BR112016006312B1 - Método e kit para determinar a presença ou ausência de staphylococcus aureus resistente à meticilina em uma amostra biológica - Google Patents

Método e kit para determinar a presença ou ausência de staphylococcus aureus resistente à meticilina em uma amostra biológica Download PDF

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Abstract

MÉTODO E KIT PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE À METICILINA EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA. São descritos métodos para identificar Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) em uma amostra em que os métodos envolvem detectar uma sequência de ácido nucleico específica para S. aureus, mecA e mecC na amostra. Kits para determinar a presença de MRSA em uma amostra também são providos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção no geral se refere a métodos de detecção de patógeno. Em particular, a presente invenção se refere a métodos para detectar Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) em uma amostra biológica.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A seguinte descrição é provida para ajudar o entendimento do leitor. Nenhuma das informações proveu ou as referências citadas são admitidas serem técnica anterior à presente invenção.
[003] Staphylococcus aureus (S. aureus) é uma causa de uma variedade de condições nos seres humanos, incluindo infecções de pele (por exemplo, foliculite, terçol, celulite, impetigo e furunculose), pneumonia, mastite, flebite, meningite, síndrome da pele escaldada, osteomielite, infecções do trato urinário, e envenenamento alimentar. Além disso, o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) tem reconhecido a S. aureus resistente à meticilina (MRSA) como um problema crescente no cenário de cuidado de saúde visto que a mesma é uma das causas principais de infecções adquiridas em hospital tais como a infecção adquirida em hospital (HA ou nosocomial) de ferimentos cirúrgicos.
[004] A MRSA é um dos dois patógenos resistentes a antibióticos mais agressivos; o enterococo resistente à vancomicina é o outro (Society for Healthcare and Epidemiology, SHEA guidelines 2003). Mais de 50% das infecções nosocomiais nas unidades de cuidado intensivo são devidas à MRSA (National Nosocomial Infections Surveillance System, NNIS report, janeiro 1992 a junho 2004). Consequentemente, a MRSA representa uma ameaça significante à saúde pública.
[005] A resistência à meticilina é causada pela aquisição de um gene exógeno mecA que codifica a proteína de ligação de penicilina (PBP2a ou PBP2‘), que exibe uma afinidade baixa para os antibióticos de β-lactama (Wielders e Fluit, 2002). mecA é transportado em um elemento genético móvel chamado cromossoma do cassete estafilocócico mec (SCCmec) que também contém o complexo do gene ccr que codifica as recombinases necessárias para a mobilidade do elemento. O cassete SCCmec é um elemento grande que pode se mover para dentro e para fora do genoma de S. aureus.
[006] O gene mecA também é encontrado nas cepas de Staphylococcus (CNS) negativas em coagulase que são menos patogênicas do que a S. aureus. Estas cepas incluem S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. capitis, S. warneri, S. sciuri e S. caprae. Algumas destas outras cepas de Staphylococcus habitam os mesmos ambientes como a S. aureus tais como as narinas anteriores e a pele. Segue que as amostras clínicas tais como esfregaços nasais ou esfregaços de ferimento conteriam potencialmente uma mistura de mais do que uma espécie estafilocócica. Portanto, a detecção de mecA apenas não é suficiente para identificar MRSA diretamente da amostra clínica. Porque a identificação de MRSA é de maior significância clínica do que as outras espécies de Staphylococcus devido à sua patogenicidade e toxicidade aumentadas, é desejável ter um ensaio de diagnóstico que distinga MRSA das outras cepas estafilocócicas contendo o gene mecA.
[007] Mais recentemente, um gene mec adicional, denominado mecC, foi descoberto que também confere resistência à beta-lactama. mecC (Acesso no GenBank no. FR821779), antigamente aludido como homólogo de mecA nas publicações antigas, está presente em um elemento SCCmec XI (Acesso no GenBank no. FR823292). O gene mecC foi descrito em S. aureus humano e bovino e codifica uma proteína que tem <63% de identidade de aa com PBP2a codificado por mecA.
[008] A MRSA adquirida em hospital (HA) é tipicamente controlada monitorando-se pacientes e corpo de funcionários quanto à infecção. Precauções de contato e/ou isolação de paciente podem ser apropriadas quando uma infecção se desenvolve ou para prevenir infecções aos indivíduos particularmente em risco. A prevalência de MRSA adquirida na comunidade (CA) também é crescente. A CA-MRSA é definida como MRSA adquirida em pessoas sem nenhum dos fatores de risco conhecidos para a infecção pela MRSA (por exemplo, hospitalização recente, contato com paciente infectado). Porque uma identificação rápida e confiável de MRSA tem se tornado importante para o diagnóstico e tratamento de pacientes infectados, assim como para a implementação e controle de procedimentos de controle de infecção hospitalar, é desejável ter um ensaio de diagnóstico que detecte a presença de S. aureus e, em particular, a presença de MRSA. É adicionalmente desejável ter um tal ensaio que não requeira um processo de preparação de espécime front-end separado do sistema de detecção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] São aqui fornecidos métodos e kits para detectar MRSA em uma amostra biológica. Em particular, os métodos descritos dizem respeito à identificação positiva de MRSA triando-se quanto à presença de três sequências marcadoras de ácido nucleico. Os presentes métodos podem ser praticados em amostras biológicas não processadas, resultando em um processo direto, eficiente de amostra para resposta.
[0010] O método divulgado para determinar a presença ou ausência de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) em uma amostra biológica compreende: (a) contatar a amostra biológica com: (i) um primeiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus, se presente, (ii) um segundo par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico de mecA alvo, se presente, e (iii) um terceiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico de mecC alvo, se presente, Para produzir uma mistura de reação-amostra, em que pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores está associado com um rótulo de fluoróforo, (b) submeter a mistura de reação-amostra às condições de reação da cadeia da polimerase (PCR) em tempo real sob as quais cada um dos ácidos nucleicos alvos presente na amostra biológica é amplificado para produzir um sinal fluorescente, (c) medir a quantidade de sinal fluorescente produzido por cada fluoróforo, e (d) determinar a presença ou ausência de MRSA comparando- se o limiar de ciclo dos ácidos nucleicos alvos, por meio do qual (i) MRSA é determinada estar presente na amostra biológica quando um sinal fluorescente é detectado tanto para o ácido nucleico específico para S. aureus quanto para os ácidos nucleicos de mecA e/ou mecC e (1) o limiar de ciclo (Ct) do ácido nucleico específico para S. aureus menos o Ct dos ácidos nucleicos de mecA e/ou mecC < 1,9, ou (2) o Ct do ácido nucleico específico para S. aureus menos o Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC > 1,9 e o Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC mais 1,9 < Ct do ácido nucleico específico para S. aureus; (ii) S. aureus e um gene de resistência à meticilina são determinados estar presentes na amostra biológica quando um sinal fluorescente é detectado tanto para o ácido nucleico específico para S. aureus quanto os ácidos nucleicos mecA e/ou mecC, e o Ct do ácido nucleico específico para S. aureus menos o Ct dos ácidos nucleicos de mecA e/ou mecC < 1,9, e o Ct do ácido nucleico específico para S. aureus mais 1,9 < o Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC; ou (iii) S. aureus é determinada estar presente e MRSA é determinada estar ausente na amostra biológica se um sinal fluorescente é detectado para o ácido nucleico alvo específico para S. aureus, mas nenhum sinal fluorescente é detectado para mecA e/ou mecC.
[0011] Todos os pares de iniciadores podem estar contidos juntos em uma mistura mestra de amplificação compreendendo ainda DNA polimerase, dNTPs e tampão de PCR antes de contatar com a amostra biológica. Além disso, a mistura mestra de amplificação pode compreender ainda um quarto par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico alvo de controle.
