CN105349657A - 病原生物的多种分析检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病原生物的多种分析检测。本发明涉及从病原的预定组鉴定病原生物的方法，该方法包括(i)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，(ii)将所述临床样品的至少第一个等分试样置于一个反应容器中进行至少一种扩增和检测反应，该反应包括iia)使用至少第一组扩增引物的扩增步骤，所述引物能够从所述病原的预定组的一些或所有成员扩增预先选择的核酸序列区，iib)使用至少2、3或多种杂交试剂的检测步骤，所述试剂一起能够从所述病原组的所有成员检测预先选择的核酸序列区，所述检测步骤iib)包括步骤：监视预先选择的温度下所述杂交试剂的每一种的杂交，所述杂交至少指示样品中存在的所述病原的属，和监视杂交的温度依赖性，所述温度依赖性至少指示所述病原的种，和(iii)确定所述扩增和检测反应是否指示所述病原的预先选择组的特定成员的存在。

Description

病原生物的多种分析检测
本申请是国际申请日为2003年12月2日的国际申请PCT/EP2003/013530进入中国、申请号为200380105073.7的题为“病原生物的多种分析检测”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及检测病原微生物的技术领域。更具体地，本发明涉及通过从所述病原生物扩增和检测特定核酸序列检测临床样品中病原生物导致的感染的领域。
背景技术
病原细菌，尤其导致脓毒的病原细菌的感染主要发生在医院的重病监护室(ICU)并且是严重的。感染患者的细菌在多数情况下是未知的并且不能从症状确定。每种细菌需要施用特定抗生素的不同疗法。目前，在常规诊断中，使用包括用血液或其他体液样品培养细菌(如果存在)来检测病原细菌，尤其革兰氏阳性细菌。这种培养保持在有利于细菌生长的条件下约3天。在该期间内，细菌的数目从而它们的核酸增加。之后，将培养基裂解。裂解混合物用作随后生化或免疫学分析的样品。整个方法花费至少约4天直到清楚病原细菌对样品造成的感染。病原细菌的感染对于受感染的人是非常严重的。在感染的第一天，必须开始治疗，该治疗优选施用适于特别影响具体感染细菌的抗生素。否则，患者受该感染的侵袭太严重而可能在弄清该感染之前死亡。另一方面，同时施用几种广谱抗生素以防止全身性事件必须避免使患者虚弱。因此当前的方法对于常规ICU诊断是不能令人满意的。
很久以来，在本领域中已经公知通过基于核酸的杂交使用特定杂交探针鉴定病原生物如病原细菌或真菌。例如，EP0131052公开了方法和探针，其中直接从培养基检测生物的某些种类或某一群体的核糖体核糖核酸(rRNA)序列。检测核糖体靶序列特别有用，因为这些序列在体内扩增，导致各自测定的高度灵敏性。
利用PCR技术改进了对病原生物的基于核酸序列的检测。对于病原真菌如念珠菌(Candida)和曲霉菌(Aspergillus)的检测，例如，WO97/07238公开了一种方法，该方法使用一般性引物扩增所有类型的真菌核糖体18SrDNA序列并随后将其与真菌种类特异的探针杂交。
作为分析核糖体基因序列的备选方案，非编码但是转录的核糖体间隔区DNA序列，像位于16S和23SrRNA基因之间的ITS-1区已经被用于检测和鉴定一些病原生物(见，例如，EP0452596)。
在另一背景中，通过与等位基因特异的扩增方法相当的依赖靶标的扩增区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌组(Klausegger，A.，等人，J.Clin.Microbiol.37(1999)464-466)。基于它们的16Sr-DNA序列，Klausegger等人研究的种在16SrRNA基因的给定位置不同，因为所有研究的革兰氏阴性细菌都在某一核苷酸位置含有一个G-残基，而所有研究的革兰氏阳性细菌在所述核苷酸位置总是含有一个C-残基。因此，分别使用有差别的互补3’-末端C-残基或互补G-残基的引物，可以扩增革兰氏阳性或革兰氏阴性序列起源的DNA。
利用动态实时PCR得到了进一步发展。在这种类型的测定中，在每轮PCR中监视PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，该热循环仪具有额外的检测方法用以监视扩增反应期间的荧光信号。一个典型的实例是RocheDiagnosticsLightCyelerTM(目录号20110468)。在LightCyclerTM以及目前通过商业途径可得到的其他实时PCR仪器中，通过荧光标记的杂交探针检测扩增产物，这些探针仅当结合靶核酸时发出荧光信号，或者在一些情况中通过结合双链DNA的荧光染料检测扩增产物。为所要分析的所有反应确定限定的信号阈值，并且为靶核酸以及对照核酸如标准或管家基因确定达到该阈值所需的循环数(Cp)。可以基于为靶核酸和对照核酸所得到的Cp值确定靶分子的绝对或相对拷贝数(RocheDiagnosticsLightCyclerTM操作手册(目录号20110468))。
对于扩增DNA的检测存在不同形式：
a)DNA结合染料形式
因为双链扩增产物的量通常超过所要分析的样品中最初存在的核酸的量，所以可以使用双链DNA特异染料，当用适宜波长激发时该染料仅当结合双链DNA时表现出增强的荧光。该方法在EP0512334中描述。优选地，仅使用像例如，GreenI的染料，它们不影响PCR反应的效率。本领域中公知的所有其他形式需要适当设计荧光标记的杂交探针，该探针仅当结合其靶核酸时发出荧光。
b)TaqManTM探针
用两种组分标记单链杂交探针。根据荧光共振能量转移，当第一种组分(所称作的荧光剂)被适当波长的光激发时，所吸收的能量被转移到第二种组分(所称作的淬灭剂)。在PCR反应的退火步骤，杂交探针结合靶DNA并在延伸期间被聚合酶，例如Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性降解。结果，所激发的荧光组分和淬灭剂在空间上相互分开，从而可以测量第一种组分的荧光发射(EPB0543942和US5,210,015)。
