CN103014135A - 一种鉴定结核分枝杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定结核分枝杆菌的方法，首先以结核杆菌编码基因Rv1508c序列为待测基因序列，并以该序列为检测靶标设计引物（和探针）进行检测，本发明方法准确性好，灵敏度高，为结核分枝杆菌的鉴定提供了一种新的方案，可用于生物菌株的鉴定、结核感染的鉴定以及药物研发过程中药效、以及结核杆菌耐药性等方面的研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定结核分枝杆菌的方法，尤其涉及一种通过检测结核杆菌编码基因Rv1508c序列来判定结核分枝杆菌的方法。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核最为多见。结核病至今仍是一种重要的传染病，估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%~10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30~50倍，且结核的病程发展更快。
在与患者接触的人群中约有20~30%人为结核潜伏感染者，他们身体健康并没有临床症状，也不属于疾病状态，细菌处于潜伏状态中。虽然其中绝大部分人终身不会患病，但是仍然大约会有10%的感染者会在未来若干年中发展成为活动性结核。此外结核杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异，而且目前医学技术仍有许多不足，依然可能存在某些未被证实的结核杆菌，因此，因此，结核杆菌的判定对提早预防结核病、以及新物种的发现都具有重要的意义。
传统的鉴定方法为涂片镜检，将标本直接涂片，用抗酸染色，若找到抗酸阳性菌，即可初步判定为结核杆菌，但是敏感性不强，准确度不高；动物实验判定结核分枝杆菌的方法成本高；结核菌素皮试（PPD）和T细胞免疫的释放γ-干扰素的方法（IGRA）均属于基于细胞免疫诊断方法，虽然法已经广泛使用，但只能鉴定结核疾病，目前不能用于鉴定结核杆菌。
PCR扩增方法也是目前应用较多的判定结核杆菌的方法，该方法应用于结核分枝杆菌的DNA鉴定，因此，需要找出结核杆菌中合适的用于PCR扩增的基因序列，然后设计引物进行PCR扩增和鉴定。
发明内容
本发明提供了一种通过检测结核杆菌编码基因Rv1508c序列来判定结核分枝杆菌的方法，通过鉴定样品中是否含有Rv1508c序列来判定是否为结核分枝杆菌。其中，所述Rv1508c序列见SEQ ID No.1。
本发明提供的鉴定结核分枝杆菌的方法，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测标靶，鉴定样品中是否含有所述Rv1508c序列，如果含有该序列，则判定为结核分枝杆菌，如果没有该序列，则不是结核分枝杆菌。
鉴定Rv1508c序列的方法可以采用已有的任意DNA检测方法实施，如PCR扩增技术，基因芯片技术或半点杂交技术等等。其中，PCR扩增技术可以是实时PCR仪进行检测或凝胶电泳检测。
根据本发明所述鉴定结核分枝杆菌方法的第一个优选实施方式，步骤包括：
步骤1，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测靶标，设计一对同源引物，对待测样品DNA进行PCR扩增；
步骤2，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以及EB染色；
步骤3，扩增产物检测为阳性，则判定为结核分枝杆菌；扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
根据所述鉴定结核分枝杆菌方法的进一步优选实施方式，根据Rv1508c基因序列中SEQ ID No.2序列（SEQ ID No.1中下划线所示序列）为检测靶标设计一对同源引物；所述一对同源引物优选为
正向引物：5′-gatccccgatagcatcaaga-3′
反向引物：5′-attggcaagacgaaaacgag-3′
但也可以由本领域技术人员根据Rv1508c基因序列设计其它引物。
本发明上述的鉴定结核分枝杆菌方法第一个优选实施方式，其中，所述PCR扩增反应体系包括：Taq 缓冲液、2.5mM浓度MgCl2，0.2mM浓度dNTP，引物浓度均为0.2μM，1U Taq NDA聚合酶，10ng模板DNA，加入ddH2O至总体积为20μL。
本发明上述鉴定结核分枝杆菌方法第一个优选实施方式，其中，所述PCR扩增反应条件为：
94℃，5min—(94℃，1min—65℃，30s—72℃，1min)×35个循环—72℃，10min，即：
首先：94℃，5min；
然后，如下过程进行35个循环：94℃，1min，再65℃，30s，再72℃，1min；
最后：72℃，10min。
根据本发明鉴定结核分枝杆菌的方法的第二个优选实施方式，步骤包括：
步骤1，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测靶标，设计一对同源引物以及分子探针，所述分子探针的5′和3′端分别进行荧光标记；
步骤2，利用所述同源引物和分子探针，通过实时定量PCR仪对待测样品DNA或待测样品RNA逆转录的cDNA进行PCR扩增，并进行分析；
