KR102055447B1 - 중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트 - Google Patents
중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조 시 쉽게 오염될 수 있는 진균을 검출할 수 있는 핵산증폭 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머 세트, 프라이머-프로브 세트, 및 이를 포함하는 진균의 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머 세트 또는 프라이머-프로브 세트를 이용하면 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조, 보관 및 투여시 오염가능한 다양한 병원성진균을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 핵산증폭 방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 진균의 검출방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 중합효소연쇄반응법 및 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
최근에 배양세포(면역세포 및 줄기세포)를 이용한 세포 치료법의 개발 및 바이오 의약품(인슐린, 성장호르몬, 인터페론 및 항체의약품)을 이용한 치료법들이 개발되면서, 바이오의약품 및 세포치료제로서 배양된 면역세포, 줄기세포, 또는 동물세포의 병원성 미생물인 바이러스, 박테리아, 병원성진균, 및 진균의 오염에 대한 신속한 균 검출법은 임상적용 전 환자의 2차 질병감염을 막기 위해 반드시 선행되어야 할 중요한 과정이다.
기존의 미생물(세균, 진균, 병원성진균 포함) 검출법으로 잘 알려진 표준 무균시험법인 직접배양법은 미생물 오염판정에 긴 시간이 소요되며, 배양이 어려운 미생물에 대해서는 적합하지 못하다는 한계가 있다.
특히, 장기간의 시험 기간이 요구되어 통상 제조 후 48시간 내에 사용되는 세포치료제에는 현실적으로 적용하기에 어려운 실정이다. 따라서 기존 직접배양법의 단점을 개선하여 고빈도 오염 미생물군과 병원성 미생물군을 효율적으로 신속 검출할 수 있는 대체법의 개발이 반드시 필요하다.
핵산을 증폭하는 기술 중 하나인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR법)을 이용한 분자진단법은 신속하면서 민감도가 높아 다양한 분자진단 제품개발을 위해 사용되고 있으며, 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 미생물 검출법에도 적용되고 있다.
기존의 미생물(세균, 진균, 병원성진균 포함) 검출법으로 잘 알려진 표준 무균시험법인 직접배양법은 미생물 오염판정에 긴 시간이 소요되며, 배양이 어려운 미생물에 대해서는 적합하지 못하다는 한계가 있다.
특히, 장기간의 시험 기간이 요구되어 통상 제조 후 48시간 내에 사용되는 세포치료제에는 현실적으로 적용하기에 어려운 실정이다. 따라서 기존 직접배양법의 단점을 개선하여 고빈도 오염 미생물군과 병원성 미생물군을 효율적으로 신속 검출할 수 있는 대체법의 개발이 반드시 필요하다.
핵산을 증폭하는 기술 중 하나인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR법)을 이용한 분자진단법은 신속하면서 민감도가 높아 다양한 분자진단 제품개발을 위해 사용되고 있으며, 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 미생물 검출법에도 적용되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 세포치료제로 이용되는 면역세포 또는 줄기세포 및 바이오의약품을 생산하는 동물세포의 배양과정에서 배양 세포에 오염될 수 있는 병원성 진균(fungi)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하기 위해 연구 노력하였다.
그 결과, 다양한 종의 진균을 단회의 핵산증폭과정을 통해 검출할 수 있는 PCR(polymerase chain reaction)용 프라이머 세트를 개발하였고, 이 프라이머세트를 사용한 핵산증폭방법을 통해 다양한 병원성 진균의 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
그 결과, 다양한 종의 진균을 단회의 핵산증폭과정을 통해 검출할 수 있는 PCR(polymerase chain reaction)용 프라이머 세트를 개발하였고, 이 프라이머세트를 사용한 핵산증폭방법을 통해 다양한 병원성 진균의 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 핵산증폭방법을 이용하여 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머 세트 또는 프라이머-프로브 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트 또는 프라이머-프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양시 오염가능한 진균 검출용 핵산 증폭 키트 및 실시간 핵산 증폭 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 핵산증폭방법을 이용하여 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 DNA 및 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계.
이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 나누어 상세히 설명한다.