c)分子信标
这些杂交探针也被第一种组分和淬灭剂标记，标记物优选位于至少部分自身互补探针的不同末端。由于该探针的二级结构的结果，溶液中两种组分在空间上接近。杂交到靶核酸后，两种组分相互分开，从而用适当波长的光激发后，可以测量第一种组分(US5,118,801)。
d)FRET杂交探针
荧光共振能量转移(FRET)杂交探针试验形式特别用于所有种类的同质(homologous)杂交测定(Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，AnalBiochem169(1988)1-25)。其特征是同时使用两种单链杂交探针，并且这两种探针与(扩增的)靶核酸的相同链的相邻部位互补。用不同荧光组分标记两种探针。当用适当波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，第一种组分将吸收的能量转移到第二种组分，从而仅当两种杂交探针结合到所要检测的靶分子的相邻位置时可以测量第二种组分的荧光发射。
当与靶序列退火时，杂交探针必须以头到尾的排列相互非常接近。通常，第一种探针的标记的3’末端和第二种探针的标记的5’末端之间的缺口尽可能小，即1-5个碱基。这容许FRET供体化合物和FRET受体化合物紧密接近，通常相距10-100埃。细节是熟知的并且在例如EP0070687中公开。
备选地，为了监视FRET受体组分的荧光的增加，还可能监视FRET供体组分的荧光降低，将其作为杂交事件的定量测量。
具体地，FRET杂交探针形式可用于实时PCR中以检测扩增的靶DNA。在实时PCR领域中所有公知的检测形式中，FRET-杂交探针形式已经被证明是高度灵敏、精确和可靠的(WO97/46707；WO97/46712；WO97/46714)。然而，适宜FRET杂交探针序列的设计有时受到所要检测的靶核酸序列的特定特征的限制。
作为使用两种FRET杂交探针的备选方案，还可能使用荧光标记的引物和仅一种标记的寡核苷酸探针(Bernard，P.S.，等人，Anal.Biochem.255(1998)101-7)。在这点上，可以任意用FRET供体或FRET受体化合物标记引物。
FRET杂交探针(所称作的FRET-Hybprobes或FRET探针)也可用于熔解曲线分析(WO97/46707；WO97/46712；WO97/46714)。在这种测定中，首先在典型PCR反应中用适宜的扩增引物扩增靶核酸。扩增反应期间杂交探针可以已经存在或者随后加入。PCR反应完成后，样品的温度组成性地增加。只要杂交探针结合到靶DNA，就可检测到荧光。在熔解温度，杂交探针从它们的靶标释放，荧光信号立即降低到背景水平。用适宜的荧光对温度-时间图监视该降低，从而可以计算一阶导数函数的负数。然后将相应于这种函数的所得最大值的温度值作为所述FRET杂交探针对的确定的熔解温度。
靶核酸内点突变或多态性导致靶核酸和FRET探针之间小于100％的互补性，从而导致熔解温度降低。这使得能够通过FERT-Hybprobe杂交一般性检测序列变体池(pool)，而随后，通过实施熔解曲线分析区分所述池的不同成员。分子信标可以代替FRET杂交探针用于熔解曲线分析。
当可以利用实施PCR和同质实时PCR熔解曲线分析时，使用双链DNA结合染料如SybrGreenTMI，或者备选地，特别设计的与不同但是类似的靶序列杂交的杂交探针，可以区分不同的物种或菌株类型。
在第一种情况中，必须确定所产生的双链PCR产物的熔解温度。然而，该方法只有有限应用，因为微小序列变异仅导致微小的熔解温度差异，其不能被有效监视。Woo，T.H.，等人，J.Microbiol.Methods35(1999)23-30公开了一个成功的实例，他们进行了双曲钩端螺旋体(Leptospirabiflexa)的16SrDNA序列的扩增并用SybrGreenTMI作为DNA结合染料进行熔解曲线分析以便从来自不同钩端螺旋体种的DNA的非特异扩增产物区分双曲钩端螺旋体株。
备选地，可以以这种方式使用杂交探针从而确定探针/靶核酸杂交体的熔解温度。例如，Espy，M.J.，等人，J.Clin.Microbiol.38(2000)795-799公开了通过扩增单纯疱疹序列并随后用FRET杂交探针分析序列以区分I型HSV和II型HSV基因型，从而诊断单纯疱疹感染。
此外，WO01/48237提出通常将扩增和依赖温度的杂交联合以检测不同的病原物种。然而WO01/48237没有教导能够排外性检测病原生物而且不检测任何非病原生物的的任何方法或条件。
甚至当前所用的包括特定细菌种的体外扩增和所述细菌的随后检测的方法也不能用于需要紧急诊断，例如，ICU中的情形，因为对于每种细菌，必须进行扩增反应和检测反应。这需要从每个患者抽取大量样品体积，如血液。在ICU中，不能从严重感染的患者得到大的样品体积。
从而本领域中需要提供特别用于在尽可能小体积中检测相关目标病原生物的方法。具体地，本领域中需要能够检测所有相关病原革兰氏阳性细菌但同时不检测类似的非病原革兰氏阳性细菌的方法。具体地，需要确定哪种病原属和/或种存在于样品中。
发明内容
通过本申请中公开和要求的方法和化合物解决了上面公开的问题。
通常，本发明涉及从病原的预定组鉴定病原生物的方法，该方法包括
a)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，
b)将所述临床样品的至少第一个等分试样置于一个反应容器中进行至少一种扩增和检测反应，该反应包括
ba)使用至少第一组扩增引物的扩增步骤，所述引物能够从所述病原的预定组的一些或所有成员扩增预先选择的核酸序列区，
bb)使用至少2、3或多种杂交试剂的检测步骤，所述试剂一起能够从病原的所述组的所有成员检测预先选择的核酸序列区，所述检测步骤bb)包括步骤：
bba)监视预先选择的温度下所述杂交试剂的每一种的杂交，所述杂交指示样品中存在的所述病原的至少属，和
