KR101782128B1 - 실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 충치(치아우식) 원인균의 정량 및 정성 검사 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강의 주요 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 미생물 4종 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물 4종에 대하여 EvaGreen dye를 이용한 Real-time PCR과 Melting Curve Analysis를 연속적으로 수행하여 상기 미생물들의 속간 정량검사 및 종간 정성검사를 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 검사 방법을 이용하여 Real-time PCR과 Melting Curve Analysis를 연속적으로 수행할 경우, 치아우식 원인균 스트렙토코커스(Streptococcus) 속의 전체 정량분석과 속 내의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 4종의 정성분석의 동시확인 검사와 치아우식 원인균 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 전체 정량분석과 속 내의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)/락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 4종의 정성분석의 동시확인 검사를 통해 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있다.

Description

실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 충치(치아우식) 원인균의 정량 및 정성 검사 방법{Quantitative and qualitative methods of detecting bacteria related to dental caries using Real-time PCR and Melting Curve Analysis}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 충치(치아우식) 원인균의 정량 및 정성 검사 방법에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 본 발명은 구강의 주요 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 (Streptococcus)속 미생물 4종과 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 4종에 대하여 EvaGreen 형광물질을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)과 융해곡선 분석법(Melting Curve Analysis)을 연속적으로 수행하여 상기 미생물들의 속간 정량검사 및 종간 정성검사를 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
충치(치아우식)는 입 안에 서식하는 세균에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생기는 산(acid)에 의해 치아의 법랑질이 손상되는 것을 말하며, 그 원인으로는 적절한 구강 위생 관리의 부재, 비효율적인 항 치아우식(anti-caries) 면역 반응, 식습관 유형과 치아 구조에 의한 여러 가지가 복합적으로 작용하여 발생하지만 그 근본 원인은 pH를 5.5 이하로 낮출 수 있는 치아우식 원인균에 의한 다인성 감염성 질환이다. 치아우식을 방치하게 되면 치수염을 일으켜 심한 통증을 느끼게 되고 이로 인해서 치아를 상실할 수도 있으며, 이를 예방하기 위해서는 치아우식의 위험 요인을 조기에 발견하고 적절한 예방적 처치를 통해 치아우식의 진행을 방지하는 것이 중요하다. 따라서, 치아우식의 예방, 발병가능성 및 치료 후 예후 판정을 위해 효율적이면서도 민감도가 높은 방법으로 검출할 수 있는 시스템 개발의 필요성이 제기되고 있는 실정이다.
인간의 구강에는 300종 이상의 세균이 상재하고 있는데, 이러한 세균들 중 뮤탄스 스트렙토코시(Mutans streptococci) 및 락토바실러스(Lactobacillus spp .) 등이 치아우식을 발생시키는 세균으로 알려져 있다. 또한 이들 치아우식증 원인균들도 균종 및 serotype에 따라 유기산 생산력에 차이가 있기 때문에 원인균 속의 전체량뿐만 아니라 각 속에 포함되는 균종 및 serotype의 정보는 더욱 정밀한 임상진단에 도움이 된다.
치아우식 주요 원인 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스는 세포 표면에 존재하는 RGPs(serotype-specific rhamnose-glucose polymers)의 화학적 구성에 따라 serotype으로 구분되며 혈청형에 따라 serotype c, serotype e, serotype f, serotype k의 4가지 타입으로 구분된다. serotype c는 치면세균막에서 발견되는 전체 뮤탄스 중 80% 이상을 차지하는 가장 보편적인 타입이다. 나머지 serotye e, f 및 k는 흔하게 발견되지 않으며, serotype e가 약 20%이상, 나머지 serotype f와 k는 5%의 분포율을 보이며 특히 serotype k의 경우 일본지역에서만 발견되고 있다. Streptococcus mutans의 serotype 들은 각 타입에 따라 특별한 대사산물을 생성하여 면역반응을 일으키는데 최근 연구에 의하면 serotype e 및 f에 의해 감염성 심내막염을 일으킨다는 사실이 보고되었으며, serotype f에 의해 출혈성 뇌졸중과 염증관련 질병이 유도된다는 보고 등 치아우식뿐만이 아닌 전신질환과의 연관성도 밝혀지고 있다.
지금까지 치아우식활성 검사로는 단순하게 구강 pH를 확인하거나 치아우식의 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)나 락토바실러스(lactobacillus spp .) 등이 선별적으로 자랄 수 있는 선택 배지를 이용하여 배양된 세균의 양을 측정하는 방법이 주로 활용되어왔다. 하지만 이 방법으로는 구강에서 확인하고자 하는 치아우식 유발 세균에 대해 한 검사 당 한 종류씩만 배양하여 확인할 수 있고, 배양 검사를 완벽히 수행하는데 3일 이상이 소요되며(time-consuming) 노동집약적(laborious)이다.
한편, 한국 등록특허 10-1562491호에는 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 속 미생물 및 락토바실러스 속 미생물을 검출하고 정량하는 방법이 기재되어 있기는 하나, 이는 미생물의 정량만이 가능할 뿐 어떠한 미생물이 존재하는지에 대한 정성분석은 가능하지 않다는 한계점이 있다.
