viele Komponenten des PCR-Mixes in einem sogenannten Mastermix vorgemischt werden. Unter Standardbedingungen wird nur das zu untersuchende DNA-Material (0-15.25 µl) als Komponente in jedes PCR Reaktionsgefäß separat zugeben.

Die PCR-Reaktionen werden in dem PCR Heizblock des ABI Sequence Detectors 7700 durchgeführt. Funktional äquivalent sind PCR-Heizblöcke mit vergleichbaren Heiz- und Wärmetransfereigenschaften, wie z. B. die PE ABI Geräte Modell 7200, 9700, 9600 und 2400. Das PCR-Zyklusprofil ist wie folgt:

Für detaillierte Erklärungen zum PCR-Zyklus-Profil siehe: User's Manual, ABI Prism 770 Sequence Detection System, PE Applied Biosystems 1997.

Beispiel 4 Selektivität des S. aureus PCR-Schnelltests 4.1 Elektrophoretische Analyse

Um die Selektivität des PCR-Tests abzuschätzen, wurde genomische DNA aus verschiedenen Organismen isoliert und im PCR Test eingesetzt (Abb. 1, Sambrock et al. 1993). Die entstandenen PCR-Produkte wurden elektrophoretisch analysiert. Die PCR-Produkte hatten eine Größe von 213 Basenpaaren. Kontrollsequenzierungen der PCR-Produkte verifizierte, daß es sich um cap8-0 DNA handelte (ohne Abbildung).

Die DNA (10 ng pro Spur, 2-14) aller eingesetzten S. aureus Stämme (Lane 2-5) wurde von den cap8-0 Primern (# 15297 und # 15485) detektiert. Dem gegenüber wurde die DNA einer nahe verwandten Staphylococcus Art, S. epidermidis (Lane 6) und die anderer bakterieller Gattungen (Lane 7-11) nicht detektiert. DNA aus Pilz, Fisch und Mensch (Lane 12-14) wurden als Kontrollen eingesetzt und ergaben kein Detektionssignal. NTC ( = no template control) ist die Wasserkontrolle, in der keine DNA eingesetzt wurde.

4.2 Fluoreszenzanalyse

Neben der elektrophoretischen Analyse wurde die Selektivität der diagnostischen PCR als TaqMan-Fluoreszenztest unter Verwendung der oben genannten Primer und Fluoreszenzsonde bestimmt. Die Resultate sind als Ct- Werte (Threshold cycle) angegeben.

C_t-Wert: Die bei der TaqMan-PCR stattfindende Hydrolyse der Fluoreszenzsonde führt zu einem Anstieg der Reporterfluoreszenzstrahlung von einem PCR-Zyklus zum Nächsten. Die Zyklenzahl, bei der erstmals die Reporterfluoreszenzstrahlung über der Hintergrundstrahlung (NTC) des Systems liegt und linear ansteigt, wird "Threshold cycle" (C_t) genannt. (Hintergrundstrahlung (NTC) ist die Reporterfluoreszenzstrahlung in PCR Kontrollreaktionen, in denen keine Template-DNA eingesetzt wurde.) Sowohl die Menge an freiwerdender Reporterstrahlung als auch der "Treshold cycle" (C_t- Schwellenwert-Zykluszahl) sind proportional zu der Menge an entstehenden PCR Produkten und somit zu der Menge an eingesetzten Genkopien (Keimzahl).

Je mehr Genkopien eingesetzt werden, desto niedriger ist der resultierende C_t- Wert. In einem PCR-System mit 100%iger Effizienz nimmt der C_t-Wert mit jeder Verdopplung der Start-Genkopienzahl um einen Zyklus ab. Bei einer PCR- Reaktion die z. B. 40 Zyklen umfaßt, und bei der kein PCR Produkt entsteht, wird der C_t-Wert per Definition 40 sein.

Es werden je 10 ng an Template-DNA in den PCR-Reaktionen für den Spezifizitätstest eingesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind in Beispiel 3 angegeben.

(je 10 ng genomische DNS analysiert)

Liste der getesteten DNA-Isolate
Organismus
Resultat(als CT-Wert)
AL=L<Staphylococcus aureus Arten
AL=L CB=3<S. aureus@	DSM 683 (ATCC 9144)	17
DSM 1104 (ATCC 25923)	17
DSM 6148	17
DSM 346 (ATCC 6538)	17
AL=L<S. epidermidis
DSM 1798 (ATCC 12228)	40
AL=L<Andere bakterielle Gattungen
AL=L CB=3<Pseudomonas aeruginosa@	DSM 1117 (ATCC 27853)	40
DSM 1128 (ATCC 9027)	40
DSM 3227 (ATCC 19429)	40
DSM 50071 (ATCC 10145)	40
AL=L<Salmonella typhimurium
DSM 5569 (ATCC 13311)	40
AL=L<Streptococcus faecalis
DSM 2981 (ATCC 14506)	40
(reclassified DSM 2570 (ATCC 29212) as Enterococcus faecalis)	40
DSM 6134	40
AL=L<Escherichia coli
DSM 787 (ATCC 11229)	40
DSM 1576 (ATCC 8739)	40
AL=L<Eukaryonten
Neurospora crassa	40
Mensch (Perkin Eimer ABI, 401846)	40
Salmon (Sigma D 9156)	40
Wasser	40

Nach etwa 17 Zyklen wurde erstmals ein linearer Anstieg der FAM-Fluoreszenz über der FAM-Hintergrundstrahlung der Fluoreszenzsonde detektiert, wenn S. aureus genomische DNA in der Fluoreszenz-PCR eingesetzt wurde. Wurde DNS von S. epidermidis in der PCR angesetzt, einer nahe verwandten Art von S. aureus innerhalb der Gattung Staphylococcus, so ließ sich kein signifikanter Anstieg der FAM-Reporterfluoreszenz detektieren.

