ES2537189T3

ES2537189T3 - Detección de estafilococos áureos resistentes a la meticilina

Info

Publication number: ES2537189T3
Application number: ES12815869.8T
Authority: ES
Inventors: Irina A. Afonina; Yevgeniy S. Belousov; Walt Mahoney
Original assignee: Elitech Holding BV
Current assignee: Elitech Holding BV
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: EP2801626B1; US20150275274A1; JP2014515268A; US9677142B2; DK2801626T3; CA2835283C; US9932643B2; US20170183717A1; EP2714939B1; ES2570591T3; JP6196968B2; CA2835283A1; JP2017158576A; WO2013048583A3; EP2801626A1; WO2013048583A2; DK2714939T3; EP2714939A2

Abstract

Un procedimiento para la detección de estafilococos áureos resistentes a la penicilina ("MRSA"), en una muestra, la cual contiene ácidos nucleicos, comprendiendo, el procedimiento: amplificar los ácidos nucleicos, en la muestra; y detectar ácidos nucleicos, en la muestra, los cuales comprendan genes amplificados de mecA y ldh1, en donde, la presencia de genes amplificados de mecA y de ldh1, en un factor de relación de 1 : 1, indica la presencia de estafilococos áureos resistentes a la meticilina.

Description

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SUPER T®, y A* es SUPER A®; y segundo cebador de aleta, comprende la siguiente secuencia: 5’AATAAATCATAAGCGCTTTGCCCTCAGGACG-3’ (SEQ ID NO:7), en donde, la secuencia de nucleótidos subrayada, no es complementaria a la secuencia del ldh1.

En otras formas de presentación de la presente invención, el cebador de mecA, de aleta, comprende la siguiente secuencia: GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG-3’ (SEQ ID NO:8), en donde, n = 0. En otras formas adicionales de presentación de la presente invención, el cuarto cebador de mecA, de aleta, comprende la siguiente la secuencia: GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC-3’ (SEQ ID NO:9), en donde, x = 0 , e I es 3-alquinil1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona (Super Inosine).

La muestra, se obtiene, de una forma típica, a partir de un animal el cual es sospechoso de tener una infección por SA / MRSA. De una forma preferible, el animal, es un ser humano. Los ejemplos de las muestras las cuales son apropiadas para su uso en los procedimientos en concordancia con la presente invención, incluyen, aunque no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a fluido cerebroespinal (CSF – [del inglés, cerebrospinal fluid) -], una torunda nasofaríngea, una torunda de la garganta, una torunda de una herida o una torunda rectal, una muestra de la heces, y una combinación de éstos.

Los ácidos nucleicos de los ldh1 y mecA, pueden detectarse mediante la utilización de cualquiera de los procedimientos de detección, los cuales se conocen en el arte especializado de técnica. Así, por ejemplo, la detección de estos ácidos nucleicos, puede llevarse a cabo después de haberse completado una reacción de amplificación (tal como, por ejemplo, mediante la utilización de bromuro de etidio, en un gel de agarosa), o de una forma simultánea, durante la reacción de amplificación (“detección a tiempo real”). Véase, a dicho efecto, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, - Cebadores de PCR -, Dieffenbach et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2003); McPherson et al., PCR Basics, 2000, - Conceptos básicos de la PCR, 2000 -; y Rapid Cycle Real-time PCR Methods and Applications: Quantification, - Procedimientos y aplicaciones de PCR tiempo real, de ciclo rápido: Cuantificación -, Wittwer et al. (eds.), Springer-Verlag (2004). De una forma preferible, los ácidos nucleicos del SA y del MRSA, amplificados, se detectan mediante la hibridación a una sonda, la cual se una, de una forma específica, a un ácido nucleico del SA ó del MRSA, amplificados. En ciertos casos, el ácido nucleico del ldh1 o del mecA, amplificados, pueden detectarse mediante la utilización de una o de dos sondas de generación de fluorescencia. Las sondas de generación de fluorescencia, incluyen a las sondas, las cuales se segmentan para liberar fluorescencia (tales como, por ejemplo, las consistentes en las sondas Taqman, Centaurus, etc.), a los compuestos de unión de ácidos nucleicos, (tales como, por ejemplo, los que se dan a conocer en las patentes estadounidenses U S nº 5. 994. 056, U S nº 6. 171. 785, y U S nº 6. 569. 627; y en Bengtsson et al., Nucl. Acids Res., 31: e45 (2003)), a las sondas basadas en la hibridación (tales como, por las de MGB Eclipse, Molecular Beacons, Pleiades, Centaurus, etc.), y por el estilo. En determinadas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, el ácido nucleico de los SA ó MRSA, se detecta mediante la utilización de uno o de más compuestos fluorescentes que se unen a uno o más ácidos nucleicos (talles como por ejemplo, los consistentes en el SYBR® Green 1 (de procedencia de la firma Molecular Probes; Eugene, OR), BOXTOX, BEBO (de procedencia de la firma TATAA Biocenter; Gotenborg, Suecia), etc.).