[0012] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus compreende toda ou uma porção de uma sequência de gene selecionada do grupo consistindo de: spa, agr, ssp protease, sir, sodM, cap, coa, alfa hemolisina, gama hemolisina, femA, Tuf, sortase, proteína de ligação de fibrinogênio, clfB, srC, sdrD, sdrE, sdrF, sdrG, sdrH, NAD sintase, sar, sbi, rpoB, girase A, e orfX. Em uma modalidade específica, o ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus é spa.
[0013] O primeiro par de iniciadores pode estar direcionado contra a sequência de ácido nucleico de spa e consiste de um primeiro iniciador compreendendo a SEQ ID NO: 1 e um segundo iniciador consistindo da SEQ ID NO: 2. O segundo par de iniciadores, que está direcionado para a sequência de ácido nucleico de mecA, pode consistir de um primeiro iniciador compreendendo a SEQ ID NO: 4 e um segundo iniciador compreendendo a SEQ ID NO: 6. O terceiro par de iniciadores, que está direcionado para o ácido nucleico de mecC, pode consistir de um primeiro iniciador compreendendo a SEQ ID NO: 7 e um segundo iniciador compreendendo a SEQ ID NO: 9.
[0014] Um iniciador de cada par de iniciadores pode compreender um elemento de sequência sonda como parte da mesma molécula iniciadora, resultando no que é aludido como uma sonda iniciadora (por exemplo uma sonda iniciadora Scorpion®). A sequência de sonda tipicamente está localizada na extremidade 5’ do iniciador e pode compreender ainda um fluoróforo associado com um extintor para reduzir a fluorescência de fundo. A seguir da extensão pela PCR, a região alvo sintetizada é ligada ao mesmo filamento como a sonda. Na desnaturação, a porção de sonda do Scorpion® especificamente hibridiza a uma parte do produto de PCR recém produzido, separando fisicamente o fluoróforo do extintor, produzindo deste modo um sinal detectável. Em algumas modalidades, o fluoróforo do iniciador de mecA e o fluoróforo do iniciador de mecC são idênticos. O fluoróforo dos iniciadores-sondas pode ser uma amidita de fluoresceína (FAM) e o fluoróforo do gene spa de mecA e mecC pode ser um corante xantena que fluoresce na região vermelha do espectro visível.
[0015] A amostra biológica pode ser levada em contato com um ou mais dos pares de iniciadores separada ou simultaneamente. Onde o contato ocorre simultaneamente (isto é, multiplexação), um ou mais do primeiro, segundo, e terceiro pares de iniciadores são levados em contato com a amostra biológica e entre si para amplificar as sequências de ácido nucleico alvo. Opcionalmente, um ácido nucleico de controle positivo interno e um quarto par de iniciadores complementar ao ácido nucleico de controle positivo interno podem ser incluídos na mistura de amplificação.
[0016] Kits compreendendo oligonucleotídeos que podem ser iniciadores ou sondas iniciadoras para realizar amplificações como aqui descritas também são fornecidos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0017] A presente invenção é aqui descrita usando várias definições, como apresentado abaixo e por todo o relatório descritivo.
[0018] Como aqui usado, a menos que de outro modo estabelecido, as formas singulares “um,” “uma,” e “o/a” incluem referência plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um oligonucleotídeo” inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo, e uma referência a “um ácido nucleico” é uma referência a um ou mais ácido nucleicos.
[0019] Como aqui usado, “cerca de” significa mais ou menos 10%.
[0020] Um par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico alvo pode hibridizar a qualquer porção do gene. Como um resultado, o gene inteiro pode ser amplificado ou um segmento do gene pode ser amplificado, dependendo da porção do gene ao qual os iniciadores hibridizam.
[0021] Os termos “amplificação” ou “amplificar” como aqui usados incluem métodos para copiar um ácido nucleico alvo, aumentando deste modo o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico selecionada. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser DNA (tal como, por exemplo, DNA genômico e cDNA) ou RNA. As sequências amplificadas desta maneira formam um “amplicon.” Embora os métodos exemplares descritos a seguir digam respeito à amplificação usando a reação da cadeia da polimerase (PCR), numerosos outros métodos são conhecidos na técnica para a amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de círculo de rolagem, etc.). O técnico habilitado entenderá que estes outros métodos podem ser usados no lugar de, ou junto com, métodos de PCR. Ver, por exemplo, Saiki, “Amplification of Genomic DNA” em PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. 1 de jun de 2001; 29(11): E54-E54; Hafner, et al., Biotechniques abril de 2001; 30(4): 852-860.
[0022] Os termos “complemento,” “complementar,” ou “complementaridade” como aqui usados com referência aos polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) se referem às regras de emparelhamento de Watson/Crick padrão. O complemento de uma sequência de ácido nucleico tal que a extremidade 5’ de uma sequência esteja emparelhada com a extremidade 3’ da outra, está em “associação antiparalela.” Por exemplo, a sequência “5’-A-G-T-3’” é complementar à sequência “3’-T-C-A-5’.” Certas bases não habitualmente encontradas nos ácidos nucleicos naturais podem ser incluídas nos ácidos nucleicos aqui descritos; estas incluem, por exemplo, inosina, 7-desazaguanina, Ácido Nucleicos Trancados (LNA), e Ácido Nucleicos Peptídicos (PNA). A complementaridade não precisa ser perfeita; duplexes estáveis podem conter pares de base desemparelhados, bases degenerativas, ou não emparelhadas. Aqueles habilitados na técnica da tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade de duplex empiricamente considerando várias variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, composição e sequência de base do oligonucleotídeo, concentração iônica e incidência de pares de base desemparelhados. Uma sequência de complemento também pode ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou sua sequência de complemento, e também pode ser um cDNA. O termo “substancialmente complementar” como aqui usado significa que duas sequências especificamente hibridizam (definidas abaixo). O técnico habilitado entenderá que as sequências substancialmente complementares não precisam hibridizar ao longo do seu comprimento completo. Um ácido nucleico que é o “complemento completo” ou que é “totalmente complementar” a uma sequência de referência consiste de uma sequência de nucleotídeo que é 100% complementar (sob as regras de emparelhamento de Watson/Crick) à sequência de referência ao longo do comprimento inteiro do ácido nucleico que é o complemento completo. Um complemento completo não contém desemparelhamentos para a sequência de referência.
[0023] Como aqui usado, o termo “detectar” usado no contexto de detectar um sinal de um rótulo detectável para indicar a presença de um ácido nucleico alvo na amostra não requer que o método forneça 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade. Como é bem conhecido, “sensibilidade” é a probabilidade de que um teste é positivo, dado que a pessoa tem um ácido nucleico alvo, enquanto que “especificidade” é a probabilidade de que um teste seja negativo, dado que a pessoa não tem o ácido nucleico alvo. Uma sensibilidade de pelo menos 50% é preferida, embora as sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. Uma especificidade de pelo menos 50% é preferida, embora sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. Detectar também abrange ensaios com falsos positivos e falsos negativos. As taxas falso negativas podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou ainda mais altas. As taxas falso positivas podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou ainda mais altas.
[0024] Um “fragmento” no contexto de um ácido nucleico se refere a uma sequência de resíduos de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 5 nucleotídeos, pelo menos cerca de 7 nucleotídeos, pelo menos cerca de 9 nucleotídeos, pelo menos cerca de 11 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 17 nucleotídeos. O fragmento é tipicamente menor do que cerca de 300 nucleotídeos, menor do que cerca de 100 nucleotídeos, menor do que cerca de 75 nucleotídeos, menor do que cerca de 50 nucleotídeos, ou menor do que 30 nucleotídeos. Em certas modalidades, os fragmentos podem ser usados na reação da cadeia da polimerase (PCR), vários procedimentos de hibridização ou procedimentos de microarranjo para identificar ou amplificar partes idênticas ou relacionadas de moléculas de mRNA ou DNA. Um fragmento ou segmento pode identificar de modo único cada sequência de polinucleotídeo da presente invenção.