Die Ergebnisse der PCR-Analyse mit DNA aus verschiedenen bakteriellen Gattungen, Staphylococcus-Arten und Staphylococcus aureus Stämmen zeigt die Spezifität des entwickelten S. aureus Tests. Nur S. aureus DNS wurde von den cap-8 Primern und Sonden detektiert.

Beispiel 5 Sensitivität des S. aureus Nachweisverfahrens

Um die Sensitivität des S. aureus PCR-Tests zu bestimmen, wurde genomische S. aureus DNA präpariert und in PCR-Experimenten eingesetzt.

10 fg genomische S. aureus DNA entsprechen 3 Genomen (Strauss and Falkow 1997, Science 276, 707-712).

10 fg = 3 KBE
10 pg = 3.000 KBE
10 ng = 3.000.000 KBE

Verschiedene Mengen an S. aureus DNA (1 fg bis 100 ng) wurden in der Fluoreszenz-PCR eingesetzt (Abb. 2). Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte aus 6 unabhängigen Experimenten dar. Die Menge an freiwerdender Fluoreszenz und somit an entstehenden PCR-Produkten wurde als CT-Wert angegeben.

Das Ergebnis zeigt, daß sich die DNA von 3 Bakterienzellen mittels Fluoreszenz-PCR nachweisen läßt. Der PCR-Schnelltest erlaubt eine lineare Quantifizierung der eingesetzten S. aureus Genome über 5 log Stufen, d. h. zwischen 3 und 300.000 KBE (1 ng DNS).

Beispiel 6 Nachweis von Pseudomonas aeruginosa

Der Nachweis von Pseudomonas aeruginosa erfolgte durch erfindungsgemäße artspezifische Amplifikation von algQ-Gensequenzen (Sequenzen s. Beispiel 24). Das algQ-Gen verschlüsselt Elemente eines Schutzmechanismus der von Pseudomonas aeruginosa im Laufe der Evolution entwickelt wurde, und der für diese Bakterienart spezifisch ist.

Die Produktion von Alginat ist eine einzigartige Virulenzeigenschaft von Pseudomonas aeruginosa. Alginat ist ein Polymer aus Mannuron- und Guluronsäure (1,4 glykosidisch verknüpft). Dieses Polymer bildet eine viskoses Gel auf der Bakterienoberfläche. Die Produktion dieses Biogels ist sehr sensitiv reguliert. Die Fähigkeit, Alginat zu synthetisieren, ist bei allen Pseudomonas aeruginosa Stämmen vorhanden. Sie ist charakteristisch für diese Bakterienart. Alginat-Synthese ist ein energiekonsumierender Prozeß und deshalb reguliert.

Ein Gen, das Alginat-Synthese reguliert, ist das algQ-Gen (Konyecsni and Deretic 1990, J. Bacteriol. 172, 2511-2520). Es verschlüsselt die sensorische Komponente eines Signaltransduktions-Systems (Roychoudhury et al. 1993, PNAS USA 90 : 965-969). Da das algQ-Gen an der Regulation eines spezifischen Schutzmechanismus beteiligt ist, stellt es einen genetischen Marker mit diagnostischer Potenz zur Identifizierung der Art Pseudomonas aeruginosa dar.

Als Resultat von DNA-Sequenzdatenbank-Vergleichen und praktischen Optimierungsarbeiten, unter Verwendung verschiedener Primer- und Sondenkombinationen, wurden folgende algQ-spezifische DNA-Sequenzen als optimale Primer-/Sonden Kombination bestimmt:

1. PCR-Sonde

26 mer: 5'-FAM - CCA ACG CCG AAG AAC TCC AGC ATT TC - TAMRA
(Sonde algQ# 911): SEQ. ID. NO. 10

Die Sonden wurden von der Firma PE Applied Biosystems Division, Weiterstadt, Deutschland hergestellt. Es handelt sich um einzelsträngige Oligonukleotide, die am 5' Ende mit einem Fluoreszenzderivat (FAM = 6-carboxyfluorescein) und am 3' Ende mit einem Rhodaminderivat (TAMRA = 6-carboxytetramethylrhodamine) modifrziert worden. Synthese und Reinigung erfolgte entsprechend der Vorschriften von PE-Applied Biosystems.

2. PCR-Primer

23 mer: 5'-CTT CGA TGC CCT GAG CGG TAT TC-3'
(Primer algQ forward # 876*) SEQ. ID. NO. 9

Reverse Primer Sequence (# 1147):
23 mer: 5'-CTG AAG GTC CTG CGG CAA CAG TT-3'
(Primer algQ reverse # 1147* als reverse complement einsetzen) SEQ. ID. NO. 11

* Positionen beziehen sich auf die in Konyecsni and Deretic 1990, J. Bacteriol. 172, 2511-2520 publizierte DNA-Sequenz.

Beispiel 7 PCR-Bedingungen für den Nachweis von P. aeruginosa

Nach Variation von Primer- und Sondenkonzentration, und MgCl₂ Konzentration ergaben such folgende Bedingungen als optimal:

Die PCR-Reaktionen werden in dem PCR Heizblock des ABI Sequence Detectors 7700 durchgeführt. Funktional äquivalent sind PCR-Heizblöcke mit vergleichbaren Heiz- und Wärmetransfereigenschaften, wie z. B. die PE ABI Geräte Modell 7200, 9700, 9600 und 2400.

