JP2006508694A - 病原性生物の多重分析検出 - Google Patents
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Abstract
(iib)上記の病原体の群の全てのメンバーから上記の予め選択された核酸配列の領域を共に特異的に検出することができる少なくとも2、3または複数のハイブリダイゼーション試薬を使用する検出工程であって、予め選択された温度で前記の各ハイブリダイゼーション試薬のハイブリダイゼーションをモニタリングする工程であって、上記ハイブリダイゼーションが、試料中に存在する前記病原体の少なくとも属の指標である工程、およびハイブリダイゼーションの温度依存をモニタリングする工程であって、上記温度依存が、前記病原体の少なくとも種の指標である工程を含む工程、ならびに、(iii)上記増幅及び検出反応が上記の病原体の予め選択された群の特異的なメンバーの存在の指標であるかどうかを決定する工程を含む、方法に関する。
Description
病原性細菌による感染は、特に、敗血症を引き起こすものとなると、主に病院の集中治療室(ICU)で起こり、深刻である。患者が感染している細菌はほとんどの場合において不明であり、症状からは決定することができない。各々の細菌に、特異的な抗生物質の投与を用いた異なった治療が必要である。現在、日常的に行われる診断において、病原性細菌、特に、グラム陽性細菌は、存在する場合、血液または他の体液の試料を、細菌を培養することに供する工程を含む方法を使用して、検出されている。この培養物は、約3日の間、細菌の増殖に好ましい条件で維持される。この間に、細菌の数、したがってそれらの核酸が増大する。その後、培養培地が溶解に供される。溶解混合物は、二次的な生化学的分析または免疫学的分析のための試料として使用される。病原性細菌による試料の何らかの感染についての明確な結果に達するまでには、この方法全体に少なくともおよそ4日を要する。病原性細菌による感染は、感染者にとっては非常に深刻な問題である。感染の第1日目のうちに、治療、好ましくは、特定の感染細菌に特に作用する適切な抗生物質の投与による治療が開始されなければならない。そうでなければ、感染者は感染によりあまりに大きな影響を受けすぎて、感染についての明確な結果に達する前に死亡してしまう場合がある。一方で、全身性の事象を妨げるための数種の広範な抗生物質の同時の投与は、患者が衰弱してしまわないように避けなければならない。したがって、該方法は、日常的に行われるICUでの診断として満足できるものではない。
二本鎖の増幅産物の量は、通常、分析される試料中にもともと存在している核酸の量より多いので、適切な波長で励起させると、二本鎖DNAに結合している場合にのみ増強された蛍光を示す、二本鎖DNAに特異的な色素を使用することができる。かかる方法は、欧州特許第0512334号に記載されている。好ましくは、PCR反応の効率には影響を与えない、たとえば、SYBR(登録商標)Green Iのような色素だけが使用される。
一本鎖のハイブリダイゼーションプローブは2つの成分で標識される。第1の成分、いわゆる蛍光剤が適切な波長の光で励起させられると、吸収されたエネルギーが、蛍光共鳴エネルギー転移の原理にしたがって第2の成分、いわゆる消光剤に転移させられる。PCR反応のアニーリング工程の間に、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、ポリメラーゼ、たとえば、Taqポリメラーゼの5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性によって、伸長期の間に分解される。結果として、励起させられた蛍光成分と消光剤は互いに空間的に離され、これにより第1の成分の蛍光放射を測定することができる(欧州特許第0543942号および米国特許第5,210,015号)。
これらのハイブリダイゼーションプローブもまた、第1の成分と消光剤とで標識され、好ましくは、標識は、少なくとも部分的に自己相補的であるプローブの異なる末端に配置される。プローブの二次構造の結果として、両方の成分は溶液中で空間的に接近している。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両方の成分は互いに離れ、その結果、適切な波長の光で励起させた後、第1の成分の蛍光放射を測定することができる(米国特許第5,118,801号)。
