KR101425149B1 - 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법에 관한 것으로, 2쌍의 결핵균 특이 프라이머를 사용한 본 발명의 one-tube nested PCR방법은 신속하고 결핵균에 특이적이며 높은 민감도를 가지고 있어서 결핵 진단에 있어서 유용하다.

Description

원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법{Improved method for diagnosing Mycobacterium tuberculosis using one-tube nested real-time PCR}
본 발명은 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법에 관한 것으로, 2쌍의 결핵균 특이 프라이머를 사용한 본 발명의 one-tube nested PCR방법은 신속하고 결핵균에 특이적이며 높은 민감도를 가지고 있어서 결핵 진단에 있어서 유용하다.
일반적으로 결핵 (tuberculosis)은 인형결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 주로 호흡기가 감염되어 일어나는 전염성 질환 중의 하나로 세계 인구의 1/3 정도가 결핵균에 감염된 것으로 추정하며, WHO 2010년 통계를 보면 한 해에 880만 명의 새로운 결핵 환자가 발생하고 110만 명이 결핵으로 사망하는 주요한 질환이다 (Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Mitchell RN. Robbins Basic Pathology. 2007. 8th Edition. p.152-160. Saunders Elsevier. Collingwood, Canada.; World Health Organization (WHO). Global tuberculosis control: WHO report 2011. 2011). 국내에서도 결핵 유병률은 한때 감소 추세를 보였으나 여성 및 어린이 등의 결핵환자가 증가하고 있어 사회적 문제로 대두되고 있다. 이러한 결핵의 발병률과 사망률을 낮추기 위해서는 결핵의 치료와 관리가 중요하며 결핵균에 대한 신속하고 특이적이며 민감한 검사법이 필요한 실정이다 (World Health Organization (WHO). Diagnostics for tuberculosis: global demand and market potential. 2008).
결핵의 검사실 진단 방법으로 세균학적 검사법인 항산균 도말 검사, 항산균 배양 검사법이 널리 쓰이고 있다. 전통적으로 이용되는 항산균 도말 검사는 저렴하고 신속하게 검사 결과를 얻을 수 있어 세계적으로 널리 사용되고 있지만, 결핵균 수가 5 × 103 ~ 4개 이상 있어야 검출할 수 있어 배양검사보다 민감도가 낮으며 결핵균과 비결핵항산균을 구별할 수 없다는 한계점이 있다(Bates JH. Diagnosis of tuberculosis. Chest. 1979. 76: 757-763; Kent P, Kubica G. Public health mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. 1985. p.57-68. US Public Health service. Washington DC: US Government Printing Office). 이에 비하여 배양 검사는 결핵 진단의 표준법으로 결핵균이 101 ~ 2 개 있어도 검출할 수 있고 특이도가 높은 장점이 있으나, 결핵균의 특성상 오랜 시간 (4주 ~ 8주)이 소요되어 신속한 결핵 진단에 한계가 있다 (Tenover FC, Crawford JT, Huebner RE, Geiter LJ, Horsburgh CR, Jr., Good RC. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? J Clin Microbiol. 1993. 31: 767-770; Woods GL. Molecular techniques in mycobacterial detection. Arch Pathol Lab Med. 2001. 125: 122-126). 그리고 객담을 검체로 사용하여 검사할 경우 폐 외 결핵의 진단이 어려우며 객담을 잘 받지 못하는 환자 및 어린이, 여성 환자의 경우와 결핵과 HIV 혼합감염이 있는 경우에는 환자의 호흡기를 통한 건락 괴사 및 항산균의 수를 감소시키는 경향을 보이고 있어 결핵의 진단이 어려운 실정이다.