[0025] “Ácido nucleico genômico” ou “DNA genômico” se refere a um pouco ou todo do DNA de um cromossoma. O DNA genômico pode ser intacto ou fragmentado (por exemplo, digerido com endonucleases de restrição pelos métodos conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, o DNA genômico pode incluir sequência de todo ou uma porção de um único gene ou de genes múltiplos. Ao contrário, o termo “ácido nucleico genômico total” é aqui usado para se referir ao complemento completo de DNA contido no genoma. Os métodos de purificar DNA e/ou RNA de uma variedade de amostras são bem conhecidos na técnica.
[0026] O termo “PCR multiplex” como aqui usado se refere à amplificação simultânea de dois ou mais produtos dentro do mesmo vaso de reação. Cada produto é iniciado usando um par de iniciadores distintos. Uma reação multiplex pode incluir ainda sondas específicas para cada produto, que são rotulados com porções detectáveis.
[0027] Como aqui usado, o termo “oligonucleotídeo” se refere a um polímero curto composto de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. Os oligonucleotídeos têm geralmente pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 40 ou 50 até cerca de 100, 110, 150 ou 200 nucleotídeos (nt) no comprimento, mais preferivelmente de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 até cerca de 70 ou 85 nt, e o mais preferivelmente de cerca de 18 até cerca de 26 nt no comprimento. O código de letra única para nucleotídeos é como descrito no U.S. Patent Office Manual of Patent Examining Procedure, seção 2422, tabela 1. A este respeito, a designação de nucleotídeo “R” significa purina tal como guanina ou adenina, “Y” significa pirimidina tal como citosina ou timidina (uracila se RNA); e “M” significa adenina ou citosina. Um oligonucleotídeo pode ser usado como um iniciador ou como uma sonda.
[0028] Como aqui usado, um “iniciador” para a amplificação é um oligonucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo alvo e leva à adição de nucleotídeos à extremidade 3’ do iniciador na presença de uma DNA ou RNA polimerase. O nucleotídeo 3’ do iniciador geralmente deve ser idêntica à sequência de ácido nucleico alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para a expressão e amplificação ótimas. O termo “iniciador” como aqui usado inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizadas incluindo iniciadores peptídicos de ácido nucleico, iniciadores de ácido nucleico trancado, iniciadores modificados por fosforotioato, iniciadores rotulados, e os semelhantes. Como aqui usado, um “iniciador avançado” é um iniciador que é complementar ao filamento de antissentido de dsDNA. Um “iniciador reverso” é complementar ao filamento de sentido de dsDNA. Um “iniciador exógeno” se refere especificamente a um oligonucleotídeo que é adicionado a um vaso de reação contendo o ácido nucleico da amostra a ser amplificado de fora do vaso e não é produzido a partir da amplificação no vaso de reação. Um iniciador que está “associado com” um fluoróforo ou outro rótulo é conectado ao rótulo através de algum meio. Um exemplo é uma sonda iniciadora.
[0029] Os iniciadores são tipicamente de pelo menos 10, 15, 18, ou 30 nucleotídeos no comprimento até cerca de 100, 110, 125, ou 200 nucleotídeos no comprimento, preferivelmente de pelo menos 15 até cerca de 60 nucleotídeos no comprimento, e o mais preferivelmente de pelo menos 25 até cerca de 40 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores e/ou sondas têm de 15 a 35 nucleotídeos no comprimento. Não há nenhum comprimento padrão para a hibridização ou amplificação pela reação da cadeia da polimerase ótimas. Um comprimento ótimo para uma aplicação de iniciador particular pode ser facilmente determinado na maneira descrita em H. Erlich, PCR Technology, Principles and Application for DNA Amplification, (1989).
[0030] Um “par de iniciadores” é um par de iniciadores que são ambos direcionados à sequência de ácido nucleico alvo. Um par de iniciadores contêm um iniciador avançado e um iniciador reverso, cada um dos quais hibridizando sob condição severa a um filamento diferente de uma sequência alvo de ácido nucleico de filamento duplo. O iniciador avançado é complementar ao filamento de antissentido do dsDNA e o iniciador reverso é complementar ao filamento de sentido. Um iniciador de um par de iniciadores pode ser uma sonda iniciadora (isto é, uma molécula bifuncional que contêm um Elemento iniciador de PCR covalentemente ligado por um grupo bloqueador da polimerase a um elemento sonda e, além disso, pode conter um fluoróforo que interage com um extintor).
[0031] Um oligonucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo “hibridizará” ao ácido nucleico alvo sob condições específicas. Como aqui usado, “hibridização” ou “hibridizar” se refere ao processo pelo qual um filamento único do oligonucleotídeo recoze com um filamento complementar através da base emparelhando sob condições de hibridização definidas.
[0032] “Hibridização específica” é uma indicação de que as duas sequências de ácido nucleico compartilham um alto grau de complementaridade. Complexos específicos da hibridização se formam sob condições de recozimento permissivas e permanecem hibridizados depois de qualquer uma das etapas de lavagem subsequentes. As condições permissivas para o recozimento das sequências de ácido nucleico são rotineiramente determináveis por uma pessoa de habilidade comum na técnica e podem ocorrer, por exemplo, a 65°C na presença de cerca de 6xSSC. A severidade de hibridização pode ser expressa, em parte, com referência à temperatura sob a qual as etapas de lavagem são realizadas. Tais temperaturas são tipicamente selecionadas para serem de cerca de 5°C a 20°C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma concentração iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob concentração iônica e pH definidos) na qual 50% do ácido nucleico alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente emparelhada. As equações para calcular a Tm e condições para a hibridização de ácido nucleico são conhecidas na técnica. A hibridização específica preferivelmente ocorre sob condições severas, que são bem conhecidas na técnica. As condições de hibridização severas são hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1xSSC a 60° C. Procedimentos de hibridização são bem conhecidos na técnica e são descritos por exemplo em Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994.
[0033] Como aqui usado, um oligonucleotídeo é “específico” para um ácido nucleico se o oligonucleotídeo tem pelo menos 50% de identidade de sequência com o ácido nucleico quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico são alinhados. Um oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é um que, sob as condições de hibridização ou lavagem apropriadas, é capaz de hibridizar ao alvo de interesse e não hibridiza substancialmente aos ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais altos de identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador comercialmente disponível com um ajuste de default que utiliza algoritmos bem conhecidos na técnica. Como aqui usado, as sequências que têm “alta identidade de sequência” têm nucleotídeos idênticos pelo menos em cerca de 50% das posições de nucleotídeo alinhadas, preferivelmente pelo menos em cerca de 60% das posições de nucleotídeo alinhadas, e mais preferivelmente pelo menos em cerca de 75% das posições de nucleotídeo alinhadas.
[0034] Os oligonucleotídeos usados como iniciadores ou sondas para amplificar especificamente (isto é, amplificar um ácido nucleico alvo particular) ou especificamente detectar (isto é, detectar uma sequência de ácido nucleico alvo particular) um ácido nucleico alvo geralmente são capazes de especificamente hibridizar ao ácido nucleico alvo sob condições severas.
[0035] Como aqui usado, o termo “amostra” ou “amostra de teste” pode compreender amostras clínicas, ácidos nucleicos isolados, ou microorganismos isolados. Nas modalidades preferidas, uma amostra é obtida a partir de uma fonte biológica (isto é, uma “amostra biológica”), tal como tecido, fluido corporal, ou microorganismos coletados de um indivíduo. As fontes de amostra incluem, mas não são limitados a, secreção das vias aéreas (processado ou não processado), lavagem broncoalveolar (BAL), lavagem brônquica (BW), sangue, fluidos corporais, fluido cerebroespinhal (CSF), urina, plasma, soro, ou tecido (por exemplo, material de biópsia). As fontes de amostra preferidas incluem esfregaços nasofaríngeos, esfregaços de ferimento, e lavagens nasais. O termo “amostra de paciente” como aqui usado se refere a uma amostra obtida de um ser humano procurando diagnóstico e/ou tratamento de uma doença.