Das PCR-Zyklenprofil für die Pseudomonas aeruginosa PCR ist wie folgt:

Für Details zu PCR-Bedingungen siehe Beispiel 3.

Beispiel 8 Selektivität des Pseudomonas aeruginosa PCR-Schnelltests

Um die Selektivität des PCR-Tests abzuschätzen, wurde genomische DNA aus verschiedenen Organismen isoliert und im Fluoreszenz-PCR Test eingesetzt. Die Menge an entstandenen PCR Produkten wurde als CT-Wert (Threshold Cycle, für C_t-Wert s. Definition Beispiel 4) angegeben.

(je 10 ng genomische DNS analysiert)

Liste der getesteten DNA-Isolate
Organismus
Resultat (als CT-Wert)
AL=L<Pseudomonas Arten
AL=L CB=3<P. aeruginosa@	DSM 1117 (ATCC 27853)	19
DSM 1128 (ATCC 9027)	19
DSM 3227 (ATCC 19429)	19
DSM 50071 (ATCC 10145)	19
AL=L<P. putida
DSM 50026	45
AL=L<P. fluoreszenz
ATCC 948	45
AL=L<Andere bakterielle Arten
AL=L CB=3<Staphylococcus aureus@	DSM 683	45
DSM 1104	45
DSM 6148	45
DSM 6538P	45
AL=L<Streptococcus faecalis
DSM 2981	45
DSM 6134	45
ATCC 29212	45
AL=L<Salmonella typhimurium
ATCC 13311	45
AL=L<Escherichia coli
DSM 301	45
DSM 787	45
DSM 1103	45
ATCC 8739	45
AL=L<Eukaryonten
Neurospora crassa	45
Arabidopsis thaliana	45
Salmon (Sigma D9156)	45
Mensch (Perkin Elmer ABI, 401846)	45
Wasser	45

Ausschließlich Pseudomonas aeruginosa Stämme ergaben ein positives Ergebnis im PCR-Schnelltest. Nach 19 PCR Zyklen (CT = 19) war erstmals ein linearer Anstieg der Fluoreszenz meßbar, wenn 10 ng P. aeruginosa DNS eingesetzt wurden. Der PCR Test war hochspezifisch. Auch die nahe verwandten Arten P. putida und P. fluoreszenz ergaben kein Fluoreszenzsignal im PCR-Schnelltest.

Als Positivkontrolle wurden die selben bakteriellen DNS, die im algQ-PCR-Test analysiert worden waren mit dem universellen 16S rRNA PCR System (s. Beispiel 19) untersucht. Alle bakteriellen DNS ergaben ein positives Signal mit dem 16S rRNA System. Das bedeutet, alle DNS ließen sich 16S rRNA-PCR amplifizieren, aber lediglich die P. aeruginosa DNS ließen sich algQ-PCR amplifizieren.

Das algQ-System ist Pseudomonas aeruginosa spezifisch.

Zusätzlich wurden die entstandenen PCR-Produkte elektrophoretisch analysiert (vgl. Beispiel 3). Die PCR-Produkte hatten eine Größe von 294 Basenpaaren (ohne Abbildung). Kontrollsequenzierungen der PCR-Produkte verifizierte, daß es sich um algQ DNS handelte (ohne Abbildung)

Beispiel 9 Sensitivität und Linearität des P. aeruginosa PCR-Schnelltests

Um die Sensitivität des P. aeruginosa PCR-Tests zu bestimmen, wurde genomische P. aeruginosa DNS präpariert und in PCR-Experimenten eingesetzt (Abb. 3). Verschiedene Mengen an P. aerugonosa Genomkopien wurden in der Fluoreszenz-PCR eingesetzt (Abb. 3). Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus 4 unabhängigen Experimenten dar. Die Menge an freiwerdender Fluoreszenz und somit an entstehenden PCR-Produkten wird als CT-Wert angegeben. Die PCR-Reaktion wurde über 45 Zyklen durchgeführt. Der CT-Wert der Wasserkontrolle (NTC = no template control) betrug 45.

Das Ergebnis zeigt, daß sich die DNS von 3 Bakterienzellen mittels Fluoreszenz-PCR nachweisen läßt. Der PCR-Schnelltest erlaubt eine lineare Quantifizierung der eingesetzten P. aeruginosa Genome über 4 log Stufen, d. h. zwischen 3 und 30.000 KBE.

Beispiel 10 Nachweis von Escherichia coli

Der Nachweis von E. coli erfolgte durch erfindungsgemäße artspezifische Amplifikation von murA-Gensequenzen.

Spezifische Bereiche des murA-Gens dienten als diagnostisches Ziel für die Entwicklung eines PCR-Schnelltests zum Nachweis von Escherichia coli. Warum wurde dieses Gen als diagnostisches Ziel gewählt? Das murA Gen verschlüsselt das Enzym UDP-N-Acetylglucosamin Enolpyruvyltransferase, ein wichtiges Strukturgen von E. coli (Marquardt et al. 1992, J. Bacteriol. 174, 5748-5752). Dieses Enzym katalysiert den ersten Schritt der Peptidoglykan- Synthese, im Falle von E. coli des Mureins, welches einen essentiellen Bestandteil der bakteriellen Zellwand darstellt. Die Zellwandkomposition ist als ein charakteristisches Merkmal von Bakterienarten anzusehen. Es wurde die murA Nukleotidsequenz von E. coli mit der nahe verwandten Enterobakteriaceaen-Art Enterobacter cloacae verglichen. Auf Grund der identifizierten Sequenzunterschiede wurde das murA-Gen als genetischer Marker mit diagnostischer Potenz zur Identifizierung der Enterobakteriaceaen- Art Escherichia coli ausgewählt.

