KR20210112350A - 다중 복제수 변이 검출 및 대립 유전자 비율 정량화를 위한 정량적 앰플리콘 서열분석 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 중합효소 연쇄 반응에 의해 올리고뉴클레오티드 바코드 서열로 DNA 샘플에서 표적화된 게놈 유전자좌의 각 가닥을 표지하고 고-처리량 서열 분석을 위해 게놈 영역(들)을 증폭시키기 위한 정량적 앰플리콘 서열 분석 방법이 제공된다. 상기 방법은 각 유전자의 추가적인 복제 빈도를 정량화함으로써 관심 유전자 세트에서 복제수 변이(CNV)의 동시 검출에 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법은 다중 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 서로 상이한 유전적 정체성의 대립 유전자 비율의 정량화를 제공한다. 또한, 상기 방법은 변이의 검출 및 변이 대립 유전자 빈도의 정량화를 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2019년 1월 4일에 출원한 미합중국 가출원 제62/788,375호의 우선권 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 원용된다.
미연방 정부 후원 연구에 관한 선언
본 발명은 미 국립보건원이 부여한 인가 번호 제R01 HG008752호 하의 정부지원으로 실시하였다. 상기 정부는 본 발명에 대한 특정한 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되고 본원에 그 전체가 원용되는 서열 목록을 포함한다. 2019년 11월 26일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 RICEP0058WO_ST25.txt이며 크기는 145.6KB이다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 정량적 앰플리콘 서열분석을 이용한 다중 복제수 변이 검출 및 대립 유전자 비율 정량화를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
복제수 변이(CNV)는 암 형성 및 진행에 기여하는 중요한 암 바이오마커이다. 상기 복제수 변이(CNV)는 암 유형에 따라 3%에서 98% 사이로 상당한 비율의 종양에 존재한다. 많은 복제수 변이(CNV)는 표적 요법에 대한 민감성 또는 내성을 부여한다. 예를 들어, MET 증폭은 비소세포 폐암에서 MET TKI에 대한 민감성을 증가시키고 PTEN 결실은 흑색종에서 BRAF 억제제 내성을 부여한다. 종양 샘플에서, 특정 유전자의 복제수 변이(CNV)는 종양 이질성 및 정상 세포 오염으로 인해 세포의 작은 부분(<10%)에만 존재할 수 있다.
돌연변이 및 삽입-결실과 달리, 복제수 변이(CNV)는 고유한 서열이 없으므로 복제수 변이(CNV)를 검출하려면 정확한 정량화가 필요하다. 상기 정량화는 DNA 분자 샘플링의 확률성으로 인해 어렵다. 예를 들어, 유전자좌당 1200개 분자를 샘플링하는 표준 편차(σ)(즉, 600개의 정상 세포로부터 1200개의 반수체 게놈 복제, 4 ng의 게놈 DNA)는 푸아송(Poisson) 분포로 추정할 수 있다: σ = = 35, 분자수의 3%에 해당함. 이 경우, 추가 복제의 1%를 감지하는 것은 불가능하다. 이론적으로, 입력 분자의 수를 늘리거나 또는 더 많은 유전자좌를 분석하면 분산이 동일하게 줄어들 수 있으며 σ는 σ = 로 추정할 수 있다. 게놈 복제 수 또는 유전자좌 수가 100배 증가하면, σ는 0.3%로 감소하고 추가 복제의 1%가 검출 가능하게 된다.
분자 진단에서 복제수 변이(CNV) 검출을 위한 현재 표준 방법은 인시투 혼성화(in situ hybridization, ISH)로서, 적은 수의 세포 관찰을 기초로 복제수 변이(CNV) 상태를 측정할 수 있다. 하지만, 인시투 혼성화(ISH) 기술은 형광 및 명시야 현미경 모두에서 구별가능한 색상의 수가 제한되기 때문에 여러 게놈 영역을 동시에 분석할 수 있는 능력이 부족하다. 또한, 인시투 혼성화(ISH)는 전문 실험실에서 실시해야 하는 복잡한 공정이므로, 널리 채택되지 않는다.
복제수 변이(CNV) 검출을 위한 다른 방법은 DNA 분자의 절대 정량화를 위한 PCR 기반 방법인 미세방울 디지털 PCR(ddPCR)이다. 하지만, 복제수 변이(CNV)에 대한 검출 한계(LoD)는 다수의 반복 실험을 통한 약 20% 추가 복제이다. 인시투 혼성화(ISH)와 마찬가지로, 미세방울 디지털 PCR(ddPCR)도 제한된 수의 형광 채널로 인해 다중화될 수 없는 문제가 있다. 어레이 비교 게놈 혼성화 및 SNP 어레이를 포함한 마이크로어레이 기반 방법은 대형 복제수 변이(CNV) 및 이수성의 선별에 사용되는 고도로 다중화된 방법이다. 하지만, 상기 방법은 40kb 미만의 더 작은 복제수 변이(CNV) 또는 추가 복제의 30% 미만의 저주파 CNV를 감지하는 데 좋지 않다.
차세대 서열 분석(NGS)은 고-처리량의 기술로 지난 10년 동안 비용이 급격히 감소하였다. 차세대 서열 분석(NGS)은 암 분자 진단 분야에서 인기가 있다. 0.1% 미만의 변이 대립 유전자 빈도의 검출 한계(LoD)를 갖는 고도로 다중화된 돌연변이 검출이 달성되었고 차세대 서열 분석(NGS) 플랫폼에서 상업화되었다. 하지만, 복제수 변이(CNV) 검출을 위한 차세대 서열 분석(NGS) 방법의 현재 검출 한계(LoD)는 좋지 않다. 전장엑솜 서열 분석(whole-exome sequencing, WES)은 약 30%의 추가 복제 수준에서 복제수 변이(CNV) 발견에 사용되었지만, 비용이 많이 들고, 낮은 검출 한계(LoD)를 달성하기 위해서는 훨씬 더 많은 차세대 서열 분석(NGS) 판독(비용의 비례적인 증가)이 필요하다. 파운데이션원(FoundationOne)의 상업용 패널과 같은 더 작은 교잡-포획(hybrid-capture) 패널은 더 낮은 비용으로 약 30%의 추가 복제의 검출 한계(LoD)에 도달할 수 있다.