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)ハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、全ての種の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である(Matthews,J.A.およびKricka,L.J.,Anal Biochem 169(1988)1-25)。これは、同時に使用され、(増幅された)標的核酸の同じ鎖の隣接する部位に相補的である2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。両方のプローブが別々の蛍光成分で標識される。適切な波長の光で励起させると、第1の成分は吸収したエネルギーを、蛍光共鳴エネルギー転移の原理にしたがって第2の成分へと転移させ、その結果、第2の成分の蛍光放射が、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の隣接している位置に結合している場合にのみ測定され得る。
上記で開示された課題は、本出願に開示され、請求される方法および化合物によって解決される。
a)少なくとも部分的に精製された核酸を含む臨床試料を単離する工程、
b)上記臨床検体の少なくとも第1アリコートを、1つの反応容器内で以下の工程を含む少なくとも1回の増幅および検出反応に供する工程:
ba)前記の病原体の予め決定された群のいくつかまたは全てのメンバーから予め選択された核酸配列の領域を増幅することができる少なくとも第1のセットの増幅プライマーを使用する増幅工程、
bb)上記の病原体の群の全てのメンバーから上記の予め選択された核酸配列の領域を共に特異的に検出することができる少なくとも2、3または複数のハイブリダイゼーション試薬を使用する検出工程であって、
bba)予め選択された温度で前記の各ハイブリダイゼーション試薬のハイブリダイゼーションをモニタリングする工程であって、上記ハイブリダイゼーションが、試料中に存在する前記病原体の少なくとも属の指標である工程、および
bbb)ハイブリダイゼーションの温度依存をモニタリングする工程であって、上記温度依存が、前記病原体の少なくとも種の指標である工程
を含む工程、
を含む、方法に関する。
本発明は、病原性生物の感染の診断に特に適切な方法および化合物を提供する。これに関して、患者が感染を有していると疑われる場合には、本発明は、上記病原性生物の種を決定するための手段を提供する。さらに、本発明による新規の方法は、特に、LightCycler(登録商標)システムのようなリアルタイムPCR技術と組み合わせられた場合に、敗血症を引き起こす感染性因子の迅速な診断を可能にする。このような迅速な診断は多くの臨床環境において極めて重要である。
a)少なくとも部分的に精製された核酸を含む臨床試料を単離する工程、
b)上記臨床検体の少なくとも第1アリコートを、1つの反応容器内で以下の工程を含む少なくとも1回の増幅および検出反応に供する工程:
ba)前記の病原体の予め決定された群のいくつかまたは全てのメンバーから予め選択された核酸配列の領域を増幅することができる少なくとも第1のセットの増幅プライマーを使用する増幅工程、
bb)上記の病原体の群の全てのメンバーから上記の予め選択された核酸配列の領域を共に特異的に検出することができる少なくとも2、3または複数のハイブリダイゼーション試薬を使用する検出工程であって、
bba)予め選択された温度で前記の各ハイブリダイゼーション試薬のハイブリダイゼーションをモニタリングする工程であって、上記ハイブリダイゼーションが、試料中に存在する前記病原体の少なくとも属の指標である工程、および
bbb)ハイブリダイゼーションの温度依存をモニタリングする工程であって、上記温度依存が、前記病原体の少なくとも種の指標である工程
を含む工程、
を含む、方法に関する。
−該少なくとも第一のセットの増幅プライマーが、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原体のいくつかまたは全てのメンバーから増幅し得、かつ
−該少なくとも2つ、3つまたは多数のハイブリダイゼーション試薬がともに、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原体の全てのメンバーから特異的に検出し得、ここで
−予め選択された温度での該ハイブリダイゼーション試薬のそれぞれのハイブリダイゼーションが、試料中に存在する病原体の、少なくとも属の指標となり、かつ
−温度依存が、該病原体の、少なくとも種の指標となる
ことを特徴とする組成物にも関する。
−ポリメラーゼ連鎖反応に適用できる緩衝液、
−デオキシヌクレオシド三リン酸
−鋳型依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは温度安定性、
