JP2007195421A - メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法 - Google Patents

メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を簡便かつ迅速・確実に検出でき、かつ、その遺伝子型を識別できるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法を提供すること、並びにこれらの方法に適用可能なメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー及びメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出キットを提供すること。
【解決手段】メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列又はそれと相補的な塩基配列に含まれる連続した少なくとも１０以上の塩基配列を備えるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用プライマーを提供する。検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を鋳型に、上記プライマーを用いて該遺伝子の標的領域を増幅させる工程と、この標的領域のＤＮＡ断片の増幅の有無に応じて該遺伝子の有無を判断する工程とを含む、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー及びプライマーセット並びにメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法に関する。さらに本発明は、細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法及びメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出キットに関する。
ペニシリンの発見により、細菌感染症の治療は著しく進歩したが、抗菌薬の使用に伴って耐性菌が出現し、院内感染が問題となった。これにより、さらに強力で幅広い抗菌スペクトルを有する新型の抗菌薬の開発が望まれ、多くの次世代β−ラクタム薬が開発された。
ところが、幅広い抗菌スペクトルを有するカルバペネム系抗菌薬が開発された後においても、その分子構造中のβ−ラクタム環を加水分解し、その抗菌作用を無効化するβ−ラクタム薬耐性菌が出現した。このβ−ラクタム薬耐性菌が医療施設内に蔓延すれば、カルバペネム系抗菌薬を含むすべてのβ−ラクタム薬が無効であるため、院内感染の問題はさらに深刻化することになる（非特許文献１）。
β−ラクタム薬耐性菌の出現は、カルバペネム系抗菌薬を安易に大量使用した結果であるため、院内感染を防止するには、カルバペネム系抗菌薬を含む全ての抗菌薬を患者の症状に合わせてより慎重に使用することが求められる。したがって、信頼性の高い検査によってβ−ラクタム薬耐性菌の検出を確実に行い、耐性菌についての正確な情報を臨床の現場に伝えることが重要となる。
現在、医療施設の検査室でβ−ラクタム薬耐性菌を確実に検出できる試験方法は確立されていないが、以下の方法でβ−ラクタム薬耐性菌を検出できることが報告されている。
１つ目の方法は、セファロスポリン系抗菌薬とカルバペネム系抗菌薬とに対してそれぞれ薬剤感受性試験を行い、セファロスポリン系抗菌薬に高度の耐性を示し、かつ、カルバペネム系抗菌薬にも低度又は高度の耐性を示す細菌株を分離する方法である（非特許文献２）。
２つ目の方法は、被検細菌を接種した培地の上に、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤であるチオール化有機酸（例えば、メルカプト酢酸ナトリウム）を含有したディスクとβ−ラクタム薬（例えば、セファロスポリン系抗菌薬、カルバペネム系抗菌薬）を含有したディスクとを置いて培養し、両ディスクの隣接部に発育阻止円が生じるか否かによって、β−ラクタム薬耐性菌を判別する方法である（特許文献１）。
特開２００１−２９９３８８号公報 Ｏｓａｎｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９４年、３８巻、ｐ．７１−７８ 伊豫部ら、臨床と微生物、１９９９年、２６巻（２）、ｐ．１５３−１５８
しかしながら、カルバペネム系抗菌薬に対する薬剤感受性試験においては、カルバペネム薬の存在下で、β−ラクタム薬耐性菌がメタロ−β−ラクタマーゼを誘導するのにはある程度の時間を要するため、β−ラクタム薬耐性菌を確実に検出することは困難である。
また、抗菌薬を含有させたディスクを用いた試験法においては、各抗菌薬を含有したディスクの準備等の煩雑な作業が伴い、発育阻止円の有無を判定するまでに長時間が必要であるため、簡便かつ迅速にβ−ラクタム薬耐性菌を検出することが困難である。
さらに、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列には多様性があり、院内感染の疫学調査においてはその遺伝情報を詳細に解析することが不可欠とされるが、上記の２つの方法では、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の遺伝子型を識別することは不可能である。
そこで、本発明の目的は、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を簡便かつ迅速・確実に検出でき、かつ、その遺伝子型を識別できる、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法、β−ラクタム薬耐性菌の検出方法及び細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法を提供することにある。本発明の目的はまた、これらの方法に適用可能なメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマー及びプライマーセット、並びにメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出キットを提供することにある。
本発明者らは、かかる課題を解決するべく検討を重ね、等温の遺伝子増幅反応であるＬｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（以下、ＬＡＭＰ）法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）を利用することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を簡便かつ迅速・確実に検出し、その遺伝子型を識別できることを見出した。
すなわち、本発明のプライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出するのに用いるプライマーであって、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列又はそれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマー、又は、このプライマーとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマーであることを特徴とする。
さらに、上記プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の５’側から、塩基配列領域としてＢ３、Ｂ２及びＢ１を選択し、この標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃを選択し、上記Ｂ３、Ｂ２及びＢ１の相補的塩基配列を、それぞれＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃとし、上記Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃに相補的な塩基配列を、それぞれＦ３、Ｆ２及びＦ１としたとき、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに該当する塩基配列からなることが好ましい。
（ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列。
（ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列。
（ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列。
