JP2023074765A - 腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット - Google Patents
腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023074765A JP2023074765A JP2021187884A JP2021187884A JP2023074765A JP 2023074765 A JP2023074765 A JP 2023074765A JP 2021187884 A JP2021187884 A JP 2021187884A JP 2021187884 A JP2021187884 A JP 2021187884A JP 2023074765 A JP2023074765 A JP 2023074765A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- primer
- nucleotide sequence
- foul
- combination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 228
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 209
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 209
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 58
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 241000193418 Paenibacillus larvae Species 0.000 claims abstract description 11
- 241001468188 Melissococcus plutonius Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 5
- 241000256837 Apidae Species 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 56
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 49
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 238000013461 design Methods 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 244000144987 brood Species 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 108091072418 Fur family Proteins 0.000 description 5
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 description 4
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 4
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 description 4
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 description 4
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 description 4
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 description 4
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 4
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 244000222296 Fagus americana Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N gelgreen Chemical compound [I-].[I-].C1=C(N(C)C)C=C2[N+](CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]3=C4C=C(C=CC4=CC4=CC=C(C=C43)N(C)C)N(C)C)=C(C=C(C=C3)N(C)C)C3=CC2=C1 TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 241001134295 Apis cerana japonica Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N D-Cellobiose Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(O)OC2CO)C(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- -1 DEAC Chemical compound 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001135571 Mus musculus Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 241000241413 Propolis Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 1
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 1
- 101100464297 Xenopus laevis plk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N chlorous acid Chemical compound OCl=O QBWCMBCROVPCKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940077239 chlorous acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000005447 environmental material Substances 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960001732 pipemidic acid Drugs 0.000 description 1
- JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N pipemidic acid Chemical compound N1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CN=C1N1CCNCC1 JOHZPMXAZQZXHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940069949 propolis Drugs 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940109850 royal jelly Drugs 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 1
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 1
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ミツバチに感染する病原菌である、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に、かつ容易に検出することができる腐蛆病菌の同時検出方法を提供すること。【解決手段】特定の５種類の配列に記載のヌクレオチド配列における第１から５の標的領域、をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする、腐蛆病菌の同時検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキットに関し、より詳しくは、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の同時検出方法、並びに、プライマーキットに関する。
ミツバチの監視伝染病である腐蛆病の原因菌には、アメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ）とヨーロッパ腐蛆病菌（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）との２種類が知られている。これらは、遺伝子型や表現型によって毒性や消毒薬への抵抗性が異なるため、野外で発生した腐蛆病がどのタイプの菌によって引き起こされたのかを知ることや、まだ発症していない蜂群が現在どのタイプの腐蛆病菌に汚染されているのかを知ることは、疾病対策を行なう上で極めて重要である。また、現在使用できる唯一の腐蛆病予防薬（タイロシン）を、耐性菌を蔓延させることなく長く有効に使用するためにも、蜂群の腐蛆病菌汚染状況を把握して投薬すべき群を見極め、適切に予防薬を使用することが重要である。
現在、アメリカ腐蛆病菌としては、遺伝子型がＥＲＩＣ Ｉ型のものからＶ型のものまでの５種類が知られており、ヨーロッパ腐蛆病菌としては、表現型が典型のものと非典型のものとの２種類が知られている。これらの中でも、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌は、現在特に世界で猛威を振るっており、日本国内でも腐蛆病を引き起こしている。特に遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌による国内の症例は近年、急速に増加している。
腐蛆病菌の検出方法として、ヨーロッパ腐蛆病菌に関しては、典型株と非典型株とを区別するＰＣＲ方法が報告されている（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８（非特許文献１））。また、アメリカ腐蛆病菌に関しても、ＥＲＩＣ Ｉ型株を検出するＰＣＲ方法が報告されている（Ｂｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｏｐｅｎ Ｖｅｔ．Ｊ．，１０：５３－５８（非特許文献２））が、特に幼虫に強い毒性を示し、国内での重要度が高まっている遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌を特異的に検出できるＰＣＲ方法は未だ報告されていない。
また、２つの腐蛆病菌はそれぞれ個別に検出することが一般的であったが、特開２０１９－０６２７４５号公報（特許文献１）には、２つの腐蛆病菌を含む病原菌を同時に検出する方法が記載されている。しかしながら、遺伝子型や表現型を区別した上で、２つの腐蛆病菌を同時に検出できる方法は未だ報告されていない。
Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８
Ｂｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｏｐｅｎ Ｖｅｔ．Ｊ．，１０：５３－５８
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、遺伝子型や表現型を区別した上で２つの腐蛆病菌を同時に、かつ、容易に検出できる方法、つまり、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に、かつ容易に検出することができる腐蛆病菌の同時検出方法、並びに、これに好適に用いることができるプライマーキットを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、遺伝子型や表現型を区別した上で２つの腐蛆病菌を同時に検出できるマルチプレックスＰＣＲの系を設計した。すなわち、先ず、アメリカ腐蛆病菌及びヨーロッパ腐蛆病菌の２つの腐蛆病菌の各遺伝子型又は表現型ごとに、マルチプレックスＰＣＲの検出対象となる特異的な標的配列を選出した。特に、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な配列としては、Ｆｕｎｆｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１：２４０－２５０に９つの配列が記載されているが、本発明者らは、遺伝子型が既知の複数のアメリカ腐蛆病菌株のゲノム情報と比較することにより、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌に真に特異的な配列は１つのみであることを見出した。なお、現在特に猛威を振るっている遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型又はＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌については、それぞれ各遺伝子型に特異的な標的配列を選出し、加えて、これらを含めた全ての遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の共通標的配列として１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を選出し、さらにこれらを組み合わせることで、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外のいずれかの遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌（本明細書中、場合により「ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌」という）の検出も可能とした。
次いで、本発明者らは、上記で選出した各腐蛆病菌の標的配列に対してそれぞれプライマーを設計した。全ての遺伝子型（現時点では遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型～Ｖ型）のアメリカ腐蛆病菌（本明細書中、場合により「全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌」という）の標的配列及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列に対してはそれぞれ従来より報告されているプライマーを用いたが、他の標的配列に対しては、それぞれ複数のプライマーを新たに設計した。さらに、これらのプライマーによる複数の組み合わせの中から、陽性コントロール（遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌のゲノムＤＮＡを全て含むサンプル）を鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを行なったときに、各標的配列に由来する目的の特異的ＰＣＲ産物を全て確認することができ、かつ、５種のＰＣＲ産物が全て異なるサイズとなる組み合わせを見出した。
その結果、かかる特定のプライマーの組み合わせ、すなわち、前記標的配列上の特定の標的領域を増幅可能なプライマーの組み合わせを用いてマルチプレックスＰＣＲを行ない、例えば、電気泳動によってＰＣＲ産物を分離して検出することで、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を、全て同時に、かつ、容易に検出することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］
試料中の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ Ｉ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ ＩＩ）、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）を同時に検出する方法であり、
前記試料由来のＤＮＡを鋳型として、下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、
を含む、腐蛆病菌の同時検出方法。
［２］
前記５種のプライマーセットが、
配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＶと、配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＶと、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
である、［１］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［３］
前記プライマーセットＩＩが、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［２］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［４］
前記プライマーセットＩＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせである、［２］又は［３］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［５］
前記プライマーセットＩＶが、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせである、［２］～［４］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［６］
前記５種のプライマーセットが、
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［７］
前記検出工程が、電気泳動により前記ＰＣＲ産物を分離する工程を含む、［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［８］