[0036] Uma “mistura de amplificação” como aqui usado é uma mistura de reagentes que são usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico, mas não contém iniciadores ou amostra. Uma mistura de amplificação compreende um tampão, dNTPs, e uma DNA polimerase. Uma mistura de amplificação pode compreender ainda pelo menos um de MgCl2, KCl, detergentes não iônica e iônica (incluindo detergentes catiônicos).
[0037] Uma “mistura mestra de amplificação” compreende uma mistura de amplificação e iniciadores para amplificar um ácido nucleico alvo, mas não contém uma amostra a ser amplificada.
[0038] Uma “mistura de reação-amostra” como aqui usado se refere a uma mistura contendo mistura mestra de amplificação mais amostra.
[0039] Um “elemento de sequência sonda” como aqui usado se refere a um trecho de nucleotídeos que está associado com um iniciador em que o mesmo é conectado a ou adjacente à sequência iniciadora de ácido nucleico, e que especificamente hibridiza sob condições severas a uma sequência de ácido nucleico alvo a ser detectada.
[0040] Como aqui usado, o termo “sistema de detecção de sonda iniciadora” se refere a um método para a PCR em tempo real. Este método utiliza uma molécula bifuncional (aqui aludida como uma sonda iniciadora), que contêm um elemento iniciador de PCR covalentemente ligado por um grupo bloqueador da polimerase a um elemento sonda. Adicionalmente, cada molécula de sonda iniciadora contém um fluoróforo que interage com um extintor para reduzir a fluorescência de fundo. As sondas iniciadoras, como aqui usadas, podem compreender um iniciador 3’ com uma cauda de sonda prolongada 5’ compreendendo uma estrutura de grampo de cabelo que possui um par de fluoróforo/extintor. Durante a PCR, a polimerase é bloqueada a partir da extensão na cauda de sonda pela inclusão de hexaetileno glicol (HEG). Durante a primeira rodada de amplificação o iniciador específico para alvo 3’ recoze ao ácido nucleico alvo e é prolongado tal que a sonda iniciadora é agora incorporada no filamento recém-sintetizado, que possui uma região alvo recém-sintetizada para a sonda 5’. Durante a rodada seguinte de desnaturação e recozimento, a região de sonda da alça de cabelo da sonda iniciadora hibridizará ao alvo, separando assim o fluoróforo e extintor e criando um sinal mensurável. Tais sondas iniciadoras são descritas em Whitcombe et al., Nature Biotech 17: 804-807 (1999). Os iniciadores SCORPION são sondas iniciadoras exemplares.
[0041] Os termos “ácido nucleico alvo” “sequência de ácido nucleico alvo” ou “sequência alvo” como aqui usado se refere a uma sequência que inclui um segmento de nucleotídeos de interesse a ser amplificado e detectado. As cópias da sequência alvo que são geradas durante a reação de amplificação são aludidas como produtos de amplificação, amplímeros ou amplicons. O ácido nucleico alvo pode ser composto de segmentos de um cromossoma, um gene completo com ou sem sequência intergênica, segmentos ou porções de um gene com ou sem sequência intergênica, ou sequências de ácido nucleico para as quais sondas ou iniciadores são designados. Os ácidos nucleicos alvos podem incluir uma sequência(s) do tipo selvagem, uma mutação, deleção ou duplicação, regiões repetidas em tandem, um gene de interesse, uma região de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante das mesmas. Os ácidos nucleicos alvos podem representar sequências alternativas ou alelos de um gene particular. Os ácidos nucleicos alvos podem ser derivados de DNA genômico, cDNA ou RNA. Como aqui usado ácido nucleico alvo pode ser DNA ou RNA extraídos de uma célula ou um ácido nucleico copiado ou amplificado a partir da mesma, ou podem incluir ácidos nucleicos extraídos convertidos ainda usando uma reação de bissulfeto.
[0042] Um “ácido nucleico de controle positivo” ou “controle de amplificação interna positiva” como aqui usados é um ácido nucleico conhecido estar presente em uma amostra em uma certa quantidade ou nível. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de controle positivo não está naturalmente presente em uma amostra e é adicionado à amostra antes de submeter a mistura de reação-amostra à reação da cadeia da polimerase em tempo real nos métodos divulgados para determinar a presença ou ausência de MRSA. Como aqui usado, um “limiar de ciclo” (Ct) para um análito é o ciclo de PCR no qual o sinal de fluorescência cruza um limiar de fluorescência específico. O Ct depende da eficiência da reação de amplificação que inclui o número de cópia padrão de partida, lise de organismo, amplificação pela PCR, hibridização ou clivagem de sonda fluorogênica e sensibilidade de detecção.
[0043] Como aqui usado “sistema de detecção pela PCR TaqMan®” se refere a um método para PCR em tempo real. Neste método, uma sonda TaqMan® hibridizando ao segmento de ácido nucleico amplificado é incluído na mistura mestra de amplificação. A sonda TaqMan® compreende um fluoróforo doador e um extintor em cada extremidade da sonda e em proximidade imediata suficiente entre si de modo que a fluorescência do doador seja absorvida pelo extintor. Entretanto, quando a sonda hibridiza ao segmento amplificado, a atividade da 5’-exonuclease da Taq polimerase cliva a sonda permitindo deste modo que o fluoróforo doador emita fluorescência que possa ser detectada.
[0044] Os presentes inventores descobriram que uma identificação positiva de MRSA pode ser feita determinando-se a presença ou ausência de três sequências de ácido nucleico marcadoras em uma amostra biológica. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos de determinar a presença ou ausência de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) em uma amostra biológica, o método compreendendo: (a) levar a amostra biológica em contato com: um primeiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus, se presente, um segundo par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico de mecA alvo se presente, e um terceiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um ácido nucleico mecC alvo, se presente, para produzir uma mistura de reação-amostra, em que pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores está associado com um rótulo de fluoróforo, (b) submeter a mistura de reação-amostra às condições da reação da cadeia da polimerase (PCR) em tempo real sob as quais cada um dos ácidos nucleicos alvos presentes na amostra biológica é amplificado para produzir um sinal fluorescente, (c) medir a quantidade de sinal fluorescente produzido por cada fluoróforo usando um sistema de ciclagem térmica integrado, e (d) determinar a presença ou ausência de MRSA comparando-se a quantidade de fluorescência dos ácidos nucleicos alvos e aplicando um algoritmo descoberto pelos presentes inventores.
Amostras biológicas e preparação de amostra
[0045] As amostras biológicas em que MRSA pode ser detectado e quantificado usando os métodos divulgados são de sítios estéreis e/ou não estéreis. Os sítios estéreis a partir dos quais as amostras podem ser obtidas são fluidos corporais tais como sangue integral, plasma, plasma isento de célula, urina, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, fluido pleural, fluido pericardial, fluido intraocular, biópsia de tecido ou aspirados endotraqueais. Como aqui usado, “plasma isento de célula” indica plasma contendo menos do que 1% de células em volume. Os sítios não estéreis a partir dos quais as amostras podem ser tiradas são por exemplo secreção das vias aéreas, fezes, esfregaços por exemplo da pele, inguinal, nasal e/ou da garganta. Preferivelmente, amostras de sítios não estéreis, mais preferivelmente esfregaços de ferimento e/ou nasais são usados na presente invenção. As amostras para a detecção de MRSA também podem compreender culturas de bactérias isoladas crescendo em meios apropriados para formar colônias. As amostras também podem incluir isolados bacterianos.