이에, 본 발명자들은 한국 등록특허 제10-1562491호에 나타난 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 속 미생물 및 락토바실러스 속 미생물의 정량만이 가능한 한계를 극복하여 신속하고 정확한 정량분석 기술을 더욱 발전시켜 치아우식 원인균 속간 정량분석 뿐만 아니라 각 속에 포함되는 주요 원인 미생물 종들에 대한 정성분석이 가능한 프라이머 세트를 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 융해곡선 분석법(Melting Curve Analysis)을 통해 치아우식 원인균의 종을 명확하게 구별하여 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 8의 염기서열 및 9 내지 16을 포함하는 프라이머는 각각 서열 상동성이 95% 이상인 염기서열을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 프라이머가 20bp인 경우, 20bp 중 2개 이상 틀리면 용융 온도(melting temperature)의 감소가 5도 이상이 되므로 결과가 좋지 않게 나타나지만, 1개만 틀릴 경우에는 PCR 과정에서 열처리(annealing) 온도를 약간 내려 실험 할 경우 동등한 결과를 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 8의 프라이머는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물의 특이적인 유전자 부위를 표적으로 하는 프라이머이며, 보다 구체적으로는, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머쌍은 스트렙토코커스 소브리너스, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머쌍은 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype E, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머쌍은 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype C 및 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머쌍은 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype F를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머이다.
바람직하게, 본 발명에서 상기 검출은 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 의한 것일 수 있다. 상기 용어 "융해(melting)"은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 해리시키는 것을 말한다. 융해는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 시료를 가온하여 수행될 수 있다. 융해는 예를 들면 50℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트는 융해곡선 분석법에 활용되어 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물에 속하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 상기 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 이용하면 상기 네 종의 스트렙토코커스속 미생물을 동시에 분석하더라도, Melt peak가 뚜렷하게 구분되기 때문에 각각의 목적하는 미생물을 명확하게 검출해 낼 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물은 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트는 치아우식을 유발하는 원인균 중에서 스트렙토코커스속 미생물을 검출하여 정량할 수 있는 프라이머 및 프로브이다. 보다 구체적으로는, 상기 스트렙토코커스속 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)이다.
서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트, 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트를 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응 및 융해곡선 분석법을 연속적으로 수행하면, 임상시료 내에 존재하는 스트렙토코커스속 미생물을 정량적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 해당 스트렙토코커스속 미생물이 어떤 종인지 여부까지 동시에 정성적으로 검출할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트, 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트를 포함하는 조성물은 상호간에 간섭반응을 일으키지 않고 각각이 목적하는 효과를 발휘하기 때문에, 표적시료 내에서 스트렙토코커스속 미생물을 정량분석이 가능함과 동시에, 정확한 정성분석 또한 가능하다는 것을 확인하였다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 서열번호 1 내지 8의 프라이머 이외에, 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트를 추가로 포함할 수 있다. 또한, PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 조성물의 성분의 비제한적인 예로는 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 키트에는 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등을 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 조성물 전체 중량 대비 0.0001∼0.01중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001∼0.005중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 조성물 전체 중량 대비 0.01중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우 중합효소연쇄반응 시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용될 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 키트 구성성분을 보다 안정화시키기 위한 안정화 물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10∼500mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50∼300mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500mM를 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 부피가 필요 이상으로 커지며, 중합효소연쇄반응을 위해 멸균 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 중합효소연쇄반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있는 문제점이 있다. 그리고 10mM 미만이면 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화 물질로서 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 키트 구성성분은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용가능하다.
본 발명에서는 또한 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 임상시료란 환자의 타액 또는 구강 내에서 채취된 치아 샘플일 수 있으며, 상기 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. etal., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. etal., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
상기 (b) 단계에서 PCR 반응이란 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
이러한 real-time PCR 분석은 시판되고 있는 real-time PCR 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, real-time PCR 기기는 예를 들어, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480 (Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems,USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 프라이머 세트는 그를 구성하는 각 프라이머 사이에 간섭현상 없이 상기의 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물의 유전자를 Real-time PCR에 의하여 성공적으로 증폭하는데 사용할 수 있다.
따라서 상기 프라이머 세트를 이용하여 Real-time PCR을 실시하는 경우, 매우 신뢰성 있고, 신속하게 치아우식 유발균인 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 스트렙토코커스 속에 포함되는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)를 검출할 수 있다.
이러한 검출은 높은 특이도 및 민감도를 나타내기 때문에 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물을 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트 현재 본 발명자의 지적재산권으로 등록되어 있는 발명인 “충치(치아우식)원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도(제10-1562491호)”에 나타난 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 속 미생물 및 락토바실러스 속 미생물의 정량만이 가능한 한계를 극복하여 신속하고 정확한 정량분석 기술을 더욱 발전시켜 치아우식 원인균 속간 정량분석뿐만 아니라 각 속에 포함되는 주요 원인 미생물 종들에 대한 정성분석을 융해곡선 분석법(Melting Curve Analysis)을 활용하여 동시에 확인함으로써 더욱 정밀하게 치아우식 원인균에 대한 임상진단 결과를 확인할 수 있다는 점에서 매우 우수하다(실시예 4).
