JP6659533B2 - 生物学的試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出 - Google Patents
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Description
(a)生物学的試料を、
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecA核酸が存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecC核酸が存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対
と接触させて、
反応-試料混合物(reaction-sample mixture)を得るステップであって、各プライマー対の少なくとも一つのプライマーにフルオロフォア標識が付随しているステップ、
(b)生物学的試料中に存在する標的核酸のそれぞれが増幅されて蛍光シグナルを生ずるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件に、反応-試料混合物を供するステップ、
(c)各フルオロフォアによって生じた蛍光シグナルの量を測定するステップ、及び
(d)標的核酸の閾値サイクル数(cycle threshold)を比較することによってMRSAの有無を決定するステップであって、それによって
(i)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ
(1)黄色ブドウ球菌特異的核酸からの閾値サイクル数(Ct)引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt≦1.9、又は
(2)黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt>1.9、且つmecA及び/又はmecC核酸からのCt足す1.9<黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt
である場合、MRSAが生物学的試料中に存在すると決定される、
(ii)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt<1.9、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt足す1.9<mecA及び/又はmecC核酸からのCtである場合、黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性遺伝子が生物学的試料中に存在すると決定される、又は
(iii)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的標的核酸に関して検出されるが、蛍光シグナルがmecA及び/又はmecCに関して検出されない場合、生物学的試料中に黄色ブドウ球菌が存在すると決定され、MRSAが存在しないと決定されるステップ
を含む。
MRSAが開示された方法を使用して検出且つ定量化され得る生物学的試料は、無菌及び/又は非無菌部位由来である。試料が得られ得る無菌部位は、全血、血漿、無細胞血漿、尿、脳脊髄液、滑液、胸水、心膜液、眼内液、組織生検又は気管内吸引液などの体液である。本明細書で使用する、「無細胞血漿」は、体積で1%未満の細胞を含有する血漿を示す。試料が採取され得る非無菌部位は、例えば、痰、便、例えば、皮膚、鼠径、鼻及び/又は咽頭からのスワブである。好ましくは、非無菌部位からの試料、より好ましくは創傷及び/又は鼻スワブが本発明において使用される。MRSA検出のための試料は、コロニーを形成するために適切な培地上で増殖された単離された細菌の培養物も含んでもよい。試料は、細菌単離体も含んでもよい。
反応-試料混合物は、生物学的試料中に存在する標的核酸のそれぞれが増幅され、増幅された産物が検出され測定されるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件に供される。一部の実施形態では、生物学的試料は、別個の、フロントエンド標本調製を有さない直接増幅ディスク中に直接充填され、同じディスク中での標的分析物のRT-PCR検出及び識別が続く。好ましくは、増幅は、Direct Amplification Disc(Focus Diagnostics, Inc.製の8ウェルディスク)において行われる。一部の実施形態では、リアルタイムPCR増幅は、直接増幅ディスク中でSIMPLEXA Directアッセイを使用して行われ、検出は、3M(St. Paul、MN、USA)によって販売されている3M(商標)Integrated Cyclerなどの統合サーマルサイクラーを使用して行われる。3M(商標)Integrated Cyclerは、Direct Amplification Discを受け入れ可能であり、ディスク当たり複数のアッセイを行う能力がある。この装置では、毎秒5℃超での加熱、及び毎秒4℃超での冷却が可能である。サイクリングパラメーターは、伸長される増幅産物の長さに依存して変更し得る。
本発明に従って、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、mecA遺伝子、及びmecC遺伝子の全体又は一部に加えて、黄色ブドウ球菌に特異的なマーカー遺伝子の全体又は一部などの標的核酸を増幅及び検出するために、本明細書で記載された方法において使用される。一実施形態では、この方法は、spa、mecA及びmecC、例えばこれらの遺伝子のいずれか又は全ての断片に対し特異的なプライマー対を用いることを含む。
黄色ブドウ球菌spaプライマー1:5'd CTTGATAAAAAGCATTTTGTTGAGCTTCA 3'(配列番号1)
黄色ブドウ球菌spaプライマー2:5'TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3'(配列番号3)
黄色ブドウ球菌spa標識プライマー-プローブ:5'd BHQ-1-agcggtGCAGCAGGTGTTA CGCCACCgc-T(配列番号2)(FAM)-スペーサー18-TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3'(配列番号3)