[0046] As fontes de amostras biológicas exemplares incluem esfregaços nasofaríngeos, esfregaços de ferimento, e lavagens nasais. Uma amostra biológica pode ser suspeita de conter MRSA e/ou ácidos nucleicos de MRSA. Além disso, uma amostra biológica pode ser obtida de um indivíduo suspeito de estar infectado com MRSA. A amostra biológica pode ser contatada com uma mistura mestra de amplificação para o uso em uma plataforma de centrifugação microfluídica/microeletrônica.
[0047] Embora os métodos divulgados preferivelmente utilizem amostras biológicas não processadas resultando assim em um processo direto, eficiente de amostra para resposta, os métodos de detecção aqui divulgados serão eficazes se usados no ácido nucleico (DNA ou RNA) isolado purificado de uma amostra biológica de acordo com qualquer um dos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Se desejado, a amostra pode ser coletada ou concentrada pela centrifugação e os semelhantes. As células da amostra podem ser submetidas à lise, tal como pelos tratamentos com enzimas, calor, tensoativos, ultrassonicação ou combinação dos mesmos. Alternativamente, uma amostra biológica pode ser processada usando um kit de extração de ácido nucleico comercialmente disponível.
[0048] Em algumas modalidades, um ou mais pares de iniciadores são presentes em uma mistura mestra de amplificação que compreende ainda DNA polimerase, dNTPs e tampão de PCR antes de contatar com a amostra biológica. Embora a amplificação preferivelmente ocorra em um formato multiplex, reações individuais para cada marcador alternativamente podem ser usadas. A amostra biológica pode ser contatada com o(s) par(es) de iniciadores e/ou com uma mistura mestra de amplificação para formar uma mistura de reação-amostra em um disco de amplificação direta. Por exemplo, a amostra biológica pode ser contatada com a mistura mestra de amplificação em um disco de amplificação direta tal como o Disco de Amplificação Direta comercializada pela Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, CA, USA) como parte dos ensaios de PCR em tempo real SIMPLEXA Direct para trabalhar em combinação com o Ciclador Integrado 3M®. Um disco de amplificação direta é um disco fino, circular contendo regiões designada múltiplas, cada um do qual contêm um poço para receber uma mistura mestra de amplificação e um poço associado para receber amostra de paciente não processada. A mistura de amostra-reação é produzida no disco de amplificação direta na ou depois da adição da mistura mestra de amplificação e da amostra.
PCR em tempo real
[0049] A mistura de reação-amostra é submetida às condições de reação da cadeia da polimerase (PCR) em tempo real sob a qual cada um dos ácidos nucleicos alvos presentes na amostra biológica é amplificada e o(s) produto(s) amplificado(s) são detectado(s) e medido(s). Em algumas modalidades, a amostra biológica é carregada diretamente em um disco de amplificação direta sem uma preparação de espécime front-end separado, seguido pela detecção e diferenciação pela RT-PCR de análitos alvo no mesmo disco. Preferivelmente, a amplificação é realizada em um Disco de Amplificação Direta (um disco de 8 poços da Focus Diagnostics, Inc.). Em algumas modalidades, a amplificação pela PCR em tempo real é realizada usando o ensaio Direto SIMPLEXA em um disco de amplificação direta e a detecção é realizada usando um termociclador integrado tal como o Ciclador Integrado 3M® vendido pela 3M (St. Paul, MN, USA). O Ciclador Integrado 3MTM pode receber um Disco de Amplificação Direta e é capaz de realizar ensaios múltiplos por disco. Este aparelho pode aquecer a >5° C por segundo e resfriado a >4° C por segundo. Os parâmetros de ciclagem podem ser variados, dependendo do comprimento dos produtos de amplificação a serem prolongados.
[0050] Um controle de amplificação positivo interno (IPC) pode ser incluído na amostra, utilizando iniciadores de oligonucleotídeo, sondas e/ou sonda iniciadoras.
[0051] Consequentemente, em algumas modalidades, pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores na reação de amplificação compreende uma porção detectável. A porção detectável pode estar em uma sonda que é ligada ao iniciador, tal como com uma sonda iniciadora. A sonda pode ser detectavelmente rotulada pelos métodos conhecidos na técnica. Os rótulos úteis incluem, por exemplo, corantes fluorescentes (por exemplo, Cy5®, Cy3®, FITC, rodamina, fósforos de lantamida, vermelho Texas, amidita de fluoresceína (FAM), JOE, um corante xantena tal como Cal Fluor Red 610® (“CFR610”) que fluoresce na região vermelha do espectro visível e pode ser eficazmente extinta por um corante I-BHQ2, Quasar 670®, 32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131I, reagentes densos em elétron (por exemplo, ouro), enzimas, por exemplo, como habitualmente usado em um ELISA (por exemplo, peroxidase de rábano, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), rótulos colorimétricos (por exemplo, ouro coloidal), rótulos magnéticos (por exemplo, Dynabeads®), biotina, dioxigenina, ou haptenos e proteínas para os quais antissoros ou anticorpos monoclonais são disponíveis. Outros rótulos incluem ligandos ou oligonucleotídeos capazes de formar um complexo com o receptor ou complemento de oligonucleotídeo correspondente, respectivamente. O rótulo pode ser diretamente incorporado no ácido nucleico a ser detectado, ou pode ser ligado a uma sonda (por exemplo, um oligonucleotídeo) ou anticorpo que hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.
[0052] Assim, a seguir da amplificação, os vários segmentos alvo podem ser identificados usando-se porções detectáveis diferentes tais como tamanho e/ou cor. A porção detectável pode ser um corante fluorescente. Em algumas modalidades, os pares de iniciadores diferentes são rotulados com porções detectáveis distinguíveis diferentes. Assim, por exemplo, os corantes fluorescentes HEX e FAM podem estar presentes em iniciadores diferentes na PCR multiplex e associados com os amplicons resultantes. Em outras modalidades, o iniciador avançado é rotulado com uma porção detectável, enquanto que o iniciador reverso é rotulado com uma porção detectável diferente, por exemplo corante FAM para um iniciador avançado e corante HEX para um reverso iniciador. O uso de porções detectáveis diferentes é útil para discriminar entre produtos amplificados que são do mesmo comprimento ou são muito similares no comprimento. Em algumas modalidades uma sonda iniciadora para o gene específico para S. aureus é rotulada com um rótulo detectável (tal como FAM) e uma sonda iniciadora específica para cada um dos genes mecA e mecC é rotulada com um rótulo detectável diferente (tal como CFR610). Assim, em certas modalidades, dois corantes fluorescentes diferentes são usados para rotular sondas iniciadoras diferentes usadas em uma única amplificação.
[0053] Em algumas modalidades, as sondas utilizadas são detectavelmente rotuladas e a detecção é realizada detectando-se o rótulo de sonda para cada produto de amplificação. Um extintor pode estar associado ainda com o rótulo detectável que impede a detecção do rótulo antes da amplificação do alvo da sonda. As sondas TAQMAN são exemplos de tais sondas.
[0054] Em certas modalidades, a sonda e um dos iniciadores do par de iniciadores podem constituir parte da mesma molécula. Isto é aludido como uma sonda iniciadora (por exemplo uma sonda iniciadora SCORPION). Nestas modalidades, a sonda iniciadora contém ainda um fluoróforo associado com um extintor para reduzir a fluorescência de fundo. A seguir da extensão pela PCR com uma tal sonda iniciadora rotulada fluorescente, a região alvo sintetizada é ligada ao mesmo filamento como a sonda. Na desnaturação, a porção de sonda da sonda iniciadora especificamente hibridiza a uma parte do produto de PCR recém produzido, separando fisicamente o fluoróforo do extintor, produzindo deste modo um sinal detectável. Assim, em algumas modalidades, um iniciador de cada par de iniciadores pode ser uma sonda iniciadora que compreende um elemento da sequência sonda na extremidade 5’ de um iniciador, em que o elemento sonda compreende ainda um fluoróforo e um extintor.