步骤3，PCR扩增产物分析结果为阳性，则判定为结核分枝杆菌；PCR扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
本发明所述鉴定结核分枝杆菌的方法的进一步优选实施方式，根据Rv1508c基因序列中SEQ No.2为检测靶标设计一对同源引物和分子探针。
其中，所述一对同源引物优选为
正向引物：5′-gatccccgatagcatcaaga-3′
反向引物：5′-attggcaagacgaaaacgag-3′
其中，所述分子探针可以是Taqman探针、MGB探针等，所述分子探针优选为：所述分子探针5′端有6个荧光标记基团；3′端进行C-MGB标记，其中，C为3′端荧光标记基团。
所述分子探针进一步优选为：5′- 6A-tcgggtttgctgtcctagtc-B-C-3′。
所述分支探针中，A为5′端荧光标记，如FAM荧光素；C为3′端荧光标记，如NFQ荧光素；B为实时定量标记，如A可以是，B可以是MGB标记，C可以是NFQ荧光素。
但也可以由本领域技术人员根据Rv1508c基因序列设计其它引物和分子探针。
本发明上述鉴定结核分枝杆菌方法的第二个优选实施方式，其中，所述PCR反应体系包括：每15ul含同源引物各500nM，探针浓度为200nM，待测样品DNA或cDNA模板10ng。反应试剂优选为1μL TaqMan? Universal PCR Master Mix。
本发明上述鉴定结核分枝杆菌方法的第二个优选实施方式，其中，所述PCR反应条件为95℃，10min—(92℃，15s—65℃，1min) ×40个循环，即：
首先：95℃，10min；
然后，如下过程进行40个循环：92℃，15s，再65℃，1min。
SEQ ID No.1：
gtgattccggtgatgagcgctcgcttcactgggttcccgctcctgccggtcgctcttcgccatggcataacgtcggggcgtggctgtgggttcatcctagatgtcggtgcccagcgccctttcggcaacgacgtcctgttgtcggttgccacgaggaagatccggtctagactgcccggcgaccgcgttggcaaccatggcgctctgctaccgtttcgcgcagaaccgaggagaatccagatgaagcgacccccggaggtgttgcgcggtgccgtgaccgcgagccgggagcggctctgggcgatcggctcccaatccgagcgcaccctcatgctcggcaccatcctgctggcgtcggtgatttcggcggcgacggcgtacgccctcagtcagtggtacgcggtcgacgtcttttccactcttttggtagtccctggggactgttggcttgattggggcatgaatatcggtcggcactgcttcagcgactacgccatggtcgccgccgccgggattcaacccaatcccgcggactacctgatctcgctacccgccgattaccagccgaccgcggttgctgcatgggcccccgcccgcataccgtatgcgattttcggactacccagccattggctgggtgcgccgcgcttggggctgatctgttacctggtcgccctaacgatggcggtcatatctcccgccatctgggcggcccggggggcacgtggtctggagcgagtggtcatcttcgtgacactgggcgccgcggccatcccggcgtggggggtcatcgatcgaggcaactcgacagggttcgtggtaccgatcgcgctggcttacttcgtggcgttgtcccgacagcggtggggcctcgccaccatcacggtgatcttggccgtcctggtaaagccgcagttcgtcgttctcggcgtggtgttgttggcggctcgacaatggcggtgggctggtatcgggatcaccggcgtggtggtgtccaatatcgcagcctttctgttgtggccacgaggcttcccggggacgatcgcacagtcgatccacggcatcatcaagttcaatagttcgttcggagggcttcgagacccgcggaacgtgtcctttggcaaggcactcctgctactatcaatcgggcaagatcccagagggtttcctcactggtccgcgaacgcagaatagtcgtggtcgccgtgctggcgctcggacgccgtatcccgcctgtcatggtggggattgtgttgctcgccaccgccaccttctcccccgcggacgtcgccttctactatcgctgcactggtagcccgagaccccaacgggcctcctggtgctgggatattcgaccaactcgcagcccatggagaccgccgccgcgcggtcggcgtctgcgtgagtttggccgtggcgctgagcatcgtcaacgtcgcggtcccgggccagccgttctacgtgccgctctatggacagctgggagccaaaggggtagtcggtaccacgccactcgttttcaccacggtgacatgggcaccgttcttgtggttggtcacgtgcgtagtaatcatcgtctcctacgcgcgcaaacccgctcgcccacatgacagtcacaacgggcctactcgggagagcgaccaggacaccgctgccagcaccacctcatgcttacccaatccggttgaggagtcctcaccacggggacccggcccaatctgccaaaattacaccccatag