단계 (a): 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
단계 (a): 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
삭제
본 발명의 검출 방법은 진균(fungi)이 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 본 발명에서 검출 대상 시료는 바람직하게는 생물학적 시료이며, 보다 바람직하게는 바이오 의약품, 배양된 세포가 될 수 있다. 예컨대, 세포배양법과 같은 생물학적 방법에 의해 생산되는 바이오 의약품, 세포치료제로 사용되는 면역세포, 또는 줄기세포의 생산과정 또는 이들의 최종 생산물을 시료로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 세포 배양 전후의 배양액, 환자 투여를 위한 수액, 바이오 의약품의 생산과정에서 사용되는 원재료 및 최종 생산물이 시료가 될 수 있다.
상기 검출 대상인 진균으로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 예컨대, 본 발명에서 진균의 세포에서 지놈 DNA(genomic DNA, gDNA)는 페놀-클로로포름 추출 방법을 응용하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출가능한 진균은 다음의 진균으로부터 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 진균이다:
칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii).
단계 (b): 상기 추출된 DNA 및 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계
칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii).
단계 (b): 상기 추출된 DNA 및 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계
삭제
본 명세서에 사용되는 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산의 증폭반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 진균 지놈 DNA 서열중에서 종(species) 보존적인 18S ribosomal RNA (rRNA)를 코딩하는 유전자 영역을 표적으로 하도록 디자인하였기 때문에 다양한 종류의 진균을 특이적으로 검출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 세포배양 과정에서 고빈도로 오염될 수 있는 다양한 진균들의 군에서 보존된 18S rRNA 코딩 유전자 영역의 서열의 상동성에 기초하여 다양한 진균을 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 프라이머 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 추가적으로 포함한다. 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머는 정상적인 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머 세트이다.
본 발명의 핵산 증폭반응에서 상기 단계 (a)에서 시료로부터 추출한 DNA가 반응의 주형 DNA로서 사용된다.
다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용 가능한 DNA 중합효소는 적합한 처리에 의해 외래 DNA가 제거된 DNA-free 중합효소를 사용할 수 있으며, 또한, 핫-스타트(Hot-start) 기능을 갖는 핫-스타트 중합효소를 사용할 수 있다. 핫-스타트 중합효소는 고온 예컨대 95℃와 같은 고온에서 중합효소 활성을 갖는 효소로서, 프라이머와 중합효소 간의 저온에서의 반응을 억제하여 프라이머 다이머 형성을 차단함으로써 중합효소 증폭반응의 특이도를 향상시킨다.
본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 dUTP의 혼합물, PCR 완충액(buffer), DNA 중합 효소 조인자, 및 UDG (Uracill DNA Glycosylase)를 포함할 수 있다. 본 발명의 증폭반응의 dNTP 혼합물은 dTTP 및 dUTP을 포함하며, 이와 함께 UDG(Uracil DNA Glycosylase)가 포함된다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염(carry-over contamination)에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 적절량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 적절량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 dUTP를 충분한 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
단계 (c): 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 18S rRNA 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열의 증폭산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 핵산 증폭 반응의 결과물을 아가로즈젤(agarose gell) 또는 모세관(capillary) 전기영동 하고 그 결과 형성되는 밴드크기를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 핵산 산물을 분석하여 병원성진균 감염여부를 결정한다. 보다 구체적으로, 핵산 증폭 산물을 표준마커와 함께 아가로스 젤 또는 모세관에서 전기영동하고 표준 마커를 기준으로 각 밴드를 비교 분석하여 병원성진균의 감염 또는 존재여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 이용하여 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하는 방법을 제공한다: (a)′검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b)′상기 추출된 DNA, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계.
단계 (a)′: 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 이용하여 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하는 방법을 제공한다: (a)′검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b)′상기 추출된 DNA, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계.
단계 (a)′: 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
삭제
삭제
검출하고자 하는 시료로부터 DNA를 추출하는 단계 (a)′는 상기 핵산증폭방법을 이용한 방법의 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
단계 (b)′: 상기 추출된 DNA, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계.
본 발명의 단계 (b)′에서는 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행한다. 프라이머에 대한 내용은 상기 핵산증폭방법을 이용한 방법의 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 7 내지 서열번호 14의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 15 및 서열번호 16의 내부대조군용 프라이머 세트를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 용어 "프로브(probe)" 는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브인 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging) 될 수 있다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 프로브는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프로브 세트는 서열번호 17 내지 서열번호 19의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 프로브 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에서 사용되는 프로브 세트는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 내부대조군용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅(tagging)되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있다.
