KR101562491B1 - 충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR용 프라이머와 프로브 및 이의 용도에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 본 발명은 구강의 주요 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 미생물 및 락토바실러스 (Lactobacillus)속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 Multiplex real-time PCR용 프라이머, 프로브 및 이를 이용하여 상기 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 경우 1회의 반응을 통해 치아우식 원인균인 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있다.

Description

충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도{Primers and probes for simultaneous detecting bacteria related to dental caries using Multiplex real-time PCR and use thereof}
본 발명은 충치(치아우식) 원인균 동시 탐지를 위한 Multiplex real-time PCR 용 프라이머와 프로브 및 이의 용도에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 본 발명은 구강의 주요 치아우식 원인균으로 인식되고 있는 스트렙토코커스 (Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 Multiplex real-time PCR용 프라이머, 프로브 및 이를 이용하여 상기 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
충치(치아우식)는 입 안에 서식하는 세균에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생기는 산(acid)에 의해 치아의 법랑질이 손상되는 것을 말하며, 그 원인으로는 적절한 구강 위생 관리의 부재, 비효율적인 항 치아우식(anti-caries) 면역 반응, 식습관 유형과 치아 구조에 의한 여러 가지가 복합적으로 작용하여 발생하지만 그 근본 원인은 pH를 5.5 이하로 낮출 수 있는 치아우식 원인균에 의한 다인성 감염성 질환이다. 치아우식을 방치하게 되면 치수염을 일으켜 심한 통증을 느끼게 되고 이로 인해서 치아를 상실할 수도 있으며, 이를 예방하기 위해서는 치아우식의 위험 요인을 조기에 발견하고 적절한 예방적 처치를 통해 치아우식의 진행을 방지하는 것이 중요하다. 따라서, 치아우식의 예방, 발병가능성 및 치료 후 예후 판정을 위해 효율적이면서도 민감도가 높은 방법으로 검출할 수 있는 시스템 개발의 필요성이 제기되고 있는 실정이다.
인간의 구강에는 300종 이상의 세균이 상재하고 있는데, 이러한 세균들 중 뮤탄스 스트렙토코시(Mutans streptococci)에 속하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus) 그리고 락토바실러스(Lactobacillus spp.)에 속하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum). 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 등이 치아우식을 발생시키는 세균으로 알려져 있다.
지금까지 치아우식활성 검사로는 단순하게 구강 pH를 확인하거나 치아우식의 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)나 락토바실러스(lactobacillus spp.) 등이 선별적으로 자랄 수 있는 선택 배지를 이용하여 배양된 세균의 양을 측정하는 방법이 주로 활용되어왔다. 하지만 이 방법으로는 구강에서 확인하고자 하는 치아우식 유발 세균에 대해 한 검사 당 한 종류씩만 배양하여 확인할 수 있고, 배양 검사를 완벽히 수행하는데 3일 이상이 소요되며(time-consuming) 노동집약적(laborious)이다.
분자생물학적 기법인 PCR 기법은 배양을 이용한 방법을 대체하는 방법으로, 다양한 병원균을 탐지하는 데 신뢰할 만한 도구로 사용되어 왔다. 특히 Multiplex PCR은 다수의 타겟을 동시에 탐지할 수 있는 장점을 가지고 있다. 하지만 Multiplex PCR을 포함한 전통적인 PCR 방법 역시 증폭 산물(product)의 분석을 위한 전기영동(gel electrophoresis) 과정을 필요로 하여 시간이 많이 소모되고 노동집약적이다.
이에 본 발명자들은 치아우식 원인균인 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물과 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 동시다중으로 검출하기 위해 16S rRNA를 인코딩하는 유전자를 기반으로 PCR 프라이머쌍과 종특이적 형광 프로브를 설계하였고, 상기 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 실시함으로써 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 높은 특이도 및 민감도로 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 동시 검출용 조성물을 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출 및 정량방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 동시 검출용 조성물을 포함하는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 동시 검출 및 정량방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 7의 염기서열을 포함하는 프라이머는 각각 서열 상동성이 95% 이상인 염 기서열을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 프라이머가 20bp인 경우, 20bp 중 2개 이상 틀리면 용융 온도(melting temperature)의 감소가 5도 이상이 되므로 결과가 좋지 않게 나타나지만, 1개만 틀릴 경우에는 PCR 과정에서 열처리(annealing) 온도를 약간 내려 실험 할 경우 동등한 결과를 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 “프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'-말단 및 3'-말단에 각각 형광물질이 표지될 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 5'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 3'-말단에 표지된 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA) 또는 black holequencher-1,2,3 (BHQ-1,2,3)일 수 있으며, 이에 한정 되는 것은 아니다.