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、及び
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキット。
［９］
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
を含む、［８］に記載のプライマーキット。
［１０］
［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法に用いるためのプライマーキットである、［８］又は［９］に記載のプライマーキット。
［１］
試料中の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ Ｉ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ ＩＩ）、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）を同時に検出する方法であり、
前記試料由来のＤＮＡを鋳型として、下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、
を含む、腐蛆病菌の同時検出方法。
［２］
前記５種のプライマーセットが、
配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＶと、配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＶと、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
である、［１］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［３］
前記プライマーセットＩＩが、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［２］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［４］
前記プライマーセットＩＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせである、［２］又は［３］に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［５］
前記プライマーセットＩＶが、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせである、［２］～［４］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［６］
前記５種のプライマーセットが、
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［７］
前記検出工程が、電気泳動により前記ＰＣＲ産物を分離する工程を含む、［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
［８］
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、及び
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキット。
［９］
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
を含む、［８］に記載のプライマーキット。
［１０］
［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法に用いるためのプライマーキットである、［８］又は［９］に記載のプライマーキット。
本発明によれば、ミツバチに感染する病原菌である、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に、かつ容易に検出することができる腐蛆病菌の同時検出方法、並びに、これに好適に用いることができるプライマーキットを提供することが可能となる。
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
＜腐蛆病菌＞
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法によれば、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ Ｉ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ ＩＩ）、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）を同時に検出することが可能である。検出される腐蛆病菌としては、そのＤＮＡが存在し得る限り、菌体の一部や死菌であってもよい。
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法によれば、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ Ｉ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ ＩＩ）、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）を同時に検出することが可能である。検出される腐蛆病菌としては、そのＤＮＡが存在し得る限り、菌体の一部や死菌であってもよい。
（アメリカ腐蛆病菌、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ）
アメリカ腐蛆病菌は、グラム陽性の有芽胞桿菌であり、現時点では、５つの遺伝子型（遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型～Ｖ型）が知られている。ＥＲＩＣ型は、Ｇｅｎｅｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：５０１－５１１及びＢｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１０：１５１３９４の方法により区別される。いずれの遺伝子型株も蜂児に対する毒性が強いが、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型株は蜂児に対する毒性が比較的弱く、発症までに時間がかかるため、蛹になるときに巣房に蓋がされた後の有蓋蜂児期での死亡率が高くなる。他方、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株は蜂児に対する毒性が強いため、巣房に蓋がされる前に早期に幼虫を死に至らしめる。また、蜂群に対しては、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型株では、感染蜂児が有蓋蜂児期に死亡することが多いため、働きバチによる死亡蜂児の発見と除去が遅れ、結果として蜂群全体への菌の蔓延が早まり蜂群の崩壊が早くなる傾向がある。他方、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株では、感染した蜂児は早期に死亡し、働きバチによって早期に発見されて巣から除去されるため、蜂群全体に菌が広がりにくく、蜂群が崩壊するほど重症になるまでには時間がかかる傾向がある。さらに、どちらの遺伝子型株も消毒薬（例えば、微酸性次亜塩素酸水や亜塩素酸水）に対する抵抗性が強いが、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株は特に強いことが知られている（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．８２：２６１－２７１）。
アメリカ腐蛆病菌は、グラム陽性の有芽胞桿菌であり、現時点では、５つの遺伝子型（遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型～Ｖ型）が知られている。ＥＲＩＣ型は、Ｇｅｎｅｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：５０１－５１１及びＢｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１０：１５１３９４の方法により区別される。いずれの遺伝子型株も蜂児に対する毒性が強いが、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型株は蜂児に対する毒性が比較的弱く、発症までに時間がかかるため、蛹になるときに巣房に蓋がされた後の有蓋蜂児期での死亡率が高くなる。他方、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株は蜂児に対する毒性が強いため、巣房に蓋がされる前に早期に幼虫を死に至らしめる。また、蜂群に対しては、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型株では、感染蜂児が有蓋蜂児期に死亡することが多いため、働きバチによる死亡蜂児の発見と除去が遅れ、結果として蜂群全体への菌の蔓延が早まり蜂群の崩壊が早くなる傾向がある。他方、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株では、感染した蜂児は早期に死亡し、働きバチによって早期に発見されて巣から除去されるため、蜂群全体に菌が広がりにくく、蜂群が崩壊するほど重症になるまでには時間がかかる傾向がある。さらに、どちらの遺伝子型株も消毒薬（例えば、微酸性次亜塩素酸水や亜塩素酸水）に対する抵抗性が強いが、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型株は特に強いことが知られている（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．８２：２６１－２７１）。
（ヨーロッパ腐蛆病菌、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）
ヨーロッパ腐蛆病菌としては、世界各国でヨーロッパ腐蛆病症例から一般的に分離され、古くから知られる典型的な性状を示す株（典型株）と、典型株とは性状が大きく異なる株（非典型株）とが知られている。表現型典型株は、Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，５：５２５－５２９の方法に従ったＭＬＳＴ分類により、ＣＣ３又はＣＣ１３に分類され、表現型非典型株は、同ＭＬＳＴ分類により、ＣＣ１２に分類される。いずれの表現型株も嫌気又は微好気条件で発育可能であるが、表現型非典型株は、発育が比較的早く、また、Ｎａ／Ｋ比＜１の培地では好気条件でも発育可能である。さらに、表現型非典型株は、Ｌ アラビノース、Ｄ セロビオース、及びサリシンからの酸産生能、並びに、エスクリンの加水分解能を有し、βグルコシダーゼ活性を有する株が多いのに対して、表現型典型株はいずれも有さない。
ヨーロッパ腐蛆病菌としては、世界各国でヨーロッパ腐蛆病症例から一般的に分離され、古くから知られる典型的な性状を示す株（典型株）と、典型株とは性状が大きく異なる株（非典型株）とが知られている。表現型典型株は、Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，５：５２５－５２９の方法に従ったＭＬＳＴ分類により、ＣＣ３又はＣＣ１３に分類され、表現型非典型株は、同ＭＬＳＴ分類により、ＣＣ１２に分類される。いずれの表現型株も嫌気又は微好気条件で発育可能であるが、表現型非典型株は、発育が比較的早く、また、Ｎａ／Ｋ比＜１の培地では好気条件でも発育可能である。さらに、表現型非典型株は、Ｌ アラビノース、Ｄ セロビオース、及びサリシンからの酸産生能、並びに、エスクリンの加水分解能を有し、βグルコシダーゼ活性を有する株が多いのに対して、表現型典型株はいずれも有さない。
＜腐蛆病菌の同時検出方法＞
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法は、試料中の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に検出する方法であり、
前記試料由来のＤＮＡを鋳型として、下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、
を含む方法である。
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法は、試料中の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に検出する方法であり、
前記試料由来のＤＮＡを鋳型として、下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、
を含む方法である。
［試料］
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法の対象となる「試料」としては、腐蛆病菌由来のＤＮＡが存在し得る試料である限り特に制限はなく、例えば、ミツバチ（成虫、蛹、幼虫）、ミツバチの死骸、ミツバチの腐蛆（ミツバチの幼虫や蛹が腐敗したもの）；蜂群の巣、ハチミツ、ローヤルゼリー、プロポリス、花粉、土壌、ミツバチの糞、蜂群の巣の底に落ちた様々な堆積物（デブリ）等の巣内又は巣周辺から採取される環境材料が挙げられる。本発明に係る試料としてはこれらのうちのいずれであってもよいが、例えば、蜂群の腐蛆病菌汚染状況調査を目的とする場合にはハチミツが好ましい。腐蛆病菌は、ハチミツに混入することが知られており、かかるハチミツが幼虫の感染源になったり、農場全体に感染が拡がる原因となったりするためや、腐蛆病が発症する数年前からハチミツに腐蛆病菌が混入し始めるという報告もされているためである。本発明によれば、ハチミツのように腐蛆病菌のＤＮＡ含有量が比較的微量の試料を用いても、下記のマルチプレックスＰＣＲで効率よく腐蛆病菌由来のＤＮＡを増幅することができるため、培養を介さずに、迅速かつ簡便に、高い精度で目的の腐蛆病菌を検出することが可能である。
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法の対象となる「試料」としては、腐蛆病菌由来のＤＮＡが存在し得る試料である限り特に制限はなく、例えば、ミツバチ（成虫、蛹、幼虫）、ミツバチの死骸、ミツバチの腐蛆（ミツバチの幼虫や蛹が腐敗したもの）；蜂群の巣、ハチミツ、ローヤルゼリー、プロポリス、花粉、土壌、ミツバチの糞、蜂群の巣の底に落ちた様々な堆積物（デブリ）等の巣内又は巣周辺から採取される環境材料が挙げられる。本発明に係る試料としてはこれらのうちのいずれであってもよいが、例えば、蜂群の腐蛆病菌汚染状況調査を目的とする場合にはハチミツが好ましい。腐蛆病菌は、ハチミツに混入することが知られており、かかるハチミツが幼虫の感染源になったり、農場全体に感染が拡がる原因となったりするためや、腐蛆病が発症する数年前からハチミツに腐蛆病菌が混入し始めるという報告もされているためである。本発明によれば、ハチミツのように腐蛆病菌のＤＮＡ含有量が比較的微量の試料を用いても、下記のマルチプレックスＰＣＲで効率よく腐蛆病菌由来のＤＮＡを増幅することができるため、培養を介さずに、迅速かつ簡便に、高い精度で目的の腐蛆病菌を検出することが可能である。
前記試料としては、粉砕や凍結等の処理がなされたものであっても、適宜、希釈液で希釈又は懸濁したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
［標的領域］
本発明によれば、本発明者らが見出した下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なようにプライマーを設計することにより、マルチプレックスＰＣＲで前記腐蛆病菌を全て同時に検出することができる。
本発明によれば、本発明者らが見出した下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なようにプライマーを設計することにより、マルチプレックスＰＣＲで前記腐蛆病菌を全て同時に検出することができる。
第１の標的領域は、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌（現時点では遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型～Ｖ型の全ての遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌）が共通に保有し、かつ、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ～Ｖ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ６０６１９（Ｇｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２２４３－２２４５）；以下、場合によりこの遺伝子の配列を「第１の標的配列」という）上の領域である。第１の標的配列の一部の、第１の標的領域を含む典型的なヌクレオチド配列を配列番号１に示す。配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、「ｎ」は、ａ、ｃ、ｇ、又はｔを示す。
第２の標的領域は、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的なＴｏｘｉｎ １遺伝子（ｐｌｘ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＣ４５６４２１（Ｂｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｏｐｅｎ Ｖｅｔ．Ｊ．，１０：５３－５８）；以下、場合によりこの遺伝子の配列を「第２の標的配列」という）上の領域である。第２の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号２に示す。第２の標的領域としては、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目であることがより好ましい。
第３の標的領域は、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な配列であることを本発明者らが見出したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＩ７６３２６７で登録されている配列（以下、場合により「第３の標的配列」という）上の領域である。第３の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号３に示す。第３の標的領域としては、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目であることがより好ましい。