En una forma de presentación de la presente invención, el ácido nucleico del ldh1 ó del mecA, se detecta mediante la utilización de una sonda de generación de fluorescencia, la cual hibrida a ambos, bien ya sea el ácido nucleico ldh1 ó el ácido nucleico del mecA, y una o más bases de ácido nucleico, de por lo menos una secuencia del cebador de aleta (de una forma típica, la porción complementaria, Y). Así, por ejemplo, la sonda de generación de fluorescencia, puede hibridar al ácido nucleico SA, y a una o más bases de nucleótidos, de la secuencia del cebador de aleta de retroceso (inverso), o de una forma simultanea, a una o más bases de nucléotidos, de ambas secuencias, las secuencias del cebador de aleta, de avance y del cebador inverso, de retroceso. La sonda de generación de fluorescencia, puede hibridar, de una forma opcional, al ácido nucleico del ldh1 ó del mecA, y a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 bases de nucleótidos, de por lo menos una secuencia del cebador de aleta, de una forma particular, la porción complementaria (Y) de un cebador de eleta.

En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, la sonda de generación de fluorescencia, para el gen ldh1, comprende la siguiente secuencia:

5’-Ra-G*ACATTACT*T*GA*ACAA*CG-Rb-5’ (SEQ ID NO:10),

en donde, Ra, se selecciona, de una forma independiente, de entre (M)a-Fl y (M)a-Q, Rb se selecciona, de una forma independiente, de entre (M)a-Fl y (M)a-Q, y M es un ligando de surco menor, a es 0 ó 1, F1 es un fluoróforo con una longitud de onda de emisión, correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre los 400 nm y los 900 nm, G* es 6-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona (SUPER G®, Elitech Group – [Grupo Elitech] -), y Q es un extintor no fluorescente, con la condición de que, la sustitución de Ra y de Rb, permita la extinción de la fluorescencia, cuando la sonda, se encuentra en estado no hibridado.

En otra forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, la sonda de generación de fluorescencia, para el gen mecA, comprende la siguiente secuencia:

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5’-Ra- G*AAAGGATCTGTACTGG*G-Rb-5’ (SEQ ID NO:11),

en donde, Ra, se selecciona, de una forma independiente, de entre (M)a-Fl y (M)a-Q, Rb se selecciona, de una forma independiente, de entre (M)a-Fl y (M)a-Q, y M es un ligando de surco menor, a es 0 ó 1, F1 es un fluoróforo con una longitud de onda de emisión, correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre los 400 nm y los 900 nm, G* es SUPER G®, (Elitech Group – [Grupo Elitech] -), y Q es un extintor no fluorescente, con la condición de que, la sustitución de Ra y de Rb, permita la extinción de la fluorescencia, cuando la sonda, se encuentra en estado no hibridado.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, Ra, en la SEQ ID NO:10 es (M)a-Fl, en donde, M es DPI3, F1 es Aquaphlour™ 554, y Q es el extintor consistente en el “Eclipse® Dark Quencher” y la SEQ ID NO:11, Ra en la SEQ ID NO:11 es (M)a-Fl, en donde, M es DPI3, Fl es FAM y Q es el extintor consistente en el Eclipse® Dark.

Los cebadores preferidos, en concordancia con la presente invención, pueden incorporar características y rasgos distintivos adicionales, los cuales permiten la detección o la inmovilización del cebador, pero los cuales no modifican la propiedad básica del cebador, tal como, por ejemplo, la propiedad consistente en actuar como un punto de iniciación de la síntesis de los ácidos nucleicos. En determinados casos, los cebadores en cuestión, contienen una o más bases no naturales, o bases modificadas, en ambas regiones de la secuencia del cebador, las regiones de la secuencia complementaria del cebador, y las regiones de la secuencia no complementaria del cebador.

En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, la amplificación, se lleva a cabo mediante la utilización de una polimerasa. La polimerasa, puede tener, aunque no de una forma necesaria, actividad nucleasa 5’. En determinados casos distintos a éste, la extensión del cebador, se lleva a cabo mediante la utilización de la transcriptasa inversa y, la amplificación, se lleva a cabo mediante la utilización de una polimerasa.

En otra forma de presentación, en concordancia con la presente invención, las secuencias de los cebadores, se solapan, en donde, la estabilidad del dúplex de las secuencias de solapado, es inferior a la estabilidad de los dúplexes de los cebadores individuales, objetivizados como diana.