본 발명에서 상기 (c) 단계는 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계이다. 용어 "융해(melting)"은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 해리시키는 것을 말한다. 융해는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 시료를 가온하여 수행될 수 있다. 융해는 예를 들면 50℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있다.
상기 증폭된 증폭 산물을 융해(melting)시켜 융해 곡선(melting curve)를 얻는 단계는 형광 염료를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 형광 염료는 예를 들면 SYBR Green®, SYTO®9, EvaGreen®, LC Green, LC Green Plus, ResoLight, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
융해 곡선은 사용된 염료의 종류에 따라 파장에 따른 형광 강도를 측정하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 510 nm에서의 형광 강도를 측정하여 융해 곡선을 얻을 수 있다.
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 얻은 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스를 검출하는 단계이다.
융해 온도(melting point; Tm)는 이중 나선 DNA 중 절반이 각각의 가닥으로 분리되는 온도, 즉 50%의 변성이 일어난 상태의 온도를 말한다. 융해 온도는 핵산의 DNA 종류, 폴리뉴클레오티드 서열, GC 함량, 폴리뉴클레오티드의 길이, 뉴클레오티드 변이의 존재 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명자들은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 및 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍의 융해온도(melting point)가 서로 중복되지 않도록 설계하였고, 융해곡선에서 각각의 프라이머가 나타내는 피크 또한 중첩되지 않도록 설계하여, 네 종의 스트렙토코커스속 미생물을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 구별하여 검출할 수 있도록 하였다.
본 발명은 또한 상기 (b) 단계에서 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트를 추가로 포함하고, 상기 (d) 단계에서 스트렙토코커스속 미생물을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서의 “정량”과 관련하여, real-time PCR 방법은 절대 정량(absolute quantification)과 상대 정량(relative quantification) 분석으로 구분되는데, 시료 내의 표적 DNA를 정량하기 위해서는 표준시료의 검량선 (표준곡선; standard curve) 작성이 필수적인 요소이다. 표준시료와 미지시료를 대상으로 동시에 정량적 Real-time PCR을 실시하여 표준시료로부터 검량선을 도출한 후, 이 검량선으로부터 미지시료 내 표적 DNA의 양을 정량한다. 이때 표준시료로부터의 검량선(x축: 표준시료의 농도, y축: 역치 주기 수(CT; threshold cycle))은 상관지수(R2)가 1에 가까울수록 이상적이다.
본 발명에서 Real-time PCR을 이용한 정량은 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 “정량”이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준시료를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 검량선은 정량하고자 하는 스트렙토코커스속 미생물 및/또는 락토바실러그속 미생물의 16s rRNA를 표준시료로 하고, 상기 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 정량적 Real-time PCR을 수행함으로써, 표준시료의 증폭으로부터 작성된 검량선을 기준으로 시료 내 존재하는 표적 유전자의 역치 주기 수(CT)를 확인하여 스트렙토코커스속 미생물 및/또는 락토바실러그속 미생물의 농도를 예측할 수 있다.
상기 방법을 통해, 1회의 실험으로 샘플 내에 존재하는 스트렙토코커스속 미생물을 정량적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 정성적인 분석 또한 가능하여 어떤 종의 미생물이 포함되어 있는지 명확하게 구별할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
상기, 서열번호 9 내지 16의 프라이머는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 특이적인 유전자 부위를 표적으로 하는 프라이머이다. 즉, 상기 프라이머는 다른 미생물에는 결합하지 않고 락토바실러스속 내 특정한 종의 미생물에만 특이적으로 결합한다.
보다 구체적으로, 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍은 락토바실러스 플란타룸, 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍은 락토바실러스 카세이 또는 파라카세이, 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍은 락토바실러스 크리스파투스 및 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍은 락토바실러스 살리바리우스를 특이적으로 검출하는 프라이머쌍이다.
서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에 속하는 4종의 미생물만을 특이적으로 검출하였으며, 다른 속에 속하는 미생물에 대해서는 어떠한 PCR 산물도 관찰되지 않아 그 특이성이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다(실시예 1).
본 발명은 또한, 상기 조성물은 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 26의 프로브 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
(c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
(d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 검출하는 방법을 제공한다.
각각의 단계에 대해서는 상기한 바와 동일하다.
본 발명은 또한, 상기 (b) 단계에서 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 26의 프로브 세트를 추가로 포함하고, 상기 (d) 단계에서 락토바실러스속 미생물을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 각 단계에 대해서는 상기한 바와 동일하다.