第４の標的領域は、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な遺伝子であるＦｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＰ０１２２８２（ローカスタグ：ＭＰＤ５＿０８６３）（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８）；以下、場合によりこの遺伝子の配列を「第４の標的配列」という）上の領域である。第４の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号４に示す。第４の標的領域としては、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目であることがより好ましい。
第５の標的領域は、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な遺伝子であるＮａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子（ｎａｐＡ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＰ０１２２００（ローカスタグ：ＭＰＴＰ＿０４２０）（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８）；以下、場合によりこの遺伝子の配列を「第５の標的配列」という）上の領域である。第５の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号５に示す。
なお、上記第１～第５の各標的配列のヌクレオチド配列については、多型などによって株レベルでの個体差が生じ得ることは理解されたい。
上記第１～第５の各標的領域において、下記のプライマーセットにより増幅する範囲は、互いに異なる塩基数の範囲、すなわち、５種の標的領域毎に異なる長さのヌクレオチド断片の範囲、つまり、下記のマルチプレックスＰＣＲで得られるＰＣＲ産物サイズ（塩基数（ｂｐ））が互いに異なる範囲であればよく、それぞれ独立に、各標的領域内の一部分であっても、全範囲であってもよい。上記第１～第５の各標的領域において、増幅する範囲の塩基数としては、互いに異なる数で、１００～１５００塩基であることが好ましく、１５０～１０００塩基であることがより好ましい。
これらの中でも、上記第１～第５の各標的領域において、下記のプライマーセットで増幅するように選択する範囲としては、特に非特異反応が低減され、電気泳動等による各ＰＣＲ産物の区別がより明確となり、かつ、各標的領域のＰＣＲによる増幅効率が互いに同等になる観点から、それぞれ、以下の範囲：
第１の標的領域では、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲（同配列では９７２塩基）、
第２の標的領域では、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（同配列では５５４塩基）、
第３の標的領域では、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（同配列では３３３塩基）、
第４の標的領域では、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（同配列では２５７塩基）、及び
第５の標的領域では、配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲（同配列では１８７塩基）
であることが好ましい。
第１の標的領域では、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲（同配列では９７２塩基）、
第２の標的領域では、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（同配列では５５４塩基）、
第３の標的領域では、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（同配列では３３３塩基）、
第４の標的領域では、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（同配列では２５７塩基）、及び
第５の標的領域では、配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲（同配列では１８７塩基）
であることが好ましい。
［プライマー設計部位］
本発明においては、上記第１～第５の各標的領域をそれぞれ増幅可能なように、すなわち、上記第１～第５の各標的領域上のそれぞれ互いに異なる２つの部位（以下、場合により「プライマー設計部位」という）にそれぞれハイブリダイズするように、プライマーを設計する。１つの標的領域上の２つのプライマー設計部位は、互いに一部重複していてもよい。
本発明においては、上記第１～第５の各標的領域をそれぞれ増幅可能なように、すなわち、上記第１～第５の各標的領域上のそれぞれ互いに異なる２つの部位（以下、場合により「プライマー設計部位」という）にそれぞれハイブリダイズするように、プライマーを設計する。１つの標的領域上の２つのプライマー設計部位は、互いに一部重複していてもよい。
前記プライマー設計部位の塩基数としては、１５塩基以上であることが好ましく、１７～３０塩基であることがより好ましく、２０～２８塩基であることがさらに好ましい。
このようなプライマー設計部位としては、それぞれ、第１～第５の各標的領域において上記の増幅する範囲（塩基数）の条件を満たす限り特に制限はなく、好ましくは、下記のプライマーが他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがないように、また、ＧＣ含量が互いに近くかつ好ましい範囲内になるように、適宜選択することができる。
これらの中でも、前記プライマー設計部位としては、特に非特異反応が低減され、電気泳動等による各ＰＣＲ産物の区別がより明確となり、かつ、各標的領域のＰＣＲによる増幅効率が互いに同等になる観点から、それぞれ、下記の部位：
第１の標的領域では、配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位、及び配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第２の標的領域では、配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位、及び配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第３の標的領域では、配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位、及び配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第４の標的領域では、配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位、及び配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第５の標的領域では、配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
が挙げられる。
第１の標的領域では、配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位、及び配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第２の標的領域では、配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位、及び配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第３の標的領域では、配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位、及び配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第４の標的領域では、配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位、及び配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
第５の標的領域では、配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位、好ましくはこれらの組み合わせ、
が挙げられる。
［プライマーセット］
本発明に係るプライマーセットは、上記第１～第５の各標的領域のうち、互いに異なる２つのプライマー設計部位にそれぞれハイブリダイズするプライマーの組み合わせである。
本発明に係るプライマーセットは、上記第１～第５の各標的領域のうち、互いに異なる２つのプライマー設計部位にそれぞれハイブリダイズするプライマーの組み合わせである。
本発明において、プライマーが前記プライマー設計部位に対して「ハイブリダイズする」には、プライマーが前記プライマー設計部位のセンス鎖（例えば、配列番号１～５で示されるヌクレオチド配列上の部位）にハイブリダイズすることに加えて、その相補鎖にハイブリダイズすることも含む。
また、本発明において、プライマーが前記プライマー設計部位に対して「ハイブリダイズする」とは、当該プライマーの少なくとも一部と前記プライマー設計部位とが二本鎖を形成可能なヌクレオチド配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるハイブリダイズの条件としては、当該プライマーと前記プライマー設計部位とのヌクレオチド配列の配列相補性が、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。なお、前記配列相補性は、当業者であれば公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いて適宜計算することができる。また、本発明において、前記ハイブリダイズの条件としては、前記プライマーのヌクレオチド配列が、前記プライマー設計部位のヌクレオチド配列の全長に対して完全に相補的なヌクレオチド配列の１～複数個所において、連続して１～５塩基（好ましくは１～３塩基、例えば、３塩基、２塩基、１塩基）の塩基が挿入、欠失、又は置換されたものであってもよい。
このようなプライマーを構成するヌクレオチド配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、前記プライマー設計部位のヌクレオチド配列に合わせて、より好ましくは他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがないように、また、ＧＣ含量が互いに近くかつ好ましい範囲内になるように、適宜設計することができる。
本発明に係るプライマーの長さとしては、それぞれ独立に、１５塩基以上であることが好ましく、１７～３０塩基であることがより好ましく、２０～２８塩基であることがさらに好ましい。また、本発明に係るプライマーにおけるＧＣ含量としては、それぞれ独立に、４０～６０％であることが好ましく、４５～５５％であることがより好ましい。
本発明に係るプライマーは、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機により合成することができる。また、本発明に係るプライマーは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、例えば、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）等の非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。
このようなプライマーセットとして、より具体的には、
配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＶと、配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＶと、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
が挙げられる。
配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＶと、配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＶと、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
が挙げられる。
上記のように菌株間で数塩基の欠失、挿入等による個体差は生じ得るため、各プライマーセットによれば、それぞれ次のＰＣＲ産物：
プライマーセットＩによれば、好ましくは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲（９７２塩基）、若しくは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲に対応する範囲（好ましくは９７２～９７４塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＩによれば、好ましくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（５５４塩基）、若しくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲に対応する範囲（好ましくは５５１～５５７塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＩＩによれば、好ましくは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（３３３塩基）、若しくは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲に対応する範囲（好ましくは３３０～３３６塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＶによれば、好ましくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（２５７塩基）、若しくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲に対応する範囲（好ましくは２５４～２６０塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＶによれば、好ましくは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲（１８７塩基）若しくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲に対応する範囲（好ましくは１８４～１９０塩基）が増幅されたＰＣＲ産物
が得られる。
プライマーセットＩによれば、好ましくは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲（９７２塩基）、若しくは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲に対応する範囲（好ましくは９７２～９７４塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＩによれば、好ましくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（５５４塩基）、若しくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲に対応する範囲（好ましくは５５１～５５７塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＩＩによれば、好ましくは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（３３３塩基）、若しくは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲に対応する範囲（好ましくは３３０～３３６塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＩＶによれば、好ましくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（２５７塩基）、若しくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲に対応する範囲（好ましくは２５４～２６０塩基）が増幅されたＰＣＲ産物；
プライマーセットＶによれば、好ましくは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲（１８７塩基）若しくは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲に対応する範囲（好ましくは１８４～１９０塩基）が増幅されたＰＣＲ産物
が得られる。
上記において、ヌクレオチド配列の各範囲に「対応する」範囲とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、ヌクレオチド配列を整列させた際に、各対照の範囲（例えば、上記プライマーセットＩの場合には配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲）と同列になるヌクレオチド配列の範囲のことである。
プライマーセットＩとしては、配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであることが好ましく、
プライマーセットＩＩとしては、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩであることが好ましく、
プライマーセットＩＩＩとしては、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであることが好ましく、
