KR20200081318A - 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트 - Google Patents

멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20200081318A
KR20200081318A KR1020190176416A KR20190176416A KR20200081318A KR 20200081318 A KR20200081318 A KR 20200081318A KR 1020190176416 A KR1020190176416 A KR 1020190176416A KR 20190176416 A KR20190176416 A KR 20190176416A KR 20200081318 A KR20200081318 A KR 20200081318A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
str
fluorescent dye
amplifying
multiplex
Prior art date
Application number
KR1020190176416A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102151657B1 (ko
Inventor
정지나
전효원
김광중
Original Assignee
주식회사 엔젠바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엔젠바이오 filed Critical 주식회사 엔젠바이오
Publication of KR20200081318A publication Critical patent/KR20200081318A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102151657B1 publication Critical patent/KR102151657B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 Y STR 분석 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 16개 STR 유전좌위들(short tandem repeat loci)를 동시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 높은 정확도로 유전자 감식을 할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법은 인간 유전자 감식에 있어서, 짧은 증폭산물을 생산하기 때문에 샘플 의존도가 낮을 뿐만 아니라, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능하여 개인식별, 혈족 확인에 있어서 유용하다.

Description

멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 Y STR 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트{Method and Kit for Analyzing Human Subject Y STR loci by using Multiplex System}
본 발명은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 Y STR 유전좌위 분석방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 16개 Y STR 유전좌위들(short tandem repeat loci)를 동시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 민감하며, 높은 정확도로 Y STR 유전좌위를 감식할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
개인식별이나 혈연관계 여부 확인을 위한 유전자감정은 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase Chain Reaction) 이용을 기본으로 한 방법이 본격적으로 사용되고 있으며, 이러한 원리는 범죄 사건 등에 법의학적 타이핑이나 DNA 신원 확인 정보와 같은 DNA 데이터베이스 구축하는데 활용되고 있다. 인간 DNA 내에 어떤 형질 등을 나타내는 유전 정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 다양하게 존재하는 것으로 알려진 짧은 반복 염기 서열(Short Tandem Repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커로서 전 세계적으로 유용하게 사용되고 있으며 많은 유전자좌가 이러한 다형성을 갖는 STR 부위를 가지고 있다. STR 부위는 2개에서 7개의 염기 서열이 반복되는 구조로 되어 있는데, 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 수가 다름에 따라 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele)에 따라 다르고 개인에 따라 고유의 대립 형질 갖게 된다. 따라서 이러한 특정 유전자좌의 STR 반복수(대립 형질)에 따라 개인식별이 가능하다. 또한, 인간의 성별을 식별하기 위하여 성염색체 아멜로게닌 좌위가 사용될 수 있다. 아멜로게닌 좌위는 유전자 은행(GenBank)에서 남성 DNA에 존재하는 Y 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELY로서 여성 DNA에 존재하는 X 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELX로서 확인된다.
한편, 멀티플렉스 PCR 시스템은 한번의 PCR 반응으로 여러 유전좌위들(loci)의 프라이머를 넣고 한 튜브 내에서 실험반응을 수행하는 것으로서, 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하게 되면 감정인력 및 분석에 사용되는 taq 폴리머라아제(PCR 반응효소) 등 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있는 큰 장점이 있다. 유전자감식에는 상용화된 고가의 반응시약류들이 소모되는 것을 감안할 때 예산상의 절감효과도 상당히 거둘 수 있는 장점을 지니고 있다. 이렇듯 멀티플렉스 PCR 시스템이 가지는 인력, 예산 면에서의 효용가치로 인하여 유전자감식을 선도하는 영국, 미국을 비롯한 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다.
Thermofisher 사의 Yfiler Plus PCR amplification Kit DYS19, DYS385 a/b, DYS387S1 a/b, DYS389 I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS449, DYS456, DYS458, DYS460, DYS481, DYS518, DYS533, DYS570, DYS576, DYS627, DYS635 (Y GATA C4) 및 Y GATA H4를 포함하는 24개 유전좌위를 동시 증폭하여 4개의 형광으로 검출하는 키트를 개발하였으며 현존하는 상용화 제품 중 민감도가 가장 높은 것으로 알려져 있다.
한편, 대한민국 특허 제 10-1414827 호에서는 DYS391, DYS389 I, DYS439, DYS389 II, DYS438, DYS393, DYS390, DYS385 a/b, DYS388, DYS456, Y-GATA-H4, DYS392, DYS19, DYS437, DYS458, DYS447, DYS635 및 DYS448를 포함하는 18개 유전좌위의 멀티플렉스 증폭 및 형광 검출방법을 개시하고 있으나, 증폭산물의 길이가 400bp를 초과하는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 인간 객체의 Y 유전자 감식을 위한 분석방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 16개좌의 Y STR 유전좌위를 본 발명의 프라이머 조합으로 증폭할 경우, 증폭산물의 길이가 300bp까지 짧아질 뿐만 아니라, 샘플의 유전정보를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 16개 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 Y STR 유전좌위 (short tandem repeat loci) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 키트를 이용한 개인식별 또는 부계 혈족확인 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
(a) 인간 객체 DNA 시료를 DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 16개의 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 16개의 STR 유전좌위를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 멀티플렉스 Y 성염색체 유전자 증폭을 이용한 유전자 감식방법을 제공한다.