En otro aspecto, en concordancia con la presente invención, se proporcionan procedimientos, para proceder a la detección simultánea de ácidos nucleicos, a partir de una pluralidad de S. aureus, en una muestra, comprendiendo, los procedimientos:

(a): contactar una muestra, la cual se sospecha que contiene ácidos nucleicos de S. aureus, con:

(i): un primer cebador de aleta, el cual comprende la siguiente secuencia: 5’-AATAAATCATAAGGT*GA*ACA*TGGTGACACTGAAT-3’ (SEQ ID NO:6, en donde, la secuencia de nucleótidos, la cual se encuentra subrayada, no es complementaria a la secuencia del ldh1, y A* es SuperA®, y T*, es bases modificadas con Super T®; y

(ii): un segundo cebador de aleta, el cual comprende la siguiente secuencia: 5’-AATAAATCATAAGCGCTTTGCCCTCAGGACG-3’ (SEQ ID NO:7), en donde, la secuencia de nucleótidos la cual no se encuentra subrayada, no es complementaria a la secuencia del ldh1.

(b): incubar la mezcla de reacción de etapa (a), en unas condiciones las cuales sean suficientes como para amplificar el ácido nucleico del ldh1, generando con ello ácidos nucleicos amplificados, a partir de una muestra la cual contiene SA; y

(c): detectar los ácidos nucleicos amplificados del SA.

En el procedimiento en concordancia con la presente invención, para la detección simultánea de ácidos nucleicos, puede procederse a añadir una etapa adicional, después de la etapa (a), de contactar la muestra, después de la etapa (a), en la cual, la mezcla de la etapa (a) se contacta con:

(i): un tercer cebador de aleta, el cual comprende una secuencia de la SEQ ID NO:8, GTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCG; y

(ii): un cuarto cebador de aleta, el cual comprende una segunda secuencia de la SEQ ID NO:9, GGTTACGGACAAGGTGAAATAITGATTAACC, en donde, I, es 3-alquinil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona (Super Inosine – [Super Inosina] -), en donde, los cebadores consistentes en el tercer y cebador de eleta y el cuarto cebador de aleta, comprenden, cada uno de ellos, un porción de secuencia, la cual complementaria a al ácido nucleico del mecA.

En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, los cebadores y las sondas para la detección de los mecA, ldh1, y el control se multiplexan. Cada una de las sondas, se marca de una forma

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Los cebadores y las sondas, en concordancia con la presente invención, se preparan, de una forma general, mediante la utilización de procedimientos en fase sólida, los cuales son conocidos por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica. De una forma general, los materiales de partida, se encuentran comercialmente disponibles en el mercado, o bien, éstos pueden prepararse de una forma fácil y directa, a partir de materiales de partidas comercialmente disponibles en el mercado, mediante la utilización de apropiadas manipulaciones de grupos funcionales apropiados, de la forma la cual se describe, por ejemplo, por parte de Marchet al., en ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY - Reactions, Mechanisms and Structures, 4th ed., - QUÍMICAORGÁNICA AVANZADA – Reacciones, mecanismos y estructuras, 4º Edición -, John Wiley & Sons, New York, NY (1992).

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, los cebadores y las sondas, pueden comprender cualesquiera nucleótidos de origen natural, cualesquiera nucleótidos de origen no natural, o cualesquiera nucleótidos modificados los cuales sean conocidos en el arte de la técnica especializada (véase, a dicho efecto, la publicación de patente estadounidense U S nº 2005 0 118 623; y la patente estadounidense U S nº

6. 949. 367).

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, los cebadores y las sondas, pueden comprender bases universales o promiscuas.

Las bases modificadas, en concordancia con la presente invención, se consideran como siendo aquéllas las cuales difieren de las bases de origen natural, mediante la adición o mediante la eliminación de uno o de más grupos funcionales, diferencias en la estructura del anillo heterocíclico (a saber, la sustitución del carbono, por un heteroátomo, o viceversa), y / o la unión de una o de más estructuras de brazos de engarce, a la base. Los nucleótidos modificados los cuales se prefieren, son aquéllos los cuales están basados en una estructura de pirimidina o en una estructura de purina, siendo éstos últimos, de una forma mayormente preferible, las 7desazapurinas y sus derivados y las pirazolopirimidinas (las cuales se encuentran descritas en las referencia de las cual son co-propietarios lo solicitantes, consistentes en la RE 38. 416; la publicación de patente estadounidense U S nº 2005 0 118 623, y la patente estadounidense U S nº 6. 127. 121). Se incluyen, en las bases modificadas, aquéllas las cuales difieren de las bases de origen natural, en donde, la estructura de la cadena del azúcar, se encuentra modificadas (véase, a dicho efecto, la patente europea EP nº 1 314 734), las bases universales (véase, a dicho efecto, el documento de prioridad de patente PCT de la publicación de patente internacional nº WO 02 / 062 816), y las bases promiscuas (véase, a dicho efecto, la patente estadounidense U S nº 7. 348. 146).