プライマーセットＩＶとしては、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであることが好ましく、
プライマーセットＶとしては、配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであることが好ましい。
プライマーセットＩＩとしては、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩであることが好ましく、
プライマーセットＩＩＩとしては、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであることが好ましく、
プライマーセットＩＶとしては、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであることが好ましく、
プライマーセットＶとしては、配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであることが好ましい。
さらに、５種のプライマーセットの組み合わせとしては、特に非特異反応が低減され、電気泳動等による各ＰＣＲ産物の区別がより明確となり、かつ、各標的領域のＰＣＲによる増幅効率が互いに同等になる観点から、上記の好ましいプライマーセットＩＩ～ＩＶ（配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３）のうちの少なくとも１セットを含むことが好ましく、上記の好ましいプライマーセットＩＩＩ（配列番号１０及び１１）を少なくとも含むことがより好ましく、上記の好ましいプライマーセットＩＩ～ＩＶを全て含むことがさらに好ましく、上記の好ましいプライマーセットＩ～Ｖを全て含むことがさらにより好ましい。
［ＤＮＡ抽出工程］
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法としては、前記ＰＣＲ工程の前に、前記試料からＤＮＡを抽出する工程をさらに含んでいてもよい。ＤＮＡの抽出方法としては特に制限されず、従来公知の方法を適宜用いることができ、例えば、アルカリ－ＳＤＳ法、フェノール抽出法、市販の核酸抽出・精製キット（例えば、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ヨーネスピン（ファスマック）、ヨーネ・ピュアスピン（ファスマック））を用いる方法、及びこれらに準じた方法が挙げられる。中でも、前記試料としてハチミツを用いる場合の好ましい方法としては、ハチミツ中で外的刺激に強い硬い殻に覆われた芽胞の状態で存在しているアメリカ腐蛆病菌のＤＮＡと、ハチミツ中で外的刺激に比較的脆弱な栄養体の形態で存在しているヨーロッパ腐蛆病菌のＤＮＡと、をいずれもハチミツからより効率よくかつ同時に抽出できる観点から、ヨーネスピン及びヨーネピュアスピンを用いる方法が挙げられる。
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法としては、前記ＰＣＲ工程の前に、前記試料からＤＮＡを抽出する工程をさらに含んでいてもよい。ＤＮＡの抽出方法としては特に制限されず、従来公知の方法を適宜用いることができ、例えば、アルカリ－ＳＤＳ法、フェノール抽出法、市販の核酸抽出・精製キット（例えば、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ヨーネスピン（ファスマック）、ヨーネ・ピュアスピン（ファスマック））を用いる方法、及びこれらに準じた方法が挙げられる。中でも、前記試料としてハチミツを用いる場合の好ましい方法としては、ハチミツ中で外的刺激に強い硬い殻に覆われた芽胞の状態で存在しているアメリカ腐蛆病菌のＤＮＡと、ハチミツ中で外的刺激に比較的脆弱な栄養体の形態で存在しているヨーロッパ腐蛆病菌のＤＮＡと、をいずれもハチミツからより効率よくかつ同時に抽出できる観点から、ヨーネスピン及びヨーネピュアスピンを用いる方法が挙げられる。
［ＰＣＲ工程（増幅工程）］
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法は、上記の第１～第５の各標的領域をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせである前記プライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程を含む。
本発明の腐蛆病菌の同時検出方法は、上記の第１～第５の各標的領域をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせである前記プライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程を含む。
本発明に係るＰＣＲ工程では、例えば、前記試料から抽出したＤＮＡに、前記５種のプライマーセット及び相補鎖合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を添加してマルチプレックスＰＣＲ反応を行なうことにより、前記試料中に目的の標的領域、すなわち目的の腐蛆病菌に特異的な目的の標的配列が存在する場合には、これに前記プライマーがハイブリダイズし、前記プライマーセットに挟まれる領域を鋳型として前記標的領域上のヌクレオチド断片が合成され、かかるヌクレオチド断片が増幅された増幅産物（ＰＣＲ産物）を得ることができる。本発明に係る５種のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲによれば、前記試料中に５種の腐蛆病菌に特異的な目的の標的配列が存在する場合には、５種のＰＣＲ産物を得ることができる。
前記マルチプレックスＰＣＲにおける相補鎖合成酵素の種類、反応液の組成、反応温度、時間、及びサイクル数等の反応条件としては、特に制限なく適宜選択することができる。例えば、本発明において、上記の好ましいプライマーセットＩ～Ｖ（配列番号６及び７、配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３、配列番号１４及び１５）を用いる場合には、一般的なＰＣＲ条件を採用することができ、例えば、相補鎖合成、より好ましくはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長化の温度を、５０～７５℃、より好ましくは５２～７２℃の範囲とすることができる。
［検出工程］
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物は、適宜公知の方法又はそれに準じた方法で検出することができる。これにより、目的の標的配列の検出、すなわち、目的の腐蛆病菌に特異的な配列の存在を検出することが可能となり、間接的に前記試料中の目的の腐蛆病菌を検出することが可能となる。
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物は、適宜公知の方法又はそれに準じた方法で検出することができる。これにより、目的の標的配列の検出、すなわち、目的の腐蛆病菌に特異的な配列の存在を検出することが可能となり、間接的に前記試料中の目的の腐蛆病菌を検出することが可能となる。
前記検出方法としては、例えば、アガロースゲル等の電気泳動によって前記ＰＣＲ産物を分離して検出する方法；前記ＰＣＲ産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を用いて測定するＤＮＡアレイ法等が挙げられる。
また、得られたＰＣＲ産物は、それぞれ、例えば、蛍光色素（例えば、臭化エチジウム、Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ６３、ＧｅｌＲｅｄ、ＧｅｌＧｒｅｅｎ等）をインターカレートしてその蛍光を検出する方法；他の蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等）、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等）、発光物質（ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等）等の標識物質で標識し、前記標識物質に応じたシグナル（呈色（発色）、反射光、発光、消光、蛍光、放射性同位体による放射線等）を検出する方法で確認することができる。さらに、必要に応じて前記シグナルの強度を測定して前記ＰＣＲ産物を定量し、目的の標的配列又はそれに示される遺伝子の量を推定してもよい。
前記検出方法としては、上記の方法に限定されず、また、上記の方法や従来公知の方法を適宜組み合わせてもよい。中でも、本発明に係る５種のプライマーセットを用いる場合には、特に容易にＰＣＲ産物の分離が可能であることから、前記検出方法としては、前記電気泳動により前記ＰＣＲ産物を分離する工程を含むことが好ましい。この場合には、例えば、アガロースゲル（例えば２％）のゲルに、得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、前記蛍光色素（例えば、臭化エチジウム、ＧｅｌＲｅｄ、ＧｅｌＧｒｅｅｎ等）で染色して、分離されたＰＣＲ産物のバンドの有無を蛍光によって確認することで、目的のＰＣＲ産物の有無、すなわち、目的の標的配列の有無、つまり前記試料中の目的の腐蛆病菌の有無を検出することができる。本発明に係る５種のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲによれば、ＰＣＲ産物が５種とも得られた場合でも、それらを明確に分離し、区別して検出することができる。
＜プライマーキット＞
本発明は、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、及び
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキットも提供する。
本発明は、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、及び
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキットも提供する。
本発明のプライマーキットに含まれるプライマーセットは、それぞれ、上述したように、
プライマーセットＩＩは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（５５４塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは５５１～５５７塩基）を増幅することで、第２の標的配列を検出、つまり遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットであり、
プライマーセットＩＩＩは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（３３３塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは３３０～３３６塩基）を増幅することで、第３の標的配列を検出、つまり遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットであり、
プライマーセットＩＶは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（２５７塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは２５４～２６０塩基）を増幅することで、第４の標的配列を検出、つまり表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットである。
プライマーセットＩＩは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列における１３６９～１９２２番目の範囲（５５４塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは５５１～５５７塩基）を増幅することで、第２の標的配列を検出、つまり遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットであり、
プライマーセットＩＩＩは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列における３～３３５番目の範囲（３３３塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは３３０～３３６塩基）を増幅することで、第３の標的配列を検出、つまり遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットであり、
プライマーセットＩＶは、配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１１１～３６７番目の範囲（２５７塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは２５４～２６０塩基）を増幅することで、第４の標的配列を検出、つまり表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットである。
これらのプライマーセットはいずれも、本発明者らが新規に見出したプライマーセットである。本発明のプライマーキットとしては、プライマーセットＩＩＩを少なくとも含むことが好ましく、プライマーセットＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを全て含むことがより好ましい。
さらに、本発明のプライマーキットとしては、
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、及び／又は
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
をさらに含むことも好ましい。
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、及び／又は
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
をさらに含むことも好ましい。
プライマーセットＩは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の範囲（９７２塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは９７２～９７４塩基）を増幅することで、第１の標的配列を検出、つまり全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌を検出可能なプライマーセットである。上記の遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型又はＩＩ型の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌をそれぞれ特異的に検出可能なプライマー（プライマーセットＩＩ及びプライマーセットＩＩＩ）と組み合わせることで、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌を検出可能である。すなわち、プライマーセットＩＩ～ＩＩＩのいずれによってもＰＣＲ産物が確認されず、かつ、プライマーセットＩのみによってＰＣＲ産物が確認された場合には、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌が検出されたと判断することができる。
プライマーセットＶは、配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の範囲（１８７塩基）若しくはそれに対応する範囲（好ましくは１８４～１９０塩基）を増幅することで、第５の標的配列を検出、つまり表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を特異的に検出可能なプライマーセットである。
本発明のプライマーキットは、上記の各腐蛆病菌の検出方法に加えて、上記の本発明の腐蛆病菌の同時検出方法に好適に用いることができる。本発明のプライマーキットに含まれる各プライマーとしては、それぞれ、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。また、本発明のプライマーキットとしては、前記試料の希釈液；ＤＮＡを抽出、精製するための試薬；マルチプレックスＰＣＲに必要な酵素、緩衝液、ｐＨ調整剤等の試薬；検出工程に必要な試薬；標準核酸；使用説明書等をさらに備えていてもよい。
以下、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の試験例に限定されるものではない。
１．マルチプレックスＰＣＲの標的配列の選定
１．１．アメリカ腐蛆病菌の標的配列
（ＥＲＩＣ Ｉ型）
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ｂｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｏｐｅｎ Ｖｅｔ．Ｊ．，１０：５３－５８に記載のＴｏｘｉｎ １遺伝子（ｐｌｘ１）の配列を用いた。遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（Ｔｏｘｉｎ １遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
１．１．アメリカ腐蛆病菌の標的配列
（ＥＲＩＣ Ｉ型）
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ｂｅｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｏｐｅｎ Ｖｅｔ．Ｊ．，１０：５３－５８に記載のＴｏｘｉｎ １遺伝子（ｐｌｘ１）の配列を用いた。遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（Ｔｏｘｉｎ １遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（ＥＲＩＣ ＩＩ型）
遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列は次のように選択した。すなわち、先ず、Ｆｕｎｆｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１：２４０－２５０においてＥＲＩＣ ＩＩ型株にのみ存在することが報告されている９つの配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースから取得した。次いで、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている、他の遺伝子型（ＥＲＩＣ Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型）のアメリカ腐蛆病菌株の完全長ゲノムと比較し、ＥＲＩＣ ＩＩ型株のみが保有するといえる配列は１つ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＩ７６３２６７で登録されている配列）であることを見出し、標的配列とした。なお、下記の表１１～１２の菌株Ｎｏ．７２～８６に記載の、遺伝子型が既知のアメリカ腐蛆病菌株における、同標的配列の有無を、下記のプライマーセットＩＩＩによるＰＣＲで調べたところ、当該標的配列が確かに真にＥＲＩＣ ＩＩ型株に特異的な配列であることが確認された。遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号３に示す。
遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列は次のように選択した。すなわち、先ず、Ｆｕｎｆｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１：２４０－２５０においてＥＲＩＣ ＩＩ型株にのみ存在することが報告されている９つの配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースから取得した。次いで、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている、他の遺伝子型（ＥＲＩＣ Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型）のアメリカ腐蛆病菌株の完全長ゲノムと比較し、ＥＲＩＣ ＩＩ型株のみが保有するといえる配列は１つ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＩ７６３２６７で登録されている配列）であることを見出し、標的配列とした。なお、下記の表１１～１２の菌株Ｎｏ．７２～８６に記載の、遺伝子型が既知のアメリカ腐蛆病菌株における、同標的配列の有無を、下記のプライマーセットＩＩＩによるＰＣＲで調べたところ、当該標的配列が確かに真にＥＲＩＣ ＩＩ型株に特異的な配列であることが確認された。遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列の典型的なヌクレオチド配列を配列番号３に示す。
（全遺伝子型）
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型を含む全ての遺伝子型（ＥＲＩＣ Ｉ～Ｖ型）のアメリカ腐蛆病菌が共通に保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列とした。全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号１に示す。この標的配列を上記の遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の両標的配列と組み合わせて検出対象とすることにより、上記の遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型の標的配列のいずれも検出されず、かつ、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）のみが検出されることで、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌を検出することができる。
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型を含む全ての遺伝子型（ＥＲＩＣ Ｉ～Ｖ型）のアメリカ腐蛆病菌が共通に保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌に特異的な標的配列とした。全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号１に示す。この標的配列を上記の遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の両標的配列と組み合わせて検出対象とすることにより、上記の遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型の標的配列のいずれも検出されず、かつ、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）のみが検出されることで、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌を検出することができる。
１．２．ヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列
（非典型）
表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のＦｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子の配列を用いた。表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｆｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
（非典型）
表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のＦｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子の配列を用いた。表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｆｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
（典型）
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のＮａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子（ｎａｐＡ）の配列を用いた。表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号５に示す。
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌に特異的な標的配列としては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のＮａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子（ｎａｐＡ）の配列を用いた。表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）の典型的なヌクレオチド配列を配列番号５に示す。
２．プライマーセットの設計
２．１ 全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌に共通の標的配列
全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を特異的に検出するプライマーとして、Ｇｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２２４３－２２４５、及び、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｐｉｃ．Ｒｅｓ．，５２：１－２８に記載のプライマーを用いた。全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を検出するためのプライマー、そのヌクレオチド配列を示す配列番号、及び同プライマーセット（プライマーセットＩ）で増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を下記の表１に示し、各プライマーの配列番号１のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図１に示す。
２．１ 全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌に共通の標的配列
全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を特異的に検出するプライマーとして、Ｇｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２２４３－２２４５、及び、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｐｉｃ．Ｒｅｓ．，５２：１－２８に記載のプライマーを用いた。全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を検出するためのプライマー、そのヌクレオチド配列を示す配列番号、及び同プライマーセット（プライマーセットＩ）で増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を下記の表１に示し、各プライマーの配列番号１のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図１に示す。
２．２ 表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）を特異的に検出するプライマーとしては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のプライマーを用いた。表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）を検出するためのプライマー、そのヌクレオチド配列を示す配列番号、及び同プライマーセット（プライマーセットＶ）で増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を下記の表２に示し、各プライマーの配列番号５のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図２に示す。
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）を特異的に検出するプライマーとしては、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８に記載のプライマーを用いた。表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）を検出するためのプライマー、そのヌクレオチド配列を示す配列番号、及び同プライマーセット（プライマーセットＶ）で増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を下記の表２に示し、各プライマーの配列番号５のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図２に示す。
２．３ 遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の各標的配列
上記２．１～２．２以外の標的配列については、より精度の高いマルチプレックスＰＣＲを構築するために、複数のフォワードプライマー（Ｆ）及びリバースプライマー（Ｒ）を設計した。各プライマーの設計には、遺伝子配列解析ソフトＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ５．４．６（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用し、長さが２０～２８ｂｐ、ＧＣ含量が４０～６０％となるように設計した。また、プライマーの特異性を上げるために３’末端の塩基がＴとなる配列は避け、マルチプレックスＰＣＲを行なった時に標的配列毎に異なる大きさのヌクレオチド断片が増幅されるように、すなわち、得られるＰＣＲ産物が異なる大きさとなるように、プライマーを設計した。また、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によりＧｅｎＢａｎｋのデータベース上にある全ての細菌の遺伝子配列と比較することによって、設計したプライマーが標的菌に高い特異性を持つことを確認した。
上記２．１～２．２以外の標的配列については、より精度の高いマルチプレックスＰＣＲを構築するために、複数のフォワードプライマー（Ｆ）及びリバースプライマー（Ｒ）を設計した。各プライマーの設計には、遺伝子配列解析ソフトＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ５．４．６（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用し、長さが２０～２８ｂｐ、ＧＣ含量が４０～６０％となるように設計した。また、プライマーの特異性を上げるために３’末端の塩基がＴとなる配列は避け、マルチプレックスＰＣＲを行なった時に標的配列毎に異なる大きさのヌクレオチド断片が増幅されるように、すなわち、得られるＰＣＲ産物が異なる大きさとなるように、プライマーを設計した。また、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によりＧｅｎＢａｎｋのデータベース上にある全ての細菌の遺伝子配列と比較することによって、設計したプライマーが標的菌に高い特異性を持つことを確認した。
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（Ｔｏｘｉｎ １遺伝子）を検出するためのプライマー（１２種類）及びそのヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表３に示し、各プライマーの配列番号２のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図３に示す。また、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＩ７６３２６７で登録されている配列）を検出するためのプライマー（６種類）及びそのヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表４に示し、各プライマーの配列番号３のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図４に示す。さらに、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｆｕｒ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ遺伝子）を検出するためのプライマー（４種類）及びそのヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表５に示し、各プライマーの配列番号４のヌクレオチド配列における設計部位を示す概略図を図５に示す。
２．４ プライマーセットの組み合わせ
最適なマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットの組み合わせを選出するため、上記で設計した表３～５に記載の複数のプライマーについて、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列に９セット（１～９）、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列に１０セット（Ａ～Ｊ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列に４セット（ａ～ｄ）のプライマーセットを設計した。下記の表６に、各プライマーセットにおけるフォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との組み合わせ、及び、各プライマーセットで増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を示す。
最適なマルチプレックスＰＣＲ用のプライマーセットの組み合わせを選出するため、上記で設計した表３～５に記載の複数のプライマーについて、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列に９セット（１～９）、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列に１０セット（Ａ～Ｊ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列に４セット（ａ～ｄ）のプライマーセットを設計した。下記の表６に、各プライマーセットにおけるフォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との組み合わせ、及び、各プライマーセットで増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ）を示す。
３．マルチプレックスＰＣＲ
ＰＣＲ反応の酵素には、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、１反応あたり、２×ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを１０μＬ、Ｑ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２μＬ、及び鋳型ＤＮＡを２μＬずつ含む全２０μＬの系で実施した。反応液中の各プライマーの最終濃度は、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を検出するプライマー（表１に記載のプライマー）は０．１μＭ、それ以外のプライマー（表２～５に記載のプライマー）は全て０．２μＭとした。
ＰＣＲ反応の酵素には、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、１反応あたり、２×ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを１０μＬ、Ｑ ｓｏｌｕｔｉｏｎを２μＬ、及び鋳型ＤＮＡを２μＬずつ含む全２０μＬの系で実施した。反応液中の各プライマーの最終濃度は、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を検出するプライマー（表１に記載のプライマー）は０．１μＭ、それ以外のプライマー（表２～５に記載のプライマー）は全て０．２μＭとした。