[0055] Em algumas modalidades, as sondas utilizadas nos métodos divulgados compreendem ou consistem de sequências de DNA curtas fluorescentemente rotuladas designadas para detectar seções de sequência de DNA com uma variação genética tal como aquela divulgada em French et al. HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination, Mol Cell probes, dez 2001; 15(6): 363-74, aqui incorporada por referência em sua totalidade. A localização central da molécula fluorescente dentro deste tipo de sonda fornece certas vantagens em relação às sondas que têm a química da sinalização no final da sonda de DNA. HyBeacons® são um exemplo deste tipo de sonda. Ácidos Nucleicos Alvos e Iniciadores
[0056] De acordo com a presente invenção, iniciadores e sondas de oligonucleotídeo são usados nos métodos aqui descritos para amplificar e detectar ácidos nucleicos alvos tais como toda ou uma porção de um gene marcador específico para Staphylococcus aureus além de todo ou uma porção do gene mecA, e o gene mecC. Em uma modalidade, o método envolve utilizar pares de iniciadores especificamente direcionados a spa, mecA e mecC incluindo fragmentos de qualquer um ou todos destes genes.
[0057] Além disso, iniciadores também podem ser usados para amplificar uma ou mais sequências de ácido nucleico de controle.
[0058] Os ácidos nucleicos alvos aqui descritos podem ser detectados individualmente ou em um formato multiplex, utilizando rótulos individuais para cada alvo. Em uma modalidade particular, uma sonda iniciadora rotulada fluorescente tal como uma sonda iniciadora SCORPION é usada em um par de iniciadores especificamente direcionados ao gene mecA e contém o mesmo rótulo fluorescente como uma sonda iniciadora rotulada fluorescente em um par de iniciadores para mecC.
[0059] O técnico habilitado é capaz de planejar e preparar iniciadores que são apropriados para amplificar um ácido nucleico alvo em vista desta divulgação. O comprimento dos iniciadores de amplificação para o uso na presente invenção depende de vários fatores incluindo a identidade de sequência de nucleotídeo e a temperatura na qual estes ácidos nucleicos são hibridizados ou usados durante a amplificação de ácido nucleico in vitro. As considerações necessárias para determinar um comprimento preferido para um iniciador de amplificação de uma identidade de sequência particular são bem conhecidas pela pessoa de habilidade comum na técnica.
[0060] O planejamento de oligonucleotídeos a serem usados como sondas de hibridização pode ser realizado em uma maneira similar ao planejamento de iniciadores. Como com iniciadores de oligonucleotídeo, sondas de oligonucleotídeo usualmente têm temperaturas de fusão similares, e o comprimento de cada sonda deve ser suficiente para que a hibridização específica de sequência ocorra, mas não tão longa que a fidelidade seja reduzida durante a síntese. As sondas de oligonucleotídeo são geralmente de 15 a 60 nucleotídeos no comprimento.
[0061] Em algumas modalidades, uma mistura de iniciadores é provida tendo degeneração em uma ou mais posições de nucleotídeo. Os iniciadores degenerados são usados na PCR onde a variabilidade existe na sequência de ácido nucleico alvo, isto é, a informação de sequência é ambígua. Tipicamente, iniciadores degenerados exibirão variabilidade em não mais do que cerca de 4, não mais do que cerca de 3, preferivelmente não mais do que cerca de 2, e o mais preferivelmente, não mais do que cerca de 1 posição de nucleotídeo dentro do iniciador.
[0062] Um ácido nucleico alvo pode ser um gene que é totalmente amplificado. Alternativamente, em algumas modalidades, um ácido nucleico alvo é um fragmento ou segmento de um gene. O fragmento pode ser derivado de qualquer região da sequência completa, mas o comprimento de fragmento de acordo com os presentes métodos é tipicamente de pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250 ou pelo menos 300 nucleotídeos. Como será entendido por uma pessoa habilitada na técnica, o tamanho e a localização do ácido nucleico alvo particular controlará a seleção dos iniciadores de amplificação e vice e versa.
[0063] Os iniciadores, sondas e sonda iniciadoras específicos para a amplificação e detecção de todo ou de um fragmento de um gene marcador específico para S. aureus incluem aqueles direcionados para as sequências presentes em S. aureus, mas ausentes de outras espécies de Staphylococcus. Os exemplos de genes marcadores específicos incluem, mas não são limitados a spa, agr, ssp protease, sir, sodM, cap, coa, hemolisina alfa, hemolisina gama, femA, Tuf, sortase, proteína de ligação de fibrinogênio, clfB, srC, sdrD, sdrE, sdrF, sdrG, sdrH, NAD sintase, sar, sbi, rpoB, girase A, e orfX. A detecção de um gene específico para S. Aureus ajuda a distinguir uma amostra contendo S. aureus de uma que pode conter outra espécie ou cepas menos patogênicas, por exemplo S. epidermidis. Um gene marcador adequado é o gene spa de 1,55 kb (ver, por exemplo, Acesso no GenBank No. NC_002952, faixa de 125378 a 123828). As sequências de iniciador e sonda iniciadora rotulada exemplares para amplificar e detectar spa incluem: Iniciador spa 1 de S. aureus: 5’d CTTGATAAAAAGCATTTTGTTGAGCTTCA 3’ (SEQ ID NO: 1) Iniciador spa 2 de S. aureus: 5’ TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3’ (SEQ ID NO: 3) sonda iniciadora rotulada spa de S. aureus: 5’d BHQ-1- agcggtGCAGCAGGTGTTACGCCACCgc-T(FAM)-Espaçador18- TGCATCTGTAACTTTAGGTACATTA 3’ (SEQ ID NO: 2)
[0064] O técnico habilitado entenderá que outros iniciadores, sondas, e sondas iniciadoras (incluindo outras sondas iniciadoras SCORPION) podem ser usados.
[0065] Os iniciadores e sondas específicos são selecionados para amplificar e detectar um fragmento do gene mecC de 2,0 kb (ver, por exemplo, Acesso no GenBank No. FR821779, faixa de 36219 a 36322). As sequências de iniciador e sonda iniciadora rotulada exemplares para amplificar e detectar mecC incluem: Iniciador mecAh 1: 5’d TCACCGATTCCCAAATCTTGC 3’ (SEQ ID NO: 4) Iniciador mecAh 2: 5’ AAGCAAGCAATAGAATCATCAGACA 3’ (SEQ ID NO: 6) sonda iniciadora rotulada de mecAh: 5’d CFR610- acgtgCCTAATGCTAATGCAATGCGGGCAcgt-BHQ-2-Espaçador18- AAGCAAGCAATAGAA TCATCAGACA 3’ (SEQ ID NO: 5)
[0066] O técnico habilitado entenderá que outros iniciadores, sondas, e sonda iniciadoras (incluindo outras sondas iniciadoras SCORPION®) direcionadas ao mecC podem ser usadas.