진단용 차세대 서열 분석(NGS) 패널에서, 관련 없는 게놈 영역에서 낭비되는 차세대 서열 분석(NGS) 판독을 줄이기 위해서는 표적 농축이 필요하다. 표적 농축을 위한 두 가지 인기 있는 방법은 교잡-포획 및 다중화 PCR이다. 현재 차세대 서열 분석(NGS) 기반 복제수 변이(CNV) 패널은 대부분 교잡-포획 기반이며, 이는 표적 영역이 비오틴화된 핵산 프로브에 의해 캡처되고 스트렙타비딘 자기 비드를 사용하여 게놈의 나머지 부분으로부터 분리됨을 의미한다. 교잡-포획 패널은 패널 크기가 작을 때 표적 적중률이 낮으므로, 대부분의 패널은 100kb 초과(즉, 1000 초과의 프로브 또는 유전자좌)이다. 이는 비드 표면, 프로브 및 캡처된 표적에 원치 않는 DNA의 비특이적 결합 때문이다. 많은 수의 유전자좌로 인해, 교잡-포획 패널의 적용 범위는 균일하지 않다. 95% 및 5% 백분위수 유전자좌는 적어도 30배의 차이가 나며, 이는 정량화에서 또 다른 편향층을 유발한다. 교잡-포획(hybrid-capture) 패널은 또한 불완전한 말단-수복 및 결찰로 인한 낮은 전환율(즉, 서열 분석된 입력 분자의 백분율)로 인해 편향된 샘플링 처리를 유발하고 변이를 발생시킨다.
본원에서는 중합효소 연쇄 반응에 의해 올리고뉴클레오티드 바코드 서열로 DNA 샘플에서 표적화된 게놈 유전자좌의 각 가닥을 표지하고 고-처리량 서열 분석을 위해 게놈 영역(들)을 증폭시키기 위한 정량적 앰플리콘 서열 분석 방법이 제공된다. 상기 방법은 각 유전자의 추가적인 복제 빈도를 정량화함으로써 관심 유전자 세트에서 복제수 변이(CNV)의 동시 검출에 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법은 다중 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 서로 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율의 정량화를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에서는 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA의 표적화된 영역을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계; (b) (i) 5'에서 3’ 방향으로 제1 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드(예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는 제2 영역, 적어도 4개의 축퇴 뉴클레오티드(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 축퇴 뉴클레오티드)를 포함하는 제3 영역, 및 제1 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제4 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 5'에서 3’ 방향으로 제5 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드(예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는 제6 영역, 및 제2 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제7 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 2회 주기의 PCR을 실시하여 게놈 DNA 샘플의 적어도 일부를 증폭시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 사용된 어닐링 온도보다 0~10℃(예컨대, 1~10, 2~10, 3~10, 4~10, 5~10, 1~9, 1~ 8, 1~7, 1~6, 1~5, 2~9, 2~8, 2~7℃ 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위 또는 값) 더 높은 어닐링 온도로 적어도 3회 주기의 PCR을 실시하고 (i) 상기 제1 영역의 적어도 일부의 역 보체에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 상기 제5 영역의 적어도 일부의 역 보체에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 제4 올리고뉴클레오티드를 사용하여 단계 (b)의 생성물을 증폭시키는 단계; 및 (d) 5'에서 3’ 방향으로 제8 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드(예컨대, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는 제9 영역, 및 제3 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제10 영역을 포함하는 제5 올리고뉴클레오티드를 사용한 적어도 1회 주기의 PCR을 실시하여 상기 단계 (c)의 생성물을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 제3 표적 게놈 DNA 영역은 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역보다 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역에 더 가까운 적어도 하나의 뉴클레오티드인 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 양태들에서, 상기 방법은 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA의 1 내지 10,000개의 표적화된 영역(예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000 또는 5,000 및 최소 10,000, 9,000, 8,000, 7,000, 6,000, 5,000, 4,000, 3,000, 2,000, 1,000, 750, 500, 250, 100, 75 또는 50개의 표적화된 영역, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위 또는 값)을 제조하는 방법이다. 일부 양태들에서, 상기 제3 영역은 고유 분자 식별자(UMI)이다. 일부 양태들에서, 상기 제3 표적 게놈 DNA 영역은 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역보다 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역에 더 가까운 1~10개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 염기이다. 일부 양태들에서, 상기 제1 영역 및 상기 제8 영역은 범용 프라이머 결합 부위이다. 일부 양태들에서, 상기 제1 영역 및 상기 제8 영역은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터 서열을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 제5 영역은 인간 게놈에서 발견될 수 없는 서열을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 제5 영역은 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터 서열과 상이한 서열을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 제1 영역 및 상기 제5 영역의 용융 온도들은 상기 제4 영역 및 상기 제7 영역의 용융 온도들보다 0~10°C(예컨대, 1~10, 2~10, 3~10, 4~10, 5~10, 1~9, 1~ 8, 1~7, 1~6, 1~5, 2~9, 2~8, 2~7℃ 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위 또는 값) 더 높다. 일부 양태들에서, 상기 제3 영역의 축퇴 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 A, T 또는 C 중 하나이다. 일부 양태들에서, 상기 제3 영역의 축퇴 뉴클레오티드 중 어느 것도 G가 아니다. 일부 양태들에서, 각각 고유한 제3 영역을 갖는 제1 올리고뉴클레오티드 군이 존재한다.
일부 양태들에서, 상기 방법은 단계 (c)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 정제 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 방법은 단계 (d)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 정제 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 방법은 상기 제1 영역 및 상기 제8 영역에 혼성화되는 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 상기 단계 (d)의 생성물을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 프라이머들은 차세대 서열 분석을 위한 인덱스 서열을 포함하는 단계 (e)를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 방법은 상기 단계 (e)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 정제 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 방법은 상기 단계 (e)의 생성물의 고-처리량 DNA 서열 분석을 실시하는 단계 (f)를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 고-처리량 DNA 서열 분석은 차세대 서열 분석을 포함한다.