ＰＣＲ反応条件は、９８℃ １５分；９４℃ ３０秒、６０℃ １分３０秒、７２℃ １分 （×３５サイクル）；７２℃ １０分で行なった。全てのＰＣＲ反応はＴ１００ＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行ない、６μＬのＰＣＲ反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供した。２％アガロースゲル電気泳動は、１００Ｖ、３０分の条件で行なった後、臭化エチジウムでＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下でＰＣＲ産物のバンドを観察することにより各標的配列由来のヌクレオチド断片の増幅を確認した。
＜試験例１＞ 最適なプライマーセットの組み合わせの検討
下記の表７に記載の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株（ＤＴＫ３８６株）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株（ＤＴＫ３８４株）、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株（ＤＡＴ６０６株）、及び表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株（ＤＡＴ５６１株）から、それぞれ、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、その取扱説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。これら４株から抽出したゲノムＤＮＡ濃度をそれぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定後、各菌株のゲノムＤＮＡが最終濃度０．２５ｎｇ／μＬになるように調整して混合した混合物２μＬを陽性コントロール用の鋳型ＤＮＡとして用いた。
下記の表７に記載の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株（ＤＴＫ３８６株）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株（ＤＴＫ３８４株）、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株（ＤＡＴ６０６株）、及び表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株（ＤＡＴ５６１株）から、それぞれ、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、その取扱説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。これら４株から抽出したゲノムＤＮＡ濃度をそれぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定後、各菌株のゲノムＤＮＡが最終濃度０．２５ｎｇ／μＬになるように調整して混合した混合物２μＬを陽性コントロール用の鋳型ＤＮＡとして用いた。
表６に記載のプライマーセットから、各標的配列に対して１つのプライマーセットをそれぞれ選び、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を検出するプライマーセットＩ（表１）及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列（Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ遺伝子）を検出するプライマーセットＶ（表２）と組み合わせ、全３６０とおりの組み合わせについて、上記陽性コントロールを鋳型として、上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行なった。
本試験例において、マルチプレックスＰＣＲにより全てのプライマーセットが正しく前記陽性コントロールの標的配列上の目的のヌクレオチド断片を増幅した場合、電気泳動像では、上から、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌（ＰＣＲ産物サイズ：９７３ｂｐ）、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（ＰＣＲ産物サイズ：４７５～８３６ｂｐ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（ＰＣＲ産物サイズ：３２６～３３８ｂｐ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ＰＣＲ産物サイズ：２３９～２５９ｂｐ）、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ＰＣＲ産物サイズ：１８７ｂｐ）に由来する５つの特異的ＰＣＲ産物が増幅される。
マルチプレックスＰＣＲ後の２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像の一部を図６～図７に示す。前記電気泳動の結果、非特異反応（標的配列以外からの非特異的なＤＮＡの増幅）が確認された場合、５種類の目的の特異的ＰＣＲ産物が確認できなかった場合、又は、５種類の目的の特異的ＰＣＲ産物が確認できても一部のＰＣＲ産物の増幅効率が悪く、電気泳動像の輝度が低い場合には、マルチプレックスＰＣＲに好適ではないプライマーセットの組み合わせと判断した。他方、５種類の目的の特異的ＰＣＲ産物が予想されるサイズで確認され、かつ、電気泳動像で全てのＰＣＲ産物が同程度の輝度で確認できた場合を、マルチプレックスＰＣＲに特に適したプライマーセットの組み合わせと判断した。
その結果、非特異反応はどの組み合わせでも確認されなかったが、１～２種類のＰＣＲ産物が増幅されない組み合わせがほとんどを占めた。しかしながら、１－Ａ－ａの組み合わせ、すなわち、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列を検出するプライマーセットが、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＰ１－ＩＩ－Ｆ１（フォーワードプライマーＩＩＩ）と、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるＰ１－ＩＩ－Ｒ１（リバースプライマーＩＩＩ）と、の組み合わせであるプライマーセット１（プライマーセットＩＩＩ）、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列を検出するプライマーセットが、配列番号８のヌクレオチド配列からなるＰ１－Ｉ－Ｆ１（フォーワードプライマーＩＩ）と、配列番号９のヌクレオチド配列からなるＰ１－Ｉ－Ｒ１（リバースプライマーＩＩ）と、の組み合わせであるプライマーセットＡ（プライマーセットＩＩ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の標的配列を検出するプライマーセットが、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるＭｐ－Ａ－Ｆ１（フォーワードプライマーＩＶ）と、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるＭｐ－Ａ－Ｒ１（リバースプライマーＩＶ）と、の組み合わせであるプライマーセットａ（プライマーセットＩＶ）、である組み合わせは、マルチプレックスＰＣＲに特に適したプライマーセットの組み合わせであることが確認された。図６～図７に示したように、１－Ａ－ａの組み合わせは、この組み合わせでなければマルチプレックスＰＣＲの安定性が低く、１のプライマーセット、Ａのプライマーセット、及びａのプライマーセットのいずれかを他のプライマーセットに代えると、５種類の目的の特異的ＰＣＲ産物が安定して増幅されない傾向にあった。
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、上記陽性コントロール又は滅菌水（陰性コントロール）を鋳型ＤＮＡとして上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行ない、２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像を図８に示す。
＜試験例２＞ マルチプレックスＰＣＲの特異性確認試験
１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせの特異性を確認するために、下記の表８～１２に記載の腐蛆病菌を含む１０５株の菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、マルチプレックスＰＣＲを行なった。
１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせの特異性を確認するために、下記の表８～１２に記載の腐蛆病菌を含む１０５株の菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、マルチプレックスＰＣＲを行なった。
表１１～１２に記載のどの腐蛆病菌も、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇという遺伝子型別法でより詳細な遺伝子型（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｅ、ＳＴ）に分けることができるが、本試験では国内の腐蛆病症例からこれまでに分離された全ての遺伝子型を網羅するために、１５株のアメリカ腐蛆病菌（ＥＲＩＣ Ｉ型が９株、ＥＲＩＣ ＩＩ型が６株）と、１９株のヨーロッパ腐蛆病菌（典型が１０株、非典型が９株）とを使用した。ヨーロッパ腐蛆病菌の基準株であるＡＴＣＣ ３５３１１株（菌株Ｎｏ．８９）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。さらに、腐蛆病菌ではない菌種として、国産ハチミツから分離された５８株（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６６７０９６）と、ミツバチの幼虫から分離された１３株（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７６：４９１－４９８）とを加えた。
各菌株のゲノムＤＮＡは、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、その取扱説明書に従って抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ濃度をそれぞれＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定後、０．２５ｎｇ／μＬに調整して鋳型ＤＮＡとした。また、上記の表７に記載の４株から試験例１と同様にして調製した混合物を陽性コントロール（Ｐ）用の鋳型ＤＮＡとして用いた。
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、各菌株から調製した鋳型ＤＮＡ、陽性コントロール（Ｐ）、又は滅菌水（陰性コントロール、Ｎ）を鋳型ＤＮＡとして、上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行ない、２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像を図９Ａ～図９Ｅに示す。
また、前記電気泳動により、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：９７２～９７４ｂｐ及び５５１～５５７ｂｐ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：９７２～９７４ｂｐ及び３３０～３３６ｂｐ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：２５４～２６０ｂｐ）、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：１８４～１９０ｂｐ）に由来する特異的ＰＣＲ産物のバンドの有無を確認し、当該バンドが確認された菌株を当該腐蛆病菌陽性（＋）であると判断し、確認されなかった菌株を当該腐蛆病菌陰性（－）であると判断した。結果を下記の表８～１２に合わせて示す。
図９Ａ～図９Ｅ及び表８～１２に示したように、本マルチプレックスＰＣＲの特異性確認試験では、供試した全ての腐蛆病菌株を正確に、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、又は表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌に判別した（図９Ｃ～図９Ｅ及び表１１～１２の菌株Ｎｏ．７２～１０５）。また、腐蛆病菌ではない細菌のゲノムＤＮＡからの非特異的なＤＮＡの増幅は全く観察されなかった（図９Ａ～図９Ｃ及び表８～１１の菌株Ｎｏ．１～７１）。
＜試験例３＞ マルチプレックスＰＣＲの感度確認試験
鋳型ＤＮＡとして、上記の表７に記載の４株から、それぞれ次の方法で抽出したＤＮＡを用いた。すなわち、アメリカ腐蛆病菌はＭＹＰＧＰ寒天培地を用いて３５℃、５％ ＣＯ２条件下で２日間、ヨーロッパ腐蛆病菌はＫＳＢＨＩ寒天培地を用いて３５℃、嫌気条件下で３日間、それぞれ培養した後、ゲノムＤＮＡを、Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２：６６７０９６、及び、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３３７０８に記載の方法で抽出した。
鋳型ＤＮＡとして、上記の表７に記載の４株から、それぞれ次の方法で抽出したＤＮＡを用いた。すなわち、アメリカ腐蛆病菌はＭＹＰＧＰ寒天培地を用いて３５℃、５％ ＣＯ２条件下で２日間、ヨーロッパ腐蛆病菌はＫＳＢＨＩ寒天培地を用いて３５℃、嫌気条件下で３日間、それぞれ培養した後、ゲノムＤＮＡを、Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２：６６７０９６、及び、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３３７０８に記載の方法で抽出した。
アメリカ腐蛆病菌の培養に用いたＭＹＰＧＰ寒天培地は、Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０４０５）１０ｇ、酵母エキス１５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ｇ、ピルビン酸ナトリウム１ｇ、粉末寒天２０ｇを１Ｌの蒸留水に加え、１２１℃で１５分間のオートクレーブで滅菌・溶解後、フィルター滅菌処理済み１０％グルコース溶液を２０ｍＬ添加し、プラスチックシャーレに分注して作製した。また、ヨーロッパ腐蛆病菌の培養に用いたＫＳＢＨＩ寒天培地は、Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ３７ｇ、可溶性でんぷん１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２０．４ｇ、粉末寒天１５ｇを１Ｌの蒸留水に加え、１１５℃で１５分間のオートクレーブで滅菌・溶解後、プラスチックシャーレに分注して作製した。
抽出したゲノムＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃度測定後、段階希釈を行ない、各２μＬを鋳型ＤＮＡとした。上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせを用い、上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行ない、２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像を図１０に示す。
図１０に示したように、本マルチプレックスＰＣＲの感度確認試験では、少なくとも１００ｆｇの各腐蛆病菌のゲノムＤＮＡから全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌の標的配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を、少なくとも１ｐｇの各腐蛆病菌のゲノムＤＮＡから他の標的配列を、いずれも検出することができた。
＜試験例４＞ ハチミツ試料を用いたマルチプレックスＰＣＲ
（１）試料の調製
（１－１） アメリカ腐蛆病菌の芽胞液の調製
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株、及び遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株として、それぞれ、表７に記載のＤＴＫ３８６株（別名：Ｉ株）及びＤＴＫ３８４株（別名：Ｎ株）（いずれもミツバチの腐蛆由来）を用いた。これらの菌株を、ＭＹＰＧＰ寒天培地を用いて３５℃、５％ ＣＯ２条件下で長期間培養し、ウィルツ芽胞染色キット（武藤化学）を用いた芽胞染色で７０－９０％以上の菌細胞が芽胞になったことを確認した後、寒天培地上の芽胞を回収した。回収芽胞は滅菌水で洗浄後、再び滅菌水に懸濁して芽胞液とした。各芽胞液は実験に使用するまで４℃で保管した。芽胞濃度は倒立顕微鏡（ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて血球計算盤上の芽胞数をカウントして算出した。
（１）試料の調製
（１－１） アメリカ腐蛆病菌の芽胞液の調製
遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株、及び遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌の代表株として、それぞれ、表７に記載のＤＴＫ３８６株（別名：Ｉ株）及びＤＴＫ３８４株（別名：Ｎ株）（いずれもミツバチの腐蛆由来）を用いた。これらの菌株を、ＭＹＰＧＰ寒天培地を用いて３５℃、５％ ＣＯ２条件下で長期間培養し、ウィルツ芽胞染色キット（武藤化学）を用いた芽胞染色で７０－９０％以上の菌細胞が芽胞になったことを確認した後、寒天培地上の芽胞を回収した。回収芽胞は滅菌水で洗浄後、再び滅菌水に懸濁して芽胞液とした。各芽胞液は実験に使用するまで４℃で保管した。芽胞濃度は倒立顕微鏡（ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて血球計算盤上の芽胞数をカウントして算出した。