이에 더 신속하고 정확한 검사를 위해 분자생물학적 방법인 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR), 실시간-중합효소연쇄반응 (real-time PCR)등으로 결핵균의 DNA를 확인하는 핵산증폭 검사 (nucleic acid amplification test, NAAT)가 개발된 바 있다 (Beavis KG, Lichty MB, Jungkind DL, Giger O. Evaluation of Amplicor PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens. J Clin Microbiol. 1995. 33: 2582-2586; Woods GL. Molecular techniques in mycobacterial detection. Arch Pathol Lab Med. 2001. 125: 122-126). 대표적인 NAAT 중 하나인 PCR은 검체 DNA의 특이 부위를 235개 이상 증폭하여 이를 전기영동으로 확인하여 (Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988. 239: 487-491) 도말 검사 및 배양 검사보다 당일 내로 빠르고 정확한 결과를 제공할 수 있으나, 방법상 숙련도가 필요하고 DNA 증폭산물로 인한 핵산 진단 검사 환경의 오염으로 위양성 결과를 유발하는 단점이 있다 (Kitchin PA, Szotyori Z, Fromholc C, Almond N. Avoidance of PCR false positives. Nature. 1990. 344: 201; Levidiotou S, Vrioni G, Galanakis E, Gesouli E, Pappa C, Stefanou D. Four-year experience of use of the Cobas Amplicor system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory and nonrespiratory specimens in Greece. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2003. 22: 349-356; Tang YW, Meng S, Li H, Stratton CW, Koyamatsu T, Zheng X. PCR Enhances acid-fast bacillus stain-based rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2004. 42: 1849-1850). 이에 더 편리하고 안전한 검사를 위해 형광 염료를 표지한 특이 oligonucleotide probe를 이용하여 증폭산물을 실시간 확인할 수 있는 real-time PCR이 결핵진단에 많이 사용되고 있다 (Kraus G, Cleary T, Miller N, Seivright R, Young AK, Spruill G, Hnatyszyn HJ. Rapid and specific detection of the Mycobacterium tuberculosis complex using fluorogenic probes and real-time PCR. Mol Cell Probes. 2001. 15: 375-383). Real-time PCR을 기반으로 한 상용화된 연구나 키트들은 대부분 single Real-time PCR 수행하여 동정 및 진단에 사용하고 있다.
그러나 검체 중 적은 수의 결핵균이 존재하는 객담은 결핵균을 확인하기 위해 AFB염색법을 사용하며 양성으로 확인하려면 최소한 객담 1ml 당 균수가 105 개 이상 존재시에만 가능하다. 이렇게 검체 내에 적은 양으로 존재하는 결핵균을 진단하기 위해서는 민감한 진단방법이 필요한 실정이다. 또한 결핵환자 중 신장 결핵환자는 검체를 소변으로 사용 시 결핵균 검출이 용이하나, 그 외의 경우에는 소변으로 결핵균을 검출하기가 어려운 실정이다. 하지만 폐결핵의 경우에도 폐에서 결핵균이 분해되어 핵산(cell-free nucleic acid)이 다시 혈액 순환계를 통해 신장으로 들어가 소변으로 배출되므로 소변에서 결핵균 DNA(transrenal DNA)를 검출할 수 있다고 알려져 있다. 하지만 소변으로 배출되는 결핵균의 대부분이 신장의 사구체망에서 걸러지기 때문에 소변으로 결핵균이 배출되기 위해서는 신장의 사구체망에서 걸러지지 않을 정도로 작은 결핵균이 검출되며, 약 70 kDa이나 100 bp이하 크기의 핵산이 소변에서 결핵균을 검출할 수 있다고 알려져 있다 (Green C, Huggett JF, Talbot E, Mwaba P, Reither K and Zumla AI. Rapid diagnosis of tuberculosis
through the detection of mycobacterial DNA in urine by nucleic acid amplification methods.Lancet Infect Dis. 2009 Aug;9(8):505-11).
증폭의 표적으로 사용한 IS6110은 copy수가 1 ~ 20 copy가 존재하여, 여러 연구에서 IS6110을 표적으로 한 PCR이 민감도가 제일 높은 것으로 알려져 있다. 그러나 MTB complex 염기서열이 여러 NTM과 유사한 부분이 있는 단점이 있으며 최근 MTB strain 중에 이 유전자를 가지고 있지 않는 균주들도 보고되고 있다. 그래서 표적으로 RNA polymerase로 작용하는 rpoB 유전자를 동시에 증폭시킴으로써 위양성 및 위음성 문제를 해결하여 민감하고 특이적인 real-time PCR을 제작하고자 하였다.