일부 양태들에서, 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역 및 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역은 상기 게놈 DNA의 반대 가닥들 상에 있다. 일부 양태들에서, 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역 및 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역은 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드(예컨대, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개의 뉴클레오티드, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 값)에 의해 분리된다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (b)는 약 30분(예컨대, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33분)의 연장 시간을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (c)는 약 30분(예컨대, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33초)의 연장 시간을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)는 약 30분(예컨대, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33분)의 연장 시간을 포함한다.
일 양태에서, 본원에서는 적어도 하나의 표적 유전자의 추가 복제의 빈도(FEC)를 정량화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은: (a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계; (b) 본 구현예들 중 임의의 한 구현예의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA를 제조하는 단계로서, 여기서 상기 제4 영역, 상기 제7 영역 및 상기 제10 영역의 서열들은 상기 적어도 하나의 표적 유전자에 혼성화되는 단계; (c) 본 구현예들 중 임의의 한 구현예의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 실시하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 서열 분석 정보를 기초로 적어도 하나의 표적 유전자에 대한 추가 복제의 빈도(FEC)를 계산하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 양태들에서, 상기 방법은 표적 유전자 세트에 대한 추가 복제의 빈도(FEC)를 정량화하는 방법이며, 여기서 상기 표적 유전자 세트는 2 내지 1000개의 표적 유전자(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 250, 500 또는 750개, 및 최대 1,000, 900, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개의 표적화된 영역, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위 또는 값)를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (b)는 제1 올리고뉴클레오티드 군, 제2 올리고뉴클레오티드 군, 및 제5 올리고뉴클레오티드 군을 사용하여 실시되고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제5 올리고클레오티드 군의 각각의 일부는 표적 유전자 세트 중 하나에 상보적인 제4, 제7 및 제10 영역들을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 제4, 제7 및 제10 영역들의 각각은 인간 게놈에서 단 한번만 발견되는 서열들을 포함한다. 일부 양태들에서, 하나의 표적 유전자에 혼성화되는 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 유전자에 혼성화되는 제1 올리고뉴클레오티드 서로에 비해 고유한 제3 영역을 갖는다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (b)는 참조 유전자에 상보적인 제4, 제7 및 제10 영역들을 각각 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드, 및 제5 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시된다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (b)는 고-처리량 서열 분석을 위한 각각의 표적 유전자 또는 참조 유전자의 일부를 제조하고, 여기서 상기 부분은 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드(예컨대, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개의 뉴클레오티드, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 값)의 길이를 갖는다. 일부 양태들에서, 추가 복제의 빈도(FEC)는 하기와 같이 정의된다:
일부 양태들에서, 상기 단계 (d)는: (i) 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 각 표적 유전자의 표적화된 부분들에 정렬하고 상기 NGS 판독물이 정렬되는 유전자좌를 기초로 하위군으로 분류하는 단계; (ii) 동일한 UMI 서열을 수반하는 모든 NGS 판독물이 하나의 UMI 패밀리로 분류되도록 UMI 서열을 기초로 각 유전자좌에서 NGS 판독물을 나누는 단계; (iii) PCR 오류 또는 NGS 오류로 인한 UMI 패밀리들을 제거하는 단계; (iv) 각 유전자좌에서 고유한 UMI 서열의 수를 세는 단계; 및 (v) 각 표적 유전자 및 참조 유전자의 각 유전자좌에 대한 고유한 UMI 서열의 수를 기초로 추가 복제의 빈도(FEC)를 계산하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iii)는 UMI 축퇴 기반 설계를 충족하지 않는 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iii)는 Fmin보다 작은 UMI 패밀리 크기를 갖는 UMI 패밀리들을 제거하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수이고, 여기서 Fmin은 2 내지 20 사이(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)이다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iv)는 더 큰 패밀리 크기를 갖는 다른 UMI 서열로부터 단지 1 또는 2개의 염기만큼 상이한 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 양태들에서, 추가 복제의 빈도(FEC)는 하기와 같이 정의된다:
여기서 은 표적 유전자 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 표적 유전자에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 참조 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 하나의 기준에 대하여 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 기준에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 고려할 기준의 수이고, 은 기준의 전체 수 이하이며; 은 실험 보정에 의해 결정된다. 일부 양태들에서, 상기 추가 복제의 빈도(FEC)를 사용하여 상기 표적 유전자의 복제 수 변이(CNV) 상태를 확인한다.
일 구현예에서, 본원에서는 적어도 하나의 표적 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율을 정량화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은: (a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계; (b) 본 구현예들 중 임의의 한 구현예의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA를 제조하는 단계로서, 여기서 상기 제4 영역, 상기 제7 영역 및 상기 제10 영역의 서열들은 상기 적어도 하나의 표적 유전자좌에 가까운 게놈 DNA에 혼성화되는 단계; (c) 본 구현예들 중 임의의 한 구현예의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 실시하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 서열 분석 정보를 기초로 적어도 하나의 표적 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
일부 양태들에서, 상기 방법은 표적 게놈 유전자좌 세트에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율을 정량화하는 방법이며, 여기서 상기 표적 게놈 유전자좌 세트는 2 내지 10,000개의 표적 게놈 유전자좌(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000 또는 5,000 및 최대 10,000, 9,000, 8,000, 7,000, 6,000, 5,000, 4,000, 3,000, 2,000, 1,000, 750, 500, 250, 100, 75 또는 50개의 표적 게놈 유전자좌, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위 또는 값)를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (b)는 제1 올리고뉴클레오티드 군, 제2 올리고뉴클레오티드 군, 및 제5 올리고뉴클레오티드 군을 사용하여 실시되고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제5 올리고뉴클레오티드 군들의 각각의 일부는 상기 표적 게놈 유전자좌 세트 중 적어도 하나에 가까운 게놈 DNA에 상보적인 제4, 제7 및 제10 영역들을 각각 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 제4, 제7 및 제10 영역들의 각각은 상기 단계 (b)의 조건하에서 상기 게놈 DNA의 비-표적 영역들과 혼성화될 수 없는 서열들을 포함한다. 일부 양태들에서, 하나의 표적 게놈 유전자좌에 가까운 상기 게놈 DNA에 혼성화되는 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 게놈 유전자좌에 가까운 게놈 DNA에 혼성화되는 제1 올리고뉴클레오티드 서로에 비해 고유한 제3 영역을 갖는다. 일부 양태들에서, 각각의 표적 게놈 유전자좌는 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드(예컨대, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개의 뉴클레오티드, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 값)의 길이를 갖는다.