mecAhプライマー1:5'd TCACCGATTCCCAAATCTTGC 3'(配列番号4)
mecAhプライマー2:5'AAGCAAGCAATAGAATCATCAGACA 3'(配列番号6)
mecAh標識プライマー-プローブ:5'd CFR610-acgtgCCTAATGCTAATGCAATGCG GGCAcgt(配列番号5)-BHQ-2-スペーサー18-AAGCAAGCAATAGAA TCATCAGACA 3'(配列番号6)
を含む。
mecAプライマー1:5'd TCTTCACCAACACCTAGTTTTTTCA 3'(配列番号7)
mecAプライマー2:5'GGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGA 3'(配列番号9)
mecA標識プライマー-プローブ:5'd CFR610acgcggcCTTACTGCCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCgccgcgt(配列番号8)-BHQ-2-スペーサー18 GGTAATATCGACTTAAAACAAGCA ATAGA 3'(配列番号9)
を含む。
試料-反応混合物をリアルタイムPCRに供し、増幅された遺伝子に付随している蛍光シグナルを検出及び測定したら、本発明の方法は、増幅された標的核酸配列からの閾値サイクル数(Ct)をマッチングすることにより最終結果を与えるMRSAアルゴリズムを使用することによってMRSAの有無を決定することをもたらす。好ましくは、mecA及びmecC標的核酸がCFR610などの可視スペクトルの赤色領域において蛍光を発するキサンテン色素で標識されたプライマー-プローブを使用して増幅され、spa標的核酸配列がFAMなどのフルオレセインアミダイトフルオロフォアで標識されているプライマー-プローブを使用して増幅される。したがって、mecA及び/又はmecCのシグナル(以下で「mecA_C(CFR610チャネル)のCt」と称される)は、キサンテン色素からであり、spaのシグナル(以下で「SA(FAMチャネル)のCt」と称される)は、フルオレセインアミダイトフルオロフォアからである。
(1)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的遺伝子(FAMシグナル)並びにmecA及び/又はmecC遺伝子(CFR610シグナル)の両方に関して検出される場合、且つ
(a)SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt≦1.9(すなわち、黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列(例えば、spa)からの閾値サイクル数引くmecA及び/又はmecC標的核酸配列からの閾値サイクル数≦1.9)の場合、又は
(b)SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt>1.9、且つmecA_C(CFR610チャネル)のCt+1.9<SA(FAMチャネル)のCt(すなわち、黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列(例えば、spa)からの閾値サイクル数引くmecA及び/又はmecC標的核酸配列からの閾値サイクル数>1.9且つmecA及び/又はmecC標的核酸配列からの閾値サイクル数足す1.9<黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列からの閾値サイクル数)の場合、
MRSAが前記生物学的試料中に存在すると決定され、
(2)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列(FAMシグナル)並びにmecA及び/又はmecC標的核酸配列(CFR610シグナル)の両方に関して検出される場合、且つ
SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt<1.9、且つSA(FAMチャネル)のCt+1.9<mecA_C(CFR610チャネル)のCt(すなわち、黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列からの閾値サイクル数引くmecA及び/又はmecC標的核酸配列からの閾値サイクル数<1.9、且つ黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列からの閾値サイクル数足す1.9<mecA及び/又はmecC標的核酸配列からの閾値サイクル数)の場合、
黄色ブドウ球菌及び少なくとも1つのメチシリン耐性遺伝子が試料中に存在すると決定される。
そのような場合では、黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性遺伝子は、試料中に存在するが、そのメチシリン耐性遺伝子は、同じ試料中の黄色ブドウ球菌又はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来であり得る。
(3)黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列の検出可能なシグナル(FAM)を有するが、mecA及び/又はmecCについては検出可能なCFR610シグナルを有さない試料は、黄色ブドウ球菌を含有するがMRSAを含有しないと解釈される。
(4)黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列のシグナル(FAMシグナル)は検出されず、mecA又はmecC(CFR610)のシグナルも検出されない場合、試料は、黄色ブドウ球菌及びMRSA陰性であると解釈される。
生物学的試料中のMRSAの有無を決定するための本明細書に記載の増幅を行うためのプライマー又はプライマー-プローブであってもよいオリゴヌクレオチドを含むキットも本発明によって提供される。本発明のキットは、増幅された核酸を検出するためのプローブとして使用されてもよいオリゴヌクレオチド、及び/又は非標的核酸を消化して、オリゴヌクレオチドプライマーによる標的核酸の検出を増加させるための1つ以上の制限酵素をさらに含んでもよい。