[0067] Os iniciadores e sondas específicos são selecionados para amplificar e detectar um fragmento do gene mecA de 2,0 kb (ver, por exemplo, Acesso no GenBank No. X52593, faixa 1491 a 1519). As sequências de iniciador e sonda iniciadora rotulada exemplares para amplificar e detectar mecA incluem: Iniciador mecA 1: 5’d TCTTCACCAACACCTAGTTTTTTCA 3’ (SEQ ID NO: 7) Iniciador mecA 2: 5’ GGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGA 3’ (SEQ ID NO: 9) sonda iniciadora rotulada de mecA: 5’d CFR610acgcggcCTTACTGCCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCgccgcgt- BHQ-2-Espaçador18GGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGA 3’ (SEQ ID NO: 5)
[0068] Consequentemente, a detecção e diferenciação qualitativas de S. aureus e S. aureus resistente à meticilina usando o método divulgado pode utilizar pares de iniciadores que compreendem uma sonda iniciadora e PCR em tempo real para a amplificação e detecção do gene spa específico para S. aureus, e os genes da resistência à meticilina mecA e mecC em um Disco de Amplificação Direta com um sistema de ciclador integrado. Com este método, o ácido nucleico alvo, tal como DNA genômico alvo, é especificamente amplificado e simultaneamente detectado pelas sondas rotuladas fluorescentes na mesma reação. A sonda iniciadora do par de iniciadores de spa pode compreender um rótulo de amidita de fluoresceína (por exemplo, FAM) e cada uma das sondas iniciadoras dos pares de iniciadores mecA e mecC pode compreender um corante xantena que fluoresce na região vermelha do espectro visível (por exemplo CFR610).
Algoritmos
[0069] Ao submeter as misturas de amostra-reação à PCR em tempo real, e detectar e medir os sinais de fluorescência associados com os genes amplificados, os métodos da presente invenção fornecem ainda que a presença ou ausência de MRSA é determinada usando-se o algoritmo de MRSA, que fornece os resultados finais pelo emparelhamento do limiar de ciclo (Ct) das sequências de ácido nucleico alvo amplificadas. Preferivelmente, os ácidos nucleicos alvos de mecA e mecC são amplificados usando uma sonda iniciadora rotulada com um corante xantena que fluoresce na região vermelha do espectro visível tal como CFR610, e a sequência de ácido nucleico alvo de spa é amplificada usando uma sonda iniciadora que é rotulada com um fluoróforo de amidita de fluoresceína tal como FAM. Assim, os sinais de mecA e/ou mecC (designados “Ct de mecA_C (canal CFR610)” abaixo) são do corante xantena e o sinal de spa (designado “Ct de SA (canal FAM)” abaixo) é do fluoróforo de amidita de fluoresceína.
[0070] O algoritmo de MRSA dita:
Figure img0001
[0071] Consequentemente, a presença ou ausência de MRSA em uma amostra podem ser determinadas com base nos seguintes cenários: (1) MRSA é determinada estar presente na dita amostra biológica quando um sinal fluorescente é detectado tanto para o gene específico para S. aureus (sinal de FAM) quanto os genes mecA e/ou mecC (sinal de CFR610), e se: (a) Ct de SA (canal FAM) - Ct de mecA_C (canal de CFR610) < 1,9 (isto é, o limiar de ciclo da sequência de ácido nucleico alvo específico para S. aureus (por exemplo, spa) menos o limiar de ciclo das sequências de ácido nucleico alvos de mec A e/ou mec C < 1,9), ou se (b) Ct de SA (canal FAM) - Ct de mecA_C (canal CFR610) > 1,9, e Ct de mecA_C (canal CFR610) +1,9 < Ct de SA (canal FAM) (isto é, o limiar de ciclo da sequência de ácido nucleico alvo específico para S. aureus (por exemplo, spa) menos o limiar de ciclo das sequências de ácido nucleico alvos de mecA e/ou mecC > 1,9 e o limiar de ciclo das sequências de ácido nucleico alvos de mecA e/ou mecC mais 1,9 < o limiar de ciclo da sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus) (2) S. aureus e pelo menos um gene de resistência à meticilina são determinados estar presentes na amostra quando um sinal fluorescente é detectado tanto para a sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus (sinal de FAM) quanto as sequências de ácido nucleico alvos de mecA e/ou mecC (sinal de CFR610) e se Ct de SA (canal de FAM) - Ct de mecA_C (canal de CFR610) < 1,9, e Ct de SA (canal de FAM) +1,9 < Ct de mecA_C (canal de CFR610) (isto é, o limiar de ciclo da sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus menos o limiar de ciclo das sequências de ácido nucleico alvos de mecA e/ou mecC < 1,9, e o limiar de ciclo da sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus mais 1,9 < limiar de ciclo das sequências de ácido nucleico alvos de mecA e/ou mecC).
[0072] Em tal caso, S. aureus está presente na amostra assim como um gene de resistência à meticilina, mas que o gene de resistência à meticilina estaria vindo da S. aureus ou de um Staphylococcus coagulase negativo na mesma amostra. (3) Uma amostra com um sinal detectável (FAM) para a sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus mas nenhum sinal de CFR610 detectável para mecA e/ou mecC é interpretada como contendo S. aureus mas não MRSA. (4) Se um sinal para a sequência de ácido nucleico alvo específica de S. aureus (sinal de FAM) não é detectado e um sinal para mecA ou mecC (CFR610) também não é detectado, então a amostra é interpretada como negativa em S. aureus e MRSA.
Kits
[0073] Kits compreendendo oligonucleotídeos que podem ser iniciadores ou sondas iniciadoras para realizar amplificações como aqui descritas para determinar a presença ou ausência de MRSA em uma amostra biológica também são fornecidos pela presente invenção. Um kit da presente invenção pode incluir ainda oligonucleotídeos que podem ser usados como sondas para detectar ácido nucleico amplificado, e/ou uma ou mais enzimas de restrição para digerir ácido nucleico não alvo para aumentar a detecção de ácido nucleico alvo pelos iniciadores de oligonucleotídeo.
[0074] Em algumas modalidades, um kit compreende (i) um primeiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um segmento de um gene marcador alvo específico para Staphylococcus aureus, (ii) um segundo par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um segmento de um gene mecA alvo, e (iii) um terceiro par de iniciadores que especificamente hibridiza sob condições severas a um segmento de um gene mecC alvo.
[0075] O primeiro par de iniciadores pode especificamente hibridizar ao gene spa e pode consistir de um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1 e um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 3 ou uma sonda iniciadora consistindo da SEQ ID NO: 2. O segundo par de iniciadores pode consistir de um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 4 e um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou uma sonda iniciadora consistindo da SEQ ID NO: 5. O terceiro par de iniciadores pode consistir de um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 7 e um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou uma sonda iniciadora consistindo da SEQ ID NO: 8.
[0076] O kit adicionalmente pode compreender um cartão de varredura de definição de ensaio e/ou instruções tais como instruções impressas ou eletrônicas quanto ao uso dos oligonucleotídeos em um ensaio. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para analisar uma amostra biológica para determinar a presença ou ausência de MRSA. Em algumas modalidades, um kit compreende uma mistura de reação de amplificação ou uma mistura mestra de amplificação. Os reagentes incluídos no kit podem estar contidos em um ou mais recipientes, tais como um frasco.
[0077] Os iniciadores, sondas, e/ou sondas iniciadoras específicas para a amplificação e detecção do controle interno de DNA podem ser incluídos na mistura mestra de amplificação como os pares de iniciadores alvo para monitorar a inibição potencial pela PCR. Os reagentes necessários para a amplificação e detecção de alvos e controle interno podem ser formulados como uma mistura mestra de amplificação tudo-em-um, que pode ser provida como alíquotas de reação única em um kit.
EXEMPLOS Exemplo 1
[0078] Uma amostra de esfregaço nasal é obtida de um indivíduo em dispositivo de coleta apropriado. 50 μl de amostra de esfregaço nasal não processado são carregados diretamente em um poço de amostra de cunha 1 de um Disco de Amplificação Direta SIMPLEXA (Focus Diagnostics, Inc., Cypress, CA, USA) sem uma etapa de preparação de espécimen front-end separada. 50 μl de Mistura mestra de amplificação são pipetados dentro do poço de reação de cunha 1 do disco, em que a mistura mestra de amplificação contém tampão de PCR, DNA polimerase, dNTPs, cloreto de magnésio, cloreto de potássio, sulfato de amônio, iniciadores consistindo das SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 e 8 e um fragmento de DNA de controle interno e um par de iniciadores específicos para os fragmentos de controle. Os iniciadores consistindo das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8 são sonda iniciadoras SCORPION e são rotuladas com FAM (SEQ ID NO: 2) ou CFR610 (SEQ ID NOs: 6 e 8).