본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어, 리포터 형광물질은 6-FAM, JOY, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, VIC, EDD, TAMRA 를 사용할 수 있으며, 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 또는 ROX를 사용할 수 있다.
본 발명의 프로브는 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광을 방출한다.
프로브의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 프라이머 혼성화 온도와 길이에 따라 변이가 있지만 전형적으로 20-35 뉴클레오타이드로 프라이머의 혼성화 온도보다 약 5-10℃ 정도 높은 혼성화 온드를 가지도록 설계하여 실시간중합효소 반응의 특이성을 높일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 추가로 포함한다. 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머는 정상적인 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머 세트이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응용 프라이머 및 프로브 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 내지 서열번호 14의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이고, 상기 프로브 세트는 서열번호 17 내지 서열번호 19의 프로브를 포함하는 프로브 세트인 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 및 서열번호 20의 프로브를 추가적으로 포함한다. 상기 서열번호 15, 16 및 20의 프라이머 및 프로브는 정상적인 실시간 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 세트 또는 프라이머 및 프로브 세트에서 상기 진균은 다음의 진균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이다:
칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 세포 배양시 오염가능한 진균 검출용 핵산 증폭 키트를 제공한다.
칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 세포 배양시 오염가능한 진균 검출용 핵산 증폭 키트를 제공한다.
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본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 프라이머 및 프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 [예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소], DNA 중합 효소 조인자, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP로 이루어지는 dNTP 혼합물 및 UDG (Uracil DNA Gylcosylase)를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 [예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소], DNA 중합 효소 조인자, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP로 이루어지는 dNTP 혼합물 및 UDG (Uracil DNA Gylcosylase)를 포함할 수 있다.
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본 발명은 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조 시 쉽게 오염될 수 있는 진균을 검출할 수 있는 핵산증폭 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머 세트, 프라이머-프로브 세트, 및 이를 포함하는 진균의 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머 세트 또는 프라이머-프로브 세트를 이용하면 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조, 보관 및 투여시 오염가능한 다양한 병원성진균을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 핵산증폭 방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 진균의 검출방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1a 및 도 1b는 표준검체를 사용하여 본 발명의 검출방법에 의해 다양한 진균을 검출한 결과를 보여준다. 도 1a는 병원성진균에 대해 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출한 결과이며, 도 1b는 병원성진균에 대해 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출한 결과이다. 표준검체로서는 ATCC로부터 구입한 12종의 진균인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 패실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 패니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus)로부터 추출한 지놈 DNA(genomic DNA)를 사용하였다. 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii) 균주에 대해서는 검출목표유전자인 18S rRNA 합성 DNA가 클로닝된 plasmid DNA를 사용하였다.
도 2a는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성진균에 대해 검출 특이도를 측정한 결과이다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 중합효소증폭반응에서 검출목표균종인 병원성진균 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 2b 및 도 2c는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 진균의 검출 특이도를 검사한 결과이다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에서 검출목표균주인 병원성진균 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa)균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 사용하여 병원성진균의 검출 민감도를 측정한 결과이다. 도 3a 내지 도 3c의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 병원성진균 전통적 방법의 핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 5x101 - 5x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다. 또한, 도 3d 및 도 3e의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시간핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 2 - 2.4x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
도 2a는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성진균에 대해 검출 특이도를 측정한 결과이다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 중합효소증폭반응에서 검출목표균종인 병원성진균 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 2b 및 도 2c는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 진균의 검출 특이도를 검사한 결과이다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에서 검출목표균주인 병원성진균 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa)균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 사용하여 병원성진균의 검출 민감도를 측정한 결과이다. 도 3a 내지 도 3c의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 병원성진균 전통적 방법의 핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 5x101 - 5x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다. 또한, 도 3d 및 도 3e의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시간핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 2 - 2.4x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 실험에 사용한 진균 균주
실시예 1 : 실험에 사용한 진균 균주
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하기 표 1 및 표 2에는 본 발명의 방법의 검출대상 진균으로서 세포치료제와 생물학적 의약품 제조 시 높은 빈도로 오염되는 세균의 목록을 나타내었다.