本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を増幅すれば、当該メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ効率的に検出可能な量まで増幅することが可能である。このため、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認することによって、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を検出することができる。
また、上記プライマーは、上記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列である配列表の配列番号１に示す塩基配列の中より塩基番号４６５〜７４１で表される塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列とすることができ、さらに、配列表の配列番号２〜９に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列のいずれか一つの塩基配列とすることが好ましい。
さらに、上記プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなることが好ましい。
（ａ）５’−（配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３に示す塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号６に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−１型の遺伝子型であると判定できる。
また、上記プライマーは、上記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列である配列表の配列番号１４に示す塩基配列の中より塩基番号４６７〜７４１で表される塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列とすることができ、さらに、配列表の配列番号１５〜２２に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列のいずれか一つの塩基配列とすることが好ましい。
さらに、上記プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなることが好ましい。
（ａ）５’−（配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１６に示す塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号１９に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２０に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−２型の遺伝子型であると判定できる。
また、上記プライマーは、上記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列である配列表の配列番号２７に示す塩基配列の中より塩基番号４５２〜６９５で表される塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列とすることができ、さらに、配列表の配列番号２８〜３４に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列のいずれか一つの塩基配列とすることが好ましい。
さらに、上記プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなることが好ましい。
（ａ）５’−（配列番号２８に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２９に示す塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号３１に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３２に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−１１型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−１１型の遺伝子型であると判定できる。
また、上記プライマーは、上記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列である配列表の配列番号３８に示す塩基配列の中より塩基番号３９〜２６６で表される塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列とすることができ、さらに、配列表の配列番号３９〜４５に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列のいずれか一つの塩基配列とすることが好ましい。
さらに、上記プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなることが好ましい。
（ａ）５’−（配列番号３９に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４０に示す塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号４３に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４４に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
本発明のプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＶＩＭ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＶＩＭ−２型の遺伝子型であると判定できる。
本発明のプライマーセットは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び／又は配列表の配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
本発明のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−１型の遺伝子型であると判定できる。
また、本発明のプライマーセットは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列表の配列番号２２及び／又は配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
本発明のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−２型の遺伝子型であると判定できる。
また、本発明のプライマーセットは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３７に示す塩基配列からなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列表の配列番号３４に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
本発明のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＩＭＰ−１１型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＩＭＰ−１１型の遺伝子型であると判定できる。
また、本発明のプライマーセットは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号４１に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号４６に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号４７に示す塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号４８に示す塩基配列からなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列表の配列番号４９に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むことが好ましい。
本発明のプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法でメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出すれば、ＶＩＭ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断でき、増幅された遺伝子はＶＩＭ−２型の遺伝子型であると判定できる。