본 발명은 또한, DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 Y STR 유전좌위(short tandem repeat loci) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 인체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA중에서 Y 성염색체를 주형으로 하고, 상기 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개인식별 또는 부계 혈족 확인방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인간 객체의 유전자 감식방법은 인간 유전자 감식에 있어서, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능할 뿐만 아니라, 증폭산물의 길이가 짧아 조각난 DNA 샘플에서도 민감도와 높으므로 개인식별 및 혈족 확인에 있어서 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 멀티플렉스 시스템에서 분석하는 유전좌의 위치를 형광 마커별로 표시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 멀티플렉스 시스템에서 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 멀티플렉스 시스템의 민감도를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 멀티플렉스 시스템을 테스트하기 위하여 인공적으로 조각낸 DNA의 길이 분포를 측정한 도면이다.
도 5는 상기 조각낸 DNA를 본 발명의 멀티플렉스 시스템을 이용하여 분석한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 'STR'은 인간 게놈(genome) 내의 어떤 형질 등의 유전정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 널리 분포한 것으로 알려진 반복염기서열(tandem repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커(marker)로서 범세계적으로 유용하게 사용되고 있다. 인간의 게놈에서 많은 유전좌위가 다형성의 STR 부위를 함유하고 있다. STR 좌위는 길이가 2 내지 7개의 염기쌍인 짧은 반복 서열 요소로 구성되어 있는데, 인간의 게놈에는 매 15 kb마다 한 번씩, 2백 만개의 삼량체 및 사량체 STR이 존재하는 것으로 추정된다. 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 단위의 수가 변함에 따라, 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele) 및 각 개인에 따라 변하게 된다. STR 좌위는 이 반복 배열의 측부에 동정되어 있는 특정 프라이머 서열을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다.
이러한 유전좌위의 대립 형질들은 증폭된 부위 내에 함유되어 있는 반복 서열의 복제수(the number of copy)에 따라 구분되며, 전기 영동법으로 분리한 후, 방사성, 형광, 실버 스테인 및 색채 등 적당한 검출 방법을 사용하여 식별한다.
본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
상기 멀티플렉스 증폭은 멀티플렉스 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 57-61℃의 어닐링(annealing) 온도 조건을 갖고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58-60℃의 어닐링 온도 조건을 가지며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58.5-59.5℃의 어닐링 온도 조건을 갖는다.
상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 PCR을 실시하는 데 적정한 싸이클 수가 요구된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 27-30 싸이클로 실시한다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 증폭을 26 싸이클 이하로 실시하는 경우에 500 RFU 이하의 피크들이 형성되었고, 31 싸이클에서는 2,000 RFU 이상의 피크가 형성되었지만 노이즈가 증가하고 불완전한 A 삽입이 발생하여 적합하지 않다.
본 발명에서 용어 '프라이머(primer)'는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트 및 중합 반응 효소 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 발명에서는 Y STR 유전좌의 위치를 멀티플렉스 시스템을 이용하고, 프라이머 세트의 조합을 새롭게 구성하여 분석할 경우, 형광염료를 추가로 사용하지 않으면서, 짧은 길이의 증폭산물을 제작하여 분석 민감도와 정확도가 증가하는 지를 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인각 객체 DNA 시료를 DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458를 포함하는 16개의 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 동시에 상기 16개의 STR 유전좌위를 멀티플렉스 증폭을 실시한 다음, 각 유전좌의 대립유전자형을 결정하여 감식한 결과, 높은 민감도와 정확도로 인간 객체의 유전자를 감식할 수 있음을 확인하였다(도 2).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 인간 객체 DNA 시료를 DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 16개의 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 16개의 STR 유전좌위를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 멀티플렉스 Y 성염색체 유전자 증폭을 이용한 유전자 감식방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 STR 좌위를 증폭할 수 있고, GC 비율이 40 내지 60% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 30의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 증폭산물은 80 내지 350bp인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 표 2에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 각 STR 좌위를 증폭하였으나, 검출 효율이 상용 제품과 유사하게 나타나는 것을 확인하고, 이를 개량하여 표 2에 기재된 프라이머 세트 대비 10배 효율이 증가한 표 1의 프라이머 세트를 개발한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트에 따른 증폭산물의 길이는 기존의 제품/특허에 공개된 증폭산물들에 비하여 획기적으로 짧으므로, 샘플이 조각나 있더라도 기존의 제품/특허 대비 높은 정확도와 민감도로 유전자를 감식할 수 있다
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교/평가하여 실시하며, 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 유전좌위-특이적 대립유전자 래더인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 객체의 유전자 감식은 대립유전자형을 결정하고, 이를 대조군과 비교하여 객체의 유전자 형을 결정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 범죄 현장에서 발견된 혈액 샘플 내의 DNA의 유전자 감식을 수행할 경우, 결정된 대립유전자형이 범죄자 인터페이스에 존재하는 지 여부를 판단하여, 용의자를 특정할 수 있으며, 친자확인에 이용할 경우, 샘플 객체의 대립유전자형을 결정하고 이를 친부 또는 친모의 대립유전자형을 대조군으로 비교하여 친자 여부를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 형광염료로 표지될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 둘 이상의 그룹으로 나누어서 서로 상이한 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, DYS437, DYS439, DYS392, DYS391 및 GATA-H4로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제1형광 염료로 표지되고; DYS456, DYS389I, DYS390 및 DYS389II 로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제2형광 염료로 표지되며; DYS385a/b, DYS438 및 DYS448로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제3형광 염료로 표지되고; 및 DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제4형광 염료로 표지되며, 상기 제1형광 염료, 제2형광 염료, 제3형광 염료 및 제4형광 염료는 서로 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 유전좌위에 상보적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머 중 하나의 프라이머의 5'말단에 형광염료가 표지된다. 상기 제1형광염료 내지 제4형광염료는 모세관 전기영동을 통해 검출할 수 있도록 한 레인에 3 내지 4개의 유전좌위를 배치하는 구성하기 위한 표지이다.