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的マーカー遺伝子のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecA遺伝子のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecC遺伝子のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対
を含む。
鼻スワブ試料を、個体から、適切な回収デバイスにとる。50μlの未処理の鼻スワブ試料を、別個のフロントエンド標本調製ステップなしにSIMPLEXA Direct Amplification Disc(Focus Diagnostics, Inc.、Cypress、CA、USA)のウェッジ1の試料ウェル中に直接充填する。50μlの増幅マスターミックスを、ディスクのウェッジ1の反応ウェル中にピペットで移す。この増幅マスターミックスは、PCR緩衝液、DNAポリメラーゼ、dNTP、塩化マグネシウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、配列番号1、2、4、5、7及び8からなるプライマー及び内部対照DNA断片及び対照断片に特異的なプライマー対を含有する。配列番号2、5及び8からなるプライマーは、SCORPIONプライマー-プローブであり、FAM(配列番号2)又はCFR610(配列番号6及び8)で標識されている。
1)SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt≦1.9、又は
2)SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt>1.9且つmecA_C(CFR610チャネル)のCt+1.9<SA(FAMチャネル)のCt
の場合、FAM及びCFR610チャネルにおけるシグナルを有する試料をMRSAと解釈し、
1)SA(FAMチャネル)のCt−mecA_C(CFR610チャネル)のCt<1.9且つSA(FAMチャネル)のCt+1.9<mecA_C(CFR610チャネル)のCt
の場合、FAM及びCFR610チャネルにおけるシグナルを有する試料をSA、メチシリン耐性と解釈する。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.生物学的試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の有無を決定するための方法であって、
(a)生物学的試料を、
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecA核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecC核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対
と接触させて、反応-試料混合物を得るステップであって、各プライマー対の少なくとも一つのプライマーにフルオロフォア標識が付随しているステップ、
(b)生物学的試料中に存在する標的核酸のそれぞれが増幅されて蛍光シグナルを生ずるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件に、反応-試料混合物を供するステップ、
(c)各フルオロフォアによって生じた蛍光シグナルの量を測定するステップ、及び
(d)標的マーカー核酸からの蛍光の量を比較することによってMRSAの有無を決定するステップであって、それによって
(i)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ
(1)黄色ブドウ球菌特異的核酸からの閾値サイクル数(Ct)引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt≦1.9、又は
(2)黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt>1.9、且つmecA及び/又はmecC核酸からのCt足す1.9<黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt
である場合、MRSAが生物学的試料中に存在すると決定され;
(ii)Ctが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt<1.9、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt足す1.9<mecA及び/又はmecC核酸からのCtである場合、黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性遺伝子が生物学的試料中に存在すると決定され;又は
(iii)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列に関して検出されるが、蛍光シグナルがmecA及び/又はmecCに関して検出されない場合、生物学的試料中に黄色ブドウ球菌が存在すると決定され、MRSAが存在しないと決定されるステップ
を含む、方法。
2.各プライマー対の一つのプライマーがプライマーの5'末端にプローブ配列エレメントを含むプライマー-プローブであり、該プローブ配列エレメントがフルオロフォア及びクエンチャーをさらに含み、且つmecAプライマーのフルオロフォア及びmecCプライマーのフルオロフォアが同一である、上記1に記載の方法。
3.全てのプライマー対が、生物学的試料と接触させる前に、DNAポリメラーゼ、dNTP及びPCR緩衝液をさらに含む増幅マスターミックスに一緒に含まれている、上記1に記載の方法。
4.ステップ(a)が、生物学的試料を、対照標的核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第4のプライマー対と接触させるステップをさらに含む、上記1に記載の方法。
5.黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spa、agr、sspプロテアーゼ、sir、sodM、cap、coa、アルファ溶血素、ガンマ溶血素、femA、Tuf、ソーターゼ(sortase)、フィブリノゲン結合タンパク質、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NADシンセターゼ、sar、sbi、rpoB、ジャイレースA、及びorfXからなる群から選択される遺伝子配列の全て又は一部を含む、上記2に記載の方法。