bbb)监视杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示所述病原的至少种。
本发明还涉及适于实施上面公开的方法的组合物。
此外，本发明涉及适于实施上面公开的方法的试剂盒。
具体实施方式
本发明提供了特别适于诊断病原生物感染的方法和化合物。在这点上，如果怀疑患者受到感染，本发明提供了确定所述病原生物的种的方法。此外，根据本发明的新方法，特别当与实时PCR技术如LightCyclerTM联合时能够快速诊断导致脓毒症的感染剂，这在许多临床环境中非常重要。
从而，通常，本发明涉及从病原的预定组鉴定病原生物的方法，该方法包括
a)分离含有至少部分纯化的核酸的临床样品，
b)将所述临床样品的至少第一个等分试样置于一个反应容器中进行至少一种扩增和检测反应，该反应包括
ba)使用至少第一组扩增引物的扩增步骤，所述引物能够从所述病原的预定组的一些或所有成员扩增预先选择的核酸序列，
bb)使用至少2、3或多种杂交试剂的检测步骤，所述试剂一起能够从病原的所述组的所有成员检测预先选择的核酸序列，所述检测步骤bb)包括步骤：
bba)监视预先选择的温度下所述杂交试剂的每一种的杂交，所述杂交指示样品中存在的所述病原的至少属，和
bbb)监视杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示所述病原的至少种。
独立于如所要求的方法的不同步骤的定义，可以理解步骤a)、b)和c)优选一个接一个地进行。可以在每个步骤之前、两个步骤之间，或每个步骤之后实施额外的步骤。
本发明方法的起始材料是怀疑含有病原生物的临床样品。这些临床样品的实例是全血、血清、血浆和脑脊液。优选地，起始材料来自人。步骤a)总是首先进行并且可以根据本领域中公知的任一方法实施。在该语境中，“临床样品”被理解为可从患者得到的含有任何种类的细胞或非细胞材料的样品，即体液或甚至组织得到的标本。优选地，临床样品来自全血、血清、血浆或脑脊液。
具体地，从最初样品中存在的蛋白质和糖分离核酸。本领域中公知的任一纯化方法可用于本发明的背景中。然而，优选地，所应用的方法导致所要分析的总DNA的基本上完全纯化。至少，纯化需要被进行到如此程度使得不用任何进一步的实质性稀释，样品的等分试样中的核酸序列可以在体外扩增，如PCR中被成功地扩增。纯化中，从核酸除去抑制聚合酶的任何化合物。
用体外方法，优选PCR(EP201184)进行扩增。在下文中，以PCR为参考，但是应该理解其他体外扩增方法也是适宜的。
步骤b)包括异质(heterologous)和同质实施方案。在异质实施方案中，首先实施扩增步骤ba)。随后，并任选包括用额外的检测试剂补充，实施步骤bb)。
在同质实施方案中，优选扩增步骤ba)开始之前已经向样品中加入了用于扩增和检测步骤的试剂。在一些情况中，步骤ba)和步骤bba)可以平行进行，即实时地、优选每次热循环期间或之后或至少几次循环之后监视杂交。在该情况中，步骤bba)的所述预先选择的温度通常与PCR热循环方案的退火温度相同或非常相似。
通常以如此方式一起实施步骤bba)和bbb)使得首先，杂交事件自身在预先选择的温度下被监视。然后，持续增加温度以确定探针/靶杂交体被分辨的温度。换句话说，实施熔解曲线分析。
对于扩增反应期间已经实时监视杂交的情况，如果在预先选择的温度下不可能发现杂交信号，那么可以省略熔解曲线分析。
在本发明背景中，上面所用的特定术语定义如下：
术语“病原生物的鉴定”用于描述确定样品中是否存在病原生物的预定组或亚组中所含的种内的特定种或株系或分离物的方法。该鉴定的输出或结果是种的名称。这允许随后适当选择选择性抗生素疗法。
术语“病原生物的预定组”用于描述病原生物的预先定义的组，该组由用于具体目标的病原生物组成。优选地，病原生物的预定组可以是所有病原生物的组，这些病原生物在给定临床环境中是临床上相关的，并且所要扩增的各自基因组序列是本领域中基本上公知的。
例如，这种预定组可以含有两种或多种属的临床上相关的成员。备选地，某一属的所有公知的临床上相关成员可以组成这种预定的组。备选地，某一个种的所有公知的临床上相关成员和株系或分离物可以组成这种预定组。预定组可以还含有不同属的分类学上的亚组，它们与其他属或种的株系混合。
术语“特异的”用于描述受试者(例如，在方法、步骤或试剂中)的特征，该受试者仅指向一个特定并且限定的结果。例如，检测特定物种的方法仅当该物种而不是其他物种被检测到时被认为是特异的。探针与靶标的特异杂交是仅该探针与该靶标而不与其他靶标之间发生的杂交。换句话说，本发明允许选择性检测一个属或种的所有病原成员，而所述属或所述种的其他公知的、非病原性成员绝对不被检测到。
在该背景下，本发明的总体方法对于生物的鉴定是优选基本上特异的。不是预定组或亚组的成员的生物优选不被鉴定，因为用这些试剂实施的步骤被调节而不检测不属于该组的生物。这不一定表示总方法的每个单一步骤都是特异的，尽管这是可能的。例如，如果选择的扩增引物对所要鉴定的生物不特异(因为那些引物可用于扩增将不被鉴定的生物的核酸)，那么步骤ba)可以是非特异的。通过选择检测步骤的一个或多个部分是特异的，例如步骤bbb)，可以实现总体方法的特异性。作为实例，本发明覆盖实施方案，其中步骤bba)导致阳性信号，因为杂交试剂与预定组的一个成员的核酸以及样品中和/或步骤ba)中扩增的非靶核酸杂交，但是在步骤bbb)中，监视温度依赖性仅仅证明预定组成员的种的身份，独立于非靶标核酸的身份。
作为与本领域中公知方法相比的一个主要优点，本发明第一次允许选择性鉴定细菌属或种的病原成员，而所述属或所述种的其他公知的、非病原成员不被鉴定。
重要的是注意到如果所要分析的临床样品含有一种新的、以前未知的株系，该株系具有新的、稍微不同的靶序列，那么根据本发明的新方法可偶然导致假阳性或假阴性结果。如果扩增并检测到一种未知的非病原生物，那么步骤bba)的结果将是假阳性。然而，在该情况中，该假阳性结果可以在所要求的方法的步骤bbb)，即监视杂交的温度依赖性期间被检测到。在该情况中，步骤bbb)的温度依赖性与已知病原生物的温度依赖性的比较将表明该生物不属于预定组的物种，即，步骤c)的结果将是阴性的。如果没有扩增或检测到一种未知病原生物，那么结果是假阴性。然而根据迄今本发明人对临床分离物进行的所有研究，这些情况非常稀少并且，也不能被本领域中任何其他相当的方法避免。