본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 6-FAM, VIC, NED, PET, ROX, HEX, dR110, dR6G, dTAMRA 및 dROX로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 피크 균형을 맞추기 위한 최적의 배합비를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트에서 DYS437 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS439 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-3.0μM의 최종 농도를 가지며, DYS392 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-5.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-5.0μM의 최종 농도를 가지며, GATA-H4 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS456 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS389I 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지며, DYS390 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-5.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS389II 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지며, DYS385a/b 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.0-5.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS438 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-5.0μM의 최종 농도를 가지며, DYS448 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS393 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-4.0μM의 최종 농도를 가지며, DYS635 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS19 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.0-6.0μM의 최종 농도를 가지고, DYS458 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리(separate)하기 위한 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 실시한다.
전기영동은 분산된 공간적으로 동일한 전기장의 영향 하에 입자의 움직임의 흐름에 관한 것이다(Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. p. 3.208; Hunter, R.J. (1989). Foundations of Colloid Science. Oxford University Press; Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974). Electrokinetic Phenomena. J. Willey and Sons; Russel, W.B.; D.A. Saville and W.R. Schowalter (1989). Colloidal Dispersions. Cambridge University Press; Kruyt, H.R. (1952). Colloid Science. Volu El1, Irreversible systems. Elsevier 및 Dukhin, A.S.; P.J. Goetz (2002). Ultrasound for characterizing colloids. Elsevier). 전기영동의 종류로는 친화성 전기영동(Affinity electrophoresis), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis) 및 겔 전기영동(Gel electrophoresis) 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리하기 위한 모세관 전기영동을 이용하여 실시한다. 상기 모세관 전기영동은 전하를 띄고 있는 이온들에 전기장을 걸어주어 각 이온들은 반대전하를 띤 전극으로 이동하는 데 이때의 이동속도는 각 이온들의 평균 전하, 크기, 모양, 용매의 성질에 따라 달라진다. 모세관 전기영동은 이온들이 가느다란 관을 통하여 존재하도록 한 상태에서 관의 양끝에 전기장을 걸어 줄 때 이온들이 관내에서 그들의 성질에 따라 각기 다른 속도로 일정한 방향성을 가지면서 이동하는 성질을 이용하여 물질을 분리하는 장치이다.
본 발명은 다른 관점에서, DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 Y STR 유전좌위(short tandem repeat loci) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 반응 완충액, DNA 중합 효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, 반응 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 필요에 따라, DNA 중합 효소 조인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 인체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA중에서 Y 성염색체를 주형으로 하고, 제8항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개인식별 또는 부계 혈족 확인방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 멀티플렉스 PCR을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 시료에서 DNA 샘플 수득
시료가 모근 또는 구강상피세포일 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(E-Prep DNA extraction solution, Viagen Biotech):
시료에 E-Prep Solution(Viagen Biotech) 100-200μl를 첨가한 다음, Porteinase K(20mg/ml, Sigma Aldrich) 10μl를 첨가한 뒤, 섞어 원심분리를 수행한 다음, 튜브 기벽에 모인 시료를 모은 후 63℃ 항온 수조에서 20분간 배양하고, 다시 85℃ 항온수조에서 15분간 배양한 뒤, 13,000rpm/min으로 4분간 원심 분리하여 상등액 50-100μl를 회수하였다.
시료가 모근, 구강 상피세포가 아닌 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(Qiagen human genomic DNA extraction kit, Qiagen, USA):
시료에 ATL buffer(Qiagen, USA) 350-400μl를 주입한 다음, 56℃ 항온수조에서 1시간 배양하고, 상등액 전체를 회수하여 다른 튜브에 옮겨 담은 후, AL buffer(Qiagen, USA 350-400μl를 첨가한 다음 70℃ 항온수조에서 10분간 배양한 후, 100% 에탄올 200μl를 첨가하였다. 상기 용액을 column에 넣어 13,000rpm 으로 1분간 원심분리하여 collection tube에 담긴 용액은 버리고 column에 AW1 buffer 650μl를 첨가한 뒤, 13,000rpm 으로 1분간 원심분리한 뒤, collection tube에 담긴 용액을 버린 다음, 상기 과정을 2회 반복하였다. 세척된 column을 1.5ml 튜브에 끼운 다음, 3차 증류수 20μl를 첨가하고 상온에서 5분간 배양한 뒤, 13,000rpm으로 1분간 원심부리하여 최종 genomic DNA를 수득하였다.