일부 양태들에서, 상기 단계 (d)는: (i) 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 표적화된 게놈 유전자좌에 정렬하고 상기 NGS 판독물이 정렬되는 유전자좌를 기초로 하위군으로 분류하는 단계; (ii) 동일한 UMI 서열을 수반하는 모든 NGS 판독물이 하나의 UMI 패밀리로 분류되도록 UMI 서열을 기초로 각 유전자좌에서 NGS 판독물을 나누는 단계; (iii) PCR 오류 또는 NGS 오류로 인한 UMI 패밀리들을 제거하는 단계; (iv) 각각의 남은 UMI 패밀리의 유전적 동일성을 호출하는 단계; (v) 각 유전자좌에서 고유한 UMI 서열의 수를 세는 단계; 및 (vi) 대립 유전자 비율을 계산하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iii)는 UMI 축퇴 기반 설계를 충족하지 않는 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iii)는 Fmin보다 작은 UMI 패밀리 크기를 갖는 UMI 패밀리들을 제거하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수이고, 여기서 Fmin은 2 내지 20 사이(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)이다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iii)는 더 큰 패밀리 크기를 갖는 다른 UMI 서열로부터 단지 1 또는 2개의 염기만큼 상이한 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iv)는 UMI 패밀리의 판독물의 70% 이상(예컨대, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%)이 관심 유전자좌에서 동일한 경우에만 유전적 동일성을 호출하는 것을 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 대립 유전자 비율은 R 대립유전자 = N 1 /N 2로 정의되고, 여기서 N 1은 제1 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이며, N 2는 제2 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이다.
일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iv)는 각 UMI 패밀리의 공통 서열을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 공통 서열은 상기 UMI 패밀리에서 가장 많은 수로 출현하는 서열이다. 일부 양태들에서, 상기 단계 (d)(iv)는 상기 공통 서열을 해당 유전자좌에 대한 야생형 서열과 비교함으로써 공통 서열에서 돌연변이를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 방법은 상기 확인된 돌연변이의 변이 대립 유전자 빈도(VAF)를 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태들에서, 상기 확인된 돌연변이의 변이 대립 유전자 빈도(VAF)는 돌연변이를 갖는 UMI 패밀리의 수/UMI 패밀리의 전체 수로 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분에 대하여 “본질적으로 없는”이라는 용어는 특정 성분의 그 어떤 것도 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 단지 오염물질로서 존재하거나 극소량 존재한다는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도치않은 오염으로부터 기인한 특정 성분의 총량은 0.05% 보다 훨씬 낮고, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 상기 특정 성분의 그 어떤 양도 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원에서 사용된 단수 표현("a" 또는 "an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 “포함하는”과 함께 사용될 때, 단수 표현(“a” 또는 “an)은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
비록 본 개시가 단지 대안들과 "및/또는"을 나타내는 정의를 택하고 있지만, 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 분명하게 대안만을 지칭하는 것으로 나타내지 않거나 또는 상기 대안들이 상호배타적이지 않은 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이후의 것들을 의미할 수 있다.
본 출원의 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 수치가 장치, 상기 수치를 측정하기 위해 사용된 방법, 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변화에 대한 고유한 오차 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화와 변형이 상세한 설명으로부터 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정한 예시가, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내긴 하지만, 단지 예시의 방식으로 제공됨이 이해되어야 한다.
하기의 도면은 본 명세서의 부분을 이루며 본 발명의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 상기 도면들 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1. QASeq 프라이머 설계 및 실험 워크플로우의 개략도. 각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다. 각 QASeq 패널은 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 하나씩만 필요로 한다. 범용 정방향 프라이머(UfP) 또는 범용 역방향 프라이머(UrP)에서 영역 1 또는 영역 5의 5'-말단에 추가 염기가 존재할 수 있다. 한 가지 권장되는 워크플로우의 경우, DNA 샘플은 먼저 모든 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA), DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼와 혼합된다. 모든 표적 유전자좌에 UMI를 추가하기 위해 2회 주기의 긴 연장 PCR이 실시된다. 다음으로, 동일한 원래 분자 상에 다중 UMI가 추가되는 것을 방지하면서 분자를 증폭시키기 위해, 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 사용하여 약 7회 주기 동안 PCR 증폭에서 어닐링 온도를 약 8ºC 올리고(짧은 연장, 약 30초), 반응에 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 추가하는 것은 열순환기의 개방형 튜브 단계임을 유념한다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용하여 정제한 후, 어댑터 교체를 위해 SrPB 프라이머, DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼를 PCR 생성물과 혼합한다. 2회 주기의 긴 연장(약 30분) 후에, 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터는 프라이머 이합체 또는 비특이적 생성물이 아닌 올바른 PCR 생성물에만 추가된다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용한 다른 정제 후, 표준 차세대 서열 분석(NGS) 인덱스 PCR이 실시되고, 라이브러리가 정규화되며 일루미나 서열 분석기(illumina sequencer) 상에 로드된다.
도 2. UMI 교차-결합 에너지의 시뮬레이션. UMI 서열로서 (N)20 또는 (SWW)6SW 대신에 (H)20을 사용하면, 평균 교차-결합 에너지가 감소하여 프라이머-이합체 상호작용이 더 적음을 나타낸다. 여기서 각 UMI 패턴에 대해 500번의 시뮬레이션이 실시되었고, 각 시뮬레이션에서 상기 패턴과 일치하는 2개의 서열이 무작위로 생성되었으며, 상기 서열들 간의 교차-결합 Gº는 60ºC 및 0.18 M K+를 가정하여 계산되었다.