PCR의 응용기법 중 이중 중합효소 연쇄반응(nested PCR)은 PCR 증폭의 특이성과 민감도를 증가시킬 수 있는 기법으로 대개 순도가 낮은 DNA나 RNA를 증폭하고자 할 때 이용한다. 이 방법은 2종류의 primer에 의해 연속적인 PCR로서 목적 유전자의 primer를 이용하여 1st PCR을 수행하고 1 번째 PCR산물의 안쪽에 위치한 2 번째 primer를 사용하여 2nd PCR을 수행한다,
본 발명에서는 real-time PCR을 수행 시, 2개의 유전자를 사용하고, 각 유전자에 특이적인 2쌍의 primer들을 같은 tube 안에 넣어서 증폭시키는 one-tube nested PCR을 이용하여 기존의 real-time PCR보다 특이도와 민감도를 향상시켜 다양한 검체에서 결핵 진단법을 제공하고자 한다.
관련특허로 대한민국특허공개번호 제1020030063935호, 미코박테리움속 균종의 ｈｓｐ65 유전자 증폭용 프라이머및 이를 이용한 미코박테리움속 균종의 동정방법은 미코박테리움속 균종에 특이적인 프라이머쌍, 및 이를 이용한 미코박테리움속 균종의 동정방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 미코박테리움속 균종의 hsp65 유전자를 증폭하는 프라이머쌍, 이를 이용하여 미코박테리움속 균종의 hsp65 유전자를 PCR(Polymerase Chain Reation) 증폭하고, 증폭된 핵산내에 존재하는 특정제한효소 부위를 이용한 RFLP 분석(Restriction Fragment Length Polymorphism Anaylsis)으로 미코박테리움속 균종을 동정하는 방법에 관한 것이 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 특이도와 민감도를 향상시켜 다양한 검체에서 결핵 진단법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특이도와 민감도를 향상시켜 다양한 검체에서 결핵을 진단할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 검체에서 결핵을 진단할 수 있는 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 9의 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 키트는 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하고, 상기 프로브는 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프로브인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것이 바람직하고, 상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3' 말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 블랙 홀 켄처(black hole quencher)-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 결핵균은 Mycobacterium tuberculosis,M. bovis, M. africanum, M. canetii, 및 M. microti로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 샘플로부터 DNA를 얻고, 그 DNA를 주형으로 하여서 실시간(real-time) PCR을 수행할 때, 첫 번째 프라이머로 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 6 내지 7의 프라이머를, 두 번째 프라이머로 서열번호 3 내지 4 및 서열번호 8 내지 9의 프라이머를 그 DNA와 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 단계를 포함하는 결핵균 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 튜브는 프로브를 더욱 포함하고, 상기 프로브는 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프로브인 것이 바람직하며, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위한 중합효소, 버퍼 증류수 및 dNTP 등을 포함하며, 사용 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라미어 농도는 10피코그램(pg)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 샘플은 객담, 소변 혈액 또는 종양 조직인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 a) 하나의 튜브에 존재하는 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 9의 프라이머 조성물에 시료로부터 추출한 균의 DNA를 혼합하여 유전자 분석 시료를 준비하는 단계; b) 단계(a)의 유전자 분석 시료에 실시간 Nested PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;c) 단계(b)의 PCR 산물을 정량하여 정량 곡선을 수득하는 단계; 및 d) 상기 정량 곡선을 이용하여, 시료로부터 추출한 균의 DNA에 존재하는 rpoB 및 IS6110 유전자 특이 유전자를 정량하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 Nested 실시간(Real-time) PCR을 이용하여 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 첫 번째 프라이머로 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 6 내지 7의 프라이머를, 두 번째 프라이머로 서열번호 3 내지 4 및 서열번호 8 내지 9의 프라이머를 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시켜서 Mycobacterium tuberculosis,M. bovis, M. africanum, M. canetii, 및 M. microti로 구성된 군으로부터 선택된 결핵균에 대한 민감도 및 특이성을 개선하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
Mycobacterium tuberculosis의 표준균주를 사용하여 민감도를 비교 분석한 결과, one tube nested Real-time PCR을 이용한 진단법이 single Real-time PCR을 이용한 진단법보다 약 100배 이상 민감도가 높다는 점도 확인할 수 있었다.
Nested PCR 방법 중 two-tube nested PCR은 보통 시료의 DNA양이 매우 제한되어 있어 한번의 PCR로는 검출할 수 없는 경우에 많이 사용하며, 첫 번째 중합효소 연쇄반응을 실시하고 여기서 나온 산물로 두 번째 증폭을 할 때에는 다시 새로운 시약을 첨가하기 때문에 반응이 원활하게 일어날 수 있으며, 한 쌍의 primers가 비교적 적은 횟수의 반응을 하여 기존의 PCR에 비해 100배 정도의 민감도와 특이성이 높일 수 있는 장점을 가지고 있다.