SEQ ID No.2：
tactatcaatcgggcaagatcccagagggtttcctcactggtccgcgaacgcagaatagtcgtggtcgccgtgctggcgctcggacgccgtatcccgcctgtcatggtggggattgtgttgctcgccaccgccaccttctcccccgcggacgtcgccttctactat
SEQ ID No.2进行PCR扩增和分子标记的序列：
tgatccccgatagcatcaagaactatcaatcgggcaagatcccagagggtttcctcactggtccgcgaacgcaga tcgggtttgctgtcctagtc atagtcgtggtcgccgtgctggcgctcggacgccgtatcccgcctgtcatggtggggattgtgttgctcgccaccgccaccttctcccccgcggacgtcgccttctactatctcgttttcgtcttgccaat
本发明鉴定结核分枝杆菌的方法，首先确定了结核分枝杆菌中的待测基因序列，并以该序列为标靶设计引物（和探针），准确性好，灵敏度高，敏感性和特异性高达100%，为结核分枝杆菌的鉴定提供了一种新的方案，可用于生物菌株的鉴定、结核感染的鉴定以及药物研发过程中药效、以及结核杆菌耐药性等方面的研究。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定结核分枝杆菌的方法，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测标靶，鉴定样品中是否含有所述Rv1508c序列，如果含有该序列，则判定为结核分枝杆菌，如果没有该序列，则不是结核分枝杆菌。
鉴定Rv1508c序列的方法可以采用已有的任意DNA检测方法实施，如PCR扩增技术，基因芯片技术或半点杂交技术等等。其中，PCR扩增技术可以是实时PCR仪进行检测或凝胶电泳检测。
PCR技术为例，下面通过基团实施例对本发明鉴定结核分枝杆菌的方法进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
步骤1，设计引物
以SEQ ID No.2为标靶设计一对同源引物如下：
正向引物：5′-gatccccgatagcatcaaga-3′
反向引物：5′-attggcaagacgaaaacgag-3′
步骤2，PCR扩增
提取临床菌株NDA作为模板DNA，利用步骤1中设计的同源引物进行PCR扩增，扩增体系如下：
10×Taq PCR缓冲液 2μL
1U Taq DNA聚合酶 1U
MgCl2 2.5mM
dNTP溶液 0.2mM
正向引物 0.2μM
反向引物 0.2μM
模板DNA 10ng
ddH2O 加至总体积为20μL
扩增条件：94℃，5min—(94℃，1min—65℃，30s—72℃，1min)×35个循环—72℃，10min
步骤3，凝胶电泳
将步骤3中的扩增产物进行2%凝胶电泳和EB染色。
凝胶电泳和EB染色均可由本领域技术人员根据已有知识采用现有技术实施。
步骤4，判定结核分枝杆菌
经步骤3凝胶电泳和EB染色，扩增产物为阳性，则判定为结核分枝杆菌，如果扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
实施例2
步骤1，设计引物和分子探针
以SEQ ID No.2为标靶设计一对同源引物和分子探针，
正向引物：5′-gatccccgatagcatcaaga-3′
反向引物：5′-attggcaagacgaaaacgag-3′
分子探针：5′- 6FAM-tcgggtttgctgtcctagtc-MGB-NFQ-3′
步骤2，PCR扩增
提取临床标本的DNA作为模板DNA，利用步骤1中设计的同源引物和分子探针通过实时PCR仪扩增分析，扩增体系如下：
反应试剂：TaqMan Universal PCR Master Mix 1μL
分子探针 20nM
正向引物 500 nM
反向引物 500 nM
模板DNA 10ng
总体积 15μL
扩增条件：95℃，10min—(92℃，15s—65℃，1min)×40个循环
步骤3，判定结核分枝杆菌
经步骤3中实施PCR仪进行分析，扩增产物为阳性，则判定为结核分枝杆菌，如果扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
实施例3
步骤1，设计引物和分子探针
以SEQ ID No.2为标靶设计一对同源引物和分子探针，
正向引物：5′-gatccccgatagcatcaaga-3′
反向引物：5′-attggcaagacgaaaacgag-3′
分子探针：5′- 6FAM-tcgggtttgctgtcctagtc-MGB-NFQ-3′
步骤2，PCR扩增