도 3a-b. 프라이머 및 UMI 사이의 스페이서는 PCR 편향성을 감소시킨다. (도 3a) 프라이머 및 UMI 사이의 스페이서의 유의성을 평가하기 위한 워크플로우 스페이서를 포함하지 않거나(세트 1), 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하거나(세트 2), 또는 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 12 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이의 11 nt 스페이서를 포함하는(세트 3) 프라이머 3 세트를 사용하여 입력 분자들을 개별적으로 증폭시켰다. 일루미나(Illumina) MiSeq에 의한 NGS 분석 전에 인덱스가 추가되었다. (도 3b) 상기 프라이머 3 세트에 대한 실험적 UMI 패밀리 크기 분포 히스토그램. UMI 설계 패턴과 일치하지 않는 UMI 서열이 제거되었다.
도 4a-b. 복제수 변이(CNV)에 대한 UMI 기반 절대 정량화를 위한 데이터 분석. (도 4a) 복제수 변이(CNV) 검출을 위한 데이터 분석 워크플로우. FASTQ 출력 파일의 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 분석하여 복제수 변이(CNV) 상태를 결과로서 생성한다. 표적 유전자의 추가 복제의 빈도(FEC)는 로 계산되고, 여기서 는 상기 표적 유전자 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 고려할 유전자좌의 수이고; 은 참조 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 한 기준에 대하여 고려할 유전자좌의 수이고; 은 고려할 기준의 수이며; 은 실험 보정에 의해 결정된다. 복제 수 변이(CNV) 상태는 추가 복제의 빈도(FEC)에 기초하여 측정된다. (도 4b) 데이터 분석에서 UMI 패밀리 크기 및 고유 UMI 번호의 정의: UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI 서열을 수반하는 판독물의 수이고, 고유 UMI 번호는 한 유전자좌에 있는 상이한 UMI 서열의 총 수이다.
도 5. 실험적 UMI 패밀리 크기 분포의 예. 동일한 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리에 있는 10개의 ERBB2 앰플리콘 및 10개의 참조 앰플리콘에 대한 UMI 패밀리 크기 분포의 예. 20-플렉스 QASeq 실험을 위한 주형 입력으로서 정상 세포주 gDNA NA18562(코리엘(Coriell)에서 구입)를 사용하였고, 입력 샘플은 2500개의 반수체 게놈 복제를 함유한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다. 허용 및 폐기된 UMI의 비율은 파이 차트로 나타내었다. 모든 UMI 중에서 약 20%는 PCR 또는 서열 분석 오류로 인해 폐기되고(즉, G 염기가 폴리(H) UMI에서 발견됨), 약 40%는 작은 패밀리 크기로 인해 폐기된다(≤3).
도 6. 상이한 유전자좌에 대한 실험적 고유 UMI 번호의 예. 도 5에 나타낸 데이터에 해당하는 각 유전자좌의 고유한 UMI 번호의 예: 흰색 막대는 ERBB2 앰플리콘이고 회색 막대는 참조 앰플리콘이다. 입력 샘플은 2500개의 반수체 게놈 복제를 포함한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다.
도 7. 정상 세포주 gDNA NA18562 및 시뮬레이션된 이론 표준 편차 한계에 대한 실험적 보정 결과. CNV 비율(σCNV비율)의 표준 편차는 입력 분자 수에 대해 표시된다. LoD는 3σCNV비율로서 근사치를 계산할 수 있다. 각각 상이한 입력량(75, 250, 750 및 2500개의 반수체 게놈 복제)에 대해 5회의 반복 실험을 실시하였고, 실험 결과는 십자 기호로 표시된다. 샘플링된 분자 수의 푸아송(Poisson) 분포를 가정하여 시뮬레이션을 실시하였고, 시뮬레이션된 σCNV비율(점선으로 표시됨)은 샘플링의 확률성으로 인한 이론적 하한치이다.
도 8a-c. FFPE 샘플에 대한 복제수 변이(CNV) 검출 실험 결과의 예. ERBB2 CNV가 발생할 가능성이 없는 동일한 종양으로부터 2개의 폐암 FFPE 슬라이드를 시험하였다. 입력 추출된 DNA 샘플은 각 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리에 대한 2500개의 반수체 게놈 복제를 포함한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다. (도 8a) 앰플리콘 ERBB2_1 및 참조_1에 대한 UMI 패밀리 크기의 예시 분포가 표시되고, 허용 및 폐기된 UMI의 비율은 파이 차트로 나타내었다. (도 8b) 각 앰플리콘 영역에 대한 예시의 고유한 UMI 번호. 흰색 막대는 ERBB2 앰플리콘이고, 회색 막대는 참조 앰플리콘이다. (도 8c) 복제수 변이(CNV) 비율은 동일한 폐암 종양으로부터 2개의 FFPE 슬라이드에 대해 표시된다. ERBB2의 CNV는 이전 보정 데이터를 기초로 QASeq를 사용하여 상기 FFPE 슬라이드에서 검출되지 않는다. 평균 및 LoD = 3σCNV비율은 750-게놈 복제 입력 세포주 gDNA 라이브러리의 데이터를 기초로 계산되고(도 7 참조), FFPE 샘플과 유사한 고유 UMI 번호를 갖는다.