また、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法は、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を鋳型に、上記プライマー又はプライマーセットを用いてメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が存在し、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が存在しないと判断する判断工程とを含むことを特徴とする。
さらに、本発明のβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法は、検体中に含まれるβ−ラクタム薬耐性菌のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記プライマー又はプライマーセットを用いてメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合にβ−ラクタム薬耐性菌が存在し、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合にβ−ラクタム薬耐性菌が存在しないと判断する判断工程とを含むことを特徴とする。
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法を使用すれば、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法で特異的かつ高感度に増幅することができ、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌が存在すると判断できる。さらに、ＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型及びＶＩＭ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出できる上記プライマーセットを使用すれば、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌の遺伝子型を判定できる。
上記方法は、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を、ＬＡＭＰ法によって増幅させることが好ましい。
メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を、ＬＡＭＰ法によって増幅させれば、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要となるため、等温での相補鎖合成反応を可能にする。このため、ＰＣＲ装置等の特殊な装置を用いることなく、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌の遺伝子型を簡便かつ迅速に判定できる。
また、本発明は、細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法であって、被検細菌のゲノムＤＮＡを鋳型に、上記プライマー又はプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法によって、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合に、β−ラクタム薬耐性であると判断し、この標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合に、β−ラクタム薬感受性であると判断する判断工程とを含む、判定方法を提供する。
さらに、本発明は、上記プライマー又はプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと、マグネシウム塩又はマンガン塩である補助因子と、を含むβ−ラクタマーゼ遺伝子の検出キットを提供する。
本発明のβ−ラクタム薬耐性の判定方法又はβ−ラクタマーゼ遺伝子の検出キットを使用すれば、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法で特異的かつ高感度に増幅することができ、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が存在し、検体中に存在する細菌はβ−ラクタム薬耐性であると判断できる。さらに、ＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型及びＶＩＭ−２型のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出できる上記プライマーセットを使用すれば、検体中に含まれるメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はβ−ラクタム薬耐性菌の遺伝子型を判定できる。
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法並びに細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法により、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を簡便かつ迅速・確実に検出することが可能となる。また、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出方法並びに細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法により、ＰＣＲ装置等の特殊な装置を用いることなく、その遺伝子型を高感度に識別することが可能となり、特異的かつ高感度にＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型又はＶＩＭ−２型のうちのいずれの遺伝子型に該当するかを判定できる。
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用プライマー及びプライマーセット並びにメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌の検出キットを使用することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子及びβ−ラクタム薬耐性菌を簡便かつ迅速・確実に検出することができる。
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列又はそれと相補的な塩基配列に含まれる連続した少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマー、又はこれらの塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマーを提供すること、及び、これらのプライマーを用いて、ＬＡＭＰ法によりメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を特異的に増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認すると同時に遺伝子型を判定すること、を基礎としている。
本発明における「メタロ−β−ラクタマーゼ」とは、活性中心に亜鉛等の金属イオンを有し、β−ラクタム薬が有するβ−ラクタム環を加水分解して、その抗菌作用を無毒化することができる酵素である。メタロ−β−ラクタマーゼは、活性中心にセリン残基を持つセリン−β−ラクタマーゼがセファマイシン系及びカルバペネム系抗菌薬を加水分解できないのに対し、これらの抗菌薬を含む総てのβ−ラクタム薬を加水分解できる。
ここで、「β−ラクタム薬」とは、その骨格にβ−ラクタム環を有する抗生物質で、細菌の細胞壁ペプチドグリカンの合成に必須の酵素群の働きを阻害することで抗菌作用を発揮する薬剤のことをいい、ペニシリンからセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系抗菌薬等が該当する。
本発明における「β−ラクタム薬耐性菌」とは、メタロ−β−ラクタマーゼを産生するメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のことであって、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子は、多くの遺伝子型が存在する。その中で、日本国内ではＩＭＰ−１型（配列番号１）とＶＩＭ−２型（配列番号３８）が一般的であるが、最近、ＩＭＰ−２型（配列番号１４）、ＩＭＰ−１１型（配列番号２７）も検出されている。これらの遺伝子型を把握することは、医療現場において重要な情報とされている。
本発明において使用される検体としては、細菌感染が疑われる人間又は他の動物の生体由来の検体、例えば、患者カテーテル拭き取り検体、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織等が挙げられ、これらの検体から分離培養した発育コロニー、培養液等も検体となり得る。
メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の有無を迅速に検出するために、これらの検体は、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。
メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域の増幅は、納富らが開発したＬＡＭＰ法で達成される。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要なループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）であって、鋳型となるヌクレオチドにプライマーの３’側をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能にする。
このＬＡＭＰ法では、鋳型となる核酸の６つの塩基配列領域を認識する少なくとも４つのプライマーが必要とされる。これらのプライマーは、３’側が常に鋳型となるヌクレオチドにアニールするように設計されるため、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することになり、高感度でかつ特異性の高い核酸の増幅反応が可能となる。
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーが認識する６つの塩基配列領域は、鋳型となるヌクレオチドの３’側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃと呼び、５’側から順にＢ３、Ｂ２、Ｂ１と呼び、さらに、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補的な塩基配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３と呼び、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３の相補的な塩基配列をそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマーの設計は、まず、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、その後、後述するインナープライマーＦ及びＢ並びにアウタープライマーＦ及びＢを設計するが、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーを設計するには、配列表の配列番号１に示す塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーを設計するには、配列表の配列番号１４に示す塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーを設計するには、配列表の配列番号２７に示す塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーを設計するには、配列表の配列番号３８に示す塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、その後それぞれインナープライマーＦ及びＢ並びにアウタープライマーＦ及びＢを設計することとなる。
ここで、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーの設計は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、配列表の塩基番号４６５〜７４１に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましく、配列表の配列番号２〜９に示す塩基配列に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域のいずれかを決定するのがさらに好ましい。
また、ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーは、配列表の配列番号１４に示す塩基配列のうち、配列表の塩基番号４６７〜７４１に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましく、配列表の配列番号１５〜２２に示す塩基配列に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域のいずれかを決定するのがさらに好ましい。
ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーは、配列表の配列番号２７に示す塩基配列のうち、配列表の塩基番号４５２〜６９５に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましく、配列表の配列番号２８〜３４に示す塩基配列に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域のいずれかを決定するのがさらに好ましい。
ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出するプライマーは、配列表の配列番号３８に示す塩基配列のうち、塩基番号３９〜２６６に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましく、配列表の配列番号３９〜４５に示す塩基配列に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域のいずれかを決定するのがさらに好ましい。
ＬＡＭＰ法に用いられるインナープライマーとは、標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’側に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’側に有するオリゴヌクレオチドのことをいい、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＩＰＦ）と呼び、「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＩＰＢ）と呼ぶ。このインナープライマーは、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」と「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」の間、あるいは「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」の間に、塩基数０〜５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。
一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、ＯＰＦ）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、ＯＰＢ）と呼ぶ。
ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示であり、各プライマーにおけるＢとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示である。
ＬＡＭＰ法における核酸の増幅では、インナープライマー及びアウタープライマーに加え、さらにループプライマーを用いることができる。ループプライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、このループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’側に含むプライマー（二本鎖を構成する各々について１つずつ）のことをいう。すなわち、ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いれば、核酸合成の起点が増加するため、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は、上記ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選択されてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは１種類であっても、２種類であってもよい。
本発明のプライマーは、１０塩基以上であることが好ましく、１５塩基以上であることがさらに好ましい。また、各プライマーは、単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