상기한 바와 같이, 치아우식의 원인균인 스트렙토코커스속 미생물 및 락토바실러스속 미생물만을 특이적으로 검출하면서, Real-time PCR 방법 및 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 의해 우수한 민감도로 각각의 미생물을 검출할 수 있는 프라이머 세트는 현재까지 보고된 바가 없다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 Real-time PCR 및 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)을 수행하는 경우 치아우식 원인균인 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물과 스트렙토코커스 속에 포함되는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)를 검출하며 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물과 락토바실러스 속에 포함되는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 정량 및 정성으로 동시에 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있다.
도 1은 유전체 DNA를 1ng/ul 농도부터 10배씩 serial dilution 한 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175([A], Cy5; blue) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334([B], Cy5; green)의 Real-time PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭곡선(fluorescent amplification curves)을 나타낸 것이다(A: S. mutans, B: L.casei).
도 2는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175([A]) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334([B])의 표준곡선을 나타낸 것이다(A: S. mutans, B: L.casei).
도 3은 융해곡선 분석법에 있어서, 프라이머쌍에 따른 분석실패 사례를 나타낸 도면이다.
도 4은 본 발명의 조성물을 이용한 표준균주에서의 Real-time PCR 반응과 융해곡선 분석 반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: 스트렙토코커스 속 4종의 표준균주 융해곡선 분석 반응, B: 락토바실러스 속 4종의 표준균주 융해곡선 분석 반응).
도 5는 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 1에서의 Real-time PCR 반응과 융해곡선 분석 반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: Real-time PCR 반응, B: 융해곡선 분석 반응, 도 5A 및 5B 각각에서 왼쪽 도면은 스트렙토코커스속 미생물 검출, 오른쪽 도면은 락토바실러스속 미생물 검출).
도 6은 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 2에서의 Real-time PCR 반응과 융해곡선 분석 반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: Real-time PCR 반응, B: 융해곡선 분석 반응, 도 6A 및 6B 각각에서 왼쪽 도면은 스트렙토코커스속 미생물 검출, 오른쪽 도면은 락토바실러스속 미생물 검출).
도 7은 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 3에서의 Real-time PCR 반응과 융해곡선 분석 반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: Real-time PCR 반응, B: 융해곡선 분석 반응, 도 7A 및 7B 각각에서 왼쪽 도면은 스트렙토코커스속 미생물 검출, 오른쪽 도면은 락토바실러스속 미생물 검출).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험준비>
1. 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Genebank 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 스트렙토코커스속 또는 락토바실러스속 미생물만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 Genebank의 entrez에서 스트렙토코커스속 또는 락토바실러스속 미생물의 특이적인 유전자를 확보한 후 다중핵산염기서열 분석 프로그램 clustal W2를 이용하여 보존 부위를 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 스트렙토코커스속 또는 락토바실러스속 미생물만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기 서열임을 확인하였다.
Figure 112017029479902-pat00001
Figure 112017029479902-pat00002
Figure 112017029479902-pat00003
Figure 112017029479902-pat00004
2. 프라이머의 합성
실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harborlaboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 바이오니아사(bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.
3. 미생물로부터 DNA의 추출
표준균주에서 ExgeneTM Cell SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 NanoDrop 2000(Thermo Scientific co., USA) spectro photometer를 이용하여 측정한 후, 10pg/ul로 희석하였다.
<실시예 1>
프라이머의 특이도 확인
상기 실험준비 단계에서 제작한 서열번호 1 내지 8의 프라이머가 스트렙토코커스 속에 포함되는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype C, se rotype E, serotype F 및 스트렙토코커스 소브리너스 미생물에 대한 특이성을 확인하기 위해 실험을 진행하였으며, 서열번호 9 내지 16의 프라이머가 락토바실러스 속에 포함되는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 살리바리우스 미생물에 대해서 특이성을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
스트렙토코커스 속 미생물 검출용 프라이머(서열번호 1 내지 8) 특이도 검증에 사용된 PCR 반응용액은 스트렙토코커스 속과 락토바실러스 속 정량 및 정성 분석을 위해 각각 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 1 내지 8의 프라이머, 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dG TP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다.
락토바실러스 속 미생물 검출용 프라이머(서열번호 9 내지 16)의 특이도 검증에 사용된 PCR 반응용액은 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 9 내지 16의 프라이머, 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Poly merase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Gly cosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다.