도 9a-e. 1차 실험 워크플로우를 사용한 프라이머 이합체 환원. (도 9a) 시험한 가장 간단한 워크플로우는 원-포트 반응이었다. UMI 추가 후, 인덱스 프라이머는 열순환기의 개방형 튜브 단계로서 반응에 직접 추가되었고, 인덱스 PCR(즉, 범용 PCR)은 이후에 실시되었다. 상기 워크플로우의 경우, 표적 적중률(on-target)이 낮았고(0.5%). 표적을 벗어난 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 대부분 프라이머 이합체였다. (도 9b) 프라이머 이합체를 환원시키기 위해 범용 PCR의 6회 주기 후에 SPRI 정제 단계를 추가하였고, 표적 적중율이 20%로 향상되었다. (도 9c) 프라이머 이합체를 추가로 환원시키기 위해 인덱스 PCR 후에 아가로스 겔을 사용한 크기 선택 단계를 추가하였고, 표적 적중율은 도 9b와 비교하여 개선되었지만, 여전히 50% 미만이다. (도 9d) 범용 PCR 후 어댑터 교체 및 정제를 모두 포함하는 기본 실험 워크플로우는 66%의 높은 평균 표적 적중률을 나타낸다. (도 9e) 워크플로우 도 9a-d에서 프라이머 이합체의 원천
도 10a-c. 차세대 서열 분석(NGS) 인덱스 PCR을 요구하지 않는 예시의 워크플로우. (도 10a) 인덱스 및 P5 서열은 범용 정방향 프라이머(UfP)의 5'에 추가되고, 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다. 어댑터 교체로부터 수득한 앰플리콘은 P5, P7 및 이중 인덱스를 포함하므로, 서열 분석할 준비가 되어 있다. (도 10b) 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가되고, 인덱스 프라이머는 어댑터 교체 단계에서 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)와 함께 추가된다. 앰플리콘은 서열 분석할 준비가 되어 있다. (도 10c) 인덱스 및 P5 서열은 특이적 정방향 프라이머(SfP)의 5'에 추가되고, P5 서열을 수반하는 프라이머는 범용 PCR 단계에서 범용 정방향 프라이머(UfP)로서 사용된다. 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다. 앰플리콘은 서열 분석할 준비가 되어 있다.
도 11. QASeq 프라이머 설계 및 워크플로우의 변형. 각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다. 원래 설계에 비해, 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA)는 주형-결합 영역만 필요하고 범용 역방향 프라이머(UrP)는 필요하지 않다. 각 QASeq 패널은 하나의 범용 정방향 프라이머(UfP)만을 필요로 하고, 범용 정방향 프라이머(UfP)에서 영역 1의 5'-말단에 추가 염기가 있을 수 있다. 원래 실험 워크플로우와 비교하여, 범용 PCR 단계에서 더 많은 PCR 주기가 필요하고, ≥10 주기가 권장된다.
도 12a-b. QASeq 기반 대립 유전자 비율 정량화를 위한 데이터 분석. (도 12a) 대립 유전자 비율 정량화를 위한 데이터 분석 워크플로우. FASTQ 출력 파일의 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 상이한 유전적 동일성 간의 대립 유전자 비율을 생성하기 위해 분석된다. 각 표적화된 유전자좌에 대한 대립 유전자 비율은 R 대립유전자 = N 1 /N 2으로 정의되고, 여기서 N 1은 제1 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이며, N 2는 제2 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이다. (도 12b) 다수결에 기초하여 각 UMI 패밀리를 호출하는 유전적 동일성.
도 13. 임상적 FFPE 샘플의 급증에 대한 복제수 변이(CNV) 검출 실험 결과의 예. 이전에 특성화된 2개의 FFPE DNA 샘플(1개의 "정상" 샘플 및 1개의 "ERBB2 증폭된 비정상" 샘플)을 혼합하여 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플을 생성하였다. "정상" 샘플의 ERBB2 FEC는 0%이고, "ERBB2 증폭 비정상" 샘플의 ERBB2 FEC는 78%이다. 실험적으로 정규화된 추가 복제의 빈도(FEC) 값은 예상되는 ERBB2 FEC에 대해 표시되었다. "정상" 샘플은 5회 반복 시험하였으며, 100-플렉스 CNV 패널의 LoD는 "정상" 샘플의 3 표준 편차로 추정되었다. 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플의 복제수 변이(CNV)는 이의 계산된 추가 복제의 빈도(FEC)가 3 표준 편차 범위를 벗어났기 때문에 성공적으로 검출되었다.
도 14. QASeq를 사용한 돌연변이 정량화를 위한 생물정보학 워크플로우. 돌연변이 정량화를 위한 데이터 처리 워크플로우의 요약을 도시하였다.
도 15. 179-플렉스 종합 패널에 대해 관찰된 분자 번호. 입력은 8.3 ng(예상 분자 수 5000)의 100% 멀티플렉스(Multiplex) I 야생형 cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리(Horizon Discovery))이었다. 전환율은 평균 62%이고, 상기 플렉스의 97%는 전환율이 >10%이다.
도 16. 179-플렉스 종합 패널의 오류율. 입력은 8.3 ng의 100% 멀티플렉스 I 야생형 cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리)이었고, 동일한 샘플을 세 번 시험하였다. 3840개의 상이한 유전자좌의 오류율(UMI를 사용한 오류 수정 후)이 표시되었다. 가장 높은 오류율은 0.23%, 0.20% 및 0.23%였으며 평균 오류율은 3회 복제에 대해 0.006%, 0.005% 및 0.005%였다.
도 17. 179-플렉스 종합 패널에 대한 돌연변이 정량화 결과. 사용된 샘플은 3회 시험된 0.3% cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리의 0.1% 멀티플렉스 I cfDNA 참조 표준 및 1% 멀티플렉스 I cfDNA 참조 표준을 혼합하여 생성)이었다. 6개 돌연변이의 실험적 VAF는 일반적으로 예상된 VAF와 일치하였고, 그 차이는 대부분 돌연변이 분자의 소수(≤9)를 샘플링할 때의 확률성 때문이었다.