（１－２） ヨーロッパ腐蛆病菌の菌液の調製
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株、及び表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株として、それぞれ、表７に記載のＤＡＴ６０６株及びＤＡＴ５６１株を用いた（いずれもミツバチの腐蛆由来）。これらの菌株を、ＫＳＢＨＩ寒天培地を用いて３５℃、嫌気条件下で３日間培養後、生えてきたコロニーを滅菌綿棒で集め、１０％グリセリン加ＫＳＢＨＩ液体培地に懸濁し、各菌液を－８０℃で保管した。菌液のコロニー形成単位濃度（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ［ＣＦＵ］／ｍＬ）は、１０倍段階希釈した菌液をＢａｓａｌ寒天培地（酵母エキス １０ｇ、グルコース １０ｇ、可溶性でんぷん １０ｇ、Ｌ－システイン ０．２５ｇ、粉末寒天 ２０ｇ、１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４ １００ｍＬ／Ｌ［ｐＨ ６．６］を、１１５℃で１５分間オートクレーブ処理したもの；Ｆｏｒｓｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｐｉｃ．Ｒｅｓ．，５２：１－１４）に滴下し、３５℃で３日間嫌気培養を行なった後に生えてきたコロニーの数を数えて計測した。ヨーロッパ腐蛆病菌は連鎖状に配列しており、１つの連鎖から１つのコロニーが形成されるため、グラム染色した各菌液を顕微鏡下で観察して１００連鎖の平均連鎖菌細胞数を計測し、正確な菌濃度（菌細胞／ｍＬ）を「ＣＦＵ／ｍＬ×平均連鎖菌細胞数」の式により算出した。
表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株、及び表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌の代表株として、それぞれ、表７に記載のＤＡＴ６０６株及びＤＡＴ５６１株を用いた（いずれもミツバチの腐蛆由来）。これらの菌株を、ＫＳＢＨＩ寒天培地を用いて３５℃、嫌気条件下で３日間培養後、生えてきたコロニーを滅菌綿棒で集め、１０％グリセリン加ＫＳＢＨＩ液体培地に懸濁し、各菌液を－８０℃で保管した。菌液のコロニー形成単位濃度（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ［ＣＦＵ］／ｍＬ）は、１０倍段階希釈した菌液をＢａｓａｌ寒天培地（酵母エキス １０ｇ、グルコース １０ｇ、可溶性でんぷん １０ｇ、Ｌ－システイン ０．２５ｇ、粉末寒天 ２０ｇ、１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４ １００ｍＬ／Ｌ［ｐＨ ６．６］を、１１５℃で１５分間オートクレーブ処理したもの；Ｆｏｒｓｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ａｐｉｃ．Ｒｅｓ．，５２：１－１４）に滴下し、３５℃で３日間嫌気培養を行なった後に生えてきたコロニーの数を数えて計測した。ヨーロッパ腐蛆病菌は連鎖状に配列しており、１つの連鎖から１つのコロニーが形成されるため、グラム染色した各菌液を顕微鏡下で観察して１００連鎖の平均連鎖菌細胞数を計測し、正確な菌濃度（菌細胞／ｍＬ）を「ＣＦＵ／ｍＬ×平均連鎖菌細胞数」の式により算出した。
（１－３） 腐蛆病菌に汚染されていないハチミツの選択
ヨーロッパ腐蛆病の発生が報告されていない、すなわちヨーロッパ腐蛆病菌の混入がないニュージーランド産のハチミツを材料とし、培養法によりさらにアメリカ腐蛆病菌の混入を確認した。すなわち、先ず、滅菌水で５０％（ｖ／ｖ）に希釈したハチミツを１２，０００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈渣を８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃で１０分間加熱処理した。加熱処理後の沈渣をナリジクス酸２０μｇ／ｍＬ及びピペミド酸１０μｇ／ｍＬ添加ＭＹＰＧＰ寒天培地に接種し、５％ ＣＯ２条件下で６日間培養し、寒天培地上のアメリカ腐蛆病菌のコロニーの有無を確認した。アメリカ腐蛆病菌の発育が見られなかったニュージーランド産ハチミツを、腐蛆病菌を人工的に接種するためのハチミツ（腐蛆病菌に汚染されていないハチミツ）として選択した。
ヨーロッパ腐蛆病の発生が報告されていない、すなわちヨーロッパ腐蛆病菌の混入がないニュージーランド産のハチミツを材料とし、培養法によりさらにアメリカ腐蛆病菌の混入を確認した。すなわち、先ず、滅菌水で５０％（ｖ／ｖ）に希釈したハチミツを１２，０００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈渣を８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又は１００℃で１０分間加熱処理した。加熱処理後の沈渣をナリジクス酸２０μｇ／ｍＬ及びピペミド酸１０μｇ／ｍＬ添加ＭＹＰＧＰ寒天培地に接種し、５％ ＣＯ２条件下で６日間培養し、寒天培地上のアメリカ腐蛆病菌のコロニーの有無を確認した。アメリカ腐蛆病菌の発育が見られなかったニュージーランド産ハチミツを、腐蛆病菌を人工的に接種するためのハチミツ（腐蛆病菌に汚染されていないハチミツ）として選択した。
（１－４） ハチミツへの腐蛆病菌の接種
上記（１－３）で選択した腐蛆病菌に汚染されていないハチミツに、（１－１）で調製したアメリカ腐蛆病菌の芽胞液、及び（１－２）で調製したヨーロッパ腐蛆病菌の菌液を、ハチミツ中の各菌株の濃度がそれぞれ、１，０００、１００、１０、又は１［菌細胞／ｍＬ］となるように添加し、既知の濃度の腐蛆病菌で汚染したハチミツ（腐蛆病菌接種ハチミツ）を調製した。
上記（１－３）で選択した腐蛆病菌に汚染されていないハチミツに、（１－１）で調製したアメリカ腐蛆病菌の芽胞液、及び（１－２）で調製したヨーロッパ腐蛆病菌の菌液を、ハチミツ中の各菌株の濃度がそれぞれ、１，０００、１００、１０、又は１［菌細胞／ｍＬ］となるように添加し、既知の濃度の腐蛆病菌で汚染したハチミツ（腐蛆病菌接種ハチミツ）を調製した。
（２）試料からのＤＮＡ抽出
上記（１－４）で調製した腐蛆病菌接種ハチミツ５ｍＬを滅菌水で５０％（ｖ／ｖ）に希釈して１２，０００×ｇで１５分間遠心分離を行ない、得られた沈渣を５００μＬの滅菌水に懸濁してＤＮＡ抽出材料とした。前記ＤＮＡ抽出材料から、ヨーネスピン（ファスマック）又はヨーネピュアスピン（ファスマック）を用いて、それぞれこれらの取扱説明書に従ってＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのうち２μＬを鋳型ＤＮＡとして、下記のマルチプレックスＰＣＲに供した。
上記（１－４）で調製した腐蛆病菌接種ハチミツ５ｍＬを滅菌水で５０％（ｖ／ｖ）に希釈して１２，０００×ｇで１５分間遠心分離を行ない、得られた沈渣を５００μＬの滅菌水に懸濁してＤＮＡ抽出材料とした。前記ＤＮＡ抽出材料から、ヨーネスピン（ファスマック）又はヨーネピュアスピン（ファスマック）を用いて、それぞれこれらの取扱説明書に従ってＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのうち２μＬを鋳型ＤＮＡとして、下記のマルチプレックスＰＣＲに供した。
（３）マルチプレックスＰＣＲ
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行なった。また、上記の表７に記載の４株から試験例１と同様にして調製した混合物（陽性コントロール）又は滅菌水（陰性コントロール）を鋳型ＤＮＡとして、同様にマルチプレックスＰＣＲを行なった。マルチプレックスＰＣＲ後の２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像を図１１に示す。
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、上記３に記載の条件でマルチプレックスＰＣＲを行なった。また、上記の表７に記載の４株から試験例１と同様にして調製した混合物（陽性コントロール）又は滅菌水（陰性コントロール）を鋳型ＤＮＡとして、同様にマルチプレックスＰＣＲを行なった。マルチプレックスＰＣＲ後の２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像を図１１に示す。
図１１に示したように、ヨーネスピン及びヨーネピュアスピンのどちらのキットを用いた場合も、１００～１，０００菌細胞／ｍＬの濃度で腐蛆病菌を接種したハチミツからＤＮＡが抽出でき、マルチプレックスＰＣＲで５種類の目的の特異的ＰＣＲ産物を検出することができた。
＜試験例５＞ 国産ハチミツの腐蛆病菌汚染状況調査
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせを用いたマルチプレックスＰＣＲの応用例として、ハチミツを用いた蜂群又は養蜂場の腐蛆病菌汚染状況調査法への有用性を確かめるため、国内で生産されたハチミツがどのくらいの割合で腐蛆病菌に汚染されているかを調査した。試料として、下記の表１３～１５に示す、可能な限り由来（産地、生産者、蜜源）が異なる１１６種類のハチミツを収集した。全てのハチミツは購入又は譲渡により２０１７年から２０２０年の間に入手された。Ｊ１２、Ｊ２４、及びＪ４２はニホンミツバチが生産したハチミツで、他は全てセイヨウミツバチが生産したハチミツである。ハチミツは全て常温で保管した。試験例４の（２）と同様の方法で、ヨーネピュアスピン（ファスマック）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのうち２μＬを鋳型ＤＮＡとして、マルチプレックスＰＣＲに供した。マルチプレックスＰＣＲは、上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、上記３に記載の条件で行なった。
上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせを用いたマルチプレックスＰＣＲの応用例として、ハチミツを用いた蜂群又は養蜂場の腐蛆病菌汚染状況調査法への有用性を確かめるため、国内で生産されたハチミツがどのくらいの割合で腐蛆病菌に汚染されているかを調査した。試料として、下記の表１３～１５に示す、可能な限り由来（産地、生産者、蜜源）が異なる１１６種類のハチミツを収集した。全てのハチミツは購入又は譲渡により２０１７年から２０２０年の間に入手された。Ｊ１２、Ｊ２４、及びＪ４２はニホンミツバチが生産したハチミツで、他は全てセイヨウミツバチが生産したハチミツである。ハチミツは全て常温で保管した。試験例４の（２）と同様の方法で、ヨーネピュアスピン（ファスマック）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのうち２μＬを鋳型ＤＮＡとして、マルチプレックスＰＣＲに供した。マルチプレックスＰＣＲは、上記１－Ａ－ａのプライマーセットの組み合わせで、上記３に記載の条件で行なった。
前記マルチプレックスＰＣＲ後の２％アガロースゲル電気泳動で得られた電気泳動像より、全遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：９７２～９７４ｂｐ）、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：９７２～９７４ｂｐ及び５５１～５５７ｂｐ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：９７２～９７４ｂｐ及び３３０～３３６ｂｐ）、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：２５４～２６０ｂｐ）、表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（期待されるＰＣＲ産物サイズ：１８４～１９０ｂｐ）にそれぞれ由来するＰＣＲ産物のバンドの有無を確認し、当該バンドが確認されたハチミツを当該腐蛆病菌陽性（＋）であると判断し、確認されなかったハチミツを当該腐蛆病菌陰性（－）であると判断した。結果を下記の表１３～１５に合わせて示す。また、１１６種類の国産ハチミツ中における各腐蛆病菌陽性ハチミツの割合（国産ハチミツにおける腐蛆病菌の陽性率）を算出した。結果を図１２に示す。
表１３～１５及び図１２に示したように、１１６種類の国産ハチミツを用いた腐蛆病菌汚染調査では、９４．０％のハチミツからいずれかの腐蛆病菌が検出され、全ての腐蛆病菌が検出限界以下（未検出）を示したハチミツは６．０％だった（図１２の（ａ））。アメリカ腐蛆病菌に着目すると、８０．２％のハチミツから遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型又はＩＩ型の腐蛆病菌が検出され、４６．６％のハチミツからは遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型の腐蛆病菌が同時に検出された（図１２の（ｂ））。ヨーロッパ腐蛆病菌は、８８．８％のハチミツから検出され、５６．９％のハチミツでは典型と非典型の両タイプが、３１．９％のハチミツでは典型のみが検出された（図１２の（ｃ））。さらに、４０検体（３４．５％）のハチミツからは、全てのタイプの腐蛆病菌（遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、表現型典型及び非典型のヨーロッパ腐蛆病菌）が同時に検出された（表１３～１５）。このように、本発明のマルチプレックスＰＣＲは、ハチミツなどの試料から全てのタイプの腐蛆病菌を一度に検出する方法として極めて有用であることが示された。
本発明によれば、ミツバチに感染する病原菌である、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌を同時に、かつ容易に検出することができる腐蛆病菌の同時検出方法、及びこれに好適に用いることができるプライマーキットを提供することが可能となる。
配列番号：６
＜２２３＞ Ｐｌａｒｖａｅ１／フォーワードプライマーＩ
配列番号：７
＜２２３＞ Ｐｌａｒｖａｅ２／リバースプライマーＩ
配列番号：８
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＩ
配列番号：９
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ１／リバースプライマーＩＩ
配列番号：１０
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＩＩ
配列番号：１１
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ１／リバースプライマーＩＩＩ
配列番号：１２
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＶ
配列番号：１３
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｒ１／リバースプライマーＩＶ
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｍｐ－Ｔ－Ｆ／フォーワードプライマーＶ
配列番号：１５
＜２２３＞ Ｍｐ－Ｔ－Ｒ／リバースプライマーＶ
配列番号：１６
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ２
配列番号：１７
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ３
配列番号：１８
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ４
配列番号：１９
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ５
配列番号：２０
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ６
配列番号：２１
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ７
配列番号：２２
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ２
配列番号：２３
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ３
配列番号：２４
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ４
配列番号：２５
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ５
配列番号：２６
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ２
配列番号：２７
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ３
配列番号：２８
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ２
配列番号：２９
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ３
配列番号：３０
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｆ２
配列番号：３１
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｒ２
＜２２３＞ Ｐｌａｒｖａｅ１／フォーワードプライマーＩ
配列番号：７
＜２２３＞ Ｐｌａｒｖａｅ２／リバースプライマーＩ
配列番号：８
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＩ
配列番号：９
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ１／リバースプライマーＩＩ
配列番号：１０
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＩＩ
配列番号：１１
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ１／リバースプライマーＩＩＩ
