JP6358753B2 - カルバペネム系薬耐性菌(KPCβ−ラクタマーゼ産生菌)の検出方法 - Google Patents
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Description
カルバペネム系薬(carbapenem)耐性グラム陰性桿菌が世界的規模で報告されている。この耐性は主に、カルバペネマーゼ(carbapenemase)遺伝子の獲得の結果として生じる(非特許文献1、2)。多種類のカルバペネマーゼが同定されているが、これらは3クラスのβ-ラクタマーゼ(β-lactamases)に分類される:アンブラー(Ambler)クラスA、BおよびDのβ-ラクタマーゼである(非特許文献3)。カルバペネマーゼは抗生物質ペニシリン系とセファロスポリン系のみならずカルバペネム系も加水分解して、その抗菌効果を無効にする。特効薬であるカルバペネム系薬まで無効にするため、カルバペネマーゼ産生菌の出現は感染症治療において脅威となっている。
KPC産生菌の検出法は感受性試験法を改良したHodge testなどに限られている(非特許文献9)。その他のカルバペネマーゼであるIMP型β-ラクタマーゼ(クラスB)やOXA-48型β-ラクタマーゼ(クラスD)などに対する検出法とは異なるため、KPC産生菌を見逃すことで誤った治療を施すことがある。日本など検出率の低い地域ではKPC産生菌を見逃すことで耐性菌の蔓延を招く可能性がある。臨床現場でのKPC産生菌の迅速検出法の開発は感染症治療と感染制御の上で重要である。腸内細菌科を含むグラム陰性桿菌の幾つかの菌種からKPC β-ラクタマーゼ遺伝子(KPC-2 β-ラクタマーゼ遺伝子)が同定され(非特許文献10)、この遺伝子を標的とするKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出が検討されている。ただし、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子には構造的変異を有する変異体(KPC-3〜KPC-17)が世界中で報告されており(非特許文献11−13)、全ての種類のKPC β-ラクタマーゼ産生菌を迅速に検出する手段は見出されていない。
短時間でのDNA増幅法としてLAMP(loop-mediated isothermal amplification)法が知られている(特許文献1、非特許文献14−16)。このLAMP法は等温条件下(60〜69℃、30〜60分間)で標的DNA配列を増幅する方法であり、PCR法では不可欠な温度制御が不要であるという利点を有している。また、標的DNA配列の増幅に際して高い特異性と感度を有しており、結果は裸眼でも判定可能である(非特許文献17)。さらに、以下のような利点をも有している:PCR法は血清および血漿のへパリンによって抑制されることが知られているが(非特許文献18)、LAMP法はこれらによって影響されない;LAMP法の感度は非標的DNAの存在によって影響を受けない(非特許文献13);サンプルからのDNA精製を必要としない(非特許文献19)。LAMP法によるβ-ラクタマーゼ遺伝子の検出としては、IMP型β-ラクタマーゼ遺伝子の検出(特許文献2)や、NDM型 β-ラクタマーゼ遺伝子の検出(非特許文献20)が知られている。
FIP:5′-AGCCGCCAAAGTCCTGTTCGAGCCACCGCGCTGACCAA-3′(F1c+F2):配列番号2
BIP:5′-CATCGGTGTGTACGCGATGAGCTGCACAGTGGGAAG-3′(B1+B2c):配列番号3
F3: 5′-CGCTGGCTGGCTTTTCTG-3′:配列番号4
B3: 5′-CACAGCGGCAGCAAGAA-3′:配列番号5
LB: 5′-GGCGCAACTGTAAGTTACCG-3′:配列番号6
FIP:5′-GGAGCCGCCAAAGTCCTGTTCGCCACCGCGCTGACCAA-3′(F1c+F2):配列番号7
BIP:5′-ATACCGGCTCAGGCGCAACGAGCTGCACAGTGGGAAG-3′(B1+B2c):配列番号8
F3: 5′-CGCTGGCTGGCTTTTCTG-3′:配列番号4
B3: 5′-CACAGCGGCAGCAAGAA-3′:配列番号5
LF: 5’-ATGGTTCCGCGACGAGG-3’:配列番号9
LB: 5′-TGTAAGTTACCGCGCTGAGG-3′:配列番号10
1.方法
(1)菌株
KPC-2を産生するK. pneumoniae ATCC BAA-1705株をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から購入し、参考株として用いた。LAMP法のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出感度を評価するため15の菌株を用いた。これらのうち、KPC-2 β-ラクタマーゼを産生する4菌株(Escherichia coli、Salmonella enterica、Pseudomonas aeruginosaおよび Acinetobacter baumannii)をポジティブコントロールとして用いた。また、以下の各β-ラクタマーゼを産生する11種の菌株(E. coli、K. pneumoniae、A. baumanniiおよびP. aeruginosa)をネガティブコントロールとして用いた:クラスA(CTX-M-2、CTX-M-9、TEM-1およびSHV-1)(Nakano, R., Nakano, A., Abe, M., Inoue M. & Okamoto R. (2012). Regional outbreak of CTX-M-2 β-lactamase-producing Proteus mirabilis in Japan. J Med Microbiol 61(Pt 12), 1727-1735)、クラスB(IMP-1、NDM-1およびVIM-2)(非特許文献3、table of contents)、クラスC(CMY-4、MOX-1およびDHA-1)(Nakano, R., Okamoto, R., Nagano N. & Inoue M. (2007). Resistance to gram-negative organisms due to high-level expression of plasmid-encoded ampC β-lactamase blaCMY-4 promoted by insertion sequence ISEcp1. J Infect Chemother 13, 18-23)、およびクラスD(OXA-48)(Nagano, N., Endoh, Y., Nagano, Y., Toyama, M., Matsui, M., Shibayama K. & Arakawa Y. (2013). First Report of OXA-48 Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan from a Patient Returned from Southeast Asia. Jpn J Infect Dis 66, 79-81)。
LAMP法の適切な温度を決定するため、Genopure Plasmid Midi Kit (Roche, Germany)を用いてK. pneumoniaeATCC BAA-1705株からプラスミドDNAを抽出した。LAMP法の特異性と感度を検定するため、ゲノムDNAおよびプラスミドDNAを含む細菌のトータルDNAを、90℃で10分間加熱することによって抽出した。