도 1. QASeq 프라이머 설계 및 실험 워크플로우의 개략도. 각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다. 각 QASeq 패널은 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 하나씩만 필요로 한다. 범용 정방향 프라이머(UfP) 또는 범용 역방향 프라이머(UrP)에서 영역 1 또는 영역 5의 5'-말단에 추가 염기가 존재할 수 있다. 한 가지 권장되는 워크플로우의 경우, DNA 샘플은 먼저 모든 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA), DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼와 혼합된다. 모든 표적 유전자좌에 UMI를 추가하기 위해 2회 주기의 긴 연장 PCR이 실시된다. 다음으로, 동일한 원래 분자 상에 다중 UMI가 추가되는 것을 방지하면서 분자를 증폭시키기 위해, 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 사용하여 약 7회 주기 동안 PCR 증폭에서 어닐링 온도를 약 8ºC 올리고(짧은 연장, 약 30초), 반응에 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 추가하는 것은 열순환기의 개방형 튜브 단계임을 유념한다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용하여 정제한 후, 어댑터 교체를 위해 SrPB 프라이머, DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼를 PCR 생성물과 혼합한다. 2회 주기의 긴 연장(약 30분) 후에, 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터는 프라이머 이합체 또는 비특이적 생성물이 아닌 올바른 PCR 생성물에만 추가된다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용한 다른 정제 후, 표준 차세대 서열 분석(NGS) 인덱스 PCR이 실시되고, 라이브러리가 정규화되며 일루미나 서열 분석기(illumina sequencer) 상에 로드된다.
도 2. UMI 교차-결합 에너지의 시뮬레이션. UMI 서열로서 (N)20 또는 (SWW)6SW 대신에 (H)20을 사용하면, 평균 교차-결합 에너지가 감소하여 프라이머-이합체 상호작용이 더 적음을 나타낸다. 여기서 각 UMI 패턴에 대해 500번의 시뮬레이션이 실시되었고, 각 시뮬레이션에서 상기 패턴과 일치하는 2개의 서열이 무작위로 생성되었으며, 상기 서열들 간의 교차-결합 Gº는 60ºC 및 0.18 M K+를 가정하여 계산되었다.
도 3a-b. 프라이머 및 UMI 사이의 스페이서는 PCR 편향성을 감소시킨다. (도 3a) 프라이머 및 UMI 사이의 스페이서의 유의성을 평가하기 위한 워크플로우 스페이서를 포함하지 않거나(세트 1), 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하거나(세트 2), 또는 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 12 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이의 11 nt 스페이서를 포함하는(세트 3) 프라이머 3 세트를 사용하여 입력 분자들을 개별적으로 증폭시켰다. 일루미나(Illumina) MiSeq에 의한 NGS 분석 전에 인덱스가 추가되었다. (도 3b) 상기 프라이머 3 세트에 대한 실험적 UMI 패밀리 크기 분포 히스토그램. UMI 설계 패턴과 일치하지 않는 UMI 서열이 제거되었다.
도 4a-b. 복제수 변이(CNV)에 대한 UMI 기반 절대 정량화를 위한 데이터 분석. (도 4a) 복제수 변이(CNV) 검출을 위한 데이터 분석 워크플로우. FASTQ 출력 파일의 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 분석하여 복제수 변이(CNV) 상태를 결과로서 생성한다. 표적 유전자의 추가 복제의 빈도(FEC)는 로 계산되고, 여기서 는 상기 표적 유전자 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 고려할 유전자좌의 수이고; 은 참조 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 한 기준에 대하여 고려할 유전자좌의 수이고; 은 고려할 기준의 수이며; 은 실험 보정에 의해 결정된다. 복제 수 변이(CNV) 상태는 추가 복제의 빈도(FEC)에 기초하여 측정된다. (도 4b) 데이터 분석에서 UMI 패밀리 크기 및 고유 UMI 번호의 정의: UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI 서열을 수반하는 판독물의 수이고, 고유 UMI 번호는 한 유전자좌에 있는 상이한 UMI 서열의 총 수이다.
도 5. 실험적 UMI 패밀리 크기 분포의 예. 동일한 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리에 있는 10개의 ERBB2 앰플리콘 및 10개의 참조 앰플리콘에 대한 UMI 패밀리 크기 분포의 예. 20-플렉스 QASeq 실험을 위한 주형 입력으로서 정상 세포주 gDNA NA18562(코리엘(Coriell)에서 구입)를 사용하였고, 입력 샘플은 2500개의 반수체 게놈 복제를 함유한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다. 허용 및 폐기된 UMI의 비율은 파이 차트로 나타내었다. 모든 UMI 중에서 약 20%는 PCR 또는 서열 분석 오류로 인해 폐기되고(즉, G 염기가 폴리(H) UMI에서 발견됨), 약 40%는 작은 패밀리 크기로 인해 폐기된다(≤3).
도 6. 상이한 유전자좌에 대한 실험적 고유 UMI 번호의 예. 도 5에 나타낸 데이터에 해당하는 각 유전자좌의 고유한 UMI 번호의 예: 흰색 막대는 ERBB2 앰플리콘이고 회색 막대는 참조 앰플리콘이다. 입력 샘플은 2500개의 반수체 게놈 복제를 포함한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다.
도 7. 정상 세포주 gDNA NA18562 및 시뮬레이션된 이론 표준 편차 한계에 대한 실험적 보정 결과. CNV 비율(σCNV비율)의 표준 편차는 입력 분자 수에 대해 표시된다. LoD는 3σCNV비율로서 근사치를 계산할 수 있다. 각각 상이한 입력량(75, 250, 750 및 2500개의 반수체 게놈 복제)에 대해 5회의 반복 실험을 실시하였고, 실험 결과는 십자 기호로 표시된다. 샘플링된 분자 수의 푸아송(Poisson) 분포를 가정하여 시뮬레이션을 실시하였고, 시뮬레이션된 σCNV비율(점선으로 표시됨)은 샘플링의 확률성으로 인한 이론적 하한치이다.