실시예 2. 멀티플렉스 시스템을 이용한 Y STR 유전좌 증폭
DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458의 16개의 STR 유전좌위들을 포함하는 유전자 좌위 세트에서 각각의 유전자 좌위에 대응되는, 프라이머들 및 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하여 DNA 샘플 내 서열을 PCR 증폭하였다.
PCR 반응물은 20μl를 기준으로 2X PCR master mix(Qiagen, USA) 10μl, 시료 DNA 1-10ng, 10X 프라이머 세트 2μl, DW 나머지의 부피로 제작하였으며, DNA 샘플의 최소 검출 한계치는 0.5~1 ng으로 법의학적 시료들의 특성상 극미량의 검체에 해당하는 프로필도 본 키트를 사용해 검출할 수 있는 민감도를 갖는 것을 확인하였다.
각 프라이머 세트별 서열 정보 및 증폭산물 크기는 하기 표 1/2와 같다.
프라이머 세트 정보
DYE NO. LOCUS SEQUENCE (5' → 3') 서열번호 Size range
(bp)
FAM
(Blue) 		1 DYS439-FF(1) GATAGATACATAGGTGGAGACAG 1 106-128
DYS439-RR(3) ATTTCTTTTACCCATCATCTCTTTAC 2
2 DYS437-FF(1) CGTGAGTGCATGCCCATCC 3 138-156
DYS437-RR(1) AGATAGATAACCACAGATAAATATCATT 4
3 DYS392-F(1) CAGAGGGATCATTAAACCTACC 5 187-222
DYS392-RR(6) GACCATATTTACCATATGTTCATCC 6
4 DYS391-FF(1) GTCAAGTAACCCTGTCTTAGCAT 7 237-271
DYS391-R(1) GGAATAAAATCTCCCTGGTTGC 8
5 GATA-H4-F(1) TACATAGCCCACTTGTTAAACAAC 9 285-311
GATA-H4-R(8) TCTGAAGAGCTAAACAGAGACC 10
VIC
(Green) 		6 DYS456-F(1) CTGTTGTGGGACCTTGTGATAA 11 145-172
DYS456-3R(1) TTCCCAAAATGCTGAGATTACAAAC 12
7,9 DYS389-I/II-FF(1) CCTACTTCTGTATCCAACTCTC 13 175-189
280-314
DYS389-I/II-RR(5) ACTTGAGGAACACAATTATCCCT 14
8 DYS390-F(1) CATTGCAATGTGTATACTCAGAAAC 15 232-258
DYS390-3R(3) CACATTTTTGGGCCCTGCATT 16
NED
(Yellow) 		10 DYS385a/b-F(1) CCAATTACATAGTCCTCCTTTCTT 17 280-314
DYS385a/b-R(4) GAGAAAAAGAAAGAAAGAGAAGAAAGA 18
11 DYS438-F(1) GAAAGATTCACTGATTACCAAAATTAG 19 119-194
DYS438-2R(2) GTGGTGGCAGACGCCTATAA 20
12 DYS448-F(1) GAGATTAGAAATAGAGATCGCGA 21 232-269
DYS448-2R(1) TTGATTCCCTGTGTTGGAGAC 22
PET
(Red) 		13 DYS393-FF(1) TTCCTAATGTGGTCTTCTACTTG 23 278-328
DYS393-R(3) AAATGAGGTATGTCTCATAGAAAAGA 24
14 DYS635-F(1) CAGCCCAAATATCCATCAATCAAT 25 99-137
DYS635-2R(3) TCTCTTGGCTTCTCACTTTGC 26
15 DYS19-F(1) CAATCTCTGCACCTGGAAATAG 27 224-254
DYS19-RR(1) CTGAGTTTCTGTTATAGTGTTTTTTAA 28
16 DYS458-FF(2) GCCATTGCACTGCAGACTGA 29 279-317
DYS458-2R(7) AGTAGCTGGGGCTAGAGGTT 30
프라이머 세트 정보 - 2
DYE NO. LOCUS SEQUENCE (5' → 3') 서열번호 Size range
(bp)
FAM
(Blue) 		1 DYS437-F-(1) ACTATGGGCGTGAGTGCATG 31 111-130
DYS437-R-(1) ATAAGTAGATAGACATCATTCACAG 32
2 DYS439-F-(1) GGTGGAGACAGATAGATGATAAAT 33 130-161
DYS439-R(3) TGGGATTACAGGCATAATCCA C 34
3 DYS392-F-(1) CAGAGGGATCATTAAACCTACC 5 167-203
DYS392-R-(1) CATCCATATTTTCTTCATTAATCTAGC 35
4 DYS391-F-(1) GTAAGATTTTGTCTGTCCATTTAGC 36 213-248
DYS391-R-(1) GGAATAAAATCTCCCTGGTTGC 8
5 GATA-H4-F-(1) TACATAGCCCACTTGTTAAACAAC 9 283-313
GATA-H4-R-(8) TCTGAAGAGCTAAACAGAGACC 10
VIC