から選択される化合物および試薬の1つもしくは数個、または好ましくは全てを含み得る。
−該少なくとも第一のセットの増幅プライマーが、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原体のいくつかまたは全てのメンバーから増幅し得、かつ
−該少なくとも2つ、3つまたは多数のハイブリダイゼーション試薬がともに、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原体の全てのメンバーから特異的に検出し得、ここで
−予め選択された温度での該ハイブリダイゼーション試薬のそれぞれのハイブリダイゼーションが試料中に存在する病原体の、少なくとも属の指標となり、かつ
−該ハイブリダイゼーションの温度依存が、該病原体の、少なくとも種の指標となる
ことを特徴とするキットに関する。
−ポリメラーゼ連鎖反応に適用できる緩衝液
−デオキシヌクレオシド三リン酸
−鋳型依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは温度安定性
から選択される他の1つまたは数種の化合物および試薬を、それぞれ別々に、または組み合わせて含めてもよい。かかるキットは、例えば臨床標本由来であり得、本発明の方法のいずれかに供され得る、少なくとも部分的に精製された核酸をさらに含み得る。かかるキット(hit)はまた、任意の標的核酸の検出に用いられるのと同じプライマーおよびプローブを用いて増幅および検出され得る内部対照DNAも含み得る。
−該セットの増幅プライマーのそれぞれは、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原体のいくつかまたは全てのメンバーから増幅し得、かつ
−少なくとも2つ、3つまたは多数のハイブリダイゼーション試薬の該セットのそれぞれがともに、予め選択された核酸配列領域を、予め決められた群の病原菌の全てのメンバーから特異的に検出し得、ここで
−予め選択された温度での該ハイブリダイゼーション試薬のそれぞれのハイブリダイゼーションが、試料中に存在する病原体の、少なくとも属の指標となり、かつ
−該ハイブリダイゼーションの温度依存が、該病原体の、少なくとも種の指標となる
ことを特徴とする。
18s rRNA遺伝子と23sRNA遺伝子との間にITS-1領域を含む、糞便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・ヘシュウム(Enterococcus faecium)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)または緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来の103、102および10コピーのプラスミドDNAを2連で、5μgヒトゲノムDNAバックグラウンドありまたはなしのいずれかで部分的に分析した。内部対照プラスミドを、完全なマスターミックス(上を参照)に加えた。
LightCyclerTM機器(Roche Diagnostics GmbH, Germany)を用いた。市販品として入手可能な機器は、ローターが100μlキャピラリーを保持するのに適合するよう改変された。前記の機器の蛍光計は、3フォトハイブリッド(photohybrid)の代わりに4フォトハイブリッドから成り、蛍光発光が、610 nm、640 nm、670 nm、および705 nmで検出され得るように改変された。
本明細書中に示される全てのオリゴヌクレオチドは化学合成によって調製した。標識を攻撃するための試薬は、Roche Diagnostics GmbH (LightCycler Red 640 NHS Ester カタログ番号2015161; LightCycler Red 705 Phosphoramidite カタログ番号2157594; LightCycler Fluorescein (以下「F」と省略) CPG カタログ番号3113906)から購入することができる。それらの試薬の使用はBiochemica No.1 (2001), p.8-13に記載される。Cy5-NHSエステルは、要求に応じてAmershamから入手され得る。LC-Red 610-NHSエステルは610 nmで最大発光を有し、米国特許第5,750,409号に開示されるように、蛍光色素を用いた標準的なプロトコールに従って合成された。
以下のサーモサイクルおよび融解温度プロフィールを用いてLightCyclerの実施を行った:
結果を次の表にまとめる。表におけるCp値(サイクル数)は、二次導関数モードを用いて表し、陽性増幅標識が検出できた。
Bernard,P.S.ら、Anal.Biochem.255(1998)101-107