PCR 반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Res earch Inc., USA) 기기를 사용하여 50에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치고, 94에서 20초간 변성과 72에서 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였고 마지막으로 72에서 5분간 신장(po st-extension)하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 Mupid-2plus 전기영동장치(Mupid, Japan)를 이용하여 증폭반응 유무 및 증폭된 DNA 크기를 확인하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 스트렙토코커스속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 각각에 대하여 특이적으로 해당 미생물만을 검출하였으며, 락토바실러스속 미생물을 포함하여 다른 속 미생물에 대해서는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 락토바실러스속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 9 내지 1 6의 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 각각의 미생물을 정확하게 검출하였으며, 그 이외에 다른 속에 속하는 미생물에 대해서는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
설계한 프라이머 세트의 특이도 확인
Bacterial strains 프라이머 세트
서열번호 17 내지 19 서열번호1 및 2 서열번호 3 및 4 서열번호 5 및 6 서열번호 7 및 8 서열번호 20 내지 23 서열번호 9 및 10 서열번호 11 및 12 서열번호 13 및 14 서열번호 15 및 16
Streptococcus mutans serotype c + - - + - - - - - -
Streptococcus mutans serotype e + - + - - - - - - -
Streptococcus mutans serotpe f + - - - + - - - - -
Streptococcus sobrinus ATCC33478 + + - - - - - - - -
Streptococcus mitis KCOM1379 - - - - - - - - - -
Streptococcus gordonii ATCC10558 - - - - - - - - - -
Streptococcus oralis ATCC35037 - - - - - - - - - -
Streptococcus sanguinis KCOM1017 - - - - - - - - - -
Streptococcus parasanguinis ATCC15912 - - - - - - - - - -
Streptococcus salivarius ATCC7073 - - - - - - - - - -
Streptococcus thermophilus ATCC19258 - - - - - - - - - -
Streptococcus vestibularis ATCC49124 - - - - - - - - - -
Lactobacillus casei ATCC334 - - - - - + - + - -
Lactobacillus paracasei ATCC335 - - - - - + - + - -
Lactobacillus fermentum ATCC11739 - - - - - + - - - -
Lactobacillus acidophilus ATCC4356 - - - - - + - - - -
Lactobacillus gasseri ATCC33323 - - - - - + - - - -
Lactobacillus crispatus ATCC33820 - - - - - + - - + -
Lactobacillus rhamnosus ATCC7469 - - - - - + - - - -
Lactobacillus plantarum ATCC10241 - - - - - + + - - -
Lactobacillus salivarius ATCC11741 - - - - - + - - - +
Campylobacter rectus ATCC33238 - - - - - - - - - -
Eikenella corrodens ATCC23843 - - - - - - - - - -
Eubacterium nodatum ATCC33099 - - - - - - - - - -
porphyromonas gingivalis ATCC33277 - - - - - - - - - -
Prevotella nigrescens ATCC33563 - - - - - - - - - -
Tannerella forsythia ATCC43037 - - - - - - - - - -
Treponema denticola ATCC35405 - - - - - - - - - -
Fusobacterium nucleatum ATCC25586 - - - - - - - - - -
Prevotella intermedia ATCC25611 - - - - - - - - - -
Esherichia coli K12 - - - - - - - - - -
상기 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 스트렙토코커스 속 미생물의 정량을 위한 프라이머인 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트는 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 각각을 정성적으로 구분하는 효과는 나타내지 못했으며,
락토바실러스 속 미생물의 정량을 위한 프라이머인 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 각각을 정성적으로 구분하는 효과를 나타내지는 못했다.
이에 반해, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍은 스트렙토코커스 속 미생물 중 목적하는 종을 정확하게 검출하는 결과를 나타냈으며,
서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16 각각의 프라이머쌍은 락토바실러스 속 미생물 중 목적하는 종을 정확하게 검출하는 효과를 나타냈다.
이러한 결과를 근거로, 본 발명자들은
(i) 서열번호 1 내지 8의 프라이머를 혼합하여 4종의 스트렙토코커스 속 미생물을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 각각의 종을 구별하여 검출할 수 있는지 여부를 판단하고자 하였으며,
(ii) 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트, 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트 및 상기 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 혼합하였을 때, 각각의 프라이머가 상호간에 간섭효과를 나타내지 않고 스트렙토코커스 속 미생물을 정량적으로 검출함과 동시에 정성적으로 구별할 수 있는지 여부를 판단하고자 하였다.
또한, 본 발명자들은
(i) 서열번호 9 내지 16의 프라이머를 혼합하여 4종의 락토바실러스 속 미생물을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 각각의 종을 구별하여 검출할 수 있는지 여부를 판단하고자 하였으며,
(ii) 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트, 서열번호 26의 프로브 및 상기 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 혼합하였을 때, 각각의 프라이머가 상호간에 간섭효과를 나타내지 않고 락토바실러스 속 미생물을 정량적으로 검출함과 동시에 정성적으로 구별할 수 있는지 여부를 판단하고자 하였다.
<실시예 2>
표준그래프(standard curve)의 작성 및 검출 민감도 평가
본 발명자는 한국 등록특허 10-1562491호에서 서열번호 17 내지 23의 프라이머 세트와 서열번호 24 내지 26의 프로브 세트를 포함하는 조성물이 치아우식을 일으키는 스트렙토코커스 속 미생물과 락토바실러스 속 미생물을 정량적으로 분석 할 수 있음을 확인한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 정량적 검출용 프라이머 및 프로브 세트가 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트와 혼합되었을 때에도, 스트렙토코커스 속 미생물 또는 락토바실러스 속 미생물을 정량적으로 검출할 수 있는지 여부를 검 출 민감도로써 판단하고자 하였다.