术语“病原生物的预定亚组”用于描述病原生物的预定组的一部分或全部。优选地，该预定亚组仅是所有病原生物，更优选主要在医院中发生的病原的一小部分。组和亚组的成员可以选自一个属，但是也可以选自不同属。如果预定组由一个属的所有病原和临床上相关的成员代表，那么各自亚组可以含有某一物种的所有各自病原成员。类似地，如果所述预定组由某一物种的所有临床上相关的成员组成，那么该亚组可以由特定株系的所有成员组成。
术语“扩增和检测反应”将指任一种体外方法，该方法包括一个或多个“扩增步骤”以便从核酸序列池扩增一种或多种靶标序列，还包括一个或多个“检测步骤”以便确定扩增产物的身份。
术语“扩增步骤”将指一个反应或一系列反应，该反应通过使用用于核酸扩增反应的正向和反向引物从含有DNA的样品扩增靶序列(如果存在于临床样品中)。所述扩增步骤的特异性取决于所选定组并且受到所用的引物的特异性的控制。优选地，通过聚合酶链式反应(PCR)使用热稳定的DNA聚合酶实施扩增。在一个实施方案中，扩增通常对于细菌是特异的；即，病毒不被大量扩增。
优选地，扩增步骤对于亚组的成员特异。在优选实施方案中，扩增对所要鉴定的种所属的属特异。
术语“检测步骤”将指通过与适宜的杂交试剂杂交，包括监视所述试剂与靶核酸杂交的温度依赖性来检测扩增产物。扩增和检测不必分开并顺序地进行，而是可以同时进行。
术语“预先选择的核酸序列区”将指旨在被扩增和检测的所有生物的DNA中存在的独特的靶核酸区。根据该实施方案，不同生物的序列之间可能存在某些序列变异。换句话说，总是每种生物的相同基因或相同同源序列被扩增。
如果将被检测的靶标生物的基因组中存在预先选择的核酸序列区的多份拷贝，那么这是有利的。例如，这些多拷贝核酸序列区的代表是编码核糖体RNA，如5sRNA基因、16SrRNA基因和23SrRNA基因和编码一些类型的tRNA的基因。其他极好的预先选择的核酸序列区是rDNA基因簇的转录和非转录的间隔区区域。
关于这点，本发明人已经证明如果预先选择的核酸序列区相应于内部转录的间隔区I，那么这是尤其有利的，该内部转录的间隔区I总是位于16SrRNA的一个拷贝和23SrRNA基因的一个拷贝之间(ITS-1区)。该区域含有进化上保守的以及高度可变序列，这允许灵活设计属和种特异的引物和探针。在真核生物如病原真菌中，18srDNA和26srDNA之间存在类似转录间隔区。
更优选地，预先选择的核酸序列区含有来自将要扩增的生物的16S/23S或18s/26s间隔区的至少20个，甚至更优选多于40个相邻核碱基。该区域含有进化上保守的以及高度可变序列，这允许灵活设计属和种特异的引物和探针。该区域包括在核酸上引物结合位点所限定的区域内。
术语“病原的”指可以影响人的健康状态的细菌(如果人被该细菌感染)。具体地，本发明设计鉴定导致脓毒症的细菌和真菌。
术语“扩增引物组”将指至少两种(可延伸的)寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，即结合靶核酸的第一条链的至少一种(正向)引物和结合所要扩增的靶核酸序列的反向链的至少另一种(反向)引物。此外，以如此方式设计引物的定位使得每种引物的依赖模板的延伸产生一种延伸产物，该产物自身含有引物结合部位，其他引物可以与该引物结合部位杂交。
在多数情况中，使用一对两种扩增引物便足够，它们由一种正向引物和一种反向引物组成。然而，在一些情况中，所要鉴定的不同病原的不同序列的引物结合部位的序列中可能存在一些微小的序列变异。从而，仅使用一种正向和一种反向引物不可能扩增所有成员的序列。对于那些情况，一组扩增引物可以由1、2或多种正向引物和/或1、2或多种反向引物组成，这些引物是类似的并且结合同源序列，但是通过1、2、3或一些单核苷酸-、二核苷酸-、或三核苷酸交换、缺失或加入而相互不同。
而且，如果使用能够结合不同预先选择的核苷酸序列区的三组或多组扩增引物，也在本发明的范围内。在该情况中，所述不同预先选择的核酸序列不必在序列上相互相关。然而，本发明的范围还包括不同的预先选择的核苷酸序列区至少部分或几乎完全重叠。
通常，基于关于所要扩增的病原细菌的预先选择的核苷酸序列区以及关于将不被扩增的那些生物的同源序列的可利用的序列信息设计扩增引物。更精确地，以如此方式选择一组或多组扩增引物使得病原生物的所选的预定组的所有靶核酸序列有最大序列互补性并且，另一方面，关于所有其他非选择的生物，即不属于预定组或者不是病原性的那些生物的核酸序列有最小的序列互补性。
术语“杂交试剂”用以描述能够杂交预先选择的核酸序列区内步骤bb)的扩增产物的试剂，即在扩增子的至少一条链上。该试剂可以含有一种或多种探针，这些探针优选是单链的或者在杂交前成为单链的。优选地，该试剂是单链核酸杂交探针系统，其通常含有一种或两种核酸，这些核酸能够与双链扩增的靶核酸的一条链杂交。根据检测形式的类型，如果杂交试剂被可检测的实体适当标记，从而，通过检测所述标记，就可以检测扩增子/杂交试剂杂交体，这在多数情况下是有利的。
在优选实施方案中，用荧光实体标记杂交试剂从而可以在通过商业途径可得到的实时PCR仪器中检测杂交。用于该实施方案的试剂在上面描述用于检测扩增的DNA的不同形式的文件中公开。
在一种简单情况中杂交试剂可以是寡核苷酸探针。例如，可以应用分子信标形式(US5,118,801)。备选地，还可能使用适宜的单标记的寡核苷酸(WO02/14555)。引用这些参考文献以并入它们的关于试剂和检测方法的内容。
更优选地，杂交试剂由两种相邻的杂交寡核苷酸组成，这些寡核苷酸被适当标记，从而它们一起可以根据如上面公开的(WO97/46707；WO97/46712；WO97/46714)FRET-Hybprobe检测形式作用。在许多情况中，如果杂交试剂由单一寡核苷酸，或者对于FREThybprobe形式，由一对作为供体探针和受体探针的寡核苷酸组成，那么这是足够的。然而，在其他情况中，需要检测的不同真菌病原细菌的靶序列中可能存在其他序列变异。从而仅使用一种寡核苷酸作为探针或者仅使用一对FRET寡核苷酸杂交探针，不可能检测所有成员的序列。
