KR101586678B1 - 단일 염기 다형성을 갖는 미생물 16S rDNA 유전자를 이용한 정량 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인위적으로 합성된 핵산의 활용에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대상 미생물의 유전자와 염기서열 상에서 구분이 가능하도록 특정 위치에 단일 염기 다형성을 갖는 미생물의 16S rDNA 유전자를 제조하고 이를 염기서열 분석을 통해 정량이 가능한 내부표준물질로 사용하여 유전자 기반 미생물 군집 분석 결과를 정량적으로 보정할 수 있다.

Description

단일 염기 다형성을 갖는 미생물 16S rDNA 유전자를 이용한 정량 분석 방법{Quantitative analytical method using bacterial 16S rDNA sequences with defined single nucleotide polymorphisms}

본 발명은 인위적으로 합성된 핵산의 활용에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대상 미생물의 유전자와 염기서열 상에서 구분이 가능하도록 특정 위치에 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 갖는 미생물의 16S rDNA 유전자를 제조하고 이를 염기서열 분석을 통해 정량이 가능한 내부표준물질(competitor or internal standard)로 사용하여 유전자 기반 미생물 군집 분석 결과를 정량적으로 보정하는 방법에 관한 것이다.

미생물 군집 분석(microbial community analysis)은 환경, 식품 및 인체에 존재하는 유해 미생물을 검출하고자 하는 용도로 널리 사용되는 기법이다. 특히 PCR을 통한 미생물 유전자의 증폭을 기반으로 하는 16S rDNA 분석 및 다중 유전자 분석(multiple locus strain typing, MLST) 방법을 미생물 군집 분석에 활용하면 고감도, 고정밀의 유전학적 분석을 통해 환경, 식품, 동물 및 인체에서 유래한 미생물의 종류, 변종 여부, 항생제 내성 등 보다 상세한 정보를 얻을 수 있다. 최근에는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)을 활용하여 다양한 환경에서 수집된 수백 종의 미지 미생물에 대해 빠르게 미생물 군집 분석을 수행할 수 있는 기술이 알려져 있다. 유전자 분석을 통한 미생물 군집 분석은 짧은 분석 시간을 통해 다양한 미생물을 동시에 검출할 수 있는 장점이 있지만 미생물 군집의 정량적 분석에는 한계를 갖고 있다. 유전자 분석 기반 미생물 군집 분석의 한계는 유전체 추출 및 증폭의 효율이 미생물마다 다를 수 있음에 주로 기인한다. 특히 미생물의 16S rDNA의 증폭을 기반으로 하는 미생물 군집 분석은 최대한 많은 종류의 미생물 유전자를 동시에 증폭하기 위해 허용적 프라이머(degenerate primer)를 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭하므로 미생물 별로 유전자 증폭의 편향성이 커질 수 있다. 상기 유전자 증폭의 편향성은 NGS를 통해 유전자의 기원을 정밀 분석했을 때 더욱 명확해진다. NGS를 통한 미생물 군집 분석의 결과에서는 PCR 증폭 과정에서 기인하는 편향성이 관찰되며, 증폭 위치, 프라이머의 염기서열 등에 영향을 받는 것으로 알려져 있다.

따라서, 유전자 기반 미생물 군집의 정량 분석 정확성 향상을 위해서는 PCR에 수반되는 유전자 증폭 편향성을 극복할 수 있는 새로운 기술의 개발이 절실하다.

상기 문제점의 해결을 위해, 본 발명에서는 증폭 대상 원본 유전자(16S rDNA)의 일부 염기서열을 인위적으로 치환한 단일 염기 다형성을 갖는 DNA를 제조하고 이를 내부표준물질(SNP 16S DNA)로 사용하여 미생물 종 별로 다른 16S rDNA 유전자 증폭의 편향성을 정량적으로 보정하고자 하였다.