6.黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spaである上記5に記載の方法。
7.第1のプライマー対が、配列番号1を含む第1のプライマー及び配列番号2からなる第2のプライマーからなる、上記6に記載の方法。
8.第2のプライマー対が、配列番号4を含む第1のプライマー及び配列番号6を含む第2のプライマーからなる、上記7に記載の方法。
9.第3のプライマー対が、配列番号7を含む第1のプライマー及び配列番号9を含む第2のプライマーからなる、上記8に記載の方法。
10.spaプライマー-プローブが、フルオレセインアミダイトフルオロフォアを含み、mecA及びmecC遺伝子プライマー-プローブが、可視スペクトルの赤色領域において蛍光を発するキサンテン色素を含む、上記6に記載の方法。
11.生物学的試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の有無を決定するためのキットであって、
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecA核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecC核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対を含み、
各プライマー対の一つのプライマーがプライマーの5'末端にプローブ配列エレメントを含むプライマー-プローブであり、該プローブ配列エレメントがフルオロフォア及びクエンチャーをさらに含み、mecAプライマーのフルオロフォア及びmecCプライマーのフルオロフォアが同一である、キット。
12.対照遺伝子配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマー対をさらに含む、上記11に記載のキット。
13.プライマー対が、DNAポリメラーゼ、dNTP及びPCR緩衝液をさらに含む増幅マスターミックス中に一緒に存在する、上記12に記載のキット。
14.黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spa、agr、sspプロテアーゼ、sir、sodM、cap、coa、アルファ溶血素、ガンマ溶血素、femA、Tuf、ソーターゼ(sortase)、フィブリノゲン結合タンパク質、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NADシンセターゼ、sar、sbi、rpoB、ジャイレースA、及びorfXからなる群から選択される、上記11に記載のキット。
15.黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spaである上記14に記載のキット。
16.第1のプライマー対が、配列番号1を含む第1のプライマー及び配列番号2を含む第2のプライマーからなる、上記15に記載のキット。
17.第2のプライマー対が、配列番号4を含む第1のプライマー及び配列番号6を含む第2のプライマーからなる、上記16に記載のキット。
18.第3のプライマー対が、配列番号7を含む第1のプライマー及び配列番号9を含む第2のプライマーからなる、上記17に記載のキット。
19.spaプライマー-プローブが、フルオレセインアミダイトフルオロフォアを含み、mecA及びmecC遺伝子プライマー-プローブが、可視スペクトルの赤色領域において蛍光を発するキサンテン色素を含む、上記18に記載のキット。
20.印刷された説明書又は電子説明書をさらに含む、上記11に記載のキット。
Claims (21)
- 生物学的試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の有無を決定するための方法であって、
(a)生物学的試料を、
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecC核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecA核酸のセグメントが存在する場合、それにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対
と接触させて、反応-試料混合物を得るステップであって、各プライマー対の少なくとも一つのプライマーにフルオロフォア標識が付随しているステップ、
(b)生物学的試料中に存在する標的核酸のそれぞれが増幅されて蛍光シグナルを生ずるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件に、反応-試料混合物を供するステップ、
(c)各フルオロフォアによって生じた蛍光シグナルの量を測定するステップ、及び
(d)標的マーカー核酸からの蛍光の量を比較することによってMRSAの有無を決定するステップであって、それによって
(i)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ
(1)黄色ブドウ球菌特異的核酸からの閾値サイクル数(Ct)引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt≦1.9、又は
(2)黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt>1.9、且つmecA及び/又はmecC核酸からのCt足す1.9<黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt
である場合、MRSAが生物学的試料中に存在すると決定され;
(ii)Ctが黄色ブドウ球菌特異的核酸並びにmecA及び/又はmecC核酸の両方に関して検出され、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt引くmecA及び/又はmecC核酸からのCt<1.9、且つ黄色ブドウ球菌特異的核酸からのCt足す1.9<mecA及び/又はmecC核酸からのCtである場合、黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性遺伝子が生物学的試料中に存在すると決定され;及び