对于那些情况，杂交试剂可以由1、2或多种杂交探针组成，这些探针是相似的并且结合同源序列，但是通过1、2、3或多个单核苷酸-、二核苷酸-、或三核苷酸交换、缺失或加入而相互不同。对于杂交试剂是一对FERT杂交探针的情况，所述杂交试剂可以由1、2、3或多种FERT供体寡核苷酸探针和/或1、2、3或多种受体寡核苷酸探针组成。在该情况中，所有供体探针可以是相似的，但是通过单核苷酸-、二核苷酸-、或三核苷酸交换、缺失或加入而相互不同。同样，所有受体探针是相似的，但是通过单核苷酸-、二核苷酸-、或三核苷酸交换、缺失或加入而相互不同。
已经明确地强调除了使用一种杂交试剂的实施方案，本发明还涉及使用2、3、4或多种杂交试剂的实施方案。在那些情况中，如果杂交试剂的每一种用一种不同的可检测实体，例如，不同的发荧光化合物标记，那么可以区分不同的杂交信号。杂交靶序列不必相互有关。然而，本发明范围还包括所述靶序列至少部分或几乎完全重叠。
对于基于FREThybprobe形式使用多种杂交试剂的情况，仅可利用单一的激发来源。那么，优选对每一对FRET杂交探针有一种共同的FRET供体染料和不同的受体染料。例如，荧光素或荧光素衍生物可用作一般的FRET供体染料，其能够与许多FRET受体染料如LC-Red640(RocheAppliedScience)、LC-Red705(RocheAppliedScience)、Cy5或Cy5.5(Amersham)相互作用。一个特定实施方案涉及基于FRET杂交形式的方法，其中所述多种杂交试剂的每一种含有具有相同序列和相同标记，如例如，荧光素的相同FRET供体探针，并且其中所述杂交探针的每一种含有不同的受体探针，每种探针被不同的荧光团标记。
此外，在该语境中，术语“FRET对”被定义为相互作用而产生FRET过程的一对荧光标记，即，它由FRET供体部分和FRET受体部分组成。
类似于一组扩增引物的设计，基于关于所要扩增和检测的预先选择的核苷酸序列区以及关于将不被检测的那些病原生物的同源序列的所有可利用的序列信息设计一种杂交试剂或多种杂交试剂。更精确地，以如此方式选择杂交试剂的序列使得病原生物的所选的预定组的所有靶核酸序列有最大序列互补性并且，另一方面，关于所有其他非选择的生物的核酸序列有最小的序列互补性。
此外，杂交试剂的设计需要考虑基于监视杂交的温度依赖性可能区分若干靶序列变异。本发明需要不同的熔解温度以便使一种杂交试剂与来自不同病原生物的不同靶序列变体杂交。从而，以如此方式设计根据本发明的杂交试剂的序列使得不同杂交试剂/靶序列杂交体的理论熔解温度(通过本领域中的方法计算)相互间相差至少2℃，优选4℃，最优选至少6℃。
总之，本发明提供了设计亚组，优选属特异的杂交试剂的可能性，其特征是这些杂交试剂检测属于某一预定组的某一亚组属的所有病原成员。备选地，可以设计种或株系特异的杂交试剂，它们允许检测属于某一预定组的某一种的所有病原株系。
术语“监视杂交的温度依赖性”将指确定熔解温度，在该温度下探针从与靶核酸形成的杂交复合体解离。精确地，杂交体的熔解温度(Tm)被定义为杂交对温度信号图的一阶导数达到最大值的温度。根据链的互补性，Tm是杂交体的特性。
在该背景中，重要的是注意到杂交体的熔解温度(Tm)依赖于独立于实际的靶核酸序列自身的一些因素，如盐浓度、探针的长度和GC含量。然而，熔解温度强烈依赖于错配数，即探针和靶序列之间互补的程度。结果，为靶序列的不同变体得到不同熔解温度，这些变体可以在不同属的独特的种或不同种的不同株系中发现。从而，使用适宜的探针设计，一种类型的杂交试剂可用于检测生物的预先选择组的所有成员和通过监视杂交的温度依赖性区分所述成员。
已经证明尤其有利的是通过熔解曲线分析确定杂交的温度依赖性。更确切地，扩增反应后，将PCR产物(杂交试剂的存在下)在第一个温度，例如，90-100℃下变性，随后冷却到第二个温度，所述第二个温度低于或接近PCR方案的退火温度。然后，以0.01-10℃/s，优选0.1-2℃/s，最优选0.1-0.5℃/s的速度升高温度。
术语“指示至少属”将指如果在步骤bba)中产生杂交信号，那么对于步骤c)可以确定某一属的病原生物分别存在于从患者收集的样品中。根据一组或几组扩增引物的设计(例如，序列)，以及根据杂交试剂的设计，从不同杂交试剂得到的杂交信号甚至可以指示所要检测的病原生物的种。优选地，从步骤bba)确定的杂交信号清楚地指示存在预定组的一个成员，但是不一定直接允许知道存在哪个成员。
术语“指示至少种”将指基于步骤bbb)中监视的杂交的温度依赖性，可以从步骤c)清楚地确定临床样品中存在哪个病原种。由于一组或多组扩增引物的设计和杂交试剂的设计，从监视杂交的温度依赖性得到的数据指示种或者甚至各自病原生物的某一株系的身份。即使样品可能含有类似或相同于靶序列的非靶标序列，它们也不会被扩增，因为引物不适于扩增非靶标区。
总之，本发明提供了鉴定病原生物的方法，其中在第一个扩增步骤中，使用一组或几组适宜的引物对，将所有目标病原生物的序列扩增并随后通过适宜的杂交试剂检测。由于适宜的引物和探针设计，非病原微生物的序列不被扩增或者不被检测，或者被扩增但是不被检测。对于用一种不同的杂交试剂发生的杂交，其指示感染剂的至少属。
随后监视依赖温度的荧光，例如，将样品置于温度的持续增加并确定靶核酸和杂交试剂发生熔解的温度。所监视的熔解温度指示最初样品中存在的各自病原的种或甚至亚种或株系。
在该背景中，杂交体的熔解温度(Tm)如文献中通常的定义，即杂交对温度曲线的一阶导数发生最大值时的温度。根据链的互补性，Tm是杂交体特征性的。
为了实现感染检测的足够灵敏性，本发明方法的步骤a)通常包括至少部分纯化来自最初样品的核酸。所要分离的核酸可以是RNA或DNA或它们的混合物。作为最优选的实施方案，本发明使用细菌DNA以最终鉴定病原生物，不需要临床样品含有RNA。因此，不必部分或甚至完全从临床样品特别分离RNA。从临床样品分离DNA对于接受具有阳性对照的信号应该是足够并且完全的。