프로브의 5'-말단 및 3'-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것 일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'-말단의 형광물질 에너지에 의해 5'-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5'-말단의 형광물질이 유리되면서 3'-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.
본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머 및 서열번호 8 및 9의 프로브는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물의 16s rRNA를 인코딩하는 유전자 부위를 특이적으로 표적으로 하는 프라이머 및 프로브이며, 서열번호 4 내지 7의 프라이머 및 서열번호 10의 프로브는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 16s rRNA를 인코딩하는 유전자 부위를 특이적으로 표적으로 하는 프라이머 및 프로브이다. 즉, 상기 프라이머 또는 프로브는 다른 미생물에는 결합하지 않고 상기 미생물에만 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물에 속하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였으며, 서열번호 4 내지 7의 프라이머 세트는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에 속하는 9종의 미생물만을 특이적으로 검출하였으며, 다른 속에 속하는 미생물에 대해서는 어떠한 PCR 산물도 관찰되지 않아 그 특이성이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다(실시예 1).
바람직하게는 본 발명에서 상기 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물에는 치아우식(충치)에 주요한 원인균으로 알려져 있는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에는,치아우식(충치)에 주요한 원인균으로 알려져 있는 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 조성물의 검출 민감도를 확인하기 위해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 대상으로 하여, 유전체 DNA를 추출한 후, 10배씩 희석하여 Multiplex real-time PCR을 실시한 결과, 약 10 fg/ul까지 특이적으로 상기 미생물을 검출할 수 있음을 확인하여, 그 검출 민감도가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다(실시예 2).
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 서열번호 1 내지 7의 프라이머 및 서열번호 8 내지 10의 프로브 이외에 PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 조성물의 성분의 비제한적인 예로는 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 키트에는 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등를 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 조성물 전체 중량 대비 0.0001∼0.01중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001∼0.005중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 조성물 전체 중량 대비 0.01중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우 중합효소연쇄반응 시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용될 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 키트 구성성분을 보다 안정화시키기 위한 안정화 물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10∼500mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50∼300mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500mM를 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 부피가 필요 이상으로 커지며, 중합효소연쇄반응을 위해 멸균 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 중합효소연쇄반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있는 문제점이 있다. 그리고, 10mM 미만이면 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화 물질로서 젤라틴, 소형청 알부민, Thesit, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 키트 구성성분은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용 가능하다.
본 발명에서는 또한 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출 및 정량방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 임상시료란 환자의 타액 또는 구강 내에서 채취된 치아 샘플일 수 있으며, 상기 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. etal., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. etal., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
상기 (b) 단계에서 PCR 반응이란 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이 적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
이러한 real-time PCR 분석은 시판되고 있는 real-time PCR 기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, real-time PCR 기기는 예를 들어, SLAN real time PCR detectionsystem(LG 생명과학, 한국), LightCycler 96/480 (Roche, Germany), ABI 7500 fast/7500/PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems,USA), iCyclerTM/CFX96TM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 프라이머 세트 및 프로브 세트는 그를 구성하는 각 프라이머 또는 프로브 사이에 간섭현상 없이 상기의 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 유전자를 Multiplex real-time PCR에 의하여 성공적으로 증폭하는데 사용할 수 있다. 즉, 하나의 중합효소 연쇄 반응에 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트를 동시에 사용하여도 프라이머 이량체, 헤어핀 고리 등이 형성되지 않고 높은 민감도로 각각의 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
따라서 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 실시하는 경우, 매우 신뢰성 있고, 신속하게 치아우식 유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시에 검출할 수 있다. 이러한 검출은 높은 특이도 및 민감도를 나타내기 때문에 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus)을 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 서열번호 8 및 9의 프로브, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)을 검출할 수 있는 서열번호 4 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 10의 프로브 각각을 단독으로 이용하여 real-time PCR을 실시하는 것과 동일한 정도의 민감도로 미생물을 동시에 검출할 수 있다는 점에서 매우 우수하다.
즉, 본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 다중 중합효소 연쇄반응 프라이머 및 프로브 세트의 미생물 검출 성능을 확인하기 위해, 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브 세트가 혼합된 반응 조성물을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하여 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 동시에 검출한 결과, 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 각각을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 단독 real-time PCR의 결과 CT 값과 거의 동등하게 나타나, 상기 프라이머 및 프로브를 동시에 사용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 수행한다고 하더라도, 각 프라이머 및 프로브 사이에 간섭현상 없이 우수한 민감도로 해당 미생물을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(실시예 3).