(iii)蛍光シグナルが黄色ブドウ球菌特異的標的核酸配列に関して検出されるが、蛍光シグナルがmecA及び/又はmecCに関して検出されない場合、生物学的試料中に黄色ブドウ球菌が存在すると決定され、MRSAが存在しないと決定されるステップ
を含む、方法。 - 各プライマー対の一つのプライマーがプライマーの5'末端にプローブ配列エレメントを含むプライマー-プローブであり、該プローブ配列エレメントがフルオロフォア及びクエンチャーをさらに含み、且つmecAプライマーのフルオロフォア及びmecCプライマーのフルオロフォアが同一である、請求項1に記載の方法。
- 全てのプライマー対が、生物学的試料と接触させる前に、DNAポリメラーゼ、dNTP及びPCR緩衝液をさらに含む増幅マスターミックスに一緒に含まれている、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)が、生物学的試料を、対照標的核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第4のプライマー対と接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spa、agr、sspプロテアーゼ、sir、sodM、cap、coa、アルファ溶血素、ガンマ溶血素、femA、Tuf、ソーターゼ(sortase)、フィブリノゲン結合タンパク質、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NADシンセターゼ、sar、sbi、rpoB、ジャイレースA、及びorfXからなる群から選択される遺伝子配列の全て又は一部を含む、請求項2に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spaである請求項5に記載の方法。
- 第1のプライマー対が、配列番号1を含む第1のプライマー及び配列番号3を含む第2のプライマーからなる、請求項6に記載の方法。
- 第2のプライマー対が、配列番号4を含む第1のプライマー及び配列番号6を含む第2のプライマーからなる、請求項7に記載の方法。
- 第3のプライマー対が、配列番号7を含む第1のプライマー及び配列番号9を含む第2のプライマーからなる、請求項8に記載の方法。
- spaプライマー-プローブが、フルオレセインアミダイトフルオロフォアを含み、mecA及びmecCプライマー-プローブが、可視スペクトルの赤色領域において蛍光を発するキサンテン色素を含む、請求項6に記載の方法。
- 生物学的試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の有無を決定するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットであって、
(i)黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第1のプライマー対、
(ii)標的mecC核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第2のプライマー対、及び
(iii)標的mecA核酸のセグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする第3のプライマー対を含み、
各プライマー対の一つのプライマーがプライマーの5'末端にプローブ配列エレメントを含むプライマー-プローブであり、該プローブ配列エレメントがフルオロフォア及びクエンチャーをさらに含み、mecAプライマーのフルオロフォア及びmecCプライマーのフルオロフォアが同一であり、第1のプライマー対が、配列番号1を含む第1のプライマー及び配列番号3を含む第2のプライマーからなり、第2のプライマー対が、配列番号4を含む第1のプライマー及び配列番号6を含む第2のプライマーからなり、及び/又は、第3のプライマー対が、配列番号7を含む第1のプライマー及び配列番号9を含む第2のプライマーからなる、キット。 - 対照遺伝子配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマー対をさらに含む、請求項11に記載のキット。
- プライマー対が、DNAポリメラーゼ、dNTP及びPCR緩衝液をさらに含む増幅マスターミックス中に一緒に存在する、請求項12に記載のキット。
- 黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spa、agr、sspプロテアーゼ、sir、sodM、cap、coa、アルファ溶血素、ガンマ溶血素、femA、Tuf、ソーターゼ(sortase)、フィブリノゲン結合タンパク質、clfB、srC、sdrD、sdrE、sdrF、sdrG、sdrH、NADシンセターゼ、sar、sbi、rpoB、ジャイレースA、及びorfXからなる群から選択される、請求項11に記載のキット。
- 黄色ブドウ球菌に特異的な標的核酸が、spaである請求項14に記載のキット。
- spaプライマー-プローブが、フルオレセインアミダイトフルオロフォアを含み、mecA及びmecCプライマー-プローブが、可視スペクトルの赤色領域において蛍光を発するキサンテン色素を含む、請求項11に記載のキット。
- 印刷された説明書又は電子説明書をさらに含む、請求項11に記載のキット。
- 第1のプライマー対が、配列番号1を含む第1のプライマー及び配列番号3を含む第2のプライマーからなり、第2のプライマー対が、配列番号4を含む第1のプライマー及び配列番号6を含む第2のプライマーからなり、及び/又は、第3のプライマー対が、配列番号7を含む第1のプライマー及び配列番号9を含む第2のプライマーからなる、請求項1に記載のキット。
- 第1のプライマー対のプライマープローブが配列番号2及び3を含む、請求項2に記載の方法。
- 第2のプライマー対のプライマープローブが配列番号5及び6を含む、請求項2に記載の方法。
- 第3のプライマー対のプライマープローブが配列番号8及び9を含む、請求項2に記載の方法。
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