提取临床标本的RNA，并将提取的RNA逆转录为cDNA作为模板DNA，利用步骤1中设计的同源引物和分子探针通过实时PCR仪扩增分析，扩增体系如下：
反应试剂：TaqMan? Universal PCR Master Mix 1μL
分子探针 20nM
正向引物 500 nM
反向引物 500 nM
模板DNA 10ng
总体积 15μL
扩增条件：95℃，10min—(92℃，15s—65℃，1min)×40个循环
步骤3，判定结核分枝杆菌
经步骤3中实施PCR仪进行分析，扩增产物为阳性，则判定为结核分枝杆菌，如果扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
通过上述描述，本领域技术人员应该理解的是，本发明也可以采用基因芯片的方法进行判定结核分枝杆菌。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市肺科医院
<120> 一种鉴定结核分枝杆菌的方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1740
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 1
gtgattccgg tgatgagcgc tcgcttcact gggttcccgc tcctgccggt cgctcttcgc 60
catggcataa cgtcggggcg tggctgtggg ttcatcctag atgtcggtgc ccagcgccct 120
ttcggcaacg acgtcctgtt gtcggttgcc acgaggaaga tccggtctag actgcccggc 180
gaccgcgttg gcaaccatgg cgctctgcta ccgtttcgcg cagaaccgag gagaatccag 240
atgaagcgac ccccggaggt gttgcgcggt gccgtgaccg cgagccggga gcggctctgg 300
gcgatcggct cccaatccga gcgcaccctc atgctcggca ccatcctgct ggcgtcggtg 360
atttcggcgg cgacggcgta cgccctcagt cagtggtacg cggtcgacgt cttttccact 420
cttttggtag tccctgggga ctgttggctt gattggggca tgaatatcgg tcggcactgc 480
ttcagcgact acgccatggt cgccgccgcc gggattcaac ccaatcccgc ggactacctg 540
atctcgctac ccgccgatta ccagccgacc gcggttgctg catgggcccc cgcccgcata 600
ccgtatgcga ttttcggact acccagccat tggctgggtg cgccgcgctt ggggctgatc 660
tgttacctgg tcgccctaac gatggcggtc atatctcccg ccatctgggc ggcccggggg 720
gcacgtggtc tggagcgagt ggtcatcttc gtgacactgg gcgccgcggc catcccggcg 780
tggggggtca tcgatcgagg caactcgaca gggttcgtgg taccgatcgc gctggcttac 840
ttcgtggcgt tgtcccgaca gcggtggggc ctcgccacca tcacggtgat cttggccgtc 900
ctggtaaagc cgcagttcgt cgttctcggc gtggtgttgt tggcggctcg acaatggcgg 960
tgggctggta tcgggatcac cggcgtggtg gtgtccaata tcgcagcctt tctgttgtgg 1020
ccacgaggct tcccggggac gatcgcacag tcgatccacg gcatcatcaa gttcaatagt 1080
tcgttcggag ggcttcgaga cccgcggaac gtgtcctttg gcaaggcact cctgctacta 1140
tcaatcgggc aagatcccag agggtttcct cactggtccg cgaacgcaga atagtcgtgg 1200
tcgccgtgct ggcgctcgga cgccgtatcc cgcctgtcat ggtggggatt gtgttgctcg 1260
ccaccgccac cttctccccc gcggacgtcg ccttctacta tcgctgcact ggtagcccga 1320
gaccccaacg ggcctcctgg tgctgggata ttcgaccaac tcgcagccca tggagaccgc 1380
cgccgcgcgg tcggcgtctg cgtgagtttg gccgtggcgc tgagcatcgt caacgtcgcg 1440
gtcccgggcc agccgttcta cgtgccgctc tatggacagc tgggagccaa aggggtagtc 1500