配列番号：１２
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｆ１／フォーワードプライマーＩＶ
配列番号：１３
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｒ１／リバースプライマーＩＶ
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｍｐ－Ｔ－Ｆ／フォーワードプライマーＶ
配列番号：１５
＜２２３＞ Ｍｐ－Ｔ－Ｒ／リバースプライマーＶ
配列番号：１６
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ２
配列番号：１７
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ３
配列番号：１８
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ４
配列番号：１９
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ５
配列番号：２０
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ６
配列番号：２１
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｆ７
配列番号：２２
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ２
配列番号：２３
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ３
配列番号：２４
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ４
配列番号：２５
＜２２３＞ Ｐｌ－Ｉ－Ｒ５
配列番号：２６
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ２
配列番号：２７
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｆ３
配列番号：２８
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ２
配列番号：２９
＜２２３＞ Ｐｌ－ＩＩ－Ｒ３
配列番号：３０
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｆ２
配列番号：３１
＜２２３＞ Ｍｐ－Ａ－Ｒ２
Claims (10)
- 試料中の、遺伝子型ＥＲＩＣ Ｉ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ Ｉ）、遺伝子型ＥＲＩＣ ＩＩ型のアメリカ腐蛆病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ＥＲＩＣ ＩＩ）、ＥＲＩＣ Ｉ型及びＩＩ型以外の遺伝子型のアメリカ腐蛆病菌、表現型非典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ａｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、及び表現型典型のヨーロッパ腐蛆病菌（ｔｙｐｉｃａｌ Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）を同時に検出する方法であり、
前記試料由来のＤＮＡを鋳型として、下記の５種の標的領域：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列における５３～１０２４番目の第１の標的領域、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列における７９４～２１０１番目の第２の標的領域、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列における２～３３９番目の第３の標的領域、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列における１０９～３６７番目の第４の標的領域、及び
配列番号５に記載のヌクレオチド配列における３６～２２２番目の第５の標的領域、
をそれぞれ増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットを５種用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なうＰＣＲ工程と、
前記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする、腐蛆病菌の同時検出方法。 - 前記５種のプライマーセットが、
配列番号１のヌクレオチド配列における５３～７５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号１のヌクレオチド配列における１００２～１０２４番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号２のヌクレオチド配列における１３６９～１３９６番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号２のヌクレオチド配列における１８９５～１９２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号３のヌクレオチド配列における３～３０番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号３のヌクレオチド配列における３１２～３３５番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号４のヌクレオチド配列における１１１～１３８番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＶと、配列番号４のヌクレオチド配列における３４０～３６７番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号５のヌクレオチド配列における３６～５５番目の部位にハイブリダイズするフォーワードプライマーＶと、配列番号５のヌクレオチド配列における２０１～２２２番目の部位にハイブリダイズするリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
であることを特徴とする、請求項１に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。 - 前記プライマーセットＩＩが、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
- 前記プライマーセットＩＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
- 前記プライマーセットＩＶが、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２～４のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
- 前記５種のプライマーセットが、
配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
であることを特徴とする、請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。 - 前記検出工程が、電気泳動により前記ＰＣＲ産物を分離する工程を含むことを特徴とする、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法。
- 配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、及び
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含むことを特徴とする、プライマーキット。 - 配列番号６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩと、配列番号７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩと、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ、
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩＩ、
配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＶと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＶと、の組み合わせであるプライマーセットＩＶ、及び
配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＶと、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＶと、の組み合わせであるプライマーセットＶ、
を含むことを特徴とする、請求項８に記載のプライマーキット。 - 請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の腐蛆病菌の同時検出方法に用いるためのプライマーキットであることを特徴とする、請求項８又は９に記載のプライマーキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021187884A JP7390736B2 (ja) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021187884A JP7390736B2 (ja) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023074765A true JP2023074765A (ja) | 2023-05-30 |
| JP7390736B2 JP7390736B2 (ja) | 2023-12-04 |
Family
ID=86541377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021187884A Active JP7390736B2 (ja) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7390736B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019062745A (ja) | 2017-09-28 | 2019-04-25 | 株式会社Ｄｎａチップ研究所 | 蜂病の原因菌を検出する方法及びその検出キット |
-
2021
- 2021-11-18 JP JP2021187884A patent/JP7390736B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7390736B2 (ja) | 2023-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| El-Hadedy et al. | Identification of Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from Egyptian food by conventional and molecular methods | |
| Goto et al. | Rapid detection of Pseudomonas aeruginosa in mouse feces by colorimetric loop-mediated isothermal amplification | |
| US10174386B2 (en) | Method of quantitatively analyzing microorganism targeting rRNA | |
| EP2419527B1 (en) | Method for the detection and characterization of a toxinogenic clostridium difficile strain | |
| KR101424103B1 (ko) | 십자화과 흑부병원균의 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| JP4621919B2 (ja) | 微生物の多重検出方法 | |
| Derzelle et al. | Use of high-resolution melting and melting temperature-shift assays for specific detection and identification of Bacillus anthracis based on single nucleotide discrimination | |
| Pieczul et al. | Detection of Tilletia caries, Tilletia laevis and Tilletia controversa wheat grain contamination using loop-mediated isothermal DNA amplification (LAMP) | |
| CN105349657A (zh) | 病原生物的多种分析检测 | |
| KR101990163B1 (ko) | 독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법 | |
| Hadjinicolaou et al. | Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discrimination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates | |
| Okamoto et al. | A novel multiplex PCR assay to detect and distinguish between different types of Paenibacillus larvae and Melissococcus plutonius, and a survey of foulbrood pathogen contamination in Japanese honey | |
| Galetto et al. | Real-time PCR diagnosis and quantification of phytoplasmas | |
| WO2004046375A2 (en) | Method for the detection of microorganisms in pharmaceutical products | |
| JP7390736B2 (ja) | 腐蛆病菌の同時検出方法及びプライマーキット | |
| US20140303072A1 (en) | Method of Determining Types I, II, III, IV or V or Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a Biological Sample | |
| KR101752274B1 (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
| Sarovich et al. | Selective isolation of Yersinia pestis from plague-infected fleas | |
| KR101395938B1 (ko) | 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법 | |
| KR101846182B1 (ko) | 바실러스 세레우스, 황색포도상구균, 살모넬라균의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 | |
| US20120009575A1 (en) | Inducible nucleic acid targets for detection of pathogens, methods and compositions thereof | |
| Buddhachat et al. | Rapid detection of two pathogenically important Xanthomonas in rice using a loop-mediated isothermal amplification with lateral flow dipstick (LAMP-LFD) | |
| KR20130021012A (ko) | 마이코플라즈마를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법 및 키트 | |
| Allawi | Isolation and Identification of Penicillium rubens from the Local Strain in Mosul, Iraq, and Investigation of Potassium Phosphate Effect on its Growth | |
| JP2012187067A (ja) | ラクトバチルス属細菌の定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230710 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20230710 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230830 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231013 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231109 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231114 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7390736 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |