JPH0654700A - 耐性菌の高感度検出法 - Google Patents
耐性菌の高感度検出法Info
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- JPH0654700A JPH0654700A JP15014892A JP15014892A JPH0654700A JP H0654700 A JPH0654700 A JP H0654700A JP 15014892 A JP15014892 A JP 15014892A JP 15014892 A JP15014892 A JP 15014892A JP H0654700 A JPH0654700 A JP H0654700A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 メチシリン耐性ブドウ球菌の高感度の検出方
法を提供することにある。 【構成】 【効果】 従来の方法よりも少なくとも１００倍検出感
度を高めることができた。
法を提供することにある。 【構成】 【効果】 従来の方法よりも少なくとも１００倍検出感
度を高めることができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、耐性菌特にメチシリン
耐性境界耐性ブドウ球菌の高感度検出方法に関する。即
ちメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌ
ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ，以下ＭＲＳＡ）およびメチシリン
耐性コアグラ−ゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺伝要素で
あるｍｅｃＡ遺伝子の検出のための簡便でかつ高感度の
検出方法に関する。
耐性境界耐性ブドウ球菌の高感度検出方法に関する。即
ちメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌ
ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ，以下ＭＲＳＡ）およびメチシリン
耐性コアグラ−ゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺伝要素で
あるｍｅｃＡ遺伝子の検出のための簡便でかつ高感度の
検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＭＲＳＡは世界中で院内感染の主要な原
因となっている。臨床研究室において、その正確な同定
は感染患者の診断と治療に重大な課題となってきてい
る。ＭＲＳＡによるＰＢＰ２’（βラクタム系の抗生物
質への結合飽和力の弱い特異的なペニシリン結合蛋白
質）の産生（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ：ＦＥＢＳ ｌｅ
ｔｔ．；１９８０，１２２，２７５−２７８．Ｕｔｓｕ
ｉ．ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９８５，２８，３９７−４
０３）及びゲノム上のＰＢＰ２’コ−ディング遺伝子で
あるｍｅｃＡの存在は良く証明されている（Ｈｉｒａｍ
ａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９９０，３４，６０
０−６０４、Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ：Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：１９８６，１６７，９７５−９
８０、Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ：ＥＦＢＳ ｌｅｔｔ．；
１９８７，２２１，１６７−１７１、Ｕｔｓｕｉ，ｅｔ
ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ．；１９８５，２８，３９７−４０３）し
かしながらＭＲＳＡの中には「多相性（異質性）」と定
義される独特の発現様式を示す菌株が見受けられる。こ
れらの菌株ではメチシリンに対して低ＭＩＣ（最低阻害
濃度）値を示す（＜６．２５μｇ／ｍｌ）が、１×１０
-4から１×１０-7の割合で高い抵抗性を示す（ＭＩＣ≧
１００）潜在クロ−ンが含まれている（Ａｎｎｅａｒ：
Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．；１９６８，１，４４４−４４
６）。この現象は、臨床研究室でのＭＲＳＡの固定に問
題を投げかけている。
因となっている。臨床研究室において、その正確な同定
は感染患者の診断と治療に重大な課題となってきてい
る。ＭＲＳＡによるＰＢＰ２’（βラクタム系の抗生物
質への結合飽和力の弱い特異的なペニシリン結合蛋白
質）の産生（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ：ＦＥＢＳ ｌｅ
ｔｔ．；１９８０，１２２，２７５−２７８．Ｕｔｓｕ
ｉ．ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９８５，２８，３９７−４
０３）及びゲノム上のＰＢＰ２’コ−ディング遺伝子で
あるｍｅｃＡの存在は良く証明されている（Ｈｉｒａｍ
ａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９９０，３４，６０
０−６０４、Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ：Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：１９８６，１６７，９７５−９
８０、Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ：ＥＦＢＳ ｌｅｔｔ．；
１９８７，２２１，１６７−１７１、Ｕｔｓｕｉ，ｅｔ
ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ．；１９８５，２８，３９７−４０３）し
かしながらＭＲＳＡの中には「多相性（異質性）」と定
義される独特の発現様式を示す菌株が見受けられる。こ
れらの菌株ではメチシリンに対して低ＭＩＣ（最低阻害
濃度）値を示す（＜６．２５μｇ／ｍｌ）が、１×１０
-4から１×１０-7の割合で高い抵抗性を示す（ＭＩＣ≧
１００）潜在クロ−ンが含まれている（Ａｎｎｅａｒ：
Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．；１９６８，１，４４４−４４
６）。この現象は、臨床研究室でのＭＲＳＡの固定に問
題を投げかけている。
【０００３】更に、ｍｅｃＡ欠失にもかかわらずメチシ
リン耐性を示す耐性境界菌群（ＭｃＤｏｕｇａｌ，ｅｔ
ａｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；１９８
６，２３，８３２−８３９）の存在により、ＭＳＳＡ
（メチシリン感受性 Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのＭＲＳ
Ａの識別はより曖昧となっている。むしろ、これらｍｅ
ｃＡ欠失菌株では、ペニシリナーゼの過剰生産（Ｍｃ
Ｄｏｕｇａｌ， ｅｔａｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．；１９８６，２３，８３２−８３９）やＰＢ
Ｐ１、ＰＢＰ３のペニシリン結合飽和力の低下、ＰＢＰ
４のペニシリン結合飽和力の増加（Ｔｏｍａｓｚ， ｅ
ｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９８９，３３，１８６９−１８
７４）といったＰＢＰの変異によるメチシリン感受性の
低減がみられる。ＭｕｒａｋａｍｉはＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ菌のｍｅｃＡ遺伝子の分布の研究にＰＣＲ
増幅法を用いることを報告している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂ．；１９９１，２９，２２４０−２２４４）
が、その検出感度は低い。
リン耐性を示す耐性境界菌群（ＭｃＤｏｕｇａｌ，ｅｔ
ａｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；１９８
６，２３，８３２−８３９）の存在により、ＭＳＳＡ
（メチシリン感受性 Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのＭＲＳ
Ａの識別はより曖昧となっている。むしろ、これらｍｅ
ｃＡ欠失菌株では、ペニシリナーゼの過剰生産（Ｍｃ
Ｄｏｕｇａｌ， ｅｔａｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．；１９８６，２３，８３２−８３９）やＰＢ
Ｐ１、ＰＢＰ３のペニシリン結合飽和力の低下、ＰＢＰ
４のペニシリン結合飽和力の増加（Ｔｏｍａｓｚ， ｅ
ｔ ａｌ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．；１９８９，３３，１８６９−１８
７４）といったＰＢＰの変異によるメチシリン感受性の
低減がみられる。ＭｕｒａｋａｍｉはＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ菌のｍｅｃＡ遺伝子の分布の研究にＰＣＲ
増幅法を用いることを報告している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂ．；１９９１，２９，２２４０−２２４４）
が、その検出感度は低い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】それ故、正確で信頼で
きるＭＲＳＡ及びメチシリン耐性コアグラ−ゼ陰性ブド
ウ球菌の同定法の確立は、臨床研究室だけでなくＭＲＳ
Ａの基礎研究にも必要である。
きるＭＲＳＡ及びメチシリン耐性コアグラ−ゼ陰性ブド
ウ球菌の同定法の確立は、臨床研究室だけでなくＭＲＳ
Ａの基礎研究にも必要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、信頼しうる
ＭＲＳＡ等の同定方法の確立において、特に高感度化と
操作の簡便化を考慮したｍｅｃＡのＰＣＲ増幅法を開発
することを目的とし、鋭意研究を行った。その結果、ｍ
ｅｃＡ遺伝子の高感度検出のためにＰＣＲ増幅に先立っ
て行う菌体細胞破砕による、鋳型ＤＮＡ調製の段階で、
アルカリデナチュレ−ションの過程を導入することによ
り、また特定のＰＣＲ用プライマ−を作製し、採用する
ことにより、上記の従来の方法よりも少なくとも１００
倍検出感度を高めることに成功し、本発明を完成した。
ＭＲＳＡ等の同定方法の確立において、特に高感度化と
操作の簡便化を考慮したｍｅｃＡのＰＣＲ増幅法を開発
することを目的とし、鋭意研究を行った。その結果、ｍ
ｅｃＡ遺伝子の高感度検出のためにＰＣＲ増幅に先立っ
て行う菌体細胞破砕による、鋳型ＤＮＡ調製の段階で、
アルカリデナチュレ−ションの過程を導入することによ
り、また特定のＰＣＲ用プライマ−を作製し、採用する
ことにより、上記の従来の方法よりも少なくとも１００
倍検出感度を高めることに成功し、本発明を完成した。
【０００６】従って、本発明の目的は境界ＭＲＳＡ菌株
等の簡便でかつ高感度で、しかも迅速に検出、同定する
手段を提供することにある。
等の簡便でかつ高感度で、しかも迅速に検出、同定する
手段を提供することにある。
【０００７】本発明は、ＭＲＳＡおよび他のブドウ球
菌、たとえばコアグラ−ゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺
伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子を検出する方法におい
て、検体由来のブドウ球菌からアルカリデナチュレ−シ
ョンの方法を用いてＤＮＡを抽出、分離する過程と、得
られたＤＮＡを鋳型として、ｍｅｃＡ遺伝子に特徴的な
ＤＮＡ断片の増幅を可能とする任意に選択されたプライ
マ−を用いたＰＣＲ（反応）を行う過程と、ＰＣＲによ
って得られた反応液中のｍｅｃＡ遺伝子に特徴的なＤＮ
Ａ断片を検出する過程とを含むことを特徴とするｍｅｃ
Ａ遺伝子を検出する方法に関する。
菌、たとえばコアグラ−ゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺
伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子を検出する方法におい
て、検体由来のブドウ球菌からアルカリデナチュレ−シ
ョンの方法を用いてＤＮＡを抽出、分離する過程と、得
られたＤＮＡを鋳型として、ｍｅｃＡ遺伝子に特徴的な
ＤＮＡ断片の増幅を可能とする任意に選択されたプライ
マ−を用いたＰＣＲ（反応）を行う過程と、ＰＣＲによ
って得られた反応液中のｍｅｃＡ遺伝子に特徴的なＤＮ
Ａ断片を検出する過程とを含むことを特徴とするｍｅｃ
Ａ遺伝子を検出する方法に関する。
【０００８】本発明のＰＣＲを行う過程で用いられる任
意に選択されたプライマ−としては、ソングらの報告し
たｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ：
ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．；１９８７，２２１，１６７）の
うち、特定箇所の特定の長さの塩基配列、例えば１１７
７塩基から１１９７塩基である。 ５’ＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧ３’ （１） または例えば１４６１塩基から１４４１塩基の相補鎖で
ある ５’ＡＡＣＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡ３’ （２） の合成オリゴヌクレオチドを用いることができる。
意に選択されたプライマ−としては、ソングらの報告し
たｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ：
ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．；１９８７，２２１，１６７）の
うち、特定箇所の特定の長さの塩基配列、例えば１１７
７塩基から１１９７塩基である。 ５’ＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧ３’ （１） または例えば１４６１塩基から１４４１塩基の相補鎖で
ある ５’ＡＡＣＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡ３’ （２） の合成オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０００９】また他のプライマ−としては、（１）及び
（２）の塩基配列の一部をプライマ−としての機能を損
なわない範囲で変換した合成オリゴヌクレオチドも用い
ることができる。
（２）の塩基配列の一部をプライマ−としての機能を損
なわない範囲で変換した合成オリゴヌクレオチドも用い
ることができる。
【００１０】上記のプライマ−を用いてｍｅｃＡ遺伝子
に特徴的な２８５塩基からなるＤＮＡ断片を電気泳動法
等により検出することができる。しかし、ｍｅｃＡ構造
遺伝子の最初の３０塩基 ５’ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＣ
ＡＣＴＴＡＴＴ３’（３） 及び１６０塩基から１８０塩基の相補鎖である ５’ＣＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡ３’ （４） の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う場合に
は、増幅されるＤＮＡ断片の量は、上記２８５塩基より
なるＤＮＡ断片の量の１０分の１程度と収量が悪く、
（１）と（２）で示すプライマ−の効率が良いことが示
された。
に特徴的な２８５塩基からなるＤＮＡ断片を電気泳動法
等により検出することができる。しかし、ｍｅｃＡ構造
遺伝子の最初の３０塩基 ５’ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＣ
ＡＣＴＴＡＴＴ３’（３） 及び１６０塩基から１８０塩基の相補鎖である ５’ＣＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡ３’ （４） の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う場合に
は、増幅されるＤＮＡ断片の量は、上記２８５塩基より
なるＤＮＡ断片の量の１０分の１程度と収量が悪く、
（１）と（２）で示すプライマ−の効率が良いことが示
された。
【００１１】検体のブドウ球菌及びＭＲＳＡであるＹＩ
株から鋳型ＤＮＡを抽出する工程は以下のようにして行
われる。各々の菌株の単一コロニ−（約１０7個を含
む）の約１０分１を爪楊枝で取り、１ｍｌのＴＮＥ溶液
（１０ｍＭトリス塩酸ＰＨ７．５，０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して、スイングロ−タ
−などを用いて１５０００×ｇで５分間程度遠心する。
上清を注意深くアスピレ−トとし、得られた菌体沈渣
は、方法１：水酸化カリウムなどのアルカリを加え煮沸
する方法及び方法２：方法１の水酸化カリウム添加の前
に、アクロモペプチダ−ゼ（和光純薬社製）などによる
細胞壁溶解段階を加えた方法によりＤＮＡを抽出するこ
とができる。
株から鋳型ＤＮＡを抽出する工程は以下のようにして行
われる。各々の菌株の単一コロニ−（約１０7個を含
む）の約１０分１を爪楊枝で取り、１ｍｌのＴＮＥ溶液
（１０ｍＭトリス塩酸ＰＨ７．５，０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して、スイングロ−タ
−などを用いて１５０００×ｇで５分間程度遠心する。
上清を注意深くアスピレ−トとし、得られた菌体沈渣
は、方法１：水酸化カリウムなどのアルカリを加え煮沸
する方法及び方法２：方法１の水酸化カリウム添加の前
に、アクロモペプチダ−ゼ（和光純薬社製）などによる
細胞壁溶解段階を加えた方法によりＤＮＡを抽出するこ
とができる。
【００１２】このアルカリデナチュレ−ションの工程を
採用することにより、細胞破砕とともに２本鎖ＤＮＡか
ら１本鎖ＤＮＡへのデナチュレ−ションが加速される。
これにより、次いで行われるＰＣＲ時にプライマ−が結
合するための基質ＤＮＡが、より多く供給されることに
なり、実施例に示されているように、特に方法２を用い
る場合、ＤＮＡ抽出の出発材料として、少なくとも３０
ＣＦＵの菌体があればｍｅｃＡ遺伝子を検出することに
成功することが示され、前記のＭｕｒａｋａｍｉらの方
法よりも少なくとも１００倍、ブドウ球菌ｍｅｃＡ遺伝
子の検出感度を高めることが可能となった。しかもこの
方法は、どのような臨床研究室でも短時間に簡便に行い
得るというメリットがある。すべての行程を実施するの
に４〜５時間を要するのみである。
採用することにより、細胞破砕とともに２本鎖ＤＮＡか
ら１本鎖ＤＮＡへのデナチュレ−ションが加速される。
これにより、次いで行われるＰＣＲ時にプライマ−が結
合するための基質ＤＮＡが、より多く供給されることに
なり、実施例に示されているように、特に方法２を用い
る場合、ＤＮＡ抽出の出発材料として、少なくとも３０
ＣＦＵの菌体があればｍｅｃＡ遺伝子を検出することに
成功することが示され、前記のＭｕｒａｋａｍｉらの方
法よりも少なくとも１００倍、ブドウ球菌ｍｅｃＡ遺伝
子の検出感度を高めることが可能となった。しかもこの
方法は、どのような臨床研究室でも短時間に簡便に行い
得るというメリットがある。すべての行程を実施するの
に４〜５時間を要するのみである。
【００１３】本発明で用いられる前記の［１］、
［２］、［３］および［４］などのプライマーは、通常
のＤＮＡ自動合成機、たとえばアプライドバイオシステ
ム社の自動合成機を用いて、公知のホスホアミダイト法
などのＤＮＡ合成法により調製することができる。
［２］、［３］および［４］などのプライマーは、通常
のＤＮＡ自動合成機、たとえばアプライドバイオシステ
ム社の自動合成機を用いて、公知のホスホアミダイト法
などのＤＮＡ合成法により調製することができる。
【００１４】患者や動物の検体試料はＭＲＳＡ等を含有
している疑いのあるものであれば特に制限はなく、たと
えば血液、髄液、腹腔液、鼻汁、喀痰、気管支肺胞洗浄
液、胃腸液等体液、小便、大便を用いることができる。
している疑いのあるものであれば特に制限はなく、たと
えば血液、髄液、腹腔液、鼻汁、喀痰、気管支肺胞洗浄
液、胃腸液等体液、小便、大便を用いることができる。
【００１５】これら検体試料を、常法により寒天培地等
にまき、ブドウ球菌を単離し、さらに培養を続け、ブド
ウ球菌の単一集落を得ることができる。
にまき、ブドウ球菌を単離し、さらに培養を続け、ブド
ウ球菌の単一集落を得ることができる。
【００１６】以下、本発明を実施例実験例をもってより
詳細に説明するが、本発明はこれのみに限定はされな
い。
詳細に説明するが、本発明はこれのみに限定はされな
い。
【００１７】
【参考１】［１］及び［２］のプライマーを、アプライ
ドバイオシステムズ社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａ型を
用い、トリチル−オンの条件下で調製した。アンモニア
水溶液でカラムから切り出し、一夜加熱して得た溶液を
水で希釈し、この溶液をオリゴヌクレオチド精製カラム
カートリッジ（アプライドバイオシステムズ社製）に加
えた。吸着したヌクレオチドを２０％アセトニトリル溶
液で溶出して、精製オリゴヌクレオチドを得た。
ドバイオシステムズ社のＤＮＡ自動合成機３８０Ａ型を
用い、トリチル−オンの条件下で調製した。アンモニア
水溶液でカラムから切り出し、一夜加熱して得た溶液を
水で希釈し、この溶液をオリゴヌクレオチド精製カラム
カートリッジ（アプライドバイオシステムズ社製）に加
えた。吸着したヌクレオチドを２０％アセトニトリル溶
液で溶出して、精製オリゴヌクレオチドを得た。
【００１８】
【実施例２】ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの精製：ｍｅｃＡ遺伝
子の高感度検出の基礎実験のために、まずｍｅｃＡ陽性
ＭＲＳＡ菌であるＹ１株の対数増殖後期の培養よりＤＮ
Ａを抽出した。培養液の１０倍連続希釈を１ｍｌのＴＮ
Ｅ溶液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、０．１Ｍ 塩
化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製し、スィング
ローターを用いて１５０００ｇで５分間遠心した。遠心
管の底に残った約１０μｌの上清を注意深くアスピレー
トした。これらの菌体沈渣は、以下に示す２種の異なっ
たＤＮＡ抽出法に供した。Ｙ１株の菌体懸濁希釈液の一
部（各々１０-5及び１０-6）はＨＩ（ハートインヒュー
ジョン）寒天培地に塗菌し生菌数を調べた。鋳型ＤＮＡ
調製の２種の方法は以下の通りに行った。
子の高感度検出の基礎実験のために、まずｍｅｃＡ陽性
ＭＲＳＡ菌であるＹ１株の対数増殖後期の培養よりＤＮ
Ａを抽出した。培養液の１０倍連続希釈を１ｍｌのＴＮ
Ｅ溶液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、０．１Ｍ 塩
化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で調製し、スィング
ローターを用いて１５０００ｇで５分間遠心した。遠心
管の底に残った約１０μｌの上清を注意深くアスピレー
トした。これらの菌体沈渣は、以下に示す２種の異なっ
たＤＮＡ抽出法に供した。Ｙ１株の菌体懸濁希釈液の一
部（各々１０-5及び１０-6）はＨＩ（ハートインヒュー
ジョン）寒天培地に塗菌し生菌数を調べた。鋳型ＤＮＡ
調製の２種の方法は以下の通りに行った。
【００１９】方法１（アルカリ煮沸液）：ミクロ遠心管
のペレット状になったＹ１菌体に５０μｌの０．５Ｍ
水酸化カリウムを加えた。ビッペティングに依りよく混
合した後、菌体懸濁液を沸騰水で５分間加熱し、続いて
５０μｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．７６）を加え中和
した。溶菌菌体は１５０００ｇで５分間遠心し、上清の
中１０μｌをＰＣＲの鋳型として用いた。方法１の水酸
化カリウム添加の前に細胞壁溶解の段階を加えた方法２
は以下の通りである。Ｙ１株の菌体沈渣に２μｌのアク
ロモペプチターゼ（和光純薬社製、１０ｍＭの塩化ナト
リウムに５００００Ｕ／ｍｌとなるよう溶解した。）を
加えよく混合し、塩化カリウム添加の前に３７℃で５分
間反応させた。方法２では、方法１の煮沸段階を省略し
た。両方法の最終遠心段階の後、上清の１〜１０μｌを
ＰＣＲ増幅の鋳型ＤＮＡとして供した。
のペレット状になったＹ１菌体に５０μｌの０．５Ｍ
水酸化カリウムを加えた。ビッペティングに依りよく混
合した後、菌体懸濁液を沸騰水で５分間加熱し、続いて
５０μｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．７６）を加え中和
した。溶菌菌体は１５０００ｇで５分間遠心し、上清の
中１０μｌをＰＣＲの鋳型として用いた。方法１の水酸
化カリウム添加の前に細胞壁溶解の段階を加えた方法２
は以下の通りである。Ｙ１株の菌体沈渣に２μｌのアク
ロモペプチターゼ（和光純薬社製、１０ｍＭの塩化ナト
リウムに５００００Ｕ／ｍｌとなるよう溶解した。）を
加えよく混合し、塩化カリウム添加の前に３７℃で５分
間反応させた。方法２では、方法１の煮沸段階を省略し
た。両方法の最終遠心段階の後、上清の１〜１０μｌを
ＰＣＲ増幅の鋳型ＤＮＡとして供した。
【００２０】その後の臨床材料のＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡ
は以下のように、各々の菌株のコロニーから直接得られ
た菌体を用いて抽出した。コロニーの一部（約１／１
０）を爪楊枝で取り、１ｍｌのＴＮＥに懸濁して遠心し
た。得られた菌体沈渣はＤＮＡ抽出の方法２（上述）に
供した。
は以下のように、各々の菌株のコロニーから直接得られ
た菌体を用いて抽出した。コロニーの一部（約１／１
０）を爪楊枝で取り、１ｍｌのＴＮＥに懸濁して遠心し
た。得られた菌体沈渣はＤＮＡ抽出の方法２（上述）に
供した。
【００２１】ＰＣＲ：ｍｅｃＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は１
００μｌの反応溶液（１０ｍＭ トリス塩酸ｐＨ８．
３、５０ｍＭ 塩化カリウム、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、２００μＭ 各ｄＮ
ＴＰ．１．０μＭ 各２種プライマー、鋳型ＤＮＡ）中
で１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑTM（パーキン エルマ
ー シータス社製）を用いて行った。プライマーとし
て、各々、報告されたｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列（Ｓｏ
ｎｇ， ｅｔ ａｌ，： ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．；１９
８７，２２１，１６７−１７１）の１１７７塩基から１
１９７塩基である［優１］、および１４６１塩基から１
４４１塩基の相補順である［優２］の合成オリゴヌクレ
オチドを用いた。全てのＰＣＲ実験の温度循環はＤＮＡ
サーマルサイクラー（パーキン エルマー シータス社
製）を用いて行った。アニール温度は５５℃に設定し、
循環数は４０とした。ＰＣＲ反応終了時に、反応溶液１
０μｌを取り、１μｇ／ｍｌのエチジウムプロミドを含
む１．２％アガロースゲルで電気泳動し、増幅されたバ
ンドを視認した。ついでこれらの増幅されたＤＮＡの塩
基配列を決定し、ｍｅｃＡに特異的な配列であることを
確認した。
００μｌの反応溶液（１０ｍＭ トリス塩酸ｐＨ８．
３、５０ｍＭ 塩化カリウム、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、２００μＭ 各ｄＮ
ＴＰ．１．０μＭ 各２種プライマー、鋳型ＤＮＡ）中
で１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑTM（パーキン エルマ
ー シータス社製）を用いて行った。プライマーとし
て、各々、報告されたｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列（Ｓｏ
ｎｇ， ｅｔ ａｌ，： ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．；１９
８７，２２１，１６７−１７１）の１１７７塩基から１
１９７塩基である［優１］、および１４６１塩基から１
４４１塩基の相補順である［優２］の合成オリゴヌクレ
オチドを用いた。全てのＰＣＲ実験の温度循環はＤＮＡ
サーマルサイクラー（パーキン エルマー シータス社
製）を用いて行った。アニール温度は５５℃に設定し、
循環数は４０とした。ＰＣＲ反応終了時に、反応溶液１
０μｌを取り、１μｇ／ｍｌのエチジウムプロミドを含
む１．２％アガロースゲルで電気泳動し、増幅されたバ
ンドを視認した。ついでこれらの増幅されたＤＮＡの塩
基配列を決定し、ｍｅｃＡに特異的な配列であることを
確認した。
【００２２】ドットプロットハイブリダイゼーション：
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌体ＤＮＡは、Ｄｙｅｒ，Ｉａｎｄ
ｏｌｏの方法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ：１９８３，４６，２８３−２８５）に従って
抽出した。各々２００ｎｇのＤＮＡを含む３μｌのＤＮ
Ａ溶液をナイロンメンブレン（Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ．ポ
ール バイオサポート社製）にブロットし、ＵＶ照射に
より固定した。ハイブリダイゼーションは、本発明者が
以前に詳述した標準ハイブリダイゼーションと洗浄の条
件（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ： Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９
９０，３４，６００−６０４）で、ブローブとしてｍｅ
ｃＡ遺伝子を含む４Ｋｂのジゴキシゲニン標識したＨｉ
ｎｄIII断片（ｐＭＲ１１１； Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，
ｅｔ ａｌ： Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９９０，３４，６００−６０
４）を用いて行った。シグナルの視認は、アルカリフォ
スファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリ
ンガー マンハイム社製）および蛍光試薬であるＡＭＰ
ＰＤ（トロビックス社製）を用いたメーカーの推奨する
手段に従って行った。ＰＣＲによるｍｅｃＡ遺伝子の高感度検出 ＭＲＳＡ菌株からの２種のＤＮＡ調製法をｍｅｃＡ遺伝
子の検出感度により比較した（図１）。アルカリ煮沸法
（方法１：パネルＡ及びＢ）では、ＰＣＲの鋳型とし
て、３×１０2 ＣＦＵより抽出したＤＮＡを用いた場合
２８５ｂのバンドが検出された（パネルＡ及びＢの４列
目）。方法１にアクロモペプチターゼによる細胞壁溶解
段階を加えた方法２（パネルＣ）では、検出感度は少な
くとも１０倍に上がった（パネルＣ）。３０ＣＦＵと推
定された菌体（パネルＣ、３列目、８列目）及び３ＣＦ
Ｕ（パネルＣ、９列目）より抽出したＤＮＡを鋳型に用
いることにより特異的なバンドが検出された。しかし、
パネルＣの９列目のバンドは、３列目、８列目のバンド
より薄かった。このように、方法２を用いることによ
り、ＤＮＡ抽出の出発材料として少なくとも３０ＣＦＵ
の菌体があれば、ｍｅｃＡ遺伝子の検出に成功すること
が示された。煮沸段階を省略した方法２の検出感度（パ
ネルＣ、６−１０列）は、煮沸を加えても改善されなか
った（パネルＣ、１−５列）。 実施例２メチシリン耐性境界線上にあるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の
ｍｅｃＡ遺伝子の検出 方法２のＤＮＡ調製を用いたＰＣＲにより、全部で４０
株のＳ．ａｕｒｅｕｓがｍｅｃＡを保持していることが
判明した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの菌体ＤＮＡは、Ｄｙｅｒ，Ｉａｎｄ
ｏｌｏの方法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ：１９８３，４６，２８３−２８５）に従って
抽出した。各々２００ｎｇのＤＮＡを含む３μｌのＤＮ
Ａ溶液をナイロンメンブレン（Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ．ポ
ール バイオサポート社製）にブロットし、ＵＶ照射に
より固定した。ハイブリダイゼーションは、本発明者が
以前に詳述した標準ハイブリダイゼーションと洗浄の条
件（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ： Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９
９０，３４，６００−６０４）で、ブローブとしてｍｅ
ｃＡ遺伝子を含む４Ｋｂのジゴキシゲニン標識したＨｉ
ｎｄIII断片（ｐＭＲ１１１； Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，
ｅｔ ａｌ： Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９９０，３４，６００−６０
４）を用いて行った。シグナルの視認は、アルカリフォ
スファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリ
ンガー マンハイム社製）および蛍光試薬であるＡＭＰ
ＰＤ（トロビックス社製）を用いたメーカーの推奨する
手段に従って行った。ＰＣＲによるｍｅｃＡ遺伝子の高感度検出 ＭＲＳＡ菌株からの２種のＤＮＡ調製法をｍｅｃＡ遺伝
子の検出感度により比較した（図１）。アルカリ煮沸法
（方法１：パネルＡ及びＢ）では、ＰＣＲの鋳型とし
て、３×１０2 ＣＦＵより抽出したＤＮＡを用いた場合
２８５ｂのバンドが検出された（パネルＡ及びＢの４列
目）。方法１にアクロモペプチターゼによる細胞壁溶解
段階を加えた方法２（パネルＣ）では、検出感度は少な
くとも１０倍に上がった（パネルＣ）。３０ＣＦＵと推
定された菌体（パネルＣ、３列目、８列目）及び３ＣＦ
Ｕ（パネルＣ、９列目）より抽出したＤＮＡを鋳型に用
いることにより特異的なバンドが検出された。しかし、
パネルＣの９列目のバンドは、３列目、８列目のバンド
より薄かった。このように、方法２を用いることによ
り、ＤＮＡ抽出の出発材料として少なくとも３０ＣＦＵ
の菌体があれば、ｍｅｃＡ遺伝子の検出に成功すること
が示された。煮沸段階を省略した方法２の検出感度（パ
ネルＣ、６−１０列）は、煮沸を加えても改善されなか
った（パネルＣ、１−５列）。 実施例２メチシリン耐性境界線上にあるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株の
ｍｅｃＡ遺伝子の検出 方法２のＤＮＡ調製を用いたＰＣＲにより、全部で４０
株のＳ．ａｕｒｅｕｓがｍｅｃＡを保持していることが
判明した。
【００２３】（ｉ）使用菌株：日本で単離されたＳ．ａ
ｕｒｅｕｓ４０株（１９８１年Ｙ病院にて３株、１９８
７年Ｔ病院にて８株、１９８８年Ｊ病院にて２９株）を
用いた。これら菌株のメチシリンＭＩＣ値は、スポット
当り１×１０4 ＣＦＵを植菌サイズとし、様々な濃度の
メチシリンを加えたミューラー・ヒントン寒天培地を用
いた平板希釈法により１．６６〜１２．５μｇ／ｍｌの
範囲と測定された。寒天培地は菌体増殖が認められるま
で３５℃で２４時間培養した。
ｕｒｅｕｓ４０株（１９８１年Ｙ病院にて３株、１９８
７年Ｔ病院にて８株、１９８８年Ｊ病院にて２９株）を
用いた。これら菌株のメチシリンＭＩＣ値は、スポット
当り１×１０4 ＣＦＵを植菌サイズとし、様々な濃度の
メチシリンを加えたミューラー・ヒントン寒天培地を用
いた平板希釈法により１．６６〜１２．５μｇ／ｍｌの
範囲と測定された。寒天培地は菌体増殖が認められるま
で３５℃で２４時間培養した。
【００２４】各菌株のペニシリナーゼ産生量はニトロセ
フィンディスクを用いて測定した。 （Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．： Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ， Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；
１９７２，１，２８３−２８８）。
フィンディスクを用いて測定した。 （Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．： Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ， Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；
１９７２，１，２８３−２８８）。
【００２５】（ｉｉ）集団解析：ｍｅｃＡ陽性の耐性境
界菌の集団解析は、様々な濃度のメチシリンを含むミュ
ーラー・ヒントン寒天培地に終夜培養した菌体を１×１
０3〜１×１０7 ＣＦＵ植菌して行った（Ｈｉｒａｍａ
ｔｓｕ，ｅｔ ａｌ．：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ， Ａｇ
ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９９０，３４，６０
０−６０４）。コロニーは３５℃で４８時間培養した後
に計測した。
界菌の集団解析は、様々な濃度のメチシリンを含むミュ
ーラー・ヒントン寒天培地に終夜培養した菌体を１×１
０3〜１×１０7 ＣＦＵ植菌して行った（Ｈｉｒａｍａ
ｔｓｕ，ｅｔ ａｌ．：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ， Ａｇ
ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；１９９０，３４，６０
０−６０４）。コロニーは３５℃で４８時間培養した後
に計測した。
【００２６】ＰＣＲの結果の信頼性は、各菌株より精製
したＤＮＡを、クローニングしたｍｅｃＡ遺伝子のブロ
ーブとハイブリダイズさせることにより確認した。ＰＣ
Ｒの結果とドットブロットハイブリダイゼーションの結
果と完全な相関を示す典型的なデータを図２に示した
（図２、下線がＰＣＲ検定によるｍｅｃＡ陽性株）。解
析した４０株のｍｅｃＡ保持とメチシリンＭＩＣ値との
相関を表１に示した。ＭＩＣ値６．２５μｇ／ｍｌでの
菌株群のなかで５株のｍｅｃＡ陽性株と８株のｍｅｃＡ
陰性株が存在したことに注目される。また、ｍｅｃＡ陰
性株であるＴ３株のＭＩＣ値が１２．５であったことも
注目に値する（表１）。この株はペニシリナーゼを産生
していないことが、セフィナーゼディスクテストで示さ
れている（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ： Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ， Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ
ｅｒ；１９７２，１，２８３−２８６）。それ故ｍｅｃ
Ａ遺伝子の存在、欠失を識別できるようなＭＩＣ値の分
岐点は得られなかった。
したＤＮＡを、クローニングしたｍｅｃＡ遺伝子のブロ
ーブとハイブリダイズさせることにより確認した。ＰＣ
Ｒの結果とドットブロットハイブリダイゼーションの結
果と完全な相関を示す典型的なデータを図２に示した
（図２、下線がＰＣＲ検定によるｍｅｃＡ陽性株）。解
析した４０株のｍｅｃＡ保持とメチシリンＭＩＣ値との
相関を表１に示した。ＭＩＣ値６．２５μｇ／ｍｌでの
菌株群のなかで５株のｍｅｃＡ陽性株と８株のｍｅｃＡ
陰性株が存在したことに注目される。また、ｍｅｃＡ陰
性株であるＴ３株のＭＩＣ値が１２．５であったことも
注目に値する（表１）。この株はペニシリナーゼを産生
していないことが、セフィナーゼディスクテストで示さ
れている（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ： Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ， Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ
ｅｒ；１９７２，１，２８３−２８６）。それ故ｍｅｃ
Ａ遺伝子の存在、欠失を識別できるようなＭＩＣ値の分
岐点は得られなかった。
【００２７】
【実験例１】メチシリン耐性境界線上の５株のｍｅｃＡ陽性菌の集団
解析 ｍｅｃＡ遺伝子を保持し、且つメチシリンＭＩＣ値が
６．２５である（表１参照）５株（Ｊ０１３、Ｊ０１
８、Ｊ０５６、Ｊ０５９、Ｊ０６０）を集団解析に供し
た（図３）。
解析 ｍｅｃＡ遺伝子を保持し、且つメチシリンＭＩＣ値が
６．２５である（表１参照）５株（Ｊ０１３、Ｊ０１
８、Ｊ０５６、Ｊ０５９、Ｊ０６０）を集団解析に供し
た（図３）。
【００２８】５株全てが、メチシリン耐性の多相形態を
示した。すなわち１０-4〜１０-5の頻度で高度耐性の菌
株が観察された。この結果から、メチシリン耐性境界線
上にあるＳ．ａｕｒｅｕｓ４０株の中少なくとも５株
（１２．５％）が異型体ＭＲＳＡ菌株であることが示さ
れた。
示した。すなわち１０-4〜１０-5の頻度で高度耐性の菌
株が観察された。この結果から、メチシリン耐性境界線
上にあるＳ．ａｕｒｅｕｓ４０株の中少なくとも５株
（１２．５％）が異型体ＭＲＳＡ菌株であることが示さ
れた。
【００２９】
【発明の効果】本発明者はＭＲＳＡおよびメチシリン耐
性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺伝子要素で
ある、ｍｅｃＡ遺伝子のＰＣＲ増幅の簡便かつ信頼度の
高い、高感度で迅速な検出方法を開発した。この方法を
用いることによりメチシリン耐性境界菌株（ＭＩＣ：範
囲１．５６〜１２．５μｇ／ｍｌ）のｍｅｃＡの有無が
検析され、これらの菌株の耐性のパターンも解析するこ
とができた。
性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の特異的な遺伝子要素で
ある、ｍｅｃＡ遺伝子のＰＣＲ増幅の簡便かつ信頼度の
高い、高感度で迅速な検出方法を開発した。この方法を
用いることによりメチシリン耐性境界菌株（ＭＩＣ：範
囲１．５６〜１２．５μｇ／ｍｌ）のｍｅｃＡの有無が
検析され、これらの菌株の耐性のパターンも解析するこ
とができた。
【００３０】ときどき単離されるメチシリン耐性境界線
上のＳ．ａｕｒｅｕｓの存在はＭＲＳＡとＭＳＳＡの識
別を困難にしている。本発明において、そのような疑似
ＭＲＳＡ株を含むＭＩＣ値が６．２５μｇ／ｍｌである
菌群を取り上げた。これらのｍｅｃＡ陽性株は、全て特
徴的な耐性の多相形態を示すことが判明した。
上のＳ．ａｕｒｅｕｓの存在はＭＲＳＡとＭＳＳＡの識
別を困難にしている。本発明において、そのような疑似
ＭＲＳＡ株を含むＭＩＣ値が６．２５μｇ／ｍｌである
菌群を取り上げた。これらのｍｅｃＡ陽性株は、全て特
徴的な耐性の多相形態を示すことが判明した。
【００３１】即ち本発明より、テンプレートＤＮＡの出
発材料として僅か３０ＣＦＵの菌体で短時間でＭＲＳＡ
の同定が可能となった。本発明者はこの方法を用いるこ
とにより、メチシリン耐性境界線上の菌株を正確に同定
できることを見いだした。また、メチシリン耐性にもか
かわらずｍｅｃＡ遺伝子が欠失しているＴ３株を見いだ
した。
発材料として僅か３０ＣＦＵの菌体で短時間でＭＲＳＡ
の同定が可能となった。本発明者はこの方法を用いるこ
とにより、メチシリン耐性境界線上の菌株を正確に同定
できることを見いだした。また、メチシリン耐性にもか
かわらずｍｅｃＡ遺伝子が欠失しているＴ３株を見いだ
した。
【００３２】
【表１】 黄色ブドウ球菌４０株のｍｅｃＡ遺伝子キャリアとメチシリンＭＩＣとの相関 性 ─────────────────────────────── ＭＩＣ値 ｍｅｃＡ陽性菌株の 試験菌株の （μｇ／ｍｌ） 数（％陽性率） 総数 ─────────────────────────────── １．５６ ０（０％） ５ ３．１３ ０（０％） ６ ６．２５ ５* （３８．５％） １３ １２．５ １５（９３．８％） １６** ─────────────────────────────── ＊ｍｅｃＡ陽性５株はＪ０１３、Ｊ０１８、Ｊ０５６、
Ｊ０５９およびＪ０６０。 ＊＊１株Ｔ３はｍｅｃＡ陰性。
Ｊ０５９およびＪ０６０。 ＊＊１株Ｔ３はｍｅｃＡ陰性。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ増幅によるｍｅｃＡ遺伝子の検出感度を
示す写真。
示す写真。
【図２】各黄色ブドウ球菌菌株の精製ＤＮＡのドットブ
ロットハイブリダイゼーションを示す写真。
ロットハイブリダイゼーションを示す写真。
【図３】ｍｅｃＡ−陽性境界メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌菌株５株の集団解析を示す図。
球菌菌株５株の集団解析を示す図。
Claims (3)
- 【請求項１】 ＭＲＳＡおよび他のブドウ球菌、たとえ
ばコアグラ−セ陰性ブドウ球箘の特異的な遺伝子要素で
あるｍｅｃＡ遺伝子を検出する方法において、検体由来
のブドウ球菌からアルカリデナチュレ−ションの方法を
用いてＤＮＡを抽出、分離する過程と、得られたＤＮＡ
を鋳型として、ｍｅｃＡ遺伝子に特徴的なＤＮＡ断片の
増幅を可能とする任意に選択されたプライマ−を用いた
ＰＣＲ（反応）を行う過程と、ＰＣＲによって得られた
反応液中のｍｅｃＡ遺伝子に特徴的なＤＮＡ断片を検出
する過程とを含むことを特徴とするｍｅｃＡ遺伝子を検
出する方法。 - 【請求項２】 任意に選択されたプライマ−が ５’ＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧ３’ （１） または ５’ＡＡＣＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡ３’ （２） の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドである請求
項１のｍｅｃＡ遺伝子を検出する方法。 - 【請求項３】 任意に選択されたプライマ−が、塩基配
列の一部をプライマ−としての機能を損なわない範囲で
変換した合成オリゴヌクレオチドである請求項１のｍｅ
ｃＡ遺伝子を検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15014892A JPH0654700A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | 耐性菌の高感度検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15014892A JPH0654700A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | 耐性菌の高感度検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0654700A true JPH0654700A (ja) | 1994-03-01 |
Family
ID=15490550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15014892A Pending JPH0654700A (ja) | 1992-05-19 | 1992-05-19 | 耐性菌の高感度検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0654700A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| WO2011081075A1 (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-07 | キッコーマン株式会社 | 黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法、黄色ブドウ球菌抗原の抽出用試薬および黄色ブドウ球菌の判定方法 |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| JP2017158576A (ja) * | 2011-05-24 | 2017-09-14 | エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップＥｌｉｔｅｃｈｇｒｏｕｐ Ｂ．Ｖ． | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出 |
-
1992
- 1992-05-19 JP JP15014892A patent/JPH0654700A/ja active Pending
Cited By (13)
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|---|---|---|---|---|
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| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8067207B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-11-29 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US10047404B2 (en) | 1999-09-28 | 2018-08-14 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved tuf genes and their use to generate probes and primers for detection of coagulase-negative Staphylococcus |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8182996B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-05-22 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Compositions and methods for detecting Klebsiella pneumoniae |
| WO2011081075A1 (ja) * | 2009-12-28 | 2011-07-07 | キッコーマン株式会社 | 黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法、黄色ブドウ球菌抗原の抽出用試薬および黄色ブドウ球菌の判定方法 |
| US8679812B2 (en) | 2009-12-28 | 2014-03-25 | Kikkoman Corporation | Method for extracting Staphylococcus aureus antigen, reagent for extracting Staphylococcus aureus antigen, and method for assessing Staphylococcus aureus |
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| JP2017158576A (ja) * | 2011-05-24 | 2017-09-14 | エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップＥｌｉｔｅｃｈｇｒｏｕｐ Ｂ．Ｖ． | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出 |
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