(Green) 		6 DYS456-F-(1) CTGTTGTGGGACCTTGTGATAA 11 122-149
DYS456-R-(8) ACTTCTTAAACTGATGTATTAGGGTT 37
7,9 DYS389-I/II-F-(1) CCAACTCTCATCTGTATTATCTATG 38 160-195
272-308
DYS389-I/II-R-(3) AAGTGTTACTTGAGGAACACAATTAT 39
8 DYS390-F-(1) CATTGCAATGTGTATACTCAGAAAC 15 196-240
DYS390-R-(5) GATATTAGGTTTATTACATTCACACATA 40
NED
(Yellow) 		10 DYS385a/b-F-(1) CCAACTCTCATCTGTATTATCTATG 41 110-198
DYS385ab-R(4) GAGAAAAAGAAAGAAAGAGAAGAAAGA 18
11 DYS438-F-(1) GAAAGATTCACTGATTACCAAAATTAG 19 220-258
DYS438-R-(2) CCTATAATCCCAGCTACCTG 42
12 DYS448-F-(1) GAGATTAGAAATAGAGATCGCGA 21 263-314
DYS448-R-(1) GGAGACCTTTTCTTCCTTAACG 43
PET
(Red) 		13 DYS393-F-(1) AATGTGGTCTTCTACTTGTGTCAA 44 102-138
DYS393-R(3) AAATGAGGTATGTCTCATAGAAAAGA 24
14 DYS635-F-(1) CAGCCCAAATATCCATCAATCAAT 25 160-199
DYS635-R-(1) AGAAATGCCCAATGGAATGCTC 45
15 DYS19-F-(1) CAATCTCTGCACCTGGAAATAG 27 226-260
DYS19-R-(4) CTACTGAGTTTCTGTTATAGTGTTT 46
16 DYS458-FF-(2) GCCATTGCACTGCAGACTGA 29 268-313
DYS458-RR-(2) CTAGAGGTTCCTGCCACCA 47
멀티플렉스 PCR 반응은 하기의 조건으로 수행하였다.
Veriti Thermal Cycler (ABI, USA) 혹은 이에 상응하는 성능을 지닌 기기
(1) 초기반응(predenaturation): 95℃ 11분
(2) 증폭반응(denaturation, amplification, extension): 30회 사이클링
95℃ 1분 →60℃ 1분 →72℃ 1분
(3) 최종연장(Final extension): 60℃ 60분
(4) 냉각(Chilling): 4℃ 지속
실시예 3. STR 유전좌 결정
3130XL Genetic Analyzer (ABI, USA), 3730XL Genetic Analyzer (ABI, USA) 및 3500 or 3500XL Genetic Analyzer (ABI, USA)를 이용하여 모세관(capillary) 전기영동을 이용하여 증폭산물의 크기를 결정하였다.
실시예 2에서 수득한 증폭 산물 1μl와 본 발명에서 제작한 allelic ladder 1μl를 준비한 다음, Hi-Di formamide 9.3μl와 GeneScan-500 LIZ(ABI, USA) 0.05μl를 혼합하고, 상기 증폭 산물 및 래더를 각각 첨가하고 95℃에서 3분간 denaturation 시킨 후, 상기 혼합물을 분석 장비의 모세관에 주입하고, 전기영동에 의해 전개가 완료된 증폭산물을 GeneMapper ID v3.2(ABI, USA) 또는 GeneMApper ID-X(ABI, USA)를 이용하여 래더를 기반으로 크기를 결정하였다.
그 결과 도 2에 개시된 바와 같이 표 1의 프라이머 세트를 사용할 경우, 특정 샘플에 대한 STR 유전좌위를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. DNA Allelic Ladder 제작
본 발명은 검체 DNA에 형광 표지된 PCR 프라이머 세트(중합효소연쇄반응 시발체 세트)를 이용하여 형광이 부착된 검체 DNA 사본을 대량 증폭하고 이렇게 증폭된 DNA를 DNA 염기서열 분석기(DNA sequencer, Genetic analyzer)를 이용하여 분석하는 방법이기 때문에, 증폭된 형광 표지 DNA의 정확한 base-pair의 수를 얻기 위해서는 실험적 오차를 보정해주는 base-pair 표지자(size standard)가 필요하다.
이를 DNA allelic ladder라고 하며 모든 STR 키트에는 각 키트에 적합한 DNA allelic ladder가 필요하며 DNA allelic ladder는 키트의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 STR 검색에 사용된 임상검체로부터 homogenous STR을 선별하고, 선별된 STR을 PCR 증폭하여 PCR 증폭산물을 운반체 플라스미드(vector plasmid)에 DNA 클로닝(cloning)하여 allelic ladder library를 제작하였다. Allelic ladder library에서 STR의 각 base-pair 크기에 알맞게 PCR하여 그 산물들을 혼합하여 각 peak balance를 맞추기 위한 농도 조절 과정을 거쳐 제작 완료하였다.