본 발명의 상기 (b) 단계에서의 “정량”과 관련하여, real-time PCR 방법은 절대 정량 (absolute quantification)과 상대 정량 (relative quantification) 분석으로 구분되는데, 시료 내의 표적 DNA를 정량하기 위해서는 표준시료의 검량선 (표준곡선; standard curve) 작성이 필수적인 요소이다. 표준시료와 미지시료를 대상으로 동시에 정량적 real-time PCR을 실시하여 표준시료로부터 검량선을 도출한 후, 이 검량선으로부터 미지시료 내 표적 DNA의 양을 정량한다. 이때 표준시료로부터의 검량선 (x축: 표준시료의 농도, y축: 역치 주기 수 (CT; threshold cycle))은 상관지수 (R2)가 1에 가까울수록 이상적이다.
본 발명에서 real-time PCR을 이용한 정량은 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 “정량”이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준시료를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 검량선은 정량하고자 하는 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및/또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 16s rRNA를 표준시료로 하고, 상기 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 정량적 real-time PCR을 수행함으로써, 표준시료의 증폭으로부터 작성된 검량선을 기준으로 시료 내 존재하는 표적 유전자의 역치 주기 수 (CT)를 확인하여 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 및/또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 농도를 예측할 수 있다.
상기한 바와 같이, 치아우식의 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)만을 특이적으로 검출하면서, Multiplex real-time PCR 방법에 의해 동시에 PCR 반응을 수행하더라도 상호간에 아무런 간섭현상 없이 우수한 민감도로 각각의 미생물을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브 세트는 현재까지 보고된 바가 없다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 경우 1회의 반응을 통해 치아우식 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)을 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있다.
도 1은 유전체 DNA를 1ng/ul 농도부터 10배씩 serial dilution 한 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175([A], FAM; blue) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334([B], HEX; green)의 Multiplex real-time PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭곡선(fluorescent amplification curves)을 나타낸 것이다(A: S. mutans, B: L.casei).
도 2는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175) 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334)의 표준곡선을 나타낸 것이다(A: S. mutans, B: L.casei).
도 3은 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 1에서의 다중 중합효소 연쇄반응과 각각의 프라이머를 단독으로 이용한 중합효소 연쇄반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: 다중 중합효소 연쇄반응, B: 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175) 단독 중합효소 연쇄반응, C: 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334) 단독 중합효소 연쇄반응).
도 4는 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 2에서의 다중 중합효소 연쇄반응과 각각의 프라이머를 단독으로 이용한 중합효소 연쇄반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: 다중 중합효소 연쇄반응, B: 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175) 단독 중합효소 연쇄반응, C: 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334) 단독 중합효소 연쇄반응).
도 5는 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료 3에서의 다중 중합효소 연쇄반응과 각각의 프라이머를 단독으로 이용한 중합효소 연쇄반응에 대한 형광 그래프를 나타낸 것이다(A: 다중 중합효소 연쇄반응, B: 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans ATCC25175) 단독 중합효소 연쇄반응, C: 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei ATCC334) 단독 중합효소 연쇄반응).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험준비>
1. 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Genebank 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 Genebank의 entrez에서 스트렙토코커스(Streptococcus)속 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물의 16s rRNA 유전자를 확보한 후 다중핵산염기서열 분석 프로그램 clustal W2를 이용하여 보존 부위를 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 스트렙토코커스(Streptococcus)속 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기 서열임을 확인하였다.
Figure 112015061678604-pat00001
Figure 112015061678604-pat00002
2. 프라이머의 합성
실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harborlaboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 바이오니아사(bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.
3. 미생물로부터 DNA의 추출
표준균주에서 ExgeneTM Cell SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific co., USA) spectrophotometer를 이용하여 측정하였으며, 초기 DNA 농도를 1ng/ul로 희석한 후, 100∼10-6까지 10배씩 순차희석(serial dilution) 하였다.