尚、各プライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入したり、あるいは天然の核酸を制限酵素等によって切断し、所望の塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結して得ることも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組合せることで、かかるプライマーを合成することができる。
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、一般に知られたものを選択することができる。ストリンジェントな条件として、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄する、という条件が挙げられる。
さらに、本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用プライマーは、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅するために、ＬＡＭＰ法のみでなく、ＰＣＲ法にも使用できる。ＰＣＲ法では、上記プライマーの任意の２つの組み合わせを用いて、検体中のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を鋳型に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行えば、目的とするＤＮＡ断片を増幅させることが可能である。
本発明者らは、ＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型及びＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子に特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、それぞれの遺伝子の塩基配列（配列番号１、１４、２７及び３８）から、以下のプライマーセットを選定した。
ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマーセット
ＩＰＦ：5'-GCGTCACCCAAATTGCCTAAACGGTTTGGTTGCCTGAAAGG-3' （配列番号１０）
ＯＰＦ：5'-GGGACACACTCCAGATAACG-3' （配列番号４）
ＩＰＢ：5'-GCTTGGCCAAAGTCCGCCCCTTTAACCGCCTGCTCTA-3' （配列番号１１）
ＯＰＢ：5'-TTAGTTGCTTGGTTTTGATGGT-3' （配列番号１２）
ＬＰＦ：5'-ACGGTTTAATAAAACAACCACCGA-3' （配列番号１３）
ＬＰＢ：5'-TCACAGTGAAGTTGGAGACGC-3' （配列番号９）
ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマーセット
ＩＰＦ：5'-GCGTCACCCAAATTACCAAGACCGGTGGTTTGGTTACCTGAAAAG-3' （配列番号２３）
ＯＰＦ：5'-GGCACACTCAAGATAACG-3' （配列番号１７）
ＩＰＢ：5'-GCTTGGCCAAAGTCCGCCCCTTTAACAGCCTGTTCC-3' （配列番号２４）
ＯＰＢ：5'-TTAGTTACTTGGCTGTGATGG-3' （配列番号２５）
ＬＰＦ：5'-TCGGTGGTTGTTTTGTTAAACCGG-3' （配列番号２６）
ＬＰＢ：5'-TCATAGTGAAATTGGGGACGC-3' （配列番号２２）
ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマーセット
ＩＰＦ：5'-TTGCGTCATCTAGATTACCAAGACCGATAACGTAGTGGTTTGGCTACC-3' （配列番号３５）
ＯＰＦ：5'-TTTATCCAGGCCCAGGGC-3' （配列番号３０）
ＩＰＢ：5'-GAAGCATGGCCACATTCGGCCAAGAGCGACGCATCTCC-3' （配列番号３６）
ＯＰＢ：5'-ACCGCCTGTTCCCACG-3' （配列番号３７）
ＬＰＢ：5'-TGCAAAACTGGTTGTTCCAAGCC-3' （配列番号３４）
ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のプライマーセット
ＩＰＦ：5'-CCGGACCTCCCCGACCGCCGCTCGCTTTTTCCGTAG-3' （配列番号４６）
ＯＰＦ：5'-GCGTCTATCATGGCTATTGCG-3' （配列番号４１）
ＩＰＢ：5'-GGTCGCATATCGCAACGCAGCCATCACGGACAATGAGACC-3' （配列番号４７）
ＯＰＢ：5'-GCACCCCACGCTGTATC-3' （配列番号４８）
ＬＰＦ：5'-ACTGTCGGATACTCACCGC-3' （配列番号４９）
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
核酸合成で使用する酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでもよく、遺伝子組換え技術によって作製されたものでもよい。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出は、公知の技術によって実現できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いてハイブリダイゼーションを行ったり、蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）で検出したり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲルで電気泳動してバンドとして検出することもできる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなるため、反応液が肉眼で確認できる程度にまで白濁する。したがって、この白濁を指標として、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器を用いて検出できる。例えば、分光光度計を用いて４００ｎｍにおける吸光度の変化を確認することによって、核酸の増幅反応を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する上記の鋳型依存性核酸合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
キットは、本発明のプライマーによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
（実施例１）検出感度の確認：
ＬＡＭＰ法を用いて検出感度を確認した。
１．ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ
（１）細菌懸濁液の調製
実験には、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有することが明らかであるＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＭＫＤＭ１７株（以下、ＭＫＤＭ１７株）を用いた。まず、ＭＫＤＭ１７株の発育コロニーを滅菌生理食塩水でＭｃＦａｒｌａｎｄ＃０．５（１．５Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に懸濁し、ＴＥ緩衝液（ニッポンジーン社）で１０倍ずつ段階的に希釈した。その後、１００℃で１０分間加熱処理し、１３，０００回転／分で５分間遠心分離し、得られた上清を、鋳型ＤＮＡを含む検体とした。
（２）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、ＩＰＦ（配列番号１０）、ＯＰＦ（配列番号４）、ＩＰＢ（配列番号１１）、ＯＰＢ（配列番号１２）、ＬＰＦ（配列番号１３）、ＬＰＢ（配列番号９）を用いた。
（３）ＬＡＭＰ法による増幅反応
ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的配列のＤＮＡ断片を増幅するため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるように、反応混合液を調製した。尚、プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
反応溶液組成：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＩＰＦ
１．６μＭ ＩＰＢ
０．２μＭ ＯＰＦ
０．２μＭ ＯＰＢ
０．８μＭ ＬＰＦ
０．８μＭ ＬＰＢ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）
上記組成の反応溶液２３μＬに各濃度の検体溶液２μＬを加えて最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学社）を用いてＤＮＡ断片の増幅反応を検出した。