Real-time PCR의 검출 민감도를 확인하기 위해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ) ATCC25175 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Ca sei) ATCC334를 대상으로 하여, 유전체 DNA를 추출한 후, 10배씩 serial dilution한 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인하였으며(도 1), 형광 증폭 곡선의 결과에 나타난 시료의 CT값을 바탕으로 표준그래프를 작성하였다(도 2). 각 표준균주의 유전체 크기는 NCBI database(http://ncbi.nlm.nih.gov)에서 확인하였으며, Avogadro의 수 (6.02 X 1023 molecules per mole)를 기반으로 하여 각각의 희석 용액 당 들어있는 각 균주에 대한 유전체 DNA copy number를 계산하였으며, 표준그래프를 그리기 위한 log값으로 환산하여 하기 표 6과 같이 작성하였다.
Real-time PCR의 반응용액은 스트렙토코커스 속의 정량 및 정성을 동시에 확인할 수 있는지 여부를 판단하기 위해 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10 pmol/ul)씩의 염기서열 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호 17 내지 19의 프라이머, 0.1ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 24 및 25의 프루브, 0.3ul의 20X EvaGreen(바이오팩트, Korea), 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다.
마찬가지로 락토바실러스 속의 정량 및 정성을 동시에 확인하기 위해 2ul (1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 염기서열 9 내지 16의 프라이머 및 서열번호 20 내지 23의 프라이머, 0.1ul(10pmol/ul)의 서열번호 26의 프루브, 0.3ul의 20X EvaGreen(바이오팩트, Korea), 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit )의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2 mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다. PCR 반응은 Real-time PCR Thermal Cycler(Model CFX96 Real-time PCR Detection system, Bio-Rad Inc., USA) 기기를 사용하여 50에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치 고, 94에서 20초간 변성과 72에서 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였다. 이 후 Melting curve analysis를 위해 65에서 95까지 0.2도씩 증가하면서 형광값을 측정하는 Melting curve 석 단계를 수행하였다. 형광값은 72에서 측정하도록 하였으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager 2.1을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 균주에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수가 측정되었다.
Figure 112017029479902-pat00005
상기와 같은 결과들을 통해, 본 발명으로 설계된 Real-time PCR에 의해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ) ATCC25175와 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ) ATCC334의 유전체 DNA를 100fg/ul 까지 종특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 표준균주의 유전체 DNA size가 각각 2.03 Mbp, 2.92 Mbp인 점을 고려하면, 본 발명에 의한 검출 민감도는 각각 45.7 copy/ul와 31.8 copy/ul 임을 확인되었으며, 이는 서열번호 17 내지 23의 프라이머 및 서열번호 24 내지 26의 프로브 세트가 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트 또는 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트와 혼합되었을 때에도, 스트렙토코커스 속 미생물 또는 락토바실러스 속 미생물을 우수한 민감도로 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
< 실시예 3>
융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 따른 표준균주 정성검사 평가
서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트가 혼합된 본 발명의 조성물 또는 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트가 혼합된 본 발명의 조성물이 Real-time PCR 및 EvaG reen을 이용한 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)을 수행하였을 때,
(i) 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트가 혼합된 본 발명의 조성물이 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스 각각을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 구별하여 검출할 수 있는지 여부, 또는
(ii) 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트가 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 각각을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 구별하여 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 상기의 실시예 2의 Real-time PCR 반응용액과 동일한 조성으로 하고 표준균주의 DNA 농도는 100pg/ul로 하여 실험을 진행하였다. 이는 임상학적 분석실험에서 충치(치아우식) 활성을 확인하기 위한 스트렙토코커스 속 및 락토바실러스 속의 원인균을 평가할 때 활성도 구분 기준이 저농도 101/ul 이하, 중간농도 102/ ul와 103/ul 사이의 농도, 고농도는 103/ul 이상인 점을 고려하여 각각의 표준균주가 임상학적으로 최대값으로 샘플에 존재함을 가정하여 표 7에 나타난 바와 같이 104/ul 이상에 해당하는 농도인 100 pg/ul로 결정하였다. 이는 본 발명의 반응용액에 각각의 표준균주가 임상적으로 각각 최대값에 해당하는 농도가 존재하더라도 각각의 정성분석 결과를 명확하게 구분할 수 있는지의 여부를 확인하기 위함이다.
상기 표준균주의 DNA에는 (i) 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트의 효과를 판단하기 위해서 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스의 DNA가 포함되어 있거나, 또는 (ii) 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트의 효과를 판단하기 위해서 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카세이/파라카세이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스의 DNA가 포함되어 있다.
본 발명의 목적이 인간의 구강에 존재하는 치아 우식 유발 미생물들 중 (i) 상기 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 스트렙토코커스 속 미생물 4종을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 구별하여 검출하는 것, (ii) 상기 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 속 미생물 4종을 정확하고 신속하게, 그리고 동시에 구별하여 검출하는 것이기 때문에, 본 실시예에서는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 융해곡선 분석(Melting curve analysis)을 수행하였을 때, 각각의 미생물 종에 해당하는 검출 피크가 상호간에 명확하게 구별되어 정확한 구별이 가능한지 여부를 판단하고자 하였다.