하지만 tube를 바꾸어 두 번의 증폭과정을 거치면서 오염의 문제가 종종 발생하기도 하는데, 이러한 문제를 해결하고자 하나의 tube에 2쌍의 primer를 같이 넣어 one-tube nested PCR을 시도하여, 오염의 문제를 줄이는 동시에 민감도 부분에서도 기존의 PCR보다 좋은 결과가 나타남을 확인할 수 있었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 배양하지 않고 직접 결핵균의 유무를 진단하거나, 객담검체와 같은 병원체의 수가 소량인 검체나 소변검체에서 2쌍의 결핵균 특이 primer를 사용한 one-tube nested PCR방법은 신속하고 결핵균에 특이적이며 높은 민감도를 가지고 있어서 결핵 진단에 있어서 유용하다.
도 1은 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 rpoB유전자의 single real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 2는 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 rpoB유전자의 one tube nested Real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 3은 프라이머 농도를 조절한 single real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 4는 증폭주기와 프라이머 농도를 조절한 single real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
a) 10p primer 농도로 사용하여 10, 40 cycle 수행한 single real-time PCR의 민감도
b) 20p primer 농도로 사용하여 10, 40 cycle 수행한 single real-time PCR의 민감도
도 5는 프라이머 농도에 따른 one tube nested Real-time PCR의 결핵균 검출민감도 비교한 그림;
도 6은 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 IS6110유전자의 single Real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 7은 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 IS6110유전자의 one tube nested Real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 8은 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 rpoB유전자와 IS6110유전자의 Dual-one tube nested Real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림;
도 9는 결핵균 표준균주 H37Rv DNA를 사용하여 rpoB유전자와 IS6110유전자의 Dual-one tube nested Real-time PCR의 민감도를 나타낸 그림이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 표준 균주 DNA 분리
표준균주로 사용한 Mycobacterium tuberculosis H37Rv(ATCC 25618) 균주를 연세대학교 미생물학교실에서 분양받아 다음과 같은 방법으로 DNA를 분리하였다(Lemarkchand et al., 2005). 50ul의 10mg/ml lysozyme(Sigma Chem. Co., USA)을 넣고 잘 섞은 후, 37℃에서 밤새도록 반응시킨다. 5ul의 10mg/ml proteinase K(Sigma Chem. Co., USA) 5ul와 70ul의 10%(w/v) SDS(Sodium Dodexyl Sulfate, Sigma Chem. Co., USA)를 넣고 잘 섞은 후, 65℃에서 10분간 반응시킨다. 100ul의 5M NaCl(Sodium Chloride, Ducksan, Korea)을 넣고 섞은 후, 65℃로 미리 데워놓은 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, SigmaChem. Co., USA)를 100ul 넣고 잘 섞고 65℃에서 10분간 반응시킨다. Chloroform:isoamylalcohol (=24:1(v/v)) 700ul를 넣고 잘 섞은 후 원심분리한다. DNA를 포함하는 상층액만을 새로운 튜브로 옮기고 450ul의 isopropanol(Ducksan, Korea)을 넣고 섞은 후 -20℃에 30분간 DNA를 침전시킨다. 4℃, 12,000rpm으로 30분간 원심분리 후, 상층액을 따라내고 1ml의 70% ethanol를 넣고 튜브 5회 가량 뒤집는다. 다시 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 따라 버리고 30분 간 건조시킨후, 50ul의 TE에 DNA를 녹인다. 녹인 DNA는 농도를 확인한 후에 1ng/ul로 희석하여 PCR에 사용한다. 배양이 실패할 경우를 대비해서 균체의 일부는 400ul TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 잘 풀어준 후, 위와 동일한 과정으로 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA는 농도를 확인하고 10배 계대희석하여 real-time PCR에 사용하였다.