La bases modificadas ejemplares, incluyen, aunque no de una forma limitativa en cuanto a éstas, al análogo de guanina consistente en la 6-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4(5H)-ona (ppG ó PPG, al cual se le hace también referencia como SUPER G®) y al análogo de adenina consistente en la 4-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (ppA ó PPA). Puede también utilizarse, así mismo, el análogo de santeño consistente en la 1H-pirazolo[5,4-d]pirimidin4(5H)-6(7H)-diona (ppX). Éstos análogos de bases, cuando se encuentran presentes en un oligonucleótido, consolidan o afianzan la hibridación, y mejoran la discriminación de los malapereamientos o divergencias. Todas las formas de las bases de origen natural, de las bases modificadas, y de los análogos de las bases, pueden encontrarse incluidas en los conjugados de oligonucleótidos. Otras bases modificadas, las cuales son de utilidad en los presentes procedimientos, en concordancia con la invención, incluyen a las consistentes en la 6-amino-3-prop-1inil-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidina-4-ona (PPPG); la 6-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidina4-ona (HOPPPG); la 6-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidina-4-ona (NH2PPPG); la 4-amino-3(prop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina (PPA); la 4-amino-3-(3-hidroxiprop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina (HOPPPA); la 4-amino-3-(3-aminoprop-1-inil)pirazolo[3,4-d]pirimidina (NH2PPPA); la 3-prop-1-inilpirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6diamino ((NH2)2PPPA); la 2-(4,6-diaminopirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)etin-1-ol ((NH2)2PPPAOH); la 3-(2-aminoetinil)pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diamina ((NH2)2PPPANH2); la 5-prop-1-inil-,3-dihidropirimidina-2,4-diona (PU); la 5-(3hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidina-2,4-diona (HOPU); la 6-amino-5-prop-1-inil-3-dihidropirimidina-2-ona (PC); la 6-amino-5-(3-hidroxiprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidina-2-ona (HOPC); la 6-amino-5-(3-aminoprop-1-inil)-1,3-dihidropirimidina-2-ona (NH2PC); la 5-[4-amino-3-(3-metoxiprop-1-inil)pirazol[3,4-d]pirimidinil]-2-(hidroximetil)oxolan-3-ol (CH3OPPPA); la 6-amino-1-[4-hidroxi-5-(hidroximetil)oxolan-2-il]-3-(3-metoxiprop-1-inil)-5-hidropirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona,(CH3OPPPG); la 4,(4,6-Diamino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-but-3-in-1-ol (SUPER A®); la 6amino-3-(4-hidroxi-but-1-inil)-1,5-dihidro-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ona; la 5-(4-hidroxi-but-1-inil)-1H-pirimidina-2,4diona (SUPER T®); la 3-yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diamina ((NH2)2PPAI); la 3-bromo-1H-pirazolo[3,4d]pirimidina-4,6-diamina ((NH2)2PPABr); la 3-cloro-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diamina ((NH2)2PPACl); la 3yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina (PPAI); la 3-Bromo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina (PPABr); y la 3cloro-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamina (PPACl).

De una forma adicional a las bases modificadas, las cuales se han listado anteriormente, arriba, los oligonucleótidos, pueden tener una estructura de la cadena de azúcar o de porciones glicosídicas, consistiendo éstas, de una forma preferible, en los 2-desoxirribofuranósidos, en donde, los engarces o ligandos internucleótidos, son los engarces de fosfodiéster, de origen natural. Si embargo, no obstante, en formas alternativas de presentación, en concordancia con la presente invención, los grupos de 2-desoxi-β-D-ribofuranosa, se encuentran reemplazados por otros azúcares, tales como, por ejemplo, la β-D-ribofuranosa. De una forma adicional, puede encontrarse presente la β-D

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La localización del ligando de sonda menor, dentro del conjugado ligando de surco menor – oligonucleótido, puede también afectar, así mismo, a las propiedades discriminatorias de tales tipos de conjugados. Una región no apareada, dentro de un dúplex, tendrá como resultado cambios en la forma del surco menor, en la vecindad de la base o de las bases de apareamiento fallido. Puesto que, los ligandos del surco menor, se adaptan, de la mejor forma, en el interior del surco menor de un dúplex de DNA apareado de una forma perfecta, los desapareamientos o apareamientos fallidos resultantes en cambios de forma, en el surco menor, reducirían la fuerza de unión de un ligando de surco menor, a una región la cual contiene el desapareamiento o apareamiento fallido. Así, de este modo, la capacidad de un ligando de surco menor, para estabilizar al tipo de híbrido, disminuiría, incrementando con ello la capacidad del conjugado de oligonucleótido ligando de surco menor, para discriminar un desapareamiento o apareamiento fallido, de un dúplex perfectamente apareado. Por otro lado, si un apareamiento fallido cae fuera de la región complementaria a un conjugado oligonucleótido ligando de surco menor, se espera entonces el hecho de que, la capacidad descriminatoria para oligonucleótidos no conjungados y conjugados a ligandos de surco menor, de igual longitud, sea aproximadamente la misma. Puesto que, la capacidad de una sonda de oligonucleótidos para discriminar desapareamientos o apareamientos fallidos de pares de bases individuales, depende de su longitud, los oligonucleótidos más cortos, son más efectivos en la discriminación de desapareamientos o apareamientos fallidos. La principal ventaja del uso conjugados oligonucleótidos ligandos de surco menor, en este contexto, reside en el hecho consistente en que pueden utilizarse oligonucleótidos mucho más cortos, si éstos se comparan con aquéllos utilizados en el arte especializado anterior de la técnica (a saber, de 20 meros ó más cortos), los cuales tienen una potencia descriminatoria mayor, debido al pronunciado efecto de estabilización de la conjugación del ligando de surco menor.