융해곡선 분석(Melting Curve Analysis) 정성분석용 프라이머는 하나의 프라이머에서 하나의 Melt peak를 나타내야 하며, 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis) 정성분석용 프라이머 여러 세트를 한번의 반응으로 동시에 실험할 경우, 상호간에 명확히 구분이 가능한 서로 다른 Melt peak 수치를 나타내어 구분이 되어야 한다. 동일한 미생물을 검출하기 위한 프라이머쌍이라고 하더라도, 미생물의 DNA 염기서열 중 어떠한 부분을 선택하여 상보적인 서열의 프라이머를 제작하였는지 여부, 제작된 프라이머의 염기 서열 길이 등에 따라서 Melt point가 상이해지며, Melt peak의 모양 또한 전혀 상이한 결과가 나타나기도 한다. 즉, 융해곡선 분석용 프라이머가 잘못 제작이 되면 하나의 프라이머에서 두 개 이상의 피크가 나타나기도 하고, 본 발명과 같이 여러 종류의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 반응을 진행시킬 경우 검출하고자 하는 타겟의 melt peak가 겹쳐져 상호간에 구분이 어렵게 되는 결과가 발생할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명자들이 제작한 프라이머들 중 잘못 제작된 프라이머의 예시를 도 3에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 결과는, 하나의 프라이머 쌍에서 비특이적인 Melt peak가 나타나, 하나의 미생물 검출을 목적으로 반응을 진행했음에도 불구하고 피크가 두 개가 관찰되었다.
도 3B에 나타낸 결과는, 두 종류의 서로 다른 프라이머쌍을 혼합하여 두 종류의 미생물을 검출하고자 반응을 진행시킨 결과를 나타낸 것인데, 서로 다른 프라이머쌍에 의한 Melt peak가 구분이 되지 않아 하나의 Melt peak로 나타난 것이다. 즉, 이러한 프라이머쌍 혼합물의 경우에는, 동시에 두 종류의 미생물을 정성적으로 구분하여 검출하는 것이 불가능한 것이다.
도 3C에 나타낸 결과는, 서로 다른 프라이머쌍에 의해 Melt peak가 구분이 되지만, 상호간에 간섭반응이 일어나 저해가 되어 peak 모양이 정확하지 않거나, Melt peak 위치가 명확하지 않은 경우의 결과를 나타 낸 것이다. 이 경우 역시, 여러 종류의 미생물을 동시에 검출하는 것이 불가능한 경우이다.
이에,
(i) 본 발명자들은 서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트(스트렙토코커스속 미생물 정성분석용), 서열번호 17 내지 19의 프라이머 세트(스트렙토코커스속 미생물 정량 분석용) 및 서열번호 24 내지 25의 프로브 세트(스트렙토코커스속 미생물 정량 분석용)의 혼합 조성물을 이용하여 표준시료를 검출하여 본 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 서열번호 1 내지 8의 프라이머쌍 세트가 미생물을 검출하는 각각의 Melt peak 온도가 겹치지 않고 모두 구분이 되는 것을 확인하였으며, 도 4A에 나타낸 바와 같이, Melt peak 그래프에서도 각각의 미생물이 정확하게 구분되어 검출이 가능한 것을 확인하였다.
(ii) 또한, 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트(락토바실러스속 미생물 정성분석용), 서열번호 20 내 지 23의 프라이머 세트(락토바실러스속 미생물 정량 분석용) 및 서열번호 26의 프로브 세트(락토바실러스속 미생물 정량 분석용)의 혼합 조성물을 이용하여 표준시료를 검출하여 본 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 서열번호 9 내지 16의 프라이머쌍 세트가 미생물을 검출하는 각각의 Melt peak 온도가 겹치지 않고 모두 구분이 되는 것을 확인하였으며, 도 4B에 나타낸 바와 같이, Melt peak 그래프에서도 각각의 미생물이 정확하게 구분되어 검출이 가능한 것을 확인하였다.
(참고로, 도 4A 및 도 4B의 그래프에서 가장 오른쪽에서 검출된 피크는 정량분석용 프라이머의 Melt peak로써, 본 발명에 따른 정성분석과는 무관하다.)
즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트들은, 4쌍의 프라이머쌍이 혼합되어 있음에도 불구하고 목적하는 미생물을 융해곡선 분석법을 통해 정확하게 구분하여 검출할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 이러한 효과는 정량분석용 프라이머 및 프로브 세트가 함께 혼합되어 있음에도 불구하고, 이에 간섭작용을 받지 않고 정확한 정성적 분석이 가능하다는 점에서 매우 우수하다고 할 수 있다.