실시예 2: 임상 검체 분리
제공받은 임상검체 중 객담 검체에서 핵산은 다음과 같은 과정으로 분리하였다. 전처리 과정으로 객담과 동량의 4% NaOH(3ml)를 5분간 실온에서 처리하고 4℃, 200 x g 에서 10분간 원심분리하였다. 분리된 상층액을 제거한 후 멸균 PBS 1ml(pH7.4)을 이용해 세척을 한 후 원심분리를 하였다. 분리된 상층액을 제거한 후 1ml의 TRIZOL reagent를 첨가하고 0.2mm 글래스 비드를 넣고 Precellys 24(Bertin Technologies, bis Avenue Ampeere, Montigny-le-Bretonneux,프랑스)에서 60초간 2회 bead-beating하고, 4℃, 12,000xg에서 15분간 원심분리하여 상층액 층을 새로운 1.5ml 마이크로센트리푸즈 튜브에 옮겨 DNA와 RNA를 분리하였다.
제공받은 임상검체 중 소변검체 DNA는 다음과 같은 과정으로 분리하였다. 소변검체 1 ml을 1.5ml 마이크로센트리푸즈 튜브에 각각 분주 한 후 15,000xg로 3 분 원심분리 후 상층액을 제거하고 멸균 PBS 1ml(pH7.4)을 첨가한 후 강하게 vortex한 다음 15,000xg로 3 분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 같은 과정을 2 회 반복하여 세척하였다. 세척과정 후 resin이 들어있는 DNA 추출용 buffer 50 ㎕를 첨가하고 100℃ 에서 20 분 끓인 후 15,000xg로 3 분간 원심 한 후 상층액을 DNA로 사용하였다.
실시예 3: Single Real - time PCR 수행
결핵균 특이적인 타겟으로 rpoB 유전자와 IS6110 유전자를 사용하였으며 각각 유전자를 다음과 같은 방법으로 single real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR의 반응물의 조성은 2x real-time PCR master mix (TOYOBO, osaka, Japan)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe는 10pmole을 넣어 주고, DNA를 5ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행한다. 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 표1과 같다.
PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 30초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
One tube nested real-time PCR과 같은 조건에서의 비교를 위해 Forward primer와 Reverse primer를 각각 20pmole을 넣어주고, PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 30초인 사이클을 50회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
실시예 4: One tube nested real - time PCR 수행
rpoB와 IS6110 유전자에서 결핵균 특이적인 부위를 선정하여 one tube nested real-time PCR을 수행하고, 특이도와 민감도를 향상시키기 위해 rpoB와 IS6110 유전자를 동시에 사용하여 One tube nested real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR의 반응물의 조성은 real-time PCR master mix (TOYOBO, osaka, Japan)와 1st Forward primer와 Reverse primer를 각각 2.5, 5, 10pmole, 2nd Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe는 10pmole을 넣어 주고, DNA를 5ul를 넣고 최종 부피를 25ul가 되게 수행한다. 또한 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 표1과 같다.
PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 65℃에서 30초인 사이클을 10회 반복하여 수행하고 2번째 PCR을 수행하기 위해 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 30초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
Target Objective Name 5'
modification		 Sequence 3' modification
rpo B gene 1st primer Sense-rpoB GCG TCG GTC GCT ATA AGG TCA AC(서열번호 1)
antisense-rpoB ACC CTC GTG CAA GCG GAC CAG ATA T(서열번호 2)
2nd primer Sense-rpoB GGT CGC TAT AAG GTC AAC AAG AAG(서열번호 3)
antisense-rpoB ACC CTC GTG CAA GCG GAC CAG(서열번호 4)
rpoB probe FAM CTG CAT GTC GGC GAG CCC ATC ACG(서열번호 5) BHQ1
IS6110 1st primer Sense-IS6110 AAC GGC TGA TGA CCA AAC TC(서열번호 6)
antisense- IS6110 AAG CGG CGC TGG ACG AGA TC(서열번호 7)
2nd primer Sense-IS6110 GTC GAA CGG CTG ATG ACC AAA CT(서열번호 8)
antisense-IS6110 TCC GAA GCG GCG CTG GAC GA(서열번호 9)
IS6110 probe-1 FAM ACC CGC GGC AAA GCC CGC AGG(서열번호 10) BHQ1
IS6110 probe-2 FAM ACC ACG ATC GCT GAT CCG GCC ACA(서열번호 11) BHQ1
표 1은 결핵균 진단을 위한 real-time PCR용 프라이머 및 프로브
상기 실시예의 결과는 하기와 같다.