| 본 발명에서 사용한 진균주 12종 | |||
| 번호 | 균주 | ATCC number | 구입처 |
| 1 | Rhodotorula mucilaginosa | 4558 | ATCC |
| 2 | Saccharomyces cerevisiae | 7904 | ATCC |
| 3 | Trichosporon asahii | 90039 | ATCC |
| 4 | Trichosporon pullulans | 10677 | ATCC |
| 5 | Candida glabrata | 7219 | ATCC |
| 6 | Malassezia furfur | 14524 | ATCC |
| 7 | Aspergillus niger | 6911 | ATCC |
| 8 | Candida albicans | 10231 | ATCC |
| 9 | Candida tropicalis | 20005 | ATCC |
| 10 | Paecilomyces sp. | 26182 | ATCC |
| 11 | Penicillium sp. | 16076 | ATCC |
| 12 | Aspergillus fumigatus | 6145 | ATCC |
| 본 발명에서 사용한 검출목표유전자 18S rRNA 합성 진균주 4종 | |||
| 번호 | 균주 | ATCC number | 합성처 |
| 1 | Candida parapsilosis | 22019D-5 | GeneScript Co. LTD. USA |
| 2 | Cryptococcus neoformans | 34873D-2 | |
| 3 | Candida krusei | 20297 | |
| 4 | Pneumocystis jirovecii | 4558 | |
실시예 2 : 진균 검출용 프라이머 및 프로브의 설계
상기 실시예 1에 나타낸 검출대상 진균을 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하였다. 검출 목표로 선정된 16종의 병원성진균균의 18S rRNA 유전자를 대상으로 BioEdit Sequence Alignment Editor 프로그램(Ver7.1.11, Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.)을 이용하여 다중 염기서열 정렬을 통해 유전자 염기서열의 유사성을 비교분석하여 검출목표균종내에서 유사성이 가장 높은 공통 염기서열을 포함한 부위를 대상으로 프라이머 위치로 선정하였다. 또한, 선정된 대상 염기서열부위에서 일부 염기서열부위의 염기가 일치하지 않은 경우, 검출 특이도를 높이기 위해 각각의 대상 프라이머를 추가하여 프라이머 세트를 구성하였다. 본 발명에서 전통적인 일반 PCR법에 기초한 검출법의 경우, 최종적으로 2종의 전방향(forward) 프라이머와 2종의 역방향(reverse) 프라이머를 선정하였다. 추가로 중합효소연쇄반응의 양성반응 확인을 위해 PCRC 프라이머를 추가하였다. 상기 PCRC 프라이머는 시금치(Spinacia oleracea)의 psbA 유전자를 증폭할 수 있도록 설계하여 병원성진균 음성검체에서 중합효소연쇄반응이 정확히 반응하였음을 확인할 수 있도록 하였으며, 본 발명의 키트에 상기 PCRC 프라이머의 타겟 DNA으로서 내부대조군용 DNA 주형인 psbA 유전자가 클로닝된 plasmid DNA를 포함시켰다. 아래 표 3에는 병원성진균 검출용 프라이머의 서열을 나타내었다.
| 프라이머 명칭 | 염기서열 | 서열번호 | Mer (bp) | Tm (℃) |
| F1-1 | TTCATTCAAATTTCTGCCCTATCA | 1 | 24 | 64 |
| F1-2 | TTCATTCAAATATCTGCCCTATCA | 2 | 24 | 64 |
| R3 | TTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCG | 3 | 24 | 66 |
| R3-1 | TTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCG | 4 | 23 | 66 |
| PCRC F | CGAATACACCAGCTACACCTAA | 5 | 22 | 64 |
| PCRC R | TACAATGGTGGTCCTTATGAACT | 6 | 23 | 64 |
본 발명에서 실시간(Real-Time) PCR 법에 기초한 검출법의 경우, 상기와 동일한 방법으로 최종적으로 3종의 전방향(forward) 프라이머, 5종의 역방향(reverse) 프라이머 및 3종의 프로브를 선정하였다. 프로브의 3'말단부위의 형광물질의 선정은 실시간 PCR 에서 가장 많이 사용되고 있는 FAM 형광물질을 선정하였으며, FAM 형광물질의 발광을 억제하는 BHQ1을 3'말단부위에 표지하였다. 추가로 중합효소연쇄반응의 양성반응 확인을 위해 PCRC 프라이머 및 프로브를 추가하였으며, PCRC 프라이머는 시금치(Spinacia oleracea)의 psbA 유전자를 증폭할 수 있도록 설계하여 병원성진균 음성검체에서 중합효소연쇄반응이 정확히 반응하였음을 확인할 수 있도록 하였다. 본 발명의 키트에 상기 PCRC 프라이머의 타겟 DNA으로서 내부 대조군용 DNA 주형인 psbA 유전자가 클로닝된 plasmid DNA를 포함시켰다. 아래 표 4에는 병원성진균 검출용 실시간 PCR용 프라이머의 서열을 표기하였다.