En un grupo de formas de presentación, en concordancia con la presente invención, el ligando de sonda menor, se selecciona de entre el grupo consistente en los análogos de CC1065, las lexitropsinas, la distamicina, la netropsina, el berenil, la duocarmicina, la pentamidina, y el 4,6-diamino-2-fenilindol, y las pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepinas.

Los ligandos de surco menor, adicionalmente preferidos, son aquéllos los cuales se seleccionan de entre las fórmulas:

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en donde, el subscrito m, es un número entero, el cual puede tomar un valor que va de 2 a 5; el subscrito 4, es un número entero, el cual puede tomar un valor que va de 2 a 10; y cada una de las Ra y Rb es, de una forma independiente, un grupo de unión al oligonucleótido (bien ya sea de una forma directa, o bien ya sea de una forma indirecta, mediante un extintor, H, -ORc, -NRcRd, -COORc ó -CONRcRd, en donde, cada una de las Rc y Rd, se selecciona de entre H, heteroalquilo (C2-C12) heteroalquenilo (C3-C12), heteroalquinilo (C2-C12) alquilo (C1-C12), alquenilo (C2-C12), alquinilo (C2-C12), ariloalquilo (C2-C12) y arilo, con la condición de que, una de las Ra ó Rb, represente un grupo de unión a ODN ó Q. En una forma de presentación adicional, en concordancia con la presente invención, cada uno de los anillos, en cada estructura, puede contener una o más sustituciones adicionales,

-

seleccionados de entre H, halógeno, alquilo (C1-C8), ORg, N(Rg)2, N+(Rg)3, SRg,CORg, CO2Rg, CON(Rg)2, P03 (CH2)mSO3-, (CH2)mCO2-, (CH2)mOPO3-2, y NHC(O)(CH2)mCO2-, y ésteres y sales de éstos, en donde, cada Rg es, de una forma independiente, H ó alquilo (C1-C8), y el subscrito m, es un número entero,, el cual puede tomar un valor de 0 a 6. El símbolo Rh, representa H ó un grupo (de una forma típica, el vestigio o resto de un grupo de unión, utilizado en la síntesis de fase sólida), el cual tiene 1 – 30 átomos, seleccionado de entre C, N, O, P, y S, el cual es, bien ya sea cíclico, bien ya sea cíclico, o bien ya sea una combinación de entre éstos, y que tiene átomos de hidrógeno adicionales, para satisfacer y cubrir las valencias disponibles.

Los ligandos de surco menor los cuales se prefieren de una forma particular, incluyen al trímero de 3-carbamoil-1,2dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato (CDPI3) a la dihidrociclopirroloindol-triamida sustituida (DPI3), al pentámero de N-metilpirrolo-4-carbox-2-amida (MPC5), y a otros ligandos de surco menor, los cuales exhiben una discriminación incrementada de desapareamientos o apareamientos fallidos. Porciones adicionales de ligandos de surco menor, las cuales encontrarán un uso, en concordancia con la presente invención, son las que se dan a conocer en la patente estadounidense US nº 5. 801. 155. En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, los ligandos de surco menor, pueden tener, unidos, grupos que intensifican o mejoran la solubilidad en el agua (tales como, por ejemplo, los azúcares, los aminoácidos, los ácidos carboxílicos ó los sustituyentes del ácido sulfónico, y por el estilo). Véase, a dicho efecto, por ejemplo la RE 38. 416; y la patente estadounidense US nº 7. 582. 739.