본 발명은 a) 16S rDNA 유전자에 대해 단일염기다형성을 갖도록 일부 염기서열이 치환된 SNP 16S DNA를 제조하는 단계; b) 분석 대상 시료에 상기 SNP 16S DNA를 첨가하여 16S rDNA와 동시에 증폭하는 단계; c) b)단계에서 증폭된 물질의 염기분석을 통해 16S rDNA와 SNP 16S DNA를 구분하여 정량화하는 단계; d) c)단계에서 정량된 16S rDNA의 양을 SNP 16S DNA의 양으로 나누어 16S rDNA의 증폭효율을 보정하는 단계; 를 포함하는 유전자 분석 기반 미생물에서 유래한 유전체의 정량 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 SNP 16S DNA는 서로 다른 1 내지 30 종의 미생물에서 유래한 유전체 군집으로부터 제조한 것을 동시에 첨가할 수 있다.

또한 본 발명에서, 상기 a)단계의 16S rDNA 유전자는 제한되지는 않지만 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 사용할 수 있다.

본 발명에서 미생물에서 유래한 유전체를 군집으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 미생물은 제한되지는 않지만 Escherichia coli, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

인위적으로 단일염기다형성을 갖도록 제조된 SNP 16S DNA는 증폭용 프라이머가 결합하는 부위가 아닌 곳에 평균적으로 약 150 bp 마다 한 개의 단일염기다형성을 갖는다(도 1). 제조된 SNP 16S DNA는 16S rDNA와 99% 정도의 염기서열 동일성을 갖고 있으며, 특히 증폭용 프라이머가 결합하는 부위의 염기서열은 완전히 동일하기 때문에 유전자 증폭 과정에서 원본 유전자와 동일한 증폭 효율을 보인다. 상기와 같이 증폭된 16S rDNA를 염기서열 해독하여 16S rDNA와 SNP 16S DNA의 양적 비율을 계산할 수 있으며, 특정 미생물에서 증폭된 16S rDNA의 양을 SNP 16S DNA의 양으로 나누어 준 값을 적용함으로써 증폭 효율 편향성에 의한 미생물 정량의 편향성을 극복할 수 있다.

본 발명은 유전자 분석을 통해 미생물 군집을 정량적으로 분석하고자 할 때 미생물별로 다른 유전자의 증폭 효율을 보정함으로써 분석의 정확도를 높여줄 수 있다. 이를 통해 인체, 식품, 환경에 존재하는 미생물 군집에 대한 정확한 정량 정보를 제공함으로써 다양한 환경에서 미생물의 효과, 질병유발 요인 및 항생제의 효능 등을 정밀 분석할 수 있게 해 준다. 또한 병원성 미생물에 대한 효과적인 대응에 활용할 수 있으며, 미생물의 의학적, 산업적 활용성을 높이는 데에도 이용될 수 있다.

도 1은 미생물 SNP 16S DNA의 개략적인 구조와 9개의 단일 염기 다형성의 위치를 나타낸다. V1~V9 미생물 구분에 활용되는 가변부위(variable region)이다.
도 2는 SNP 16S DNA를 내부표준물질로 사용하여 16S rDNA 증폭효율을 보정하는 방법이다.
도 3은 16S rDNA를 증폭하기 위해 사용된 프라이머의 위치와 증폭 산물에 포함된 단일염기다형성의 위치를 표기한 것이다.
도 4는 SNP 16S DNA를 내부표준물질로 활용하여 각 미생물의 16S rDNA의 증폭 효율을 보정한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) SNP 16S DNA 제조

Escherichia coli, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus에 대해 SNP 16S DNA를 제조하였다. 상기 4종 미생물의 16S rDNA 염기서열을 NCBI GenBank에서 입수하여 ClustalW 기반 다중 염기서열 정렬 프로그램(http://www.genome.jp/tools/clustalw)를 이용하여 정렬하였다. 정렬된 염기서열 상에서 가변부위에 가까우면서 종간 염기서열이 좋은 위치에 9개의 단일염기다형성을 산재하여 갖도록 염기서열을 치환하였다(도 1). 4개의 미생물 별로 16S rDNA 대비 9개의 단일염기다형성을 갖는 4종의 SNP 16S DNA를 제조하여(바이오니아, 한국) 플라스미드 벡터(pGEM-B1^TM,바이오니아)에 삽입하였다. 제조한 4종의 SNP 16S DNA의 염기서열은 3730 DNA analyzer(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 확인하였다.

상기 SNP 16S DNA 서열의 길이는 E. coli (Ec_SNP) 1534 bp (서열번호 1), B. cereus (Bc_SNP) 1554 bp (서열번호 2), L. monocytogenes (Lm_SNP) 1550 bp (서열번호 3) 및 S. aureus (Sa_SNP) 1554 bp (서열번호 4)이다.