실시예 3 : 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 진균의 검출
3-1. 시료의 제조
상기 실시예 2에서 제작한 진균 검출용 프라이머 세트를 사용하여 진균의 검출 특이도를 검사하였다. 먼저, ATCC로부터 구입한 12종의 진균인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa), 패실로마이세스 스페시스(Paecilomyces sp.), 패니실리움 스페시스(Penicillium sp.), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히(Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주로부터 각각의 지놈 DNA를 추출하였다. 지놈 DNA의 추출은 SolgentTM Genomic DNA Prep Kit (Cat.No. SGD41-C100, Solgent, Korea)를 사용하여 키트에 포함된 설명서의 내용에 따라 행하였다. 추출된 지놈 DNA는 UV 분광기로 농도(10-100 pg의 범위)를 측정하고, 순도는 A260/A280 비율(≥ 1.8)을 측정한 후에 사용하였다. 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 크루세이(Candida krusei) 및 뉴모시스티스 자로베시이(Pneumocystis jirovecii)의 4종의 진균에 대해서는 GeneScript Co. LTD. (USA)로부터 검출목표유전자 18S rRNA 코딩 유전자를 합성하여 이를 중합효소연쇄반응의 주형으로 사용하였다.
3-2. 표준 마커(standard marker)의 제조
본 발명의 일반적 PCR 키트의 경우, 젤 전기영동시에 사용하는 850 bp 및 301 bp 크기의 표준마커는 Lentinula plasmid DNA를 사용하여 제작하였다. Lentinula plasmid DNA가 형질전환된 E.coli DH5α를 액체 배지내에서 배양하고, 배양세포를 회수하여 플라스미드 DNA를 추출하였다(SolGent Plasmid mini-prep kit [SPM01-C050, C100]). 추출한 플라스미드 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 표준마커를 증폭하여 제작하였다. 표준마커 제작에 사용한 프라이머는 다음과 같았다: [Fungi SM F 850: GACTATATGTCATCGCTTCTTC (서열번호 21), SM R1: GAATGCTGCGACTACGATCTG (서열번호 22), 증폭크기 850 bp], [SM-301bp-F: GTTTGAAAATCTTTTTAACTTCAAAG (서열번호 23), SM R2: CATAGAGAGGCTAACAGATTCA (서열번호 24)]. 표준마커 생성용 PCR 혼합물의 조성은 및 반응조건은 아래 표 5 및 표 6에 나타내었다.
| PCR 반응성분 | 부피(㎕) |
| SolgTM 2x multiplex PCR Smart mix (CatNo.SMP01-MB50k) | 25 |
| Primer (Forward) 10 pmole | 2 |
| Primer (Reverse) 10 pmole | 2 |
| Lentinula edodes plasmid DNA (2.5 ng/㎕) | 2 |
| Nuclease free Water | 19 |
| Total | 50 |
| 온도 | 시간 | 사이클 |
| 95℃ | 15 분 | 1 |
| 95℃ | 30 초 | 35 |
| 60℃ | 30 초 | |
| 72℃ | 1 분 | |
| 72℃ | 5 분 | 1 |
| 4℃ | ∞ |
3-3. 양성대조군 (positive control) 주형의 제조
본 발명의 일반 PCR과 실시간(Real-Time) PCR 모두에서 양성대조군으로 사용할 주형 DNA는 진균(Fungi Species) 유전자 18S ribosomal RNA 유전자 및 1종의 Spinacia oleracea의 psbA를 증폭한 후 증폭 산물을 T vector에 클로닝하여 이를 양성대조군 주형으로 사용하였다.