Los procedimientos de detección recientemente desarrollados, emplean el procedimiento de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), para la detección de la hibridación de las sondas, en lugar de la detección directa de la intensidad de fluorescencia. En este tipo de ensayo, la FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, acontece entre un fluróforo donante (reportero), y una molécula aceptora (extintor), cuando el espectro de absorción de la molécula extintora, se solapa con el especto de emisión del fluoróforo

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Tabla 2

SEQ ID: Nombre del Componente Oligo-secuencia 1X final

6: LDH - L12 imagen21 0,500 µM

7: LDH – E4 imagen22 1,260 µM

8: MEC – L4 imagen23 0,500 µM

9: MEC – E6 imagen24 1,260 µM

10: LDH – AP554 – 5 imagen25 0,500 µM

11: MEC – FAM 3 imagen26 0,200 µM

13: E6132 – 642 - 3 imagen27 0,200 µM

14: E6132 - E imagen28 0,100 µM

15: E6132-L CTGCACGGACCAGTTACTTTACG 0,300 µ/M

16: 16 dT(8) - AP593 Referencia Pasiva TTTTTTTT - AP593 0,035 µM

10 X PCR Mezcla máster: NA 1,00 X

10 X PCR Potenciador: NA 1,00 X

Biolgía molecular, Grado acuoso: NA NA

Se procede a introducir veinte microlitros de mono – reactivo, en una placa de PCR de 96 pozos, con 10 µl del ácido

5 nucleico de muestra. El ácido nucleico de muestra, se obtiene mediante la extracción con un sistema automatizado de extracción múltiples, del tipo easyMAG mediante la utilización de reactivos de extracción del tipo “NucliSENSE easyMAG extraction reagents” y de las instrucciones facilitadas por el fabricante (Biomieurex, l’Etoile, Francia). La placa, se sella, con una película adhesiva del tipo “MicroAmp® Optical Adhesive Film” (de la firma Applied Biosystems, Foster City, CA) y, a continuación, ésta se centrifuga,, con objeto de recolectar las solución de ensayo, en el

10 fondo del pozo de la placa. Se procede, a continuación, la llevar a cabo la realización del ensayo, en una máquina de PCR a tiempo real, del tipo “ABI 7500 DX Fast Block Real-time PCR machine” mediante la utilización del protocolo, cuyos datos se encuentran descritos en la Tabla 3, la cual se facilita abajo, a continuación.

Tabla 3 Protocolo de la máquina de PCR a tiempo real, del tipo “ABI 7500 DX Fast Block Real-time PCR machine” 15

Etapa: Tiempo Temperatura

UNG: 2 minutos 50 °C

Desnaturalización: 2 minutos 93 °C

Ciclación de la PCR (45 X): 10 segundos 93 °C

30 segundos: 56° C

20 segundos: 72 °C

Tiempo real: 1 hora y 10 minutos

EJEMPLO 1

En este ejemplo, se establece el criterio para la identificación de los RMSA y SA, mediante la detección de los genes 20 mecA y ldh1. Puesto que, los mecA y ldh1, se encuentran presentes como genes de copia individual, en un genoma de MRSA, las cantidades relativas respectivas, deberían ser las correspondientes al mismo valor de relación o

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292: 25,22 24,59 0,63 + MRSA MRSA Sí

298: 34,19 37,66 3,47 - MSSA MSSA Sí

300: 29,16 27,98 1,18 - MSSA MSSA Sí

301: 32,18 32,34 0,16 + MRSA MSSA No

309: 24,09 25,22 1,12 + MRSA MRSA Sí

337: 27,78 26,02 1,76 - MSSA MSSA Sí

345: 28,32 28,21 0,11 - MSSA MSSA Sí

Tal y como se muestra en la tabla 4, facilitada anteriormente, arriba, las muestras 261, 300, 337 y 345, tienen aproximadamente las mismas cantidades de los marcadores de mecA y ldh1, pero son negativos para el marcador de la región puente de SCCmec. Este hecho, es indicativo para una infección mixta (MSSA y MRCoNS), la cual se

5 confirmó mediante los resultados del cultivo microbiano obtenidos.

EJEMPLO 4

Este ejemplo, ilustra la sensibilidad del ensayo, mediante la utilización de cultivo secado por congelación (es decir,

10 un cultivo liofilizado), comercialmente disponible y adquirida de procedencia de la ATCC. Éste compara también, así mismo, los valores de CqS, de la PCR a tiempo real, de la detección del ldh1, con un control interno (IC), o sin éste.

Se procedió a rehidratar y subcultivar el cultivo LN 593372 47 de la subespecie del estafilococo áureo consistente en el Staphylococcus aureus; subsp. aureus; Cepa BAA-1762, de la siguiente forma. En primer lugar se procedió a

15 añadir, al material secado por congelación (es decir, liofilizado), una cantidad de medio de caldo de cultivo tríptico de soja del tipo (Tryptic Soy Broth Medium (VWR 90000-376)), correspondiente a una cantidad comprendida dentro de unos márgenes que van desde los 0,3 ml a los 0,4 ml, adición ésta, la cual se llevó a cabo mediante un pipeta de Pasteur, y un pozo de mezcla. A continuación, se procedió a transferir la totalidad de la mezcla, a una cantidad correspondiente a 5 ml, del mismo medio de cultivo, en un tubo de ensayo, y se procedió a incubar, a una