図１は、リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。横軸は時間（分）、縦軸は６５０ｎｍでの吸光度（濁度）である。図１に示すように、ＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有したＭＫＤＭ１７株を３×１０１ｃｆｕ／ｔｅｓｔの濃度まで、６０分以内に検出できた。
２．ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ
（１）細菌懸濁液の調製
実験には、ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有することが明らかであるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＥＫＮ７１０８株（以下、ＥＫＮ７１０８株）を用いた。まず、ＥＫＮ７１０８株の発育コロニーを滅菌生理食塩水でＭｃＦａｒｌａｎｄ＃０．５（１．５Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に懸濁し、ＴＥ緩衝液（ニッポンジーン社）で１０倍ずつ段階的に希釈した。その後、１００℃で１０分間加熱処理し、１３，０００回転／分で５分間遠心分離し、得られた上清を、鋳型ＤＮＡを含む検体とした。
（２）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、ＩＰＦ（配列番号２３）、ＯＰＦ（配列番号１７）、ＩＰＢ（配列番号２４）、ＯＰＢ（配列番号２５）、ＬＰＦ（配列番号２６）、ＬＰＢ（配列番号２２）を用いた。
（３）ＬＡＭＰ法による増幅反応
ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的配列のＤＮＡ断片を増幅するため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。尚、プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
反応溶液組成：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＩＰＦ
１．６μＭ ＩＰＢ
０．２μＭ ＯＰＦ
０．２μＭ ＯＰＢ
０．８μＭ ＬＰＦ
０．８μＭ ＬＰＢ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）
上記組成の反応溶液２３μＬに各濃度の検体溶液２μＬを加えて最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学社）を用いてＤＮＡ断片の増幅反応を検出した。
図２は、リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。横軸は時間（分）、縦軸は６５０ｎｍでの吸光度（濁度）である。図２に示すように、ＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有したＥＫＮ７１０８株を３×１０１ｃｆｕ／ｔｅｓｔの濃度まで、６０分以内に検出できた。
３．ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ
（１）細菌懸濁液の調製
実験には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＥＫＮ７１１６株（以下、ＥＫＮ７１１６株）を用いた。まず、ＥＫＮ７１１６株の発育コロニーを滅菌生理食塩水でＭｃＦａｒｌａｎｄ＃０．５（１．５Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に懸濁し、ＴＥ緩衝液（ニッポンジーン社）で１０倍ずつ段階的に希釈した。その後、１００℃で１０分間加熱処理し、１３，０００回転／分で５分間遠心分離し、得られた上清を、鋳型ＤＮＡを含む検体とした。
（２）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、ＩＰＦ（配列番号３５）、ＯＰＦ（配列番号３０）、ＩＰＢ（配列番号３６）、ＯＰＢ（配列番号３７）、ＬＰＢ（配列番号３４）を用いた。
（３）ＬＡＭＰ法による増幅反応
ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的配列のＤＮＡ断片を増幅のため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。尚、プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
反応溶液組成：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＩＰＦ
１．６μＭ ＩＰＢ
０．２μＭ ＯＰＦ
０．２μＭ ＯＰＢ
０．８μＭ ＬＰＢ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）
上記組成の反応溶液２３μＬに各濃度の検体溶液２μＬを加えて最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学社）を用いてＤＮＡ断片の増幅反応を検出した。
図３は、リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。横軸は時間（分）、縦軸は６５０ｎｍでの吸光度（濁度）である。図３に示すように、ＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有したＥＫＮ７１１６株を３×１０１ｃｆｕ／ｔｅｓｔの濃度まで、６０分以内に検出できた。
４．ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ
（１）細菌懸濁液
実験には、ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有することが明らかであるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＣＢ３２６株（以下、ＮＣＢ３２６株）を用いた。まず、ＮＣＢ３２６株の発育コロニーを滅菌生理食塩水でＭｃＦａｒｌａｎｄ＃０．５（１．５Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に懸濁し、ＴＥ緩衝液（ニッポンジーン社）で１０倍ずつ段階的に希釈した。その後、１００℃で１０分間加熱処理し、１３，０００回転／分で５分間遠心分離し、得られた上清を、鋳型ＤＮＡを含む検体とした。
（２）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、ＩＰＦ（配列番号４６）、ＯＰＦ（配列番号４１）、ＩＰＢ（配列番号４７）、ＯＰＢ（配列番号４８）、ＬＰＦ（配列番号４９）を用いた。
（３）ＬＡＭＰ法による増幅反応
ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的配列のＤＮＡ断片を増幅のため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。尚、プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。
反応溶液組成：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭ ＩＰＦ
１．６μＭ ＩＰＢ
０．２μＭ ＯＰＦ
０．２μＭ ＯＰＢ
０．８μＭ ＬＰＦ
８Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ社）
上記組成の反応溶液２３μＬに各濃度の検体溶液２μＬを加えて最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学社）を用いてＤＮＡ断片の増幅反応を検出した。
図４は、リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。横軸は時間（分）、縦軸は６５０ｎｍでの吸光度（濁度）である。図４に示すように、ＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を保有したＮＣＢ３２６株を３×１００ｃｆｕ／ｔｅｓｔの濃度まで、６０分以内に検出できた。
（実施例２）プライマーの評価（特異性試験）：
実験には、メタロ−β−ラクタマーゼ阻害剤であるメルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含有ディスクを用いた試験でメタロ−β−ラクタマーゼ産生株であると確認した９０菌株を用いた。各菌株の発育コロニーに、それぞれの菌株を精製水に懸濁し、１００℃で１０分間加熱処理したものを検体とし、実施例１に記載の各々のＬＡＭＰ法の反応溶液２０μＬに検体５μＬを添加して、ＬＡＭＰ法による増幅反応を行うことにより遺伝子型を評価した。