3-4. 중합효소연쇄반응
PCR의 반응액은 다음의 성분 비율로 제조하였다: 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG) 12.5 ㎕, 프라이머 혼합물 2 ㎕에 Nuclease free Water 및 DNA 주형시료를 첨가하여 총 반응액 부피를 25 ㎕로 맞추었다. PCR 반응은 다음의 조건으로 실시하였다. UDG 반응은 50℃에서 3분의 1 사이클, 초기 PCR 활성화는 95℃에서 15분의 1 사이클, 95℃에서 20초의 변성(denaturation), 56℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 40초의 연장(extension)으로 구성되는 사이클을 40 사이클, 및 최종 연장(extension) 반응은 72℃에서 5 분간 행하였다. 상기 반응조건에 따라 PCR을 통해 핵산을 증폭한 후 증폭산물을 3％의 아가로스 젤상에서 전기영동하여 표준 마커를 기준으로 하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다. 12 개종의 병원성진균으로부터 추출한 지놈 DNA에 대해 PCR 반응을 실시한 결과는 도 1a에 나타내었다. 도 1a의 결과로부터 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR 방법을 사용하여 다양한 종류의 병원성진균을 동시에 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
3-5. 실시간 중합효소연쇄반응
실시간(Real-Time) PCR의 반응액은 다음의 성분 비율로 제조하였다: 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG) 12.5 ㎕, 프라이머 혼합물 2 ㎕에 Nuclease free Water 및 DNA 주형시료를 첨가하여 총 반응액 부피를 25 ㎕로 맞추었다. PCR 반응은 다음의 조건으로 실시하였다. UDG 반응은 50℃에서 3분의 1 사이클, 초기 PCR 활성화는 95℃에서 15분의 1 사이클, 95℃에서 20초의 변성(denaturation), 60℃에서 40초의 어닐링(annealing)으로 구성되는 사이클을 40사이클로 행하였다. 실시간 PCR의 증폭여부는 사용장비(ABI7500 또는 CFX96)에서 제공하는 각 프로그램을 사용하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다. 12의 병원성진균으로부터 추출한 지놈 DNA와 4종의 병원성진균의 합성한 18S rRNA 코딩 유전자에 대해 실시간 PCR 반응의 결과는 도 1b에 나타내었다. 도 1b의 결과로부터 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응법을 사용하여 다양한 종류의 병원성진균을 동시에 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4 : 본 발명의 병원성진균 검출 키트의 검출 특이도 및 민감도
4-1. 검출특이도
본 발명의 병원성진균의 전통적인 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성진균에 대한 검출 특이도를 측정하였다. 특이도 검사에서 음성검체로는 human gDNA 및 0-14일간 배양된 면역세포를 사용하였으며, 양성검체로는 병원성진균 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 사용하였다. 이들 양성 검체 및 음성검체를 사용한 특이도 검사의 결과는 도 2a에 나타내었다. 도 2a의 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 중합효소증폭반응에서 검출목표균종인 병원성진균 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균만이 특이적으로 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않았다.