EP 0 070 687
EP 0 131 052
EP 0 201 184
EP 0 452 596
EP 0 497 784
EP 0 512 334
EP 0 543 942
Espy,M.J.ら、J.Clin.Microbiol.38(2000)795-799
Klausegger,A.ら、J.Clin.Microbiol.37(1999)464-466
Matthews,J.A.およびKricka,L.J. Anal.Biochem.169(1988)1-25
US 5,118,801
US 5,210,015
WO 01/48237
WO 01/94634
WO 02/14555
WO 97/07238
WO 97/46707
WO 97/46712
WO 97/46714
Woo,T.H.ら、J.Microbiol.Methods 35(1999)23-30
Claims (9)
- 病原体の予め決定された群からの病原性生物の同定のための方法であって、
a)臨床試料由来の核酸を少なくとも部分的に精製する工程、
b)ba)前記病原体の予め決定された群のいくつかまたは全てのメンバーから予め選択された核酸配列領域を増幅することができる増幅プライマーの少なくとも第1セットを用いた増幅工程、
bb)以下の工程を含む、少なくとも2、3または複数のハイブリダイゼーション試薬を用いた検出工程、ここで、前記試薬は共に前記病原体の群の全メンバーから予め選択された核酸配列領域を特異的に検出することができる、
bba)予め選択された温度で前記ハイブリダイゼーション試薬の各々のハイブリダイゼーションをモニターする工程、ここで、前記ハイブリダイゼーションは、試料中に存在する前記病原体の少なくとも属の指標である、
bbb)ハイブリダイゼーションの温度依存をモニターし、ここで、前記温度依存は、前記病原体の少なくとも種の指標である、前記の増幅及び検出反応が前記の病原体の予め選択された群の特異的なメンバーの存在の指標であるかどうかを決定する工程、
を含む、前記臨床検体の少なくとも第1アリコートを1つの反応容器内において、少なくとも1つの増幅および検出反応に供する工程
を含む、方法。 - 第1、および第2アリコートの各々が、2つの異なる反応容器内において互いに独立して増幅及び検出反応に供される、請求項1記載の方法。
- 第1、第2および第3アリコートの各々が、2つの異なる反応容器内において互いに独立して増幅及び検出反応に供される、請求項2記載の方法。
- さらなるハイブリダイゼーション試薬が、内部対照の検出のために使用される請求項1〜3記載の方法。
- 1つの増幅及び検出反応において、グラム陽性病原性生物が独占的に同定され、別の増幅及び検出反応において、グラム陰性病原性生物が独占的に同定される、請求項2記載の方法。
- 第3の増幅及び検出反応において、真菌性病原体が独占的に同定される、請求項3及び5記載の方法。
- 各増幅工程が同じサーモサイクルプロフィールを用いて行われる、請求項2〜6記載の方法。
- 少なくとも増幅プライマーの第1セット及び少なくとも2、3又は複数のハイブリダイゼーション試薬を含み、
−前記の少なくとも増幅プライマーの第1セットが、病原体の予め決定された群のいくつか又は全メンバーから予め選択された核酸配列領域を増幅することができ、
−前記の少なくとも2、3又は複数のハイブリダイゼーション試薬が共に、病原体の予め決定された群の全メンバーから予め選択された核酸配列領域を特異的に検出することができ、ここで、
−予め選択された温度における前記のハイブリダイゼーション試薬の各々のハイブリダイゼーションが、試料中に存在する病原体の少なくとも属の指標であり、
−前記ハイブリダイゼーションの温度依存が、前記病原体の少なくとも種の指標である
ことに特徴付けられる組成物。 - 少なくとも増幅プライマーの第1セット及び少なくとも2、3又は複数のハイブリダイゼーション試薬を含み、
−前記の少なくとも増幅プライマーの第1セットが、病原体の予め決定された群のいくつか又は全メンバーから予め選択された核酸配列領域を増幅することができ、
−前記の少なくとも2、3又は複数のハイブリダイゼーション試薬が共に、病原体の予め決定された群の全メンバーから予め選択された核酸配列領域を特異的に検出することができ、ここで、
−予め選択された温度における前記のハイブリダイゼーション試薬の各々のハイブリダイゼーションが、試料中に存在する病原体の少なくとも属の指標であり、
−前記ハイブリダイゼーションの温度依存が、前記病原体の少なくとも種の指標である
ことに特徴付けられるキット。
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