Figure 112017029479902-pat00006
< 실시예 4>
Real-time PCR 및 융해곡선 분석법( M elting curve analysis)의 임상샘플 적용 평가
서열번호 1 내지 8의 프라이머 세트가 포함된 본 발명의 조성물 또는 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트가 포함된 본 발명의 조성물을 이용하여 Real-time PCR 및 EvaGreen 형광물질을 이용한 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)을 수행하였을 때, 임상샘플 내에서도 목적하는 미생물을 정확하게 구분하여 정성적으로 분석하고, 동시에 정량적 분석용 프라이머 및 프로브도 그 효과를 발휘하는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
상기 실시예 3과 동일한 방법을 이용하되, 분석시료를 임상시료 3종으로 변경하여 분석하였다. 임상시료는 충치(치아우식) 활성을 확인하기 위한 원인균 검사방법에 사용하는 시료와 동일한 타액을 채취하기 위해 임상지원자가 가글액을 이용하여 20-30초간 강하게 가글링하여 뱉은 타액샘플을 이용하였으며, 의료기관의 분석의뢰서와 임상지원자 본인이 직접 작성한 유전자검사 동의서를 첨부하여 받은 시료를 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 5 내지 도 7 및 하기 표 8에 나타내었다.
Figure 112017029479902-pat00007
도 5 내지 도 7 및 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 임상샘플에서도 스트렙토코커스 속의 정량 및 스트렙토코커스 속에 포함된 주요 4종에 대한 정성분석이 가능하였으며, 락토바실러스 속의 정량 및 락토바실러스 속에 포함된 주요 4종에 대한 정성분석이 가능하였다.
본 발명에 따른 검사 방법을 이용하여 Real-time PCR과 Melting Curve Analysis를 연속적으로 수행할 경우, 치아우식 원인균 스트렙토코커스(Streptococcus) 속의 전체 정량분석과 속 내의 스트렙토코커스 뮤탄스 serotype c, serotype e, serotype f 및 스트렙토코커스 소브리너스(Sterptococcus sobrinus) 4종의 정성분석의 동시 확인 검사와 치아우식 원인균 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 전체 정량분석과 속 내의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이/파라카제이(Lactobacillus casei/paracasei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 4종의 정성분석의 동시 확인 검사를 통해 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
<110> KIM, sung hyun <120> Quantitative and qualitative methods of detecting bacteria related to dental caries using Real-time PCR and Melting Curve Analysis <130> NP16-0055D <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus sobrinus specific primer forward <400> 1 tcaagatccc gctgaacaaa c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus sobrinus specific primer reverse <400> 2 ggttgcatct tgagcgtatt tc 22 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype E specific primer forward <400> 3 cttaaaaatt ggatttcttt gaaacctcg 29 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype E specific primer reverse <400> 4 ggtgtttgaa ctaaccattc atctgt 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype C specific primer forward <400> 5 ggagcatttg gtgtttcttt attagg 26 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype C specific primer reverse <400> 6 caatctcttg cgagagacga c 21 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype F specific primer forward <400> 7 gtcttatata tttagtggta ggttcttttc tc 32 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus mutans serotype F specific primer reverse <400> 8 gtctatcatc agataatgcc tcagc 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum specific primer forward <400> 9 aaatgttccg taagacactt gact 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus plantarum specific primer reverse <400> 10 agtttggatc gaacctggct ta 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus casei/paracasei specific primer forward <400> 11 ccgtgagcat atcttgttgg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus casei/paracasei specific primer reverse <400> 12 cgtcaaccaa gtctgtcttg t 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus crispatus specific primer forward <400> 13 cttctttagc acaatcacac gaag 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus crispatus specific primer reverse <400> 14 tgtttggctt aacattaaca gtagc 25 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus salivarius specific primer forward <400> 15 tgatatagga tgtacaatcg ctaatacc 28 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus salivarius specific primer reverse <400> 16 tgttttatac ctagttggtt acatttctg 29 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus specific primer forward <400> 17 gcatcactag tagatggacc tgcgtt 26 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus specific primer reverse 1 <400> 18 agcacactat ggttgagcca tagc 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus specific primer reverse 2 <400> 19 agcatacatt ggttgagcca atgc 24 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific primer forward <400> 20 gtgttggrrg gtttccgcc 19 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific primer reverse 1 <400> 21 gcaccacctg tcattttgcc c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific primer reverse 2 <400> 22 gcaccacctg tcttagcgtc c 21 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific primer reverse 3 <400> 23 aagacctggt aaggttcttc gcgta 25 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus specific probe 1 <400> 24 aagaacgtgt gtgagagtgg aaagttcaca 30 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus specific probe 2 <400> 25 aagaacgtgt gtaagagtgg aaagcttaca ca 32 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific probe <400> 26 ctcaaaggaa ttgacggggg cc 22

Claims (6)

  1. 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 정성적 동시 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출은 융해곡선 분석법(Melting curve analysis)에 의한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 26의 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스 정성적 동시 검출용 키트.
  5. (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 9 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(real time PCR)으로 유전자를 증폭하는 단계;
    (c) 상기 증폭된 증폭산물을 융해(melting)시켜 융해곡선(melting curve)을 얻는 단계; 및
    (d) 상기 융해곡선으로부터 융해 온도를 확인하여 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 카제이 또는 파라카제이, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 살리바리우스를 정성적으로 구분하여 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 서열번호 20 내지 23의 프라이머 세트 및 서열번호 26의 프로브를 추가로 포함하고, 상기 (d) 단계에서 락토바실러스속 미생물을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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