본 발명의 병원성진균의 실시간중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 진균의 검출 특이도를 검사하였다. 실시간중합효소연쇄반응의 특이도 검사에서 음성검체로는 다음의 16종의 박테리아균과 16종의 마이코플라즈마균을 사용하였다: 16종의 박테리아균[바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 글루타미쿰(Enterobacter glutamicum), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 크랩시엘라 옥시토카(Klepsiella oxytoca), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)]; 16종의 마이코플라즈마균 [마이코플라즈마 아르기니니(Mycoplasma arginini), 마이코플라즈마 부칼레(Mycoplasma buccale), 마이코플라즈마 부테오니스(Mycoplasma buteonis), 마이코플라즈마 콜리스(Mycoplasma collis), 마이코플라즈마 칼리포니쿰(Mycoplasma californicum), 마이코플라즈마 코트위(Mycoplasma cottewii), 마이코플라즈마 크리세툴리(Mycoplasma cricetuli), 마이코플라즈마 이퀴르히니스(Mycoplasma equirhinis), 마이코플라즈마 펠리파우시엄(Mycoplasma felifaucium), 마이코플라즈마 펠리스(Mycoplasma felis), 마이코플라즈마 기피스(Mycoplasma gypis), 마이코플라즈마 미코이드스(Mycoplasma mycoides), 마이코플라즈마 가티에(Mycoplasma gateae), 마이코플라즈마 피룸(Mycoplasma pirum), 마이코플라즈마 레오파린기스(Mycoplasma leopharyngis), 마이코플라즈마 리포파시엔스(Mycoplasma lipofaciens)]. 양성검체로는 병원성진균 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa)을 사용하였다. 상기 음성검체 및 양성검체를 사용하여 행한 특이도 검사의 결과는 도 2b 및 도 2c에 나타내었다. 도 2b 및 도 2c의 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소증폭반응에서 검출목표균종인 병원성진균 로도토룰라 뮤시라지노사(Rhodotorula mucilaginosa) 균만을 특이적으로 검출하였으며, 음성검체(균)은 검출되지 않았다.
4-2. 검출민감도
본 발명에서 제작한 병원성진균 검출 키트를 사용하여 병원성진균의 검출 민감도를 검사하였다. 검출민감도 측정은 병원성진균 양성검체(균)을 사용하였다. 검출 민감도 측정 결과는 도 3a 내지 도 3e에 나타내었다. 도 3a 내지 도 3c의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 병원성진균 전통적 방법의 핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 5x101 - 5x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다. 또한, 도 3d 및 도 3e의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시간핵산증폭검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 2 - 2.4 x 103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Solgent Co., Ltd.
<120> Method for Detecting Fungi Contaminated in Therapeutic Cells or
Biological Medicine By Using Polymerase Chain Reaction and
Real-time Polymerase Chain Reaction and Kit for the Same Method
<130> PN130290
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<170> KopatentIn 2.0
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catagagagg ctaacagatt ca 22
Claims (13)
- 다음의 단계를 포함하는 핵산증폭방법을 이용하여 세포배양 시 오염 가능한 진균을 검출하는 방법:
(a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 DNA 및 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 상기 진균은 다음의 진균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사 (Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히 (Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스 (Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스 (Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스 (Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이 (Pneumocystis jirovecii). - 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 핵산증폭반응은 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 이용하여 세포배양 시 오염 가능한 진균을 검출하는 방법:
(a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 DNA, 서열번호 7 내지 14의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 17 내지 19의 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계. - 제 5 항에 있어서, 상기 진균은 다음의 진균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사 (Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히 (Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스 (Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스 (Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스 (Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이 (Pneumocystis jirovecii). - 서열번호 1 내지 4의 프라이머를 포함하는, 세포배양 시 오염 가능한 진균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머 세트.
- 제7항에 있어서, 상기 진균은 다음의 진균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 프라이머 세트:
칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사 (Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히 (Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스 (Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스 (Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스 (Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이 (Pneumocystis jirovecii). - 서열번호 7 내지 14의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및
서열번호 17 내지 19의 프로브를 포함하는 프로브 세트;
를 포함하는 세포배양 시 오염 가능한 진균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응 (real time polymerase chain reaction)용 프라이머 및 프로브 세트. - 제9항에 있어서, 상기 진균은 다음의 진균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 프라이머 및 프로브 세트:
칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 로도토룰라 뮤시라지노사 (Rhodotorula mucilaginosa), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 트리코스포론 아사히 (Trichosporon asahii), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 파실로마이세스 스페시스 (Paecilomyces sp.), 페니실리움 스페시스 (Penicillium sp.), 아스퍼질러스 퓨미가투스 (Aspergillus fumigatus), 및 뉴모시스티스 자로베시이 (Pneumocystis jirovecii). - 제7항 기재의 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양 시 오염 가능한 진균 검출용 핵산증폭 키트.
- 제9항 기재의 프라이머 및 프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양시 오염가능한 진균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)용 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 키트는 핫-스타트(hot-start) 기능을 갖는 핵산중합효소 또는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP로 이루어지는 dNTP 혼합물, 및 UDG (Uracil DNA Glycosylase)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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