rpoB 유전자의 Single real - time PCR 과 one tube nested Real - time PCR 의 결핵균 검출민감도
결핵균 검출을 위한 single real-time PCR과 one tube nested Real-time PCR법의 민감도를 비교분석하기 위해 결핵균 표준균주인 H37Rv DNA를 10ng에서 10fg까지 10배 계대희석하여 real-time PCR의 template DNA로 사용하였다. 그 결과 rpoB유전자의 single real-time PCR에서는 10p 농도의 primer를 사용시, 10ng에서 10fg까지의 ct값은 각각 17.36에서 37.18이었다(도 1) one tube nested Real-time PCR에서는 10ng에서 10fg까지의 ct값은 각각 10.33에서 27.92이었다(도 2). 따라서 one tube nested Real-time PCR을 이용한 방법에서 single real-time PCR을 이용한 방법보다 약 100배 이상 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
rpoB 유전자의 Single real - time PCR 의 결핵균 검출민감도
one tube nested Real-time PCR법에서 Single real-time PCR보다 민감도가 향상된 원인으로 사용한 primer농도와 cycle수의 영향을 확인하고자 하였다. 2nd primer의 농도를 각각 10p와 20p를 사용하고(도 3), 기존의 40 cycle과 50 cycle을 수행하여(도 4a, 4b) Single real-time PCR과 one tube nested Real-time PCR의 민감도에 영향을 확인하였다.
그 결과 40 cycle을 수행 시, primer농도를 10p에서 20p농도로 사용하여도 민감도가 증가하지 않았으며, one tube nested Real-time PCR과 동일한 cycle수인 50 cycle을 수행하면 primer 농도를 10p와 20p에서 40 cycle을 수행할 때보다 민감도가 감소하였다. 1쌍의 primer로는 50 cycle을 수행하기에는 부족하고 동일한 농도의 primer, cycle을 수행하여도 one tube nested Real-time PCR의 민감도가 single real-time PCR보다 높은 것을 확인하였다.
rpoB 유전자의 one tube nested Real - time PCR 의 결핵균 검출민감도
one tube nested Real-time PCR에서 primer농도를 조절하여 민감도를 확인하고자 하였다. 1st primer농도를 각각 2.5p(도 5a), 5p(도 5b)와 10p(도 5c)를 사용하고, 2nd primer의 농도는 10p로 사용하였다.
그 결과 primer농도별로 민감도를 확인하면 100fg농도에서 2.5p농도에서는 Ct값이 30.48이고, 5p농도에서는 Ct값이 29.42이고, 10p농도에서는 Ct값이 27.42이었다(도 5). primer농도 의해 민감도 10배 차이가 것을 확인하였다.
위의 결과들을 종합하면 1st primer농도를 10p를 사용하고, 2nd primer의 농도는 10p로 사용하여 one tube nested Real-time PCR을 수행하였을 때 민감도가 최소 100배 이상 높을 것을 확인할 수 있었다(표 2).
Figure 112012047412881-pat00001
표 2는 rpoB유전자의 single real-time PCR과 one tube nested Real-time PCR의 결핵균 검출민감도 비교한 표이다.
IS6110 유전자를 사용한 single real - time PCR 과 one tube nested Real - time PCR의 결핵균 검출민감도
결핵균 검출을 위한 single real-time PCR과 one tube nested Real-time PCR법의 민감도를 비교분석하기 위해 결핵균 표준균주인 H37Rv DNA를 10ng에서 10fg까지 10배 계대희석하여 real-time PCR의 template DNA로 사용하였다. 그 결과 IS6110유전자의 single real-time PCR에서는 10p 농도의 primer를 사용시, 10ng에서 10fg까지의 ct값은 각각 14.95에서 35.71이었다(도 6). one tube nested Real-time PCR에서는 10ng에서 10fg까지의 ct값은 각각 5.83에서 30.62이었다(도 7). 따라서 one tube nested Real-time PCR을 이용한 방법에서 single real-time PCR을 이용한 방법보다 약 100배 이상 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
rpoB 유전자와 IS6110 유전자를 사용한 one tube nested Real - time PCR 의 결핵균 검출민감도
rpoB one-tube nested real-time PCR의 민감도를 향상시키고자 IS6110 유전자를 추가하여 dual-one tube nested real-time PCR을 수행하였다. 결핵균 검출을 위한 one tube nested Real-time PCR법의 민감도를 비교분석하기 위해 결핵균 표준균주인 H37Rv DNA를 10ng에서 10fg까지 10배 계대희석하여 real-time PCR의 template DNA로 사용하였다. 그 결과 10p 농도의 primer를 사용시, 10ng에서 10fg까지의 ct값은 각각 4.99에서 24.9이었다(도 8). 그리고 민감도를 상승시키기 위해 10,40 cycled서 15, 25 cycle을 수행한 결과 10 fg에서 1fg까지의 민감도를 확인할 수 있었다(도 9).