LAMP法は、25μl容量の反応溶液中でLoopamp DNA amplification kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) を用いて行った(非特許文献14、15)。反応溶液の組成は以下のとおりである:5個のプライマーのセット、すなわち2個のインナープライマー(FIPおよびBIP、各40 pmol)、2個のアウタープライマー(F3およびB3、各5 pmol)およびループプライマー(LB、20 pmol);1 μlのBst DNA ポリメラーゼ(8 units);2 μlの鋳型DNA;およびキットに付属の12.5 μl 反応溶液。LAMP反応は、Loopamp real-time turbidimeter (LoopampEXIA; Eiken Chemical)のもとで6秒毎に650 nmの濁度計測を行いながら、60℃から69℃の範囲の等温条件で50分間行い、5分間80℃で反応を停止させた。
LAMPプライマーセットの候補は、KPC-2〜KPC-17 β-ラクタマーゼ遺伝子のヌクレオチド配列(GenBank/AY034847、AB557734、FJ473382、EU400222、EU555534、EU729727、FJ234412、FJ624872、GQ140348、HM066995、HQ641421、HQ342890、JX524191、KC433553、KC465199およびKC465200)に基づき、Primer Explorer version V4 software (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)を用いて設計した。3つのプライマーセットの候補うち、KPC-2〜KPC-17 β-ラクタマーゼ遺伝子の相同領域から設計され、最短時間で標的遺伝子を増幅することのできる適切なプライマーを選択した。LAMPアッセイの最初の標準化と最適化は同一の反応条件下で行った。選択したプライマーセット(A)を図1に示した。また、各プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号2−6である。
LAMPアッセイによるKPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出感度を決定するため、培養したK. pneumoniae ATCC BAA-1705株から抽出したDNAの段階希釈液(106-100CFU per reaction)を用いた。さらに、感度の比較対象として、文献(Poirel, L., Walsh, T. R., Cuvillier V. & Nordmann, P. (2011). Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes. Diagn Microbiol Infect Dis 70, 119-123)記載の方法に基づきPCR増幅を実施した。LAMP産物およびPCR産物は1.2%アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、UV光の下で可視化した。
KPC β-ラクタマーゼ産生菌を含む臨床検体より、培地にて産生菌を分離培養することなく直接LAMPアッセイにより検出できる感度を測定した。健常人から提供された検体(喀痰、尿、便、血液)にKPC-2産生K. pneumoniae ATCC BAA-1705を107〜100、0 CFU/mlになるように添加したものをサンプルとして用いた。MORA-EXTRACT(極東製薬)を用いて、それぞれの検体からDNAを直接抽出し、LAMP法を試した。比較として同じサンプルを用いてPCR法を行った。
LAMP反応の確度を確認するため、BigDye Terminator kit(Applied Biosystems)およびDNA Sequencer ABI Prism310(Applied Biosystems)を用いて、メーカーの指示のとおりにLAMP産物の配列決定を行った。
反応混合物を60℃から69℃でインキュベートすることによって、効果的な増幅のための至適温度を特定した(図2)。濁度測定により、増幅のための至適温度は68℃であることが確認された。また、ループプライマー添加による反応効率を確認したところ、初期増幅の時間はループプライマーがない場合は約36分間であるのに対し、有りの場合は約15分間に短縮された。創出したループプライマーが反応速度を加速させるのに適当であることが見いだされた。
図7(下段)に示した6個のプライマーセット(B)を用いたことを除き、実施例1と同様の方法によって菌株から抽出したDNAを対象としてLAMP法の感度を測定した。
結果は図7(上段)に示したとおりであり、プライマーセット(B)を用いた場合でも100 CFU濃度の細菌の標的遺伝子を検出することが可能であることが確認された。また、臨床検体(喀痰、尿、便、血液)を対象とした場合も、100CFU濃度のKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出することが可能であった。
Claims (10)
- Klebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC) β-ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、検体中の腸内細菌科を含むグラム陰性桿菌のDNAを鋳型とするLAMP(loop-mediated isothermal amplification)法によって配列番号1のヌクレオチド配列を増幅し、前記ヌクレオチド配列が増幅された場合に、検体中に含まれるグラム陰性桿菌がKPC-2からKPC-17のいずれかのβ-ラクタマーゼ産生菌であることを15分から40分で判定することを特徴とする方法。
- LAMP法に使用するプライマーが、配列番号2−5のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項1の方法。
- LAMP法に使用するプライマーが、配列番号2−6のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項1の方法。
- LAMP法に使用するプライマーが、配列番号7、8、4、5のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項1の方法。
- LAMP法に使用するプライマーが、配列番号7、8、4および5、または配列番号7、8、4、5と配列番号9または10、もしくは配列番号7、8、4、5と配列番号9および10のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項1の方法。
- KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号2−5のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
- KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号2−6のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
- KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号7、8、4および5のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
- KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号7、8、4、5と配列番号9または10、もしくは配列番号7、8、4、5、9および10のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
- 請求項6から9のいずれかに記載のプライマーセット、DNAポリメラーゼおよびLAMP反応混合物を含むKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出キット。
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