対照実験として、同一の検体を、Ｐ−Ｆ１（配列番号５０）及びＰ−Ｒ１（配列番号５１）、Ｐ−Ｆ２（配列番号５２）及びＰ−Ｒ２（配列番号５３）、並びにＰ−Ｆ３（配列番号５４）及びＰ−Ｒ３（配列番号５５）の各々のプライマーセットを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。
Ｐ−Ｆ１及びＰ−Ｒ１の組合せでＤＮＡ断片の増幅が認められたものは、増幅されたＤＮＡ断片を精製し、ＤＮＡシーケンサーによる解析を行い、決定された塩基配列からＩＭＰ−１型又はＩＭＰ−１１型であると判定した。Ｐ−Ｆ２及びＰ−Ｒ２の組合せでＤＮＡ断片の増幅が認められたものは、ＩＭＰ−２型と判定した。Ｐ−Ｆ３及びＰ−Ｒ３の組合せで増幅が認められたものは、ＶＩＭ−２型と判定した。
表１は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生株である上記９０菌株のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が、ＬＡＭＰ法とＰＣＲ法とによる解析でどの遺伝子型に分類されたかを比較するためにまとめた表である。
Figure 2007195421
その結果、いずれの方法でも９０菌株のすべてが、ＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型及びＶＩＭ−２型の４種類の遺伝子型に分類され、ＬＡＭＰ法とＰＣＲ法とによる結果は一致した。このことより、ＩＭＰ−１型、ＩＭＰ−２型、ＩＭＰ−１１型及びＶＩＭ−２型の各々のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子検出用のＬＡＭＰ法のプライマーセットは、各々のメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を特異的に検出することが判明した。
リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。 リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。 リアルタイム濁度法によるＩＭＰ−１１型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。 リアルタイム濁度法によるＶＩＭ−２型メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子のＬＡＭＰ法の検出感度を示す図である。

Claims (27)

  1. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を検出するのに用いるプライマーであって、
    メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列又はそれと相補的な塩基配列、に含まれる連続した少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマー、又は、
    前記プライマーとストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも１０以上の塩基配列を備えるプライマー。
  2. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列が、
    配列表の配列番号１に示され、
    該塩基配列の塩基番号４６５〜７４１から選ばれた任意の塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、に含まれる、
    請求項１記載のプライマー。
  3. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子から選ばれた配列表の配列番号２〜９に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、から選ばれた、
    請求項２記載のプライマー。
  4. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列が、
    配列表の配列番号１４に示され、
    該塩基配列の塩基番号４６７〜７４１から選ばれた任意の塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、に含まれる、
    請求項１記載のプライマー。
  5. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子から選ばれた配列表の配列番号１５〜２２に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、から選ばれた、
    請求項４記載のプライマー。
  6. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列が、
    配列表の配列番号２７に示され、
    該塩基配列の塩基番号４５２〜６９５から選ばれた任意の塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、に含まれる、
    請求項１記載のプライマー。
  7. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子から選ばれた配列表の配列番号２８〜３４に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、から選ばれた、
    請求項６記載のプライマー。
  8. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列が、
    配列表の配列番号３８に示され、
    該塩基配列の塩基番号３９〜２６６から選ばれた任意の塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、に含まれる、
    請求項１記載のプライマー。
  9. 前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子から選ばれた配列表の配列番号３９〜４５に示す塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列、から選ばれた、
    請求項８記載のプライマー。
  10. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の５’側から、塩基配列領域としてＢ３、Ｂ２及びＢ１を選択し、
    前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃを選択し、
    前記Ｂ３、Ｂ２及びＢ１の相補的塩基配列を、それぞれＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃとし、
    前記Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃに相補的な塩基配列を、それぞれＦ３、Ｆ２及びＦ１としたとき、
    以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに該当する塩基配列からなる、請求項１〜９のいずれか一項記載のプライマー。
    （ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列。
    （ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列。
    （ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列。
    （ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列。
  11. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、
    以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる、
    請求項１〜３及び１０のいずれか一項記載のプライマー。
    （ａ）５’−（配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３に示す塩基配列）−３’。
    （ｂ）５’−（配列番号６に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
  12. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、
    以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる、
    請求項１、４〜５及び１０のいずれか一項記載のプライマー。