(실시예 2) SNP 16S DNA를 활용한 유전자 기반 미생물 군집 정량 분석

유전체 추출 및 정량

Escherichia coli (KCTC 2571, ATCC 8739), Bacillus cereus (KCTC 1012, ATCC 11778), Listeria monocytogenes (KCTC 3710, ATCC 19115) 및 Staphylococcus aureus (KCTC 1916, ATCC 23832)에서 GenElute^TM Bacterial Genomic DNA kit (Sigma, St. Loius, USA)를 이용하여 유전체를 추출하였다. 추출된 유전체를 초음파 파쇄기(Vibra Cell 500; Sonics, Newtown, USA)를 이용해 35%의 파워에서 500 bp~3 kb 정도의 크기를 갖도록 절편화(fragmentation)시킨 후 피코그린(Life Technologies, Carlsbad, USA)을 이용해 정량하였다. 상기 정량된 4종 미생물의 유전체 DNA는 정방향 프라이머 511F (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3', 서열번호 6), 역방향 프라이머 798R (5'-GACTACCAGGGTATCTAATCC-3', 서열번호 7)을 이용하여 정량적 PCR(qPCR; SYBR premix EX Taq^TM; Takara, Otsu, Japan).

유전체 양을 기준으로 4종 유전체를 혼합하고 각 16S rDNA가 μL 당 200,000 카피(copy)가 되도록 하였다. SNP 16S DNA에 대해서도 상기와 동일한 절차를 통해 피코그린을 통해 정량한 후, qPCR을 수행하여 개별 SNP 16S DNA의 최종 농도가 μL 당 200,000 카피(copy)가 되도록 하였다. 상기 4종 유전체 혼합물과 SNP DNA 혼합물을 1:1로 혼합하여 8종의 16S DNA가 μL 당 100,000 카피(copy)가 되도록 주형 혼합물(template mixture)을 제조하였다.

16S rDNA와 SNP 16S DNA의 증폭 효율

동일량의 16S rDNA와 SNP 16S DNA가 혼합된 주형 혼합물에 대해 16S 유전자를 증폭용 PCR 반응을 실시한 후, 차세대 염기서열 분석장치(Miseq^TM, Illumina, San Diego, USA)를 통해 분석하였다. 표준적인 증폭 반응은 qPCR을 이용하여 500 nm 프라이머, 각 100,000 카피의 16S DNA가 혼합되어 있는 주형 혼합물을 첨가한 증폭 반응 혼합물을 제조한 후 StepOne Plus^TM 장치(Life Technologies)에서 최종 부피 20 μL로 수행하였다. 온도 순환 조건은 95 ℃에서 5분간 최초 변성 후, 94 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1분간 반응하는 2단계 순환 반응을 40회 실시하였다. 최종 반응으로서 60 ℃에서 5분간 연장 반응을 하여 완료하였다.

상기 표준적인 증폭 반응 조건 외에도 증폭 반응의 저해 요소인 EDTA가 1 mM로 첨가된 조건, 증폭 반응의 촉진 요소인 DMSO가 5% 첨가된 조건, 증폭 반응의 순환 횟수를 20회로 단축시킨 조건, 각 프라이머의 염기서열에 무작위적인 염기서열 N이 두 개 존재하는 2N 조건 등에 대해서도 증폭 반응을 수행하여 16S rDNA와 SNP 16S DNA의 증폭효율을 검사하였다. 차세대 염기서열 분석장치에 의해 분석된 약 200만 개의 염기서열은 미생물 별 16S rDNA 염기서열 4종, SNP 16S DNA 염기서열 4종에 대해 염기서열 유사성을 비교하여 가장 높은 유사성을 보이는 데이터베이스 항목으로 분류를 하였다. 이 때, SNP 부위에 16S rDNA 또는 SNP 16S DNA와 다른 염기서열을 갖는 데이터는 제외하였고, 동시에 두 개 이상의 데이터베이스에 유사성을 보이는 염기서열도 제외하였다. 상기 결과를 표 1에 도시하였다.