Als Resultat von DNS-Sequenzdatenbank-Vergleichen und praktischer Optimierungsarbeiten, unter Verwendung verschiedener Primer- und Sondenkombinationen, wurden folgende murA-spezifische DNA-Sequenzen als optimale Primer-/Sonden Kombination bestimmt:

Forward Primer Sequence (# 767*):
5' GTT CTG TGC ATA TTG ATG CCC GCG 3' SEQ. ID. NO. 12

Sonde (# 802):
5'-FAM - TCT GCG CAC CTT ACG ATC TGG TT - TAMRA 3' SEQ. ID. NO. 13

Reverse Primer Sequence (# 884):
5' GCA AGT TTC ACT ACC TGG CGG TTG 3'
(als reverse complement einsetzen) SEQ. ID. NO. 14

* Positionen beziehen sich auf die in Marquardt et al. 1992, J. Bacteriol. 174. 5748-5752 publizierte DNA-Sequenz (Genbank: M92358).

Die Sonden wurden von der Firma PE Applied Biosystems Division, Weiterstadt, Deutschland hergestellt. Es handelt sich um einzelsträngige Oligonukleotide, die am 5' Ende mit einem Fluoreszenzderivat (FAM = 6-carboxyfluorescein) und am 3' Ende mit einem Rhodaminderivat (TAMRA = 6-carboxytetramethylrhodamine) modifiziert worden. Synthese und Reinigung erfolgte entsprechend der Vorschriften von PE-Applied Biosystems.

Beispiel 11 PCR-Bedingungen für den Nachweis von Escherichia coli

Nach Variation von Primer- und Sondenkonzentration, der MgCl₂ bzw. Glycerin Konzentration und der Nukleotidkomposition ergaben sich folgende Bedingungen als optimal:

Das PCR-Zyklenprofil für die Escherichia coli PCR

Für Details siehe Beispiel 3.

Beispiel 12 Selektivität des Escherichia coli PCR-Schnelltests

Um die Selektivität des PCR-Tests abzuschätzen, wurde genomische DNA aus verschiedenen Organismen isoliert und im Fluoreszenz-PCR Test eingesetzt. Die Menge an entstandenen PCR Produkten wurde als CT-Wert (Threshold Cycle) angegeben (Tab.).

(je 10 ng genomische DNS analysiert)

Liste der getesteten DNA-Isolate
Organismus	Resultat(als CT-Wert)
AL=L<Escherichia coli Stämme
AL=L CB=3<Escherichia coli@	DSM 301	16
DSM 787	16
DSM 1103	16
ATCC 8739	16
AL=L<Andere Enterobacteriaceae
AL=L CB=3<Acetobacter pasteurianus@	DSM 3509	40
AL=L<Acinetobacter calcoaceticus
DSM 6962	40
AL=L<Aeromonas enteropelogenes
DSM 6394	40
AL=L<Alcaligenes faecalis
DSM 30030	40
AL=L<Budvicia aquatica
DSM 5075	40
AL=L<Buttiauxella agrestis
DSM 4586	40
AL=L<Cedecea davisae
DSM 4568	40
AL=L<Chromobacterium violaceum
DSM 30191	40
AL=L<Enterobacter cloacae
DSM 30054	40
AL=L<Edwardstella tarda
DSM 30052	40
AL=L<Ewingella americana
DSM 4580	40
AL=L<Erwinia amylovora
DSM 30165	40
AL=L<Hafnia alvei
DSM 30163	40
AL=L<Haemophilus influenzae
DSM 4690	40
AL=L<Halomonas elongata
DSM 2581	40
AL=L<Helicobacter pylori
DSM 4867	40
AL=L<Kluyvera ascorbata
DSM 4611	40
AL=L<Leclercia adecarboxylata
DSM 5077	40
AL=L<Legionella pneumophilia
DSM 7515	40
AL=L<Leminorella grimontli
DSM 5078	40
AL=L<Levinea malonatica
DSM 4596	40
AL=L<Listeria monocytogenes
DSM 20600	40
AL=L<Moellerella wisconsensis
DSM 5076	40
AL=L<Morganella morganii sp.
DSM 30164	40
AL=L<Pantoea agglomerans
DSM 3493	40
AL=L<Photorhabdus luminescens
DSM 3368	40
AL=L<Plesiomonas shigelloides
DSM 8224	40
AL=L<Pragia fontium
DSM 5563	40
AL=L<Providencia stuarti
DSM 4539	40
AL=L<Proteus mirabilis
DSM 788	40
AL=L<Rhanella aquatilis
DSM 4594	40
AL=L<Serratia marcescens
DSM 30121	40
AL=L<Tatumella ptyseos
DSM 5000	40
AL=L<Vibrio proteolyticus
DSM 30189	40
AL=L<Xenorhabdus nematophilus
DSM 3370	40
AL=L<Yersinia enterocolitica
DSM 4780	40
AL=L<Andere bakterielle Arten
AL=L CB=3<Pseudomonas aeruginosa@	DSM 1128 (ATCC 9027)	40
Bacillus subtilis	40
AL=L<Salmonella typhimurium
ATCC 13311	40
AL=L<Pseudomonas mirabelis
DSM 788	40
AL=L<Staphylococcus aureus
DSM 6538P	40
AL=L<Streptococcus faecalis
DSM 2981	40
AL=L<Klebsiella pneumonia
ATCC 10031	40
AL=L<Citrobacter freundii
DSM 30040	40
AL=L<Eukaryonten
Neurospora crassa	40
Arabidopsis thaliana	40
Salmon (Sigma D9156)	40
Mensch (Perkin Elmer ABD, 401846)	40
Wasser	40

Lediglich Escherichia coli Stämme ergaben ein positives Ergebnis im PCR- Schnelltest. Nach 16 PCR Zyklen (CT = 16) war erstmals ein linearer Anstieg der Fluoreszenz meßbar, wenn 10 ng Escherichia coli DNS eingesetzt wurden. Der PCR Test war hochspezifisch. Auch ein nahe verwandte Enterobacteriaceaen- Art, Enterobacter cloacae, ergab kein Fluoreszenzsignal im PCR-Schnelltest (Tab.).