실시예 5. 프라이머 세트의 성능 검증
5-1. 내부 민감도 검증
상기 프라이머 세트의 민감도 검증을 위해 50pg/uL의 샘플 DNA를 실시예 1 내지 4의 방법을 이용하여 테스트하였다.
그 결과 도 3에 개시된 바와 같이 모든 좌위를 100%로 확인할 수 있다는 것을 검증하였다.
5-2. 조각난 핵산에 대한 성능 검증
FFPE 샘플과 같이 핵산이 손상된 샘플을 모사하기 위하여, Covaris 장비를 이용하여 평균 핵산 길이가 317bp가 되도록 genomic DNA를 조각내었다(도 3). 상기 조각은 증폭산물의 길이보다도 짧기 때문에, 기존의 제품으로는 증폭이 쉽지 않은 길이이다.
실시예 1 내지 4의 방법으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭산물을 확인한 결과, 도 4에 기재된 바와 같이 조각난 샘플에서도 모든 좌위가 확인 가능하다는 것을 검증하였다.
5-3. 전문기관 성능 실험
명확한 성능 검증을 위하여 외부기관(한국 마사회)에 성능 검증을 의뢰한 결과, 반복성, 재현성, 민감성, 정확도 및 특이성에서 획기적으로 향상된 결과를 확인할 수 있었으며, 검출한도는 0.05ng/ul로 현존하는 키트 중 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
평가항목 종합 의견
반복성 시료 5개에 대한 IDaccuTestTM Y-STR 키트 3명 3반복 실험 결과 정확도 및 정밀도 ±0.5 % 범위 이내, ANOVA(분산)분석 통한 P-value 〉 0.05로 시험자간 차이없슴 확인으로 충족 함☞ 정확도 평가(Bias%): 최소 -0.08 %, 최대 0.09 %,
☞ 정밀도 평가(C.V%): 최소 0.02 %, 최대 0.15 %
☞ P-value검정 : 최소 0.118, 최대 0.930
재현성 시료 5개에 대한 IDaccuTestTM Y-STR 키트의 로트(Lot)별 차이 비교분석 결과 정확도와 정밀도 모두 ±0.5 % 범위 이내로 차이 없슴 확인으로 충족 함☞ 정확도 평가(Bias %): 최소 -0.13 %, 최대 0.20 %,
☞ 정밀도 평가(C.V %): 최소 0.00 %, 최대 0.09 %
☞ 로트(Lot)별 차이 비교 : 최소 0.00 %, 최대 0.24 %
민감성 시료 4개 모두 검출한계 확인 결과 DNA 농도 0.05 ng/uL 이상 일 때 유전자형 값 100 % 검출되어 충족 함☞ 농도 조건 : 1ng / 0.5ng / 0.25 ng / 0.1ng / 0.05ng (5개 농도)
동일성 기존제품 Y-Filer Plus키트(Thermo社)과 국산화 개발제품 IDaccuTestTM Y-STR 키트((주)엔젠바이오)에 대한 비교 분석 결과 유전자형 값 100 % 일치되어 충족 함☞ 평가항목 (16개 마커) : DYS437외 15개 마커
특이성 IDaccuTestTM Y-STR 키트가 Human Y-STR 전용 유전자분석 키트인지 여부 확인 위한 이종(異種)동물 적용 결과 유전자형 값 100 % 미검출로 충족 함☞ 비교동물(5종) : 말(Equine), 소(Bovine), 개(Canine), 당나귀(Donkey), 돼지(Pig)
최종판단 ㈜엔젠바이오 개발품 “IDaccuTestTM Y-STR 멀티플렉스 키트” 성능평가 시험결과 반복성 및 재현성에 대한 정확도(Bias, %) 및 정밀도(C.V, %), LOT별 차이 측정결과 ±0.5 % 이내 범위, 시험자간 차이 검정(P-value〉0.05) 충족하고, 민감성(검출한계)은 DNA 농도 0.05 ng이상일 때 유전자형 값 100 % 검출되며, 동일성은 기존제품과 개발제품의 결과가 100 % 일치하며, 특이성은 이종동물 적용 실험시 유전자형 값 미검출로 사람에게만 특화된 DNA검사 키트로서 적합하다고 판단 됨.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 구체적인 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NGeneBio <120> Method and Kit for Analyzing Human Subject Y STR loci by using Multiplex System <130> P19-B351 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> DYS439-FF(1) <400> 1 gatagataca taggtggaga cag 23 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> DYS439-RR(3) <400> 2 atttctttta cccatcatct ctttac 26 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> DYS437-FF(1) <400> 3 cgtgagtgca tgcccatcc 19 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> DYS437-RR(1) <400> 4 agatagataa ccacagataa atatcatt 28 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> DYS392-F(1) <400> 5 cagagggatc attaaaccta cc 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> DYS392-RR(6) <400> 6 gaccatattt accatatgtt catcc 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> DYS391-FF(1) <400> 7 gtcaagtaac cctgtcttag cat 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> DYS391-R(1) <400> 8 ggaataaaat ctccctggtt gc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> GATA-H4-F(1) <400> 9 tacatagccc acttgttaaa caac 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> GATA-H4-R(8) <400> 10 tctgaagagc taaacagaga cc 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> DYS456-F(1) <400> 11 ctgttgtggg accttgtgat aa 22 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> DYS456-3R(1) <400> 12 ttcccaaaat gctgagatta caaac 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> DYS389-I/II-FF(1) <400> 13 cctacttctg tatccaactc tc 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> DYS389-I/II-RR(5) <400> 14 acttgaggaa cacaattatc cct 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> DYS390-F(1) <400> 15 cattgcaatg tgtatactca gaaac 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> DYS390-3R(3) <400> 16 cacatttttg ggccctgcat t 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> DYS385a/b-F(1) <400> 17 ccaattacat agtcctcctt tctt 24 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> DYS385a/b-R(4) <400> 18 gagaaaaaga aagaaagaga agaaaga 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> DYS438-F(1) <400> 19 gaaagattca ctgattacca aaattag 27 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> DYS438-2R(2) <400> 20 gtggtggcag acgcctataa 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> DYS448-F(1) <400> 