步骤a)的结果通常是流体，其含有来自最初临床样品的核酸以及分离步骤期间加入的试剂，像缓冲液。在步骤b)中，临床样品或其部分进行一个或多个扩增反应。扩增和检测反应可以包括一步或多步。扩增反应和检测反应都是本领域中公知的。使用体外方法，优选PCR(EP0201184)实施扩增。在下文中，参照PCR，但是应该理解其他体外方法也是适宜的。扩增反应的结果是产生所述引物的大量延伸产物，它们主要具有从一种引物的5’末端位置到另一引物的5’末端位置的序列。产生的那些核酸通常被称为扩增子。
为了避免由于临床样品中可能存在的抑制性残留组分导致的假阴性结果和为了定量的目的，已经证明尤其有利的是加入内部对照模板。通常，所述对照模板含有具有引物结合部位的已知序列，这些引物结合部位与用于所要检测的靶核酸序列的扩增的至少一组扩增引物互补。因此，所述扩增引物还能够引发对照模板的所述选择的序列的扩增。使用内部标准，尤其关于定量的细节在EP0497784中公开。
已经证明有利的是使用临床样品的等分试样实施根据本发明的方法，该等分试样的体积为10到100μl。从而，如果可以得到仅少量临床样品，如全血或血清，就可以足够灵敏地实施本发明的方法。
然而，最终，本发明方法和本领域中公知的任一其他方法的结果可能受到临床样品中存在的人基因组DNA的高背景的影响。如果发生该情况，那么可以进行根据WO01/94634的预扩增步骤，其特征是选择性非人DNA序列被选择性扩增。
关于步骤b)，如上面指出的，本发明涉及实施方案，其中使用至少第一种和第二种，或者备选地，第一种、第二种和第三种和甚至第一、第二、第三和第四种杂交试剂以检测宽范围的病原生物。优选地，杂交试剂的每一种携带不同的标记，优选荧光标记。从而，根据本发明，在一种多步骤方法的步骤ba)期间可以已经存在所有杂交试剂，允许在一个反应容器中检测多种病原细菌。
为了避免由于临床样品中可能存在的抑制性残留组分导致的假阴性结果，已经证明尤其有利的是加入内部对照模板。通常，所述对照模板含有具有引物结合部位的所选序列，这些引物结合部位与用于所要检测的靶核酸序列的扩增的至少一组扩增引物互补。因此，所述扩增引物组还能够引发对照模板的所述选择序列的扩增。
对于步骤b)，存在异质和同质实施方案。在异质实施方案中，首先加入步骤ba)所需的试剂并首先实施扩增步骤ba)。随后，并任选包括用额外的检测试剂补充，实施步骤bb)。
在一些情况中优选使用异质形式，其特征是扩增步骤ba)后，将反应混合物分成至少2、3、4或若干亚等分试样。然后用至少相同数目的不同杂交试剂实施步骤bb)，每种杂交试剂在一个不同的反应容器中。
在比异质实施方案高度优选的同质实施方案中，在扩增步骤ba)开始之前将用于扩增和检测步骤的试剂加入样品。在一些情况中，步骤ba)和步骤bba)可以平行进行，即在扩增期间监视杂交，对于PCR，每次热循环期间或之后或至少几次循环之后监视杂交。在该情况中，步骤bba)的所述预先选择的温度通常与PCR热循环方案的退火温度相同或非常相似。退火温度是杂交试剂(例如，探针)与其靶标(即，所要扩增的核酸，和/或更早的延伸反应中形成的扩增子)杂交的温度。为了实现杂交的足够特异性(即，主要检测靶标的序列)，选择退火温度使得探针主要与靶核酸退火/杂交，但是不与将不被鉴定的生物的核酸退火/杂交。影响探针与核酸杂交的选择性的方法是本领域中熟知的(长度、GC-含量和互补性程度)。
根据本发明，随后以同质测定形式实施扩增步骤ba)和检测步骤bb)，同质测定形式的特征是在扩增步骤期间一种或多种杂交试剂已经存在于反应混合物内。换句话说，在相同的反应容器中实施扩增步骤ba)和检测步骤bb)而在这两个步骤之间不加入其他试剂。
步骤bba)中，测量杂交的杂交试剂的信号并且将如常规同质核酸杂交中，尤其如上面关于LightCycler的不同方法所概述的进行测量。
优选如此一起实施步骤bba)和bbb)使得首先，杂交事件自身在预先选择的第一温度下被监视。然后，持续增加温度到至少可以确定含有杂交试剂的杂交体被分辨的温度。换句话说，即实施杂交体的熔解曲线分析。
优选一旦实施足够的循环数Cp以将存在的任一靶序列扩增到通过温度依赖性可检测的水平，就实施监视步骤bbb)。那通常与通过探针杂交可检测的核酸的量相符，即，一旦测量了步骤bba)中明显阳性信号，就可以实施步骤bbb)。Cp优选为20到50。
当在扩增反应期间监视杂交时(也称作“实时”)，可以省略熔解曲线分析，只要不可能在预先选择的温度发现杂交信号。
步骤c)包括解释步骤bb)期间得到的结果。这可通过解释所得结果手工进行。优选地，使用计算机程序分析结果，这些程序产生输出，其清楚地表明是否并且哪种革兰氏阳性细菌存在于样品中并从而可能已经导致该感染。
该解释基于从步骤bba)和bbb)中得到的信号与从阳性对照得到的值的相关性。阳性对照的使用通常也从现有技术得知。阳性对照是一种核酸，公知该核酸存在于该样品或者人工制备的对照样品中。例如，在预先选择的温度下探针杂交的特异性被用于确定在步骤ba)中可能已经被引物扩增并且属于革兰氏阳性病原生物的所述亚组的任何核酸是否存在于该样品中。阳性信号(相对于阴性对照)表明存在属于所述亚组(步骤bba)的物种，即使从所述步骤bba)没有确定所述物种的身份。
杂交的温度依赖性被用于鉴定样品中存在的物种。通过该步骤，可以确定所述生物(其一般存在从步骤bba确定)属于所述亚组的哪个物种。例如，其熔解温度表明特定物种的核酸。因此，可通过达到靶标与杂交试剂的杂交体的熔解温度时信号变化的发生来验证实际样品中预定物种的存在。
本发明还涉及含有至少第一组扩增引物和至少2、3、或多种杂交试剂的组合物，该组合物的特征是
-所述至少第一组扩增引物能够扩增来自病原的预定组的一些或所有成员的预先选择的核酸序列区，和
-所述至少2、3或多种杂交试剂一起能够特异检测来自病原的预定组的所有成员的预先选择的核酸序列区，其中
-预先选择的温度下每个所述杂交试剂的杂交指示样品中存在的病原的至少属，并且
-温度依赖性指示所述病原的至少种。
此外，根据本发明的这种组合物可以含有选自下面所列的一种或几种或优选所有化合物和试剂：