Als Positivkontrolle wurden dieselben bakteriellen DNS, die im murA-PCR-Test analysiert worden waren (Tab.) mit dem universellen 16S rRNA PCR System (s. Beispiel 19) untersucht. Alle bakteriellen DNS ergaben ein positives Signal mit dem 16S rRNA System. D. h. alle DNS ließen sich 16S rRNA-PCR amplifizieren, aber lediglich die Escherichia coli DNS ließen sich murA-PCR amplifizieren.

Das murA-System ist spezifisch für Escherichia coli.

Zusätzlich wurden die entstandenen PCR-Produkte elektrophoretisch analysiert (vgl. Bericht Staphylococcus aureus). Die PCR-Produkte hatten eine Größe von 142 Basenpaaren (ohne Abbildung). Kontrollsequenzierungen der PCR-Produkte verifizierten, daß es sich um murA DNS handelte (ohne Abbildung)

Beispiel 13 Sensitivität des E. coli Test

Um die Sensitivität des Escherichia coll PCR-Tests zu bestimmen, wurde genomische Escherichia coli DNS präpariert und in PCR-Experimenten eingesetzt (Abb. 4).

Verschiedene Mengen an Escherichia coll Genomkopien wurden in der Fluoreszenz-PCR eingesetzt (Abb. 4). Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus 4 unabhängigen Experimenten dar. Die Menge an freiwerdender Fluoreszenz und somit an entstehenden PCR-Produkten wird als CT angegeben. Die PCR Reaktion wurde über 40 Zyklen durchgeführt. Der CT-Wert der Wasserkontrolle (NTC = no template control) betrug 40.

Das Ergebnis zeigt, daß sich die DNS von 3 Bakterienzellen mittels Fluoreszenz-PCR nachweisen läßt. Der PCR-Schnelltest erlaubt eine lineare Quantifizierung der eingesetzten Escherichia coli-Genome über 6 log Stufen, d. h. zwischen 3 und 3.000000 KBE.

Beispiel 14 Nachweis von Salmonella ssp. (Subspezies)

Der Nachweis von Salmonella spp. der Art Salmonella enterica erfolgte durch erfindungsgemäße spezifische Amplifikation von invA-Gensequenzen.

Spezifische Bereiche des invA Gens dienten als diagnostisches Ziel für die Entwicklung eines PCR-Schnelltests zum Nachweis von Salmonella spp. Warum wurde dieses Gen als diagnostisches Ziel gewählt? Das invA Gen verschlüsselt einen Salmonella-spezifischen Virulenzfaktor. Verschiedene Untersuchungen an einer Reihe von Salmonellen haben gezeigt, daß diese Bakterienarten an Epithelzellen binden. Bei diesem Prozeß wird das Actin- System der Wirtszellen von den Bakterien beeinflußt. Als Reaktion umschließen die Wirtszellen die Bakterienzellen. Nach vollständigem Einschluß existieren die Bakterien in Vesikeln im Zytoplasma der Wirtszellen. An diesem Einschließungsprozeß (engl. invasion) sind die sogenannten inv Gene (invA-H) von Salmonella beteiligt. Mutanten in dem invA Gen binden noch an Wirtszellen, werden von diesen aber nicht mehr aufgenommen. Die inv Gensequenz Salmonella Subspezies stark konserviert erhalten (Salyers and Whitt 1994, Salmonella Infection, in: Bacterial Pathogenesis ASM Press, Washington D. C. p233). Das invA Gen von Salmonella wurde isoliert und die Nukleotidsequenz aufgeklärt (Galan and Curtis 1989, PNAS USA 86: 6383-7, Galan and Curtis 1991, Infection and Immunity 59: 2901-2908, und siehe: Rahn et al. 1992, Mol. Cell. Probes 6: 271-279). Da das invA Gen an der Expression eines spezifischen Virulenzmechanismus von Salmonellen beteiligt ist, stellt es einen genetischen Marker mit diagnostischer Potenz zur Identifizierung von Salmonella ssp. dar (Rahn et al. 1992, Mol. Cell. Probes. 6: 271-279).

Als Resultat von DNS-Sequenzdatenbank-Vergleichen und praktischer Optimierungsarbeiten, unter Verwendung verschiedener Primer- und Sondenkombinationen, wurden folgende invA-spezifische DNA-Sequenzen als optimale Primer-/Sonden Kombination bestimmt:

Forward Primer Sequence (# 269*):
5' GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC 3' SEQ. ID. NO. 15

Sonde (# 333):
5'-FAM - CTT CTC TAT TGT CAC CGT GGT CCA - TAMRA 3' SEQ. ID. NO. 16

Reverse Primer Sequence (# 542):
5' GGT TCC TTT GAC GGT GCG ATG AAG 3'
(als reverse complement einsetzen) SEQ. ID. NO. 17

* Positionen beziehen sich auf die in Boyd et al. 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62: 804-808 publizierte DNA-Sequenz (Genbank: U43237).

Die Sonden wurden von der Firma PE Applied Biosystems Division, Weiterstadt, Deutschland hergestellt. Es handelt sich um einzelsträngige Oligonukleotide, die am 5' Ende mit einem Fluoreszenzderivat (FAM = 6-carboxyfluorescein) und am 3' Ende mit einem Rhodaminderivat (TAMRA = 6-carboxytetramethylrhodamine) modifiziert wurden. Synthese und Reinigung erfolgte entsprechend der Vorschriften von PE-Applied Biosystems.

Beispiel 15 PCR-Bedingungen für den Nachweis von Salmonellen

Das PCR-Zyklenprofil für die Salmonella ssp. PCR

Für Details siehe Beispiel 3.

Beispiel 16 Selektivität des Salmonella ssp. PCR-Schnelltests

Um die Selektivität des PCR-Tests abzuschätzen, wurde genornische DNA aus verschiedenen Organismen isoliert und im Fluoreszenz-PCR Test eingesetzt. Die Menge an entstandenen PCR Produkten wurde als CT-Wert (Threshold Cycle) angegeben (CT-Definition s. Beispiel 4).

(je 10 ng genomische DNS analysiert)

Liste der getesteten DNA-Isolate
Organismus
Resultat(als CT-Wert)
AL=L<Salmonella enterica
AL=L CB=3<Subspezies@	Salmonella typhimurium ATCC 13311	15
Salmonella typhi	15
Salmonella agona	15
Salmonella borismorbificans	15
Salmonella anatum	15
Salmonella brandenburg	15
Salmonella derby	15
Salmonella montevideo	15
Salmonella newport	15
Salmonella parathyphi B	15
Salmonella pullorum	15
Salmonella dublin	15
Salmonella enteritidis	15
Salmonella hadar	15
Salmonella infantis	15
AL=L<Andere bakterielle Arten
AL=L CB=3<Pseudomonas aeruginosa@	DSM 1117 (ATCC 27853)	40
DSM 1128 (ATCC 9027)	40
DSM 3227 (ATCC 19429)	40
DSM 50071 (ATCC 10145)	40
AL=L<Pseudomonas mirabelis
DSM 788	40
AL=L<Staphylococcus aureus
DSM 683	40
DSM 1104	40
DSM 6148	40
DSM 6538P	40
AL=L<Streptococcus faecalis
DSM 2981	40
DSM 6134	40
ATCC 29212	40
AL=L<Escherichia coli
DSM 301	40
DSM 787	40
DSM 1103	40
ATCC 8739	40
AL=L<Enterobacter cloacae
DSM 30054	40
AL=L<Klebsiella pneumonia
ATCC 10031	40
AL=L<Citrobacter freundii
DSM 30040	40
AL=L<Eukaryonten
Neurospora crassa	40
Arabidopsis thaliana	40
Salmon (Sigma D9156)	40
Mensch (Perkin Elmer ABD, 401846)	40
Wasser	40

Lediglich Salmonellen ergaben ein positives Ergebnis im PCR-Schnelltest. Nach 15 PCR Zyklen (CT = 15) war erstmals ein linearer Anstieg der Fluoreszenz meßbar, wenn 10 ng Salmonella ssp. DNS eingesetzt wurden. Der PCR Test war hochspezifisch. Auch die nahe verwandten Escherichia coli Stämme ergaben kein Fluoreszenzsignal im PCR-Schnelltest.

Als Positivkontrolle wurden dieselben bakteriellen DNS, die im invA-PCR-Test analysiert worden waren mit dem universellen 16S rRNA PCR System untersucht. Alle bakteriellen DNS ergaben ein positives Signal mit dem 16S rRNA System. D. h. alle DNS ließen sich 16S rRNA-PCR-amplifizieren, aber lediglich die Salmonella DNS ließen sich invA-PCR-amplifizieren.

Das invA-System ist spezifisch für Salmonella.

Zusätzlich wurden die entstandenen PCR-Produkte elektrophoretisch analysiert. Die PCR-Produkte hatten eine Größe von 287 Basenpaaren (ohne Abbildung). Kontrollsequenzierungen der PCR-Produkte verifizierten, daß es sich um invA DNS handelte (ohne Abbildung)

Beispiel 17 Sensitivität des PCR-Schnelltests

Um die Sensitivität des Salmonella ssp. PCR-Tests zu bestimmen, wurde genomische Salmonella typhimurium DNS präpariert und in PCR-Experimenten eingesetzt (Abb. 5).

Verschiedene Mengen an Salmonella typhimurium Genomkopien wurden in der Fluoreszenz-PCR eingesetzt (Abb. 5). Die gezeigten Daten stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus 4 unabhängigen Experimenten dar. Die Menge an freiwerdender Fluoreszenz und somit an entstehenden PCR-Produkten wird als CT angegeben. Die PCR Reaktion wurde über 40 Zyklen durchgeführt. Der CT-Wert der Wasserkontrolle (NTC = no template control) betrug 40.

Das Ergebnis zeigt, daß sich die DNS von 3 Bakterienzellen mittels Fluoreszenz-PCR nachweisen läßt. Der PCR-Schnelltest erlaubt eine lineare Quantifizierung der eingesetzten Salmonella typhimurium Genome über 6 log Stufen.; d. h. zwischen 3 und 3.000000 KBE.

Beispiel 18 DNA-Freisetzung ohne Voranreicherung in Nährmedien

DNS aus verschiedenen Testmikroorganismen wurde entsprechend Boom et al., 1990, extrahiert, von Proteinen und sonstigen PCR-Inhibitoren gereinigt (Quiagen Säulen Kit, 1995) und in PCR Amplifikationsexperimenten eingesetzt.