20 temperatura correspondiente a un valor de 37 °C, durante un transcurso de tiempo de 24 horas. Se procedió a determinar la titulación volumétrica bacteriana, llevando a cabo diluciones en series correspondientes a un valor de dilución de 1/10 (es decir, a un valor de dilución 10 veces inferior), del medio de caldo de cultivo tríptico de soja. Se procedió a transferir de 100 µl de diluciones correspondientes a uno valores de dilución de 10-5, de 10-6, y de 10-7, a las placas del medio de caldo de cultivo tríptico de soja, y se procedió a incubar, durante el transcurso de toda la

25 noche, a una temperatura correspondiente a un valor de 37 ± 2°C. Se procedió a llevar a cabo un recuento de las colonias, en las placas, las cuales contenían 10 – 200 colonias, y se determinó el número de unidades de formación de colonias / ml, (CFU / ml – [CFU, del inglés, colony forming units] -), de la siguiente forma:

CFU / ml = Número de colonias x 10 x Factor de Dilución

30 Se procedió preparar dos juegos de siete diluciones correspondiente a un valor de dilución de 1/10 (es decir, dilución a la décima parte), las cuales cubrían un rango correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes de 107 – 10 CFU / ml, en un medio de colección del tipo “ESwab collection media”. Se procedió a “dopar” el primer juego de dilución, con 10 µl de Control Interno 2 (IC2 – [IC, de sus iniciales, en idioma ingles, correspondientes a

35 Internal Control] -), y dopaje éste, el cual no se llevó a cabo en el segundo juego. Ambos juegos, se extrajeron mediante la utilización un sistema de extracción automatizado del tipo “NucliSENS easyMAG automated extraction system”, y éstos se eluyeron en un volumen de 50 µl. Se procedió, a continuación, a someter a test de ensayo, mediante PCR, replicados de 10 µl, de cada muestra extraída.

40 El conjunto de los datos en blanco, las muestras negativas (SN – [del inglés, negative samples] -), (medio ESwab no estimulado (M110024)), representados, se extrajeron, por separado, mediante el mismo procedimiento, y se procedió así mismo, también, a someter a test de ensayo, 10 µl de replicados de cada muestra negativa extraída, mediante PCR, conjuntamente con las muestras de CFU. Se procedió, a continuación, a comparar los valores de CqS, de dos juegos de reacciones objetivizadas como diana, positivas, (con / sin IC).

45 La tabla 5, la cual se facilita abajo, a continuación, muestra los valores de Cqs de diluciones en serie de los cultivos de S. aureus, los cuales detectan el ldh1, el cual es un marcador de SA, en presencia o en ausencia de un control interno (IC).

50 Tabla 5

Número de muestra: CqS medios ∆ CqS medios

1e7 No IC2 / +IC2: 13,27 / 13,28 0,01

1e6 No IC2 / +IC2: 16,88 / 16,87 0,00

1e5 No IC2 / +IC2: 20,38 / 20,38 -0,01

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Tal y como se ilustra en las Tablas 6 y 7, facilitadas anteriormente, arriba, la detección de los genes mecA y ldh1 detecta, de una forma específica, los MRSA y SA.

5 EJEMPLO 6

Este ejemplo, ilustra la especificidad del ensayo. Se procedió a la evaluación de éste, mediante el sometimiento, a test de ensayo, para la reactividad cruzada, para especies filogenéticamente relacionadas con S. aureus, microorganismos patogénicos y con los microorganismos usualmente presentes en una microflora nasal, normal. El 10 panel de ensayo (véase, a dicho efecto, la Tabla 8, la cual se facilita abajo, a continuación), consistía en 17 especies víricas, 3 especies fúngicas, 1 especie micoplásmica, y 41 especies bacterianas. Los microorganismos, se sometieron a tests de ensayo, como cultivos, en una concentraciones correspondientes a un valor de 1 x 106 CFU (1 x 105 PFU) / torunda (swab). De una forma adicional, se procedió así mismo, también, a someter a test de ensayo a células humanas, en una concentración correspondiente a un valor de 106 células / ml. Se encontró que, las células

15 humanas, eran negativas para los MRSA y SA. La especificidad del análisis, era el correspondiente a un valor del 100 %.

Tabla 8. Especies sometidas a test se ensayo para la Reactividad Cruzada y para la Interferencia Microbiana

Especies de Estafilococos: Otros organismos Virus

CoNS* Staphylococcus arlettae, Staphylococcus capitis, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus hominis subsp. hominis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri: Acinetobacter haemolyticus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium genitalium, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hiraem, Escherichia coli, productor de ESBL, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, productor de ESBL, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis,Pasteurella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Adenovirus Tipo 1, Adenovirus Tipo 7A, Humano coronavirus (229E), Humano coronavirus (OC43), Citomegalovirus, Coxsackievirus Tipo A21, Epstein Barr Virus, Humano influenza virus A, Humano influenza virus B, Humano parainfluenza Tipo 2, Humano parainfluenza Tipo 3, Humano metapneumovirus 3 Tipo B1, Measles, Mumps virus, Virus respiratorio sincicial Tipo B Rinovirus Tipo 1ª

Especies de Estafilococos: Otros organismos Virus

MSCoPS* Staphylococcus delphini, MSCoNS* Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosus MRCoNS* Staphylococcus epidermidis CoPS* Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius: Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens,Shigella sonnei, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Yersinia enterocolitica,Candida albicans, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Lactobacillus acidophilus, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis avirulent, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitides, Streptococcus mutans,Streptococcus pneumoniae, Streptococcuspyogenes, Homo sapiens, Células Humanas HT1080

* CoNS: Staphylococci (Estafilococos) coagulasa - negativos MSCoPS: Staphylococci (Estafilococos) coagulasa - positivos, susceptibles a la meticilina MSCoNS: Staphylococci (Estafilococos) coagulasa - negativos, susceptibles a la meticilina MRCoNS: Staphylococci (Estafilococos )coagulasa-negativos, resistentes a la meticilina CoPS: Staphylococci (Estafilococos )coagulasa – positivos

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Tabla 10

A: B C D E

1: Muestra ID# IC ldh1 mecA Test de ensayo ELITeMGB (realizado mediante Epoch) (Algoritmo)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 30,0174 30,1315 30.009 30.0331 30.1328 30.2963 30.0692 30.1117 30.1551 30.1809 30.1308 29.9252 30.0645 29.9879 31.1726 30.3026 30.6207 30.3318 30.246 50 50 37.8131 38.3301 50 23.7551 50 35.5751 50 50 26.5344 50 35.4711 50 37.0951 50 50 50 25.8525 37,7672 38, 3186 33.0587 38.3669 31.525 24.5647 36.3243 35.7861 32.1061 28.3299 27.1298 33.0466 33.3906 50 36.048 36.0029 50 30.5635 28.7516 NEG NEG NEG NEG NEG MRSA NEG NEG NEG NEG MRSA NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG SA

Situación 1:

5 E2= En el caso en el que (y que (C2 <= 35,05, ABS(C2 - D2) < 2, D2 <= 35,05), "MRSA", y en el caso en el que (y que (C2 <= 35,05, ABS(C2-D2) >=2 ), "SA","NEG") Calificación resultante: "MRSA – Negativo / SA - Negativo"

10 Situación 3: E7= En el caso en el que (y que (C7 <= 35,05, ABS(C7 - D7) < 2, D7 <= 35,05), "MRSA" y en el caso en el que (y que (C7 <= 35, 05, ABS(C7 - D7) >= 2),"SA", "NEG")) Calificación resultante: "MRSA - Positivo"

Situación 4:

15 E20= = En el caso en el que (y que (C20 <= 35,05, ABS(C20- D20) < 2, D20 <= 35,05),"MRSA", y en el caso en el que (y que (C 20 <= 35,05, ABS(C20 - D20) > =2),"SA", "NEG")) Calificación resultante: "MRSA – Negativo / SA - Positivo"

20 Situación 5:

E4 = En el caso en el que (y que (C4 <= 35,05, ABS(C4 - D4) < 2, D4 = 35,05),"MRSA" y en el caso en el que (y que (C4 <= 35,05, ABS(C4 - D4) >= 2),"SA","NEG")) Calificación resultante: "MRSA – Negativo / SA - Negativo".

25 Debería tomarse debida nota, en cuanto al hecho de que, no se proporciona un ejemplo de la Situación 2, debido a la ausenta de un resultado inválido (no válido) en la Tabla 10.

REFERENCIAS

30 Documentos de patente estadounidenses U S nº 3. 194. 805: U S nº 3. 128. 179; U S nº 3. 996. 345; U S nº 4. 351. 760; U S nº 4, 683. 195; U S nº 4. 683. 202; U S nº 4. 965. 188; U S nº 5. 187. 288; U S nº 5. 188. 934; U S nº 5. 227. 487, U S nº 5. 248. 782; U S nº 5. 304. 645; U S nº 5. 433. 896; 5. U S nº 442. 045; U S nº 5. 492. 806; U S nº 5. 525. 464; U S nº 5. 556. 752; U S nº 5. 556. 959; U S nº 5. 583. 236; U S nº 5. 808. 044; U S nº 5. 852. 191; U S nº 5. 986. 086; U S nº 5. 994. 056; 6. 020. 481; U S nº 6. 127. 121; U S nº 6. 156. 507; U S nº 6. 162. 931; U S nº 6. 171. 785;

35 U S nº 6. 180. 295; U S nº 6. 221. 604; U S nº 6. 569. 627; U S nº 6. 727. 356; U S nº 6. 790. 945; U S nº 6. 946. 267; U S nº 6. 949. 367; U S nº 7. 348. 146; U S nº 7. 671. 218; U S nº 7.767. 834; U S nº 7. 838. 221; RE 38. 416.

Publicación de patente estadounidense U S nº 2005 / 0 118 623.

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Claims

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