<실시예 1>
프라이머의 특이도 확인
상기 실험준비 단계에서 제작한 서열번호 1 내지 7의 프라이머가 스트렙토코커스(Streptococcus)속 또는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에 대해서 특이성을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
프라이머 특이도 검증에 사용된 PCR 반응용액은 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 서열번호 1 내지 7의 프라이머, 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다. PCR 반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Research Inc., USA) 기기를 사용하여 50℃에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94℃에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치고, 94℃에서 20초간 변성(denature)과 72℃ 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 신장(post-extension)하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 Mupid-2plus 전기영동장치(Mupid, Japan)를 이용하여 증폭반응 유무 및 증폭된 DNA 크기를 확인하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 두 종의 미생물만을 검출했을 뿐, 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 포함하여 다른 속 미생물에 대해서는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 서열번호 4 내지 7의 프라이머 세트는 실험에 사용된 9종의 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 모두를 정확하게 검출하였으며, 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물을 포함하여 다른 속에 속하는 미생물에 대해서는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
Figure 112015061678604-pat00003
<실시예 2>
표준그래프(standard curve)의 작성 및 검출 민감도 평가
Multiplex real-time PCR의 검출 민감도를 확인하기 위해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC25175 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei) ATCC334를 대상으로 하여, 유전체 DNA를 추출한 후, 10배씩 serial dilution한 시료를 대상으로 형광 증폭 곡선을 확인하였으며(도 1), 형광 증폭 곡선의 결과에 나타난 시료의 CT값을 바탕으로 표준그래프를 작성하였다(도 2). 각 표준균주의 유전체 크기는 NCBI database(http://ncbi.nlm.nih.gov)에서 확인하였으며, Avogadro의 수 (6.02 × 1023 molecules per mole)를 기반으로 하여 각각의 희석 용액 당 들어있는 각 균주에 대한 유전체 DNA copy number를 계산하였으며, 표준그래프를 그리기 위한 log값으로 환산하여 하기 표 4와 같이 작성하였다.
Multiplex real-time PCR의 반응용액은 2ul(1ng/ul)의 template DNA, 0.5ul(10pmol/ul)씩의 염기서열 1 내지 7의 프라이머, 0.1ul(10pmol/ul)씩의 염기서열 8 내지 10의 프루브, 0.4ul(1 unit)의 SolgTM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3ul(15 mM MgCl2 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 30ul가 되도록 하였다. PCR 반응은 Real-time PCR Thermal Cycler(Model CFX96 Real-time PCR Detection system, Bio-Rad Inc., USA) 기기를 사용하여 50℃에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 오염 방지 단계 후에 94℃에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계를 거치고, 94℃에서 20초간 변성(denature)과 72℃ 40초간 결합(annealing) 및 신장(extension)하는 과정을 40회 반복하였다. 형광값은 72℃에서 측정하도록 하였으며, 데이터 분석은 Bio-Rad CFX Manager 2.1 을 이용하였다. Cycle threshold(Ct)는 알려진 숫자의 DNA 농도의 대수증폭기로 시작하여 균주에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수가 측정되었다.
Figure 112015061678604-pat00004
상기와 같은 결과들을 통해, 본 발명으로 설계된 Multiplex real-time PCR에 의해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC25175와 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei) ATCC334의 유전체 DNA를 10fg/ul 까지 종특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 표준균주의 유전체 DNA size가 각각 2.03 Mbp, 2.92Mbp인 점을 고려하면, 본 발명에 의한 검출 민감도는 각각 4.57 copy/ul와 3.18 copy/ul 임을 계산하였다.
<실시예 3>
Multiplex real-time PCR의 성능 평가
서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브 세트가 혼합된 본 발명의 조성물이 Multiplex real-time PCR을 수행하였을 때, 각 프라이머 및 프로브 세트가 상호간에 간섭반응을 일으키지 않고 해당 미생물을 높은 정확성으로 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
즉, (i) 스트렙토코커스(Streptococcus)속 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 동시에 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브 세트가 혼합된 조성물을 이용한 Multiplex real-time PCR, (i) 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물만을 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 서열번호 8 및 9의 프로브로 이루어진 조성물을 이용한 real-time PCR 및 (iii) 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물만을 검출할 수 있는 서열번호 4 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 10의 프로브로 이루어진 조성물을 이용한 real-time PCR을 실시하여, 그 검출 결과를 비교하였다.
이에 대한 결과를 도 3 내지 도 5 및 하기 표 5에 나타내었다.
Figure 112015061678604-pat00005
도 3 내지 도 5 및 상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 샘플에서 Multiplex real-time PCR과 단독 real-time PCR의 실험 결과에 나타난 CT값의 차이는 ±1 범위 이내의 유사한 수치로 확인되었으며, 이는 본 발명에서 설계된 Multiplex real-time PCR을 이용한 스트렙토코커스(Streptococcus)속 및 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물 동시검출 방법이 각각의 단독으로 수행된 real-time PCR과 성능적으로 유사함을 나타낸다.
즉, 결과적으로 본 발명에 따른 조성물 및 검출방법에 따라 Multiplex real-time PCR을 수행하면, 신속하고 정확하게 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 동시에 검출할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 경우 1회의 반응을 통해 치아우식 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 신속하고 용이하게 임상진단을 할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
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Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 5' 말단 표지된 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출용 키트.
  7. (a) 임상시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
    (b) 상기 얻어진 DNA를 서열번호 1 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 10의 프로브 세트를 이용하여 Multiplex real-time PCR을 수행하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리너스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물 동시 검출 및 정량방법.
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