Beispiel 19 Nachweis von Bakterien universell

Der Nachweis von Bakterien erfolgte durch erfindungsgemäße spezifische Amplifikation von konservierten 16S rRNA Gensequenzen (SEQ. ID. NO. 5, siehe Beispiel 24). Bestimmte 16S rRNA-spezifische DNA-Sequenzen haben sich im Laufe der Evolution konserviert, sind deshalb im Genom aller Bakterien vorhanden und können als Primer und Sonden zum universellen Nachweis von Bakterien eingesetzt werden (Relman 1993, Weisburg et al. 1991, J. Bacteriol. 173).

Als Resultat von DNS-Sequenzdatenbank-Vergleichen und praktischen Optimierungsarbeiten, unter Verwendung verschiedener Primer- und Sondenkombinationen, wurden folgende 16S rRNA-spezifische DNA- Sequenzen als optimales Primer-/Sondenkombination bestimmt:

1. PCR Sonde

23 mer: 5'- FAM - TTA AGT CCC GCA ACG AGC GCA AC - TAMRA - 3'
(Sonde 16S rRNA # 1090): SEQ. ID. NO. 19

2. PCR Primer

19 mer: 5'- GCA T GG CTG TCG TCA GCT C - 3'
(Primer 16S rRNA forward # 1053*) SEQ. ID. NO. 18

20 mer: 5'- TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG - 3'
(Primer 16S rRNA reverse # 1386*) SEQ. ID. NO. 20

* Positionen beziehen sich auf die DNS Sequenz des 16S rRNA Gens (E. coli in Weisburg et al. 1991, J. Bacteriol. 173)

Synthese und Reinigung der PCR -Primer -Oligonukleotide erfolgte durch die Firma PE Applied Biosystems und nach deren Protokollen.

Beispiel 20 PCR Bedingungen für den Nachweis von Bakterien universell

Nach Variation von Primer- und Sondenkonzentration, und MgCl₂ Konzentration Temperatur und Zyklenprofil der PCR und Abstand des Reporterfarbstoffs zum Quencherfarbstoff innerhalb der Sonde ergaben sich folgende Bedingungen als optimal:
Folgende Komponenten wurden in einem PCR Reaktionsgefäß (PE Applied Biosystems Best. No. N8010580) gemischt.:

Das PCR-Zyklusprofil ist wie folgt:

Dieses Schema ist kompatibel für PCR-Geräte mit Heizblock, wie z. B.: GeneAMP PCR Geräte 2400 und 9600 und das ABI Prism 7700 Sequence Detection System von Perkin Eimer. Für Details siehe Beispiel 3.

Nach Abschluß der PCR Reaktionen wurden die Proben in das Fluorimeter LS- 50B, mit Zusatz zur Detektion von Fluoreszenz in Mikrotiterplatten der Firma Perkin Elmer transferiert. Messung und Quantifizierung der Fluoreszenzstrahlung erfolgt nach Angaben des Herstellers (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).

Beispiel 21 Selektivität des universellen bakteriellen PCR-Schnelltests

Um die Selektivität des PCR-Tests abzuschätzen, wurde genomische DNA von verschiedenen Organismen isoliert und in dem universellen PCR-Test eingesetzt (Abb. 6). Die Menge an entstandenen PCR-Produkten wird in relativen Fluoreszenzeinheiten angegeben (Abb. 6).

Der entwickelte PCR Test detektiert selektiv Bakterien.

Die unterschiedlichen Signalintensitäten der bakteriellen Proben reflektierten die eingesetzten variablen DNA-Mengen.

Die entstandenen PCR-Produkte wurden elektrophoretisch analysiert. Die PCR Produkte hatten eine Größe von 330 Basenpaaren (ohne Abbildung). Kontrollsequenzierungen dieser PCR-Produkte ergaben, daß es sich tatsächlich um 16S rRNA handelte (ohne Abbildung). Der PCR-Schnelltest ist 16S rRNA spezifisch.

Beispiel 22 Sensitivität und Linearität des Schnelltests zum Nachweis von Bakterien

Um die Sensitivität des PCR Tests zu bestimmen, wurde Salmonella DNS präpariert und in PCR-Experimenten eingesetzt. Es wurden verschiedene Verdünnungen der DNS hergestellt. Jede Verdünnung wurde dreifach parallel hergestellt und in dem PCR-Test eingesetzt (Abb. 7). Die Menge an freiwerdender Fluoreszenz wird als sogenannter RQ Wert angegeben.

Der RQ Wert ist die Differenz zwischen der Reporter-(R) Fluoreszenzstrahlung in einer PCR Reaktion, in der Template DNS (hier genomische Salmonella DNS) eingesetzt wurde (R⁺) und der Reporter-Fluoreszenzstrahlung, in einer PCR-Reaktion, in der keine DNS eingesetzt wurde (R^-). R^- entspricht also der Hintergrundsstrahlung. Die Reporter-Strahlung (R) wird jeweils zur Quencher- Strahlung (Q) ins Verhältnis gesetzt. Die Quencher-Strahlung ändert sich während der PCR-Reaktion nicht und stellt somit einen internen Standard dar, gegen den normiert wird.

Das Ergebnis zeigt, daß sich die DNS von 1-3 Salmonella Bakterien mittels Fluoreszenz-PCR nachweisen ließ. Die Fluoreszenzstrahlung, die nach 40 PCR Zyklen entsteht, liegt signifikant über der Hintergrundstrahlung.

Der Fluoreszenz-PCR-Test erlaubt die lineare Quantifizierung der eingesetzten Salmonella Genome über mindestens 4 log Stufen d. h. zwischen 1-3 und 30.000 KBE (Abb. 7).