[0079] A cunha é selada com folha e o Disco de Amplificação Direta é depois inserido em um Ciclador Integrado 3M® (3M, St. Paul, MN, USA) e a RT-PCR começa no ciclador. As condições de ciclagem de PCR incluem as seguintes etapas: i) pré-aquecimento da amostra a 97oC, 480 segundos, 1 ciclo ii) ativação da polimerase a 97oC, 120 segundos, 1 ciclo iii) Desnaturação a 97oC, 10 segundos e recozimento a 58oC, 30 segundos por 37 ciclos.
[0080] O DNA genômico alvo é especificamente amplificado e simultaneamente detectado pela sonda iniciadora rotulada fluorescente na mesma reação. A presença de MRSA é determinada pelo seguinte algoritmo de MRSA, que fornece os resultados finais pelo emparelhamento do limiar de ciclo (Ct) no FAM e canais de CFR610:
[0081] Uma amostra com sinal em FAM e canais de CFR610 é interpretado como MRSA se: 1) Ct de SA (canal de FAM) - Ct de mecA_C (canal de CFR610) < 1,9, ou 2) Ct de SA (canal de FAM) - Ct de mecA_C (canal de CFR610) > 1,9 e Ct de mecA_C (canal de CFR610) +1,9 < Ct de SA (canal de FAM)
[0082] Uma amostra com sinal em FAM e canais de CFR610 é interpretada como SA, resistente à meticilina se: 1) Ct de SA (canal de FAM) - Ct de mecA_C (canal de CFR610) < 1,9 e Ct de SA (canal de FAM) +1,9 < Ct de mecA_C (canal de CFR610)
[0083] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence.
[0084] As invenções ilustrativamente aqui descritas podem ser adequadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui divulgadas. Adicionalmente, os termos e expressões aqui utilizadas foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir nenhum dos equivalentes dos traços mostrados e descritos ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.
[0085] Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção fosse especificamente divulgada pelas modalidades preferidas e traços opcionais, modificação, melhoria e variação das invenções nela incorporadas aqui divulgadas podem ser utilizadas por aqueles habilitados na técnica, e que tais modificações, melhorias e variações são consideradas estar dentro do escopo desta invenção. Os materiais, métodos, e exemplos aqui fornecidos são representativo das modalidades preferidas, são exemplares, e não são intencionadas como limitações no escopo da invenção.
[0086] A invenção foi aqui descrita ampla e genericamente. Cada uma das espécies mais limitadas e agrupamentos subgenéricos que caem dentro da divulgação genérica também formam parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa que remove qualquer matéria objeto do gênero, independente de se o material excisado é especificamente aqui citado ou não.
[0087] Além disso, onde traços ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a invenção também é deste modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.
[0088] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporadas por referência na sua totalidade, no mesmo grau como se cada uma fosse incorporada por referência individualmente. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, controlarão.
[0089] Outras modalidades são apresentadas dentro das seguintes reivindicações.

Claims (10)

1. Método para determinar a presença ou ausência de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contactar a amostra biológica com: (i) um primeiro par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus, se presente, (ii) um segundo par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico mecC alvo, se presente, e (iii) um terceiro par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico mecA alvo, se presente, para produzir uma mistura de amostra de reação, em que pelo menos um iniciador de cada par de iniciadores é associado a um traçador fluoróforo, (b) submeter a mistura de amostra de reação a condições de reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real sob as quais cada um dos ácidos nucleicos alvo presentes na amostra biológica é amplificado para produzir um sinal fluorescente, (c) medir a quantidade de sinal fluorescente produzido por cada fluoróforo, e (d) determinar a presença ou ausência de MRSA comparando a quantidade de fluorescência do ácido nucleico alvo específico de S. aureus e dos ácidos nucleicos alvos mecA e/ou mecC, por meio dos quais (i) MRSA é determinada como presente na amostra biológica quando um sinal fluorescente é detectado tanto para ácido nucleico alvo específico para S. aureus quanto para ácidos nucleicos mecA e/ou mecC e (1) o limite de ciclo (Ct) dos ácidos nucleicos alvos específicos para S. aureus é igual ao Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC ± 1,9, ou (2) o Ct do ácido nucleico alvo específico para S. aureus não é igual ao Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC ± 1,9, e o Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC mais 1,9 < Ct do ácido nucleico alvo específico para S. aureus; (ii) S. aureus e um gene de resistência à meticilina são determinados como presentes na amostra biológica quando um Ct é detectado tanto para o ácido nucleico alvo específico para S. aureus quanto para os ácidos nucleicos mecA e/ou mecC, o Ct do ácido nucleico alvo específico para S. aureus não é igual ao Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC ± 1,9, e o Ct do ácido nucleico alvo específico para S. aureus mais 1,9 < o Ct dos ácidos nucleicos mecA e/ou mecC; e (iii) S. aureus é determinada como presente e MRSA é determinada como ausente na amostra biológica se um sinal fluorescente é detectado para a sequência de ácido nucleico alvo específico para S. aureus, mas nenhum sinal fluorescente é detectado para mecA e mecC.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um iniciador de cada par de iniciadores é uma sonda de iniciador que compreende um elemento de sequência de sonda na extremidade 5’ do iniciador, em que o elemento de sequência de sonda compreende adicionalmente um fluoróforo e um inibidor, e em que o fluoróforo do iniciador mecA e o fluoróforo do iniciador mecC são idênticos.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que todos os pares de iniciadores estão contidos em uma mistura mestre de amplificação compreendendo adicionalmente polimerase de DNA, dNTPs e tampão de PCR antes do contato com a amostra biológica.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende adicionalmente contactar a amostra biológica com um quarto par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico alvo controle.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus compreende toda ou uma porção de uma sequência de genes selecionada do grupo que consiste em: spa, agr, protease ssp, sir, sodM, cap, coa, alfa hemolisina, gama hemolisina, femA, Tuf, sortase, proteína de ligação a fibrinogênio, clfB, srC, sdrD, sdrE, sdrF, sdrG, sdrH, sintetase NAD, sar, sbi, rpoB, girase A e orfX.
6. Kit para determinar a presença ou ausência de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um primeiro par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico alvo específico para Staphylococcus aureus, (ii) um segundo par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico mecC alvo, e (iii) um terceiro par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para um segmento de um ácido nucleico mecA alvo, em que um iniciador de cada par de iniciadores é uma sonda de iniciador que compreende um elemento de sequência de sonda na extremidade 5’ do iniciador, em que o elemento de sequência de sonda compreende adicionalmente um fluoróforo e um inibidor, e em que o fluoróforo do iniciador mecA e o fluoróforo do iniciador mecC são idênticos, em que o primeiro par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 1 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 3, o segundo par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 4 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 6, e o terceiro par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 7 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 9.
7. Kit de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições rigorosas para uma sequência de gene controle.
8. Kit de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os pares de iniciadores estão presentes juntos em uma mistura mestre de amplificação compreendendo adicionalmente polimerase de DNA, dNTPs e tampão de PCR.
9. Método de acordo com a reivindicação 2 ou o kit de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sonda de iniciador do primeiro par de iniciadores compreende um fluoróforo de amidita de fluoresceína e as sondas de iniciador do segundo par de iniciadores e do terceiro par de iniciadores compreendem um corante xantena que fluoresce na região vermelha do espectro visível.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro par de iniciadores consiste de um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 1 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 3, o segundo par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 4 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 6, e/ou o terceiro par de iniciadores consiste em um primeiro iniciador compreendendo SEQ ID NO: 7 e um segundo iniciador compreendendo SEQ ID NO: 9.
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