[표 1]

* Ec_g, Ec_SNP, Bc_g, Bc_SNP, Lm_g, Lm_SNP: read count 값을 나타냄.

상기 표 1의 결과는 증폭 반응 조건에 따라 16S rDNA의 증폭 효율이 달라지고 있음을 나타낸다. 예를 들어 E. coli 16S rDNA (Ec_g)는 증폭 반응 조건에 따라 749에서 119,369 까지 염기서열 빈도가 달라지는데 이는 약 150 배에 이르는 증폭률이다. 그러나, SNP 16S DNA (Ec_SNP)에서도 유사한 증폭률이 유지되고 있기 때문에 Ec_g/Ec_SNP의 값은 증폭 조건에 무관하게 약 2.5를 유지하고 있음을 확인하였다.

증폭 효율이 보정된 각 미생물의 16S rDNA 염기서열 빈도에 근거하여 주형 혼합물에 존재하는 각 미생물의 유전체의 양을 정량분석한 결과를 도 4에 도시하였다. 증폭 보정 후 각 미생물 유전체의 혼합 비율이 25%에 가까운 값으로 산출된다. 특히 20 사이클(cycle) 조건이나 EDTA가 첨가된 비우호적 조건에서도 SNP 16S DNA에 의한 보정이 잘 작동함을 확인하였다.

상기의 실시예로부터 미생물 각각의 SNP 16S DNA가 다양한 유전자 증폭 조건에서 16S rDNA와 동일한 증폭 효율을 갖는다는 사실을 확인하였고, 증폭 효율이 보정된 미생물 군집 정량 분석 결과는 그 정확도가 매우 높다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

<110> Korea Research Institute of Standards and Science <120> Quantitative analytical method using bacterial 16S rDNA sequences with defined single nucleotide polymorphisms <130> P13101351404 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1534 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60 ggtaacagaa agcagcttgc tgctttgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg 120 gaaactgcct gatggagggg gatatctact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg 180 caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag 240 ctagcaggtg gggtaacggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac 300 cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360 tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt 420 gtacagtact ttcagcgggg aggaagggag taaagttaat acctttgctc attgacgtta 480 cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa 540 gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga 600 aatccccggg 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DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 3 ttaaagagag tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag 60 tcgaacgaac ggaggaagag cttgctcttc caaagttagt ggcggacggg tgagtaacac 120 gtgggcaacc tgcctgtaag ttggggatat ctccgggaaa ccggggctaa taccgaatga 180 taaagtttgg cgcatgccac gcttttgaaa gatggtttcg gctatcgctt acagatgggc 240 ccgcggtgca ttagctagct ggtagggtaa tggcctacca aggcaacgat gcatagccga 300 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 360 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgtatgaag 420 aaggttttcg gatcgtacag tactgttgtt agagaagaac aaggataaga gtaactgctt 480 gtcccttgac ggtatctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtcttt 600 taagtctgat gtgaaagccc ccggcttaac cggggagggt cattggaaac tggaagactg 660 gagtgcagaa gaggagagtg gaataccacg tgtagcggtg aaatgcgtag atatgtggag 720 gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg 780 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 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<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 798R reverse primer <400> 7 gactaccagg gtatctaatc c 21

Claims (6)

1. a) 16S rDNA 유전자에 대해 단일염기다형성을 갖도록 일부 염기서열이 치환된 SNP 16S DNA를 제조하는 단계;
   b) 분석 대상 시료에 상기 SNP 16S DNA를 첨가하여 16S rDNA와 동시에 증폭하는 단계;
   c) b)단계에서 증폭된 물질의 염기분석을 통해 16S rDNA와 SNP 16S DNA를 구분하여 정량화하는 단계;
   d) c)단계에서 정량된 16S rDNA의 양을 SNP 16S DNA의 양으로 나누어 16S rDNA의 증폭효율을 보정하는 단계;
   를 포함하는 유전자 분석 기반 미생물에서 유래한 유전체의 정량 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 SNP 16S DNA는 서로 다른 1 내지 30 종의 군집으로부터 제조한 것을 동시에 첨가하는 유전자 분석 기반 미생물에서 유래한 유전체의 정량 방법.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 a)단계의 16S rDNA 유전자는 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA인 유전자 분석 기반 미생물에서 유래한 유전체의 정량 방법.
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