따라서 one tube nested Real-time PCR을 이용한 방법보다 dual-one tube nested real-time PCR을 수행한 결과 약 100배 이상 민감도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
위의 결과들을 종합하면 1st primer농도를 10p를 사용하고, 2nd primer의 농도는 10p로 사용하여 15 cycle을 선행한 후 25 cycle을 수행하는 dual-one tube nested real-time PCR을 수행하였을 때 민감도가 최소 100배 이상 높을 것을 확인할 수 있었다(표 3).
Figure 112012047412881-pat00002
표 3은 rpoB유전자와 IS6110유전자의 single real-time PCR과 one tube nested Real-time PCR와 dual one-tube nested real-time PCR의 결핵균 검출민감도 비교한 표이다.
표준균주를 이용한 single real-time PCR과 dual one-tube nested real-time PCR의 결핵균 검출특이도 확인
표준균주 DNA를 사용하여 제작한 single real-time PCR과 dual one-tube nested real-time PCR의 특이도를 확인하였다. 확인한 결과, MTB complex에서만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다(표 4).
Figure 112012047412881-pat00003
표 4는 표준 균주를 사용하여 특이도 확인한 표이다.
임상검체에서 Single PCR과 dual one-tube nested real-time PCR에서의 민감도의 유용성 평가
새로 개발된 dual one-tube nested real-time PCR의 민감도와 특이도를 확인하고자 임상검체를 사용하였다. 정상인의 객담과 소변을 제공받아 특이도를 확인하였고, 결핵환자로 판명된 환자의 검체들을 사용하여 민감도를 확인하였다.
7-1) 임상 객담검체에서 Single PCR과 dual one-tube nested real-time PCR에서의 민감도의 유용성 평가
임상 객담검체에서 결핵균의 검출율을 확인하고자 기존에 상용화되어 있는 Real MTB-ID (M&D, Korea)을 이용한 single PCR과 새롭게 개발된 dual one-tube nested real-time PCR의 민감도를 비교하였다. 정상인군 객담을 사용하여 특이도를 확인하였다. 환자군 객담을 사용하여 실험한 결과 Single PCR에서는 결핵균 검출률이 12/26 (46.1%)인 반면 dual one-tube nested real-time PCR에서는 26/26 (100%)로 높게 나타남을 확인할 수 있었다(표 5).
Figure 112012047412881-pat00004
표 5는 객담 검체에서 민감도와 특이도 확인한 표이다.
7-2) 임상 소변검체에서 Single PCR과 dual one-tube nested real-time PCR에서의 민감도의 유용성 평가
임상 소변검체에서 결핵균의 검출율을 확인하고자 기존에 상용화되어 있는 AdvanSureTM TB/NTM real-time PCR ((LG생명과학, 대전)을 이용한 single PCR과 새롭게 개발된 dual one-tube nested real-time PCR의 민감도를 비교하였다.
정상인군 소변을 사용하여 특이도를 확인하였다. 임상소변검체에서 민감도를 비교한 결과 Single PCR에서는 결핵균 검출률이 3/56 (5.4%)인 반면 dual one-tube nested real-time PCR에서는 29/56 (51.8%)로 높게 나타남을 확인 할 수 있었다(표 6).
Figure 112012047412881-pat00005
표 6은 소변 검체에서 민감도와 특이도 확인한 표이다.
7-3) 임상 조직검체에서 Single PCR과 dual one-tube nested real-time PCR에서의 민감도의 유용성 평가
임상 Granuloma(육아종, 활발하게 성장하는 섬유아세포 및 모세관아세포를 함유한 육아조직의 종양모양 덩어리 또는 결절) 조직검체에서 결핵균의 검출율을 확인하고자 기존에 상용화되어 있는 Real MTB-ID (M&D, Korea)을 이용한 Single PCR과 새롭게 개발된 dual one-tube nested real-time PCR의 민감도를 비교한 결과 Single PCR에서는 결핵균 검출율이 25/76 (32.9%)인 반면 dual one-tube nested real-time PCR에서는 44/76 (57.9%)로 높게 나타남을 확인할 수 있었다(표 7).