ggtaccacgc cactcgtttt caccacggtg acatgggcac cgttcttgtg gttggtcacg 1560
tgcgtagtaa tcatcgtctc ctacgcgcgc aaacccgctc gcccacatga cagtcacaac 1620
gggcctactc gggagagcga ccaggacacc gctgccagca ccacctcatg cttacccaat 1680
ccggttgagg agtcctcacc acggggaccc ggcccaatct gccaaaatta caccccatag 1740
<210> 2
<211> 166
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
tactatcaat cgggcaagat cccagagggt ttcctcactg gtccgcgaac gcagaatagt 60
cgtggtcgcc gtgctggcgc tcggacgccg tatcccgcct gtcatggtgg ggattgtgtt 120
gctcgccacc gccaccttct cccccgcgga cgtcgccttc tactat 166
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 3
gatccccgat agcatcaaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 4
attggcaaga cgaaaacgag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子探针
<400> 5
tcgggtttgc tgtcctagtc 20
Claims (10)
1.一种鉴定结核分枝杆菌的方法，其特征在于，步骤包括：
步骤1，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测靶标，设计一对同源引物，对待测样品DNA进行PCR扩增；
步骤2，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以及EB染色；
步骤3，扩增产物检测为阳性，则判定为结核分枝杆菌；扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据Rv1508c基因序列中SEQ ID No.2为检测靶标设计一对同源引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系包括：
Taq PCR缓冲液、2.5mM浓度MgCl2，0.2mM浓度dNTP，所述同源引物浓度均为0.2μM，1U浓度的Taq NDA聚合酶，10ng模板DNA，加入ddH2O至总体积为20μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：
首先：94℃，5min；
然后，如下过程进行35个循环：94℃，1min，再65℃，30s，再72℃，1min；
最后：72℃，10min。
5.一种鉴定结核分枝杆菌的方法，其特征在于，步骤包括：
步骤1，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测靶标，设计一对同源引物以及分子探针，所述分子探针的5′和3′端分别进行荧光标记；
步骤2，利用所述同源引物和分子探针，通过实时定量PCR仪对待测样品DNA或RNA逆转录的cDNA进行PCR扩增，并进行分析；
步骤3，PCR扩增产物分析结果为阳性，则判定为结核分枝杆菌；PCR扩增产物为阴性，则不是结核分枝杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据Rv1508c基因序列中SEQ ID No.2为检测靶标设计一对同源引物和分子探针。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分子探针5′端有6个荧光标记基团；3′端进行C-MGB标记，其中，C为3′端荧光标记基团。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：每15ul含同源引物各500nM，探针浓度为200nM，待测样品DNA或cDNA模板10ng。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：
首先：95℃，10min；
然后，如下过程进行40个循环：92℃，15s，再65℃， 1min。
10.一种鉴定结核分枝杆菌的方法，其特征在于，以结核杆菌编码基因Rv1508c基因序列为检测标靶，鉴定样品中是否含有所述Rv1508c序列，如果含有该序列，则判定为结核分枝杆菌，如果没有该序列，则不是结核分枝杆菌。
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2011
- 2011-09-22 CN CN201110282781.4A patent/CN103014135B/zh active Active
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