    （ａ）５’−（配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１６に示す塩基配列）−３’。
    （ｂ）５’−（配列番号１９に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２０に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
  13. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、
    以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる、
    請求項１、６〜７及び１０のいずれか一項記載のプライマー。
    （ａ）５’−（配列番号２８に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号２９に示す塩基配列）−３’。
    （ｂ）５’−（配列番号３１に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３２に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
  14. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子又はその相補鎖から選択される標的領域のＤＮＡ断片を増幅し、かつ、
    以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる、
    請求項１及び８〜１０のいずれか一項記載のプライマー。
    （ａ）５’−（配列番号３９に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４０に示す塩基配列）−３’。
    （ｂ）５’−（配列番号４３に示す塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４４に示す塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
  15. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
    配列表の配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーと、
    を含む、プライマーセット。
  16. 配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び／又は配列表の配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含む、
    請求項１５記載のプライマーセット。
  17. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
    配列表の配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーと、
    を含む、プライマーセット。
  18. 配列表の配列番号２２及び／又は配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含む、
    請求項１７記載のプライマーセット。
  19. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
    配列表の配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号３５に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号３６に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号３７に示す塩基配列からなるプライマーと、
    を含む、プライマーセット。
  20. 配列表の配列番号３４に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含む、
    請求項１９記載のプライマーセット。
  21. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子をＬｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
    配列表の配列番号４１に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号４６に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号４７に示す塩基配列からなるプライマーと、
    配列表の配列番号４８に示す塩基配列からなるプライマーと、
    を含む、プライマーセット。
  22. 配列表の配列番号４９に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含む、
    請求項２１記載のプライマーセット。
  23. メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の検出方法であって、
    検体中に含まれる前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子を鋳型に、請求項１〜１４のいずれか一項記載のプライマー又は請求項１５〜２２のいずれか一項記載のプライマーセットを用いて、前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、
    前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合に、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が存在し、前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合に、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子が存在しないと判断する判断工程と、
    を含む、検出方法。
  24. β−ラクタム薬耐性菌の検出方法であって、
    検体中に含まれる前記β−ラクタム薬耐性菌のゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１〜１４のいずれか一項記載のプライマー又は請求項１５〜２２のいずれか一項記載のプライマーセットを用いて、前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、
    前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合に、β−ラクタム薬耐性菌が存在し、前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合に、β−ラクタム薬耐性菌が存在しないと判断する判断工程と、
    を含む、検出方法。
  25. 前記増幅工程において、前記メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を、Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法によって増幅させることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の検出方法。
  26. 細菌のβ−ラクタム薬耐性の判定方法であって、
    被検細菌のゲノムＤＮＡを鋳型に、請求項１〜１４のいずれか一項記載のプライマー又は請求項１５〜２２のいずれか一項記載のプライマーセットを用いて、Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法によって、メタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させる増幅工程と、
    前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅された場合に、β−ラクタム薬耐性であると判断し、前記標的領域のＤＮＡ断片が増幅されなかった場合に、β−ラクタム薬感受性であると判断する判断工程と、
    を含む、判定方法。
  27. 請求項１〜１４のいずれか一項記載のプライマー又は請求項１５〜２２のいずれか一項記載のプライマーセットと、
    ＤＮＡポリメラーゼと、
    ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと、
    マグネシウム塩又はマンガン塩である補助因子と、
    を含む、
    β−ラクタマーゼ遺伝子の検出キット。

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