　 Single PCR nested qPCR
MTB 25(32.9%) 44(57.9%)
- 51(67.1%) 32(42.1%)
total 76 76
표 7은 임상 조직(Granuloma)에서 single PCR과 One-tube nested PCR에서의 민감도의 유용성 평가 표이다.
<110> Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Improved method for diagnosing Mycobacterium tuberculosis using one-tube nested real-time PCR <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcgtcggtcg ctataaggtc aac 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 accctcgtgc aagcggacca gatat 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtcgctata aggtcaacaa gaag 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accctcgtgc aagcggacca g 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 ctgcatgtcg gcgagcccat cacg 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aacggctgat gaccaaactc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aagcggcgct ggacgagatc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcgaacggc tgatgaccaa act 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tccgaagcgg cgctggacga 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 acccgcggca aagcccgcag g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 11 accacgatcg ctgatccggc caca 24

Claims (18)

  1. 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 9의 프라이머로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 11로 구성된 프로브를 포함하고,
    여기서, 상기 서열번호 1 내지 4의 프라이머들은 rpo(RNA 중합효소의 베타 소단위)B 유전자를 증폭시키기 위하여 그리고 서열번호 6 내지 9의 프라이머들은 IS6110(Mycobacterium tuberculosis 특이적인 Insertion Sequence) 유전자를 증폭시키기 위하여 사용하고 상기 각 유전자에 특이적인 2쌍의 프라이머들을 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 원-튜브 네스티드 PCR을 위한 것을 특징으로 결핵균 검출용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는 결핵균 검출용 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 결핵균 검출용 키트.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 3' 말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 블랙 홀 켄처(black hole quencher)-1,2,3 (BHQ-1,2,3)인 것을 특징으로 하는 결핵균 검출용 키트.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 결핵균은 Mycobacterium tuberculosis,M. bovis, M. africanum, M. canetii, 및 M. microti로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 결핵균 검출용 키트.
  9. 샘플로부터 DNA를 얻고, 그 DNA를 주형으로 하여서 실시간(real-time) PCR을 수행할 때, 첫 번째 프라이머로 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 6 내지 7의 프라이머를, 두 번째 프라이머로 서열번호 3 내지 4 및 서열번호 8 내지 9의 프라이머를 그 DNA와 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시키는 단계를 포함하는 결핵균 검출방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 튜브는 프로브를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프로브인 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 결핵균은 Mycobacterium tuberculosis,M. bovis, M. africanum, M. canetii, 및 M. microti로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라미어 농도는 10피코그램(pg)인 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  15. 제 9항에 있어서, 상기 샘플은 객담, 소변, 혈액 또는 종양조직인 것을 특징으로 하는 결핵균 검출방법.
  16. a) 하나의 튜브에 존재하는 서열번호 1 내지 4 및 서열번호 6 내지 9의 프라이머 조성물에 시료로부터 추출한 균의 DNA를 혼합하여 유전자 분석 시료를 준비하는 단계;
    b) 단계(a)의 유전자 분석 시료에 실시간 Nested PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;
    c) 단계(b)의 PCR 산물을 정량하여 정량 곡선을 수득하는 단계; 및
    d) 상기 정량 곡선을 이용하여, 시료로부터 추출한 균의 DNA에 존재하는 rpoB 유전자 및 IS6110 유전자를 정량하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 방법은 튜브에 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 11로 구성된 군으로부터 선택된 프로브를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. Nested 실시간(Real-time) PCR을 이용하여 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 첫 번째 프라이머로 서열번호 1 내지 2 및 서열번호 6 내지 7의 프라이머를, 두 번째 프라이머로 서열번호 3 내지 4 및 서열번호 8 내지 9의 프라이머를 같은 튜브 안에 넣어서 증폭시켜서 Mycobacterium tuberculosis,M. bovis, M. africanum, M. canetii, 및 M. microti로 구성된 군으로부터 선택된 결핵균을 검출하는 방법.

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