-缓冲液，适于聚合酶链式反应
-脱氧核苷三磷酸
-模板依赖的DNA聚合酶，优选热稳定的。
这种组合物可以还含有至少部分纯化的核酸，其可以例如，来自临床样品并且可以经历根据本发明任一种方法。
在再一方面，本发明涉及含有至少第一组扩增引物和至少2、3、或多种杂交试剂的试剂盒，该试剂盒的特征是
-所述至少第一组扩增引物能够扩增来自病原的预定组的一些或所有成员的预先选择的核酸序列区，和
-所述至少2、3或多种杂交试剂一起能够特异检测来自病原的预定组的所有成员的预先选择的核酸序列区，其中
-预先选择的温度下每个所述杂交试剂的杂交指示样品中存在的病原的至少属，并且
-所述杂交的温度依赖性指示所述病原的至少种。
此外，根据本发明的这种试剂盒可以含有选自下面所列的一种或几种化合物和试剂：
-缓冲液，适于聚合酶链式反应
-脱氧核苷三磷酸
-依赖模板的DNA聚合酶，优选热稳定的。
每一种为单独或者组合的。
这种试剂盒可以还含有至少部分纯化的核酸，其可以例如，来自临床样品并且可以经历根据本发明的任一种方法。这种试剂盒可以还含有内部对照DNA，可以使用与用于检测任何靶核酸相同的引物和探针扩增和检测该内部对照DNA。
上面公开的组分的每一种可以保存在单个保存容器中。然而，将组分的任一组合保存在相同容器中也是可能的。
此外，这种试剂盒可以还包含软件工具如携带用于定量和定性分析通过所要求的方法得到的数据的计算机程序的光盘。
本发明与现有技术细菌测定的不同之处在于公知的测定仅提供了关于一种特定种或株系的信息(用于检测样品中特定生物存在的常规方法)，本发明的试剂适于并且用于两个或多个种的鉴定，同时平行地指出它们中的任一种(不管哪种生物)是否存在。
如上面所指出的，监视可以指示至少病原属的依赖扩增的信号与监视杂交的温度依赖性的联合容许同时检测和鉴定宽范围的目标病原生物。
在一个实施方案中，本发明使得能够检测和鉴定病原革兰氏阳性细菌的预定组，所述组包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、Streptococcusagalactine、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
在另一具体实施方案中，本发明使得能够检测和鉴定病原革兰氏阴性细菌的预定组，所述组包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、粘质沙雷氏杆菌(Serratiamarcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Acinetobacterbaumanii、stenotrophomonasmaltophilia。
在另一具体实施方案中，本发明使得能够检测和鉴定病原真菌的预定组，所述组包括白色念珠菌(Candidaalbicans)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、Candidacrusei、无名假丝酵母(Candidaglabrata)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。
优选地，上面提到的所述组不含有任何其他物种。
本发明范围内还包括本发明方法的步骤a)之后，将第一和第二份等分试样每种在两个不同的反应容器中相互独立地根据步骤b)和c)进行扩增和检测反应。
例如，第一个等分试样可用于检测和鉴定病原性革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、肺炎链球菌、Streptococcusagalactine、酿脓链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌。第二个等分试样可用于检测和鉴定病原性革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌、绿脓假单胞菌、Acinetobacterbaumanii、和stenotrophomonasmaltophilia。
此外，本发明范围还包括本发明方法的步骤a)之后，将第一和第二和第三份等分试样分别在三个不同的反应容器中相互独立地根据步骤b)和c)进行扩增和检测反应。如果第一和第二份等分试样分别用于检测和鉴定所有相关的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，那么第三份等分试样用于检测和鉴定真菌病原如白色念珠菌、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、Candidacrusei、无名假丝酵母、烟曲霉。
上面提到的临床样品的两份或三份不同等分试样的分析平行地在相同仪器中运行是方便且节省时间的。因此，高度优选用相同的热循环条件实施不同扩增和检测反应的扩增步骤。换句话说，将用相同的退火、延伸、变性时间和温度参数实施每个扩增。
此外，根据本发明的试剂盒可以由用于不同等分试样中临床样品的平行分析的试剂的联合组成。这种试剂盒含有第一、第二和任选第三组扩增引物和第一、第二和任选第三组至少2、3或多种杂交试剂，每组的特征是
-所述扩增引物组的每一组能够扩增来自病原的预定组的一些或所有成员的预先选择的核酸序列区，和
-所述组的每一组的至少2、3或多种杂交试剂一起能够特异检测来自病原的预定组的所有成员的预先选择的核酸序列区，其中
-在预先选择的温度处的每种所述杂交试剂的杂交指示样品中存在的病原的至少属，并且
-所述杂交的温度依赖性指示所述病原的至少种。
下面提供的实施例、参考文献和序列表有助于理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书给出。可以理解可以在所给出的步骤中做出修改而不背离本发明的精神。
实施例
下面提供的实施例、参考文献和序列表有助于理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书给出。可以理解可以在所给出的步骤中做出修改而不背离本发明的精神。