Beispiel 23 Produktprüfung mit dem bakteriellen Schnelltest

Die Anwendung des entwickelten PCR-Schnelltests wurde durch spiking Experimente untersucht. 10 ml WFI (Wasser für Injektionszwecke, Chargen Nr. 63022) wurden mit 50 KBE Salmonellen gespikt (5 KBE/ml). DNS wurde aus den verschiedenen, gespikten Proben präpariert (Boom et al. 1990), gereinigt (Qiagen 1995) und im PCR-Schnelltest analysiert (Abb. 8).

Die gespikten Salmonellen ließen sich im Prüfprodukt nachweisen. Die Nachweismenge betrug 90% der eingesetzten DNA-Menge (Abb. 8). Dieser Wert reflektiert die Materialverluste, die bei der DNS Präparation aus den gespikten Produkten auftreten. Trotz dieser Verluste ließen sich 1-3 KBE/ml in dem gespikten Prüfprodukt nachweisen. Auf der anderen Seite waren im nicht gespikten Prüfprodukts keine Salmonella Keime detektierbar (Abb. 8). Die Sterilität des Prüfprodukts wurde durch Membranfiltration entsprechend der Methoden in der EP (1997) nachgewiesen.

Beispiel 24

Target-Gen-, Primer- und Sondensequenzen für die verschiedenen Organismen/-gruppen

Beispiel 25 Varianten in den Primer- und Sondensequenzen

Als Varianten werden die Primer-/Sondensequenzkombinationen definiert, die die Target-DNA- Sequenzen mit gleicher Spezifität (100%) und vergleichbarer Sensitivität (<70%) detektieren, wie die in Beispiel 24 angegebenen Sequenzen.

Beispiel 26 Fehlvarianten in den Primer- und Sondensequenzen

Als Fehlvarianten werden die Primer-/Sondenkombinationen definiert, die die Target-DNA- Sequenzen mit nicht zufriedenstellender Spezifität (<100%) und Sensitivität (<70%) detektieren, wie die in Beispiel 24 angegebenen Sequenzen.
vgl. Figur mit Primern und Sonden

Claims

1. Testkit zum Nachweis mikrobieller Verunreinigungen nicht steriler Produkte, insbesondere nach GMP-Richtlinien, auch Kosmetika und Lebensmittel, umfassend mindestens ein DNA-Fragment, das die folgenden SEQ ID und Spacer (Abstandhalter) umfaßt:

a) einen Forward-Primer (SEQ ID_{Forward-Primer});
b) eine Sonde (SEQ ID_Sonde);
c) einen Reverse-Primer (SEQ ID_{Reverse-Primer});
d) gegebenenfalls einen Spacer zwischen Forward-Primer und Sonde,
e) gegebenenfalls einen Spacer zwischen Sonde und Reverse- Primer,
f) gegebenenfalls einen Spacer upstream des Forward-Primers
g) gegebenenfalls einen Spacer downstream des Reverse-Primers
- 1. wobei die SEQ ID [(SEQ ID_{Forward-Primer}); (SEQ ID _Sonde); und (SEQ ID_{Reverse-Primer})] auch Varianten umfassen, bei denen eine, zwei oder drei Nukleotide substituiert, deletiert und/oder insertiert sind,
  dabei hat die Variante im wesentlichen dieselbe Funktion wie die Sequenz der SEQ ID [(SEQ ID_{Forward-Primer}) (SEQ ID_Sonde); und (SEQ ID_{Reverse-Primer})],
  bei Sonden die Funktion der Bindung an DNA und bei Primern die Funktion der Bindung an DNA und die Bereitstellung eines verlängerbaren 3' Endes für die DNA-Polymerase;
- 2. wobei die Spacer 0-40 Nukleotiden umfassen,
  das DNA-Fragment genommen aus der Gruppe
- 3. für Staphylococus aureus
  SEQ. ID. NO. 6 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 7 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 8 als Reverse-Primer
- 4. für Pseudomonas aeruginosa
  SEQ. ID. NO. 9 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 10 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 11 als Reverse-Primer
- 5. für Escherichia coli
  SEQ. ID. NO. 12 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 13 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 14 als Reverse-Primer
- 6. für Salmonella ssp.
  SEQ. ID. NO. 15 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 16 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 17 als Reverse-Primer
- 7. für Bakterien
  SEQ. ID. NO. 18 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 19 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 20 als Reverse-Primer

2. Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere Arzneimitteln oder Kosmetika, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Einsetzen von Primern und fluoreszenzmarkierten Sonden mit den entsprechenden Sequenzen und deren Variationen,
- a) für Staphylococus aureus
  SEQ. ID. NO. 6 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 7 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 8 als Reverse-Primer
- b) für Pseudomonas aeruginosa
  SEQ. ID. NO. 9 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 10 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 11 als Reverse-Primer
- c) für Escherichia coli
  SEQ. ID. NO. 12 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 13 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 14 als Reverse-Primer
- d) für Salmonella ssp.
  SEQ. ID. NO. 15 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 16 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 17 als Reverse-Primer
- e) für Bakterien
  SEQ. ID. NO. 18 als Forward-Primer
  SEQ. ID. NO. 19 als Sonde und
  SEQ. ID. NO. 20 als Reverse-Primer
b) Vervielfältigen der DNA mit PCR; und
c) Bestrahlung mit spezifischen Wellenlängen, die den Fluoreszenzfarbstoff anregen.
d) Messung und Quantifizierung der Emission des angeregten Fluoreszenzfarbstoffes.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Herstellung der Sonden auf der TaqMan-Detektionstechnologie beruht.