21 gagattagaa atagagatcg cga 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> DYS448-2R(1) <400> 22 ttgattccct gtgttggaga c 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> DYS393-FF(1) <400> 23 ttcctaatgt ggtcttctac ttg 23 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> DYS393-R(3) <400> 24 aaatgaggta tgtctcatag aaaaga 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> DYS635-F(1) <400> 25 cagcccaaat atccatcaat caat 24 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> DYS635-2R(3) <400> 26 tctcttggct tctcactttg c 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> DYS19-F(1) <400> 27 caatctctgc acctggaaat ag 22 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> DYS19-RR(1) <400> 28 ctgagtttct gttatagtgt tttttaa 27 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> DYS458-FF(2) <400> 29 gccattgcac tgcagactga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> DYS458-2R(7) <400> 30 agtagctggg gctagaggtt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> DYS437-F-(1) <400> 31 actatgggcg tgagtgcatg 20 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> DYS437-R-(1) <400> 32 ataagtagat agacatcatt cacag 25 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> DYS439-F-(1) <400> 33 ggtggagaca gatagatgat aaat 24 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> DYS439-R(3) <400> 34 tgggattaca ggcataatcc a 21 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> DYS392-R-(1) <400> 35 catccatatt ttcttcatta atctagc 27 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> DYS391-F-(1) <400> 36 gtaagatttt gtctgtccat ttagc 25 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> DYS456-R-(8) <400> 37 acttcttaaa ctgatgtatt agggtt 26 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> DYS389-I/II-F-(1) <400> 38 ccaactctca tctgtattat ctatg 25 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> DYS389-I/II-R-(3) <400> 39 aagtgttact tgaggaacac aattat 26 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> DYS390-R-(5) <400> 40 gatattaggt ttattacatt cacacata 28 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> DYS385a/b-F-(1) <400> 41 ccaactctca tctgtattat ctatg 25 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> DYS438-R-(2) <400> 42 cctataatcc cagctacctg 20 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> DYS448-R-(1) <400> 43 ggagaccttt tcttccttaa cg 22 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> DYS393-F-(1) <400> 44 aatgtggtct tctacttgtg tcaa 24 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> DYS635-R-(1) <400> 45 agaaatgccc aatggaatgc tc 22

Claims (13)

  1. (a) 인간 객체 DNA 시료를 DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 16개의 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 이용하여 상기 16개의 STR 유전좌위를 멀티플렉스 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는
    멀티플렉스 Y 성염색체 유전자 증폭을 이용한 유전자 감식방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 30의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 둘 이상의 그룹으로 나누어서 서로 다른 형광 염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    DYS437, DYS439, DYS392, DYS391 및 GATA-H4로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제1형광 염료로 표지되고; DYS456, DYS389I, DYS390 및 DYS389II 로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제2형광 염료로 표지되며; DYS385a/b, DYS438 및 DYS448로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제3형광 염료로 표지되고; 및 DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 STR 유전좌위를 증폭할 수 있는 프라이머는 제4형광 염료로 표지되며, 상기 제1형광 염료, 제2형광 염료, 제3형광 염료 및 제4형광 염료는 서로 상이한 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제 1 형광 염료, 상기 제 2 형광 염료, 상기 제 3 형광 염료 및 상기 제 4 형광 염료는 각각 6-FAM, VIC, NED 및 PET로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 증폭산물은 80-350bp인 것을 특징으로 하는 증폭 산물인 것을 특징으로 하는 유전자 감식방법.
  9. DYS437, DYS439, DYS392, DYS391, GATA-H4, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS385a/b, DYS438, DYS448, DYS393, DYS635, DYS19 및 DYS458로 구성된 STR 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 Y STR 유전좌위(short tandem repeat loci) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트.
  10. (a) 인체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA중에서 Y 성염색체를 주형으로 하고, 제9항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 개인 식별방법.
  11. (a) 인체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA중에서 Y 성염색체를 주형으로 하고, 제9항의 키트를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 부계혈족 확인방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 증폭은 멀티플렉스 PCR을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020190176416A 2018-12-27 2019-12-27 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트 KR102151657B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180170293 2018-12-27
KR1020180170293 2018-12-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200081318A true KR20200081318A (ko) 2020-07-07
KR102151657B1 KR102151657B1 (ko) 2020-09-04

Family

ID=71129214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190176416A KR102151657B1 (ko) 2018-12-27 2019-12-27 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102151657B1 (ko)
WO (1) WO2020138995A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114457166B (zh) * 2022-01-18 2023-12-19 无锡中德美联生物技术有限公司 八色系统检测60个人Y-STR和Y-Indel基因座复合扩增试剂盒及应用
CN115346607B (zh) * 2022-10-20 2023-02-10 百特元生物科技（北京）有限公司 Dna样本查重方法及装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090111407A (ko) * 2008-04-22 2009-10-27 공주대학교 산학협력단 인간 성염색체 짧은 연쇄반복 염기서열의 동시증폭 키트 및방법
KR101008828B1 (ko) * 2010-03-12 2011-01-19 대한민국 한국인 집단에서 변별력을 가진 16개의 짧은 반복 단위 유전좌위들 및 성염색체 유전좌위를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식 방법
KR20140071967A (ko) * 2011-05-12 2014-06-12 네트바이오, 인코포레이티드 Ｓｔｒ 유전자좌의 신속한 다중 증폭 방법 및 조성법
KR20140079665A (ko) * 2012-12-18 2014-06-27 (주)휴먼패스 멀티 플렉스 y 성염색체 유전자 증폭 시스템을 이용한 유전자 감식 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703583B (zh) * 2012-03-23 2014-01-01 无锡中德美联生物技术有限公司 具有改善鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
EP2893035B1 (en) * 2012-09-06 2018-05-02 Life Technologies Corporation Multiplex y-str analysis
CN104694621A (zh) * 2014-10-29 2015-06-10 宁波海尔施基因科技有限公司 具有增强鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN105986022B (zh) * 2015-02-13 2019-12-20 苏州阅微基因技术有限公司 24个y染色体str基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090111407A (ko) * 2008-04-22 2009-10-27 공주대학교 산학협력단 인간 성염색체 짧은 연쇄반복 염기서열의 동시증폭 키트 및방법
KR101008828B1 (ko) * 2010-03-12 2011-01-19 대한민국 한국인 집단에서 변별력을 가진 16개의 짧은 반복 단위 유전좌위들 및 성염색체 유전좌위를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭 시스템 및 이를 이용한 유전자 감식 방법
KR20140071967A (ko) * 2011-05-12 2014-06-12 네트바이오, 인코포레이티드 Ｓｔｒ 유전자좌의 신속한 다중 증폭 방법 및 조성법
KR20140079665A (ko) * 2012-12-18 2014-06-27 (주)휴먼패스 멀티 플렉스 y 성염색체 유전자 증폭 시스템을 이용한 유전자 감식 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102151657B1 (ko) 2020-09-04
WO2020138995A1 (ko) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9347099B2 (en) Single cell analysis by polymerase cycling assembly
JP2009502137A (ja) 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法
CN104450869B (zh) 一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用
KR102151657B1 (ko) 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트
KR20210112350A (ko) 다중 복제수 변이 검출 및 대립 유전자 비율 정량화를 위한 정량적 앰플리콘 서열분석
JP3051451B2 (ja) ＰＣＲを用いたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のための、特異的マーカーの使用
CA2697532A1 (en) Method of amplifying nucleic acid
EP2798078B1 (en) Method and primer set for detecting mutation
CN104818340A (zh) 检测jak2基因v617f位点多态性的引物、试剂盒及其pcr方法
CN110295218B (zh) 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法
CN106520948B (zh) 一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针、试剂盒及其检测方法
KR101282924B1 (ko) 살모넬라의 동시 검출을 위한 ｐｃｒ 프라이머
US20160083806A1 (en) Sequence specific primer pool for multiplex pcr and method of detecting microbial infections in thalassemia patients
KR101843432B1 (ko) 소 미토콘드리아 dna의 단일염기다형성 마커를 포함하는 소 개체 및 품종 식별용 조성물, 및 이를 이용하는 소의 식별 방법
KR102074959B1 (ko) 듀얼 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 str 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트
KR20160134106A (ko) 성별 판별용 키트
KR101735028B1 (ko) 실시간 중합효소 연쇄반응과 융해곡선 분석법을 이용한 충치(치아우식) 원인균의 정량 및 정성 검사 방법
KR102108737B1 (ko) Snp를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 소의 육색 판별용 조성물
KR102465232B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 개의 개체식별, 친자확인 방법 및 이를 이용한 분석 키트
CN112522386A (zh) 一种检测mecp2基因拷贝数变异的试剂盒
JP6853523B2 (ja) ヘリカーゼを用いたｐｃｒ
CN117965800B (zh) 基于qpcr的烟曲霉、耶氏肺孢子菌及新生隐球菌检测的组合物和试剂盒
KR101341943B1 (ko) Ｓｔｒ 검출용 키트 및 이를 이용한 ｓｔｒ 검출 방법
JP4650420B2 (ja) 塩基判定方法及び塩基判定用キット
KR101911017B1 (ko) 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right