样品
在缺少或存在5μg人基因组DNA背景的情况下一式两份地部分分析了含有来自屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或绿脓假单胞菌的18SrRNA和23sRNA之间的ITS-1区的质粒DNA的103、102和10份拷贝。向完成的mastermix(见上面)加入内部对照质粒。
硬件/软件
使用LightCyclerTM仪器(RocheDiagnosticsGmbH，德国)。将该通过商业途径可得到的仪器改装使得转子适于容纳100μl毛细管。改装所述仪器的荧光计使得其由4个而不是3个photohybrid组成，并且可以在610nm、640nm、670nm和705nm检测荧光发射。
试剂
通过化学合成制备此处提到的所有寡核苷酸。用于附着标记的试剂可从RocheDiagnosticsGmbH(LightCyclerRed640NHS酯目录号：2015161；LightCyclerRed705亚磷酰胺目录号：2157594；LightCycler荧光素(在下面缩写为“F”)CPG目录号：3113906)购买。这些试剂的使用在BiochemicaNo.1(2001)，8-13页中描述。需要时，可从Amersham得到Cy5-NHSEster。LC-Red610-NHS酯在610nm处具有发射最大值并且按照US5,750,409中描述的使用荧光染料根据标准方案合成。
需要检查所有试剂被将检测的生物的污染。只有不含那些生物和来自这些生物的核酸的试剂可以导致最佳灵敏性。
通常如LightCycler-FastStart-DNAMaster杂交探针试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH目录号2239272)中推荐的使用FastStart聚合酶和FastStartMaster。
根据下表使用针对16s和23srDNA之间的ITS-1区的引物和探针。
使用这些寡核苷酸，如下制备反应混合物：
方法
使用下面的热循环和熔解温度条件运行LightCycler：
结果
结果在下表中概述，该结果指出Cp值(循环数)时，使用二阶导数模式，可以检测到阳性扩增信号。
从上表可以看到，在该多重实验中，可以检测含有粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌或绿脓假单胞菌的ITS-1区的质粒DNA的10份拷贝，而对于表皮葡萄球菌，可以检测到100份拷贝。
在人背景DNA的存在下，可以检测到金黄色葡萄球菌或绿脓假单胞菌的10份拷贝，而对于粪肠球菌、屎肠球菌、和表皮葡萄球菌，可以检测到1000份拷贝。
此外，并且独立于人背景DNA的存在或缺乏，通过熔解曲线分析可以区分610nm通道中粪肠球菌和屎肠球菌的扩增。
对粪肠球菌监视到的Tm为57.5℃，而对屎肠球菌监视到的Tm为53.5℃。
类似地，由于所得两个熔解峰之间的熔解温度，通过熔解曲线分析可以区分640nm通道中金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的扩增。
对于金黄色葡萄球菌，所得Tm为54℃，而对于表皮葡萄球菌，所得Tm为45℃。
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Claims (9)

1.至少第一组扩增引物和至少2、3或多种杂交试剂在制备用于从病原的预定组鉴定病原生物的方法中的试剂盒中的用途，该方法包括
a)从临床样品至少部分纯化核酸，
b)将所述临床样品的至少第一个等分试样置于一个反应容器中进行至少一种扩增和检测反应，该反应包括
ba)使用所述至少第一组扩增引物的扩增步骤，所述引物能够从所述病原的预定组的一些或所有成员扩增预先选择的核酸序列区，
bb)使用所述至少2、3或多种杂交试剂的检测步骤，所述试剂一起能够从所述病原组的所有成员特异检测预先选择的核酸序列区，所述检测步骤bb)包括步骤：
bba)监视预先选择的温度下所述杂交试剂的每一种的杂交，所述杂交指示样品中存在的所述病原的至少属，和
bbb)监视杂交的温度依赖性，所述温度依赖性指示所述病原的至少种，确定所述扩增和检测反应是否指示所述病原的预先选择组中特定成员的存在。
2.根据权利要求1的用途，其中第一份和第二份等分试样分别被置于两个不同的反应容器中而相互独立地进行扩增和检测反应。
3.根据权利要求2的用途，其中第一份、第二份和第三份等分试样分别被置于两个不同的反应容器中而相互独立地进行扩增和检测反应。
4.根据权利要求1-3的用途，其中额外的杂交试剂被用于内部对照的检测。
5.根据权利要求2的用途，其中在一个扩增和检测反应中专门鉴定了革兰氏阳性病原生物，在另一个扩增和检测反应中专门鉴定了革兰氏阴性病原生物。
6.根据权利要求3和5的用途，其中在第三个扩增和检测反应中专门鉴定了真菌病原。
7.根据权利要求2-6的用途，其中用相同的热循环条件实施每个扩增步骤。
8.含有至少第一组扩增引物和至少2、3或多种杂交试剂的组合物，其特征在于
-所述至少第一组扩增引物能够扩增来自病原的预定组的一些或所有成员的预先选择的核酸序列区，和
-所述至少2、3或多种杂交试剂一起能够特异检测来自病原的预定组的所有成员的预先选择的核酸序列区，其中
-预先选择的温度下每个所述杂交试剂的杂交指示样品中存在的病原的至少属，并且
-所述杂交的温度依赖性指示所述病原的至少种。
9.含有至少第一组扩增引物和至少2、3或多种杂交试剂的试剂盒，其特征在于
-所述至少第一组扩增引物能够扩增来自病原的预定组的一些或所有成员的预先选择的核酸序列区，和
-所述至少2、3或多种杂交试剂一起能够特异检测来自病原的预定组的所有成员的预先选择的核酸序列区，其中
-预先选择的温度下每个所述杂交试剂的杂交指示样品中存在的病原的至少属，并且
-所述杂交的温度依赖性指示所述病原的至少种。
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