도 8a-c. FFPE 샘플에 대한 복제수 변이(CNV) 검출 실험 결과의 예. ERBB2 CNV가 발생할 가능성이 없는 동일한 종양으로부터 2개의 폐암 FFPE 슬라이드를 시험하였다. 입력 추출된 DNA 샘플은 각 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리에 대한 2500개의 반수체 게놈 복제를 포함한다. 제조된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리는 일루미나 MiSeq 시약 키트 v3(Illumina MiSeq Reagent Kit v3, 150회 주기)에 의해 150만 개의 판독물을 사용하여 서열 분석하였다. (도 8a) 앰플리콘 ERBB2_1 및 참조_1에 대한 UMI 패밀리 크기의 예시 분포가 표시되고, 허용 및 폐기된 UMI의 비율은 파이 차트로 나타내었다. (도 8b) 각 앰플리콘 영역에 대한 예시의 고유한 UMI 번호. 흰색 막대는 ERBB2 앰플리콘이고, 회색 막대는 참조 앰플리콘이다. (도 8c) 복제수 변이(CNV) 비율은 동일한 폐암 종양으로부터 2개의 FFPE 슬라이드에 대해 표시된다. ERBB2의 CNV는 이전 보정 데이터를 기초로 QASeq를 사용하여 상기 FFPE 슬라이드에서 검출되지 않는다. 평균 및 LoD = 3σCNV비율은 750-게놈 복제 입력 세포주 gDNA 라이브러리의 데이터를 기초로 계산되고(도 7 참조), FFPE 샘플과 유사한 고유 UMI 번호를 갖는다.
도 9a-e. 1차 실험 워크플로우를 사용한 프라이머 이합체 환원. (도 9a) 시험한 가장 간단한 워크플로우는 원-포트 반응이었다. UMI 추가 후, 인덱스 프라이머는 열순환기의 개방형 튜브 단계로서 반응에 직접 추가되었고, 인덱스 PCR(즉, 범용 PCR)은 이후에 실시되었다. 상기 워크플로우의 경우, 표적 적중률(on-target)이 낮았고(0.5%). 표적을 벗어난 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 대부분 프라이머 이합체였다. (도 9b) 프라이머 이합체를 환원시키기 위해 범용 PCR의 6회 주기 후에 SPRI 정제 단계를 추가하였고, 표적 적중율이 20%로 향상되었다. (도 9c) 프라이머 이합체를 추가로 환원시키기 위해 인덱스 PCR 후에 아가로스 겔을 사용한 크기 선택 단계를 추가하였고, 표적 적중율은 도 9b와 비교하여 개선되었지만, 여전히 50% 미만이다. (도 9d) 범용 PCR 후 어댑터 교체 및 정제를 모두 포함하는 기본 실험 워크플로우는 66%의 높은 평균 표적 적중률을 나타낸다. (도 9e) 워크플로우 도 9a-d에서 프라이머 이합체의 원천
도 10a-c. 차세대 서열 분석(NGS) 인덱스 PCR을 요구하지 않는 예시의 워크플로우. (도 10a) 인덱스 및 P5 서열은 범용 정방향 프라이머(UfP)의 5'에 추가되고, 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다. 어댑터 교체로부터 수득한 앰플리콘은 P5, P7 및 이중 인덱스를 포함하므로, 서열 분석할 준비가 되어 있다. (도 10b) 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가되고, 인덱스 프라이머는 어댑터 교체 단계에서 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)와 함께 추가된다. 앰플리콘은 서열 분석할 준비가 되어 있다. (도 10c) 인덱스 및 P5 서열은 특이적 정방향 프라이머(SfP)의 5'에 추가되고, P5 서열을 수반하는 프라이머는 범용 PCR 단계에서 범용 정방향 프라이머(UfP)로서 사용된다. 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다. 앰플리콘은 서열 분석할 준비가 되어 있다.
도 11. QASeq 프라이머 설계 및 워크플로우의 변형. 각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다. 원래 설계에 비해, 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA)는 주형-결합 영역만 필요하고 범용 역방향 프라이머(UrP)는 필요하지 않다. 각 QASeq 패널은 하나의 범용 정방향 프라이머(UfP)만을 필요로 하고, 범용 정방향 프라이머(UfP)에서 영역 1의 5'-말단에 추가 염기가 있을 수 있다. 원래 실험 워크플로우와 비교하여, 범용 PCR 단계에서 더 많은 PCR 주기가 필요하고, ≥10 주기가 권장된다.
도 12a-b. QASeq 기반 대립 유전자 비율 정량화를 위한 데이터 분석. (도 12a) 대립 유전자 비율 정량화를 위한 데이터 분석 워크플로우. FASTQ 출력 파일의 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 상이한 유전적 동일성 간의 대립 유전자 비율을 생성하기 위해 분석된다. 각 표적화된 유전자좌에 대한 대립 유전자 비율은 R 대립유전자 = N 1 /N 2으로 정의되고, 여기서 N 1은 제1 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이며, N 2는 제2 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이다. (도 12b) 다수결에 기초하여 각 UMI 패밀리를 호출하는 유전적 동일성.
도 13. 임상적 FFPE 샘플의 급증에 대한 복제수 변이(CNV) 검출 실험 결과의 예. 이전에 특성화된 2개의 FFPE DNA 샘플(1개의 "정상" 샘플 및 1개의 "ERBB2 증폭된 비정상" 샘플)을 혼합하여 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플을 생성하였다. "정상" 샘플의 ERBB2 FEC는 0%이고, "ERBB2 증폭 비정상" 샘플의 ERBB2 FEC는 78%이다. 실험적으로 정규화된 추가 복제의 빈도(FEC) 값은 예상되는 ERBB2 FEC에 대해 표시되었다. "정상" 샘플은 5회 반복 시험하였으며, 100-플렉스 CNV 패널의 LoD는 "정상" 샘플의 3 표준 편차로 추정되었다. 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플의 복제수 변이(CNV)는 이의 계산된 추가 복제의 빈도(FEC)가 3 표준 편차 범위를 벗어났기 때문에 성공적으로 검출되었다.
도 14. QASeq를 사용한 돌연변이 정량화를 위한 생물정보학 워크플로우. 돌연변이 정량화를 위한 데이터 처리 워크플로우의 요약을 도시하였다.
도 15. 179-플렉스 종합 패널에 대해 관찰된 분자 번호. 입력은 8.3 ng(예상 분자 수 5000)의 100% 멀티플렉스(Multiplex) I 야생형 cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리(Horizon Discovery))이었다. 전환율은 평균 62%이고, 상기 플렉스의 97%는 전환율이 >10%이다.
도 16. 179-플렉스 종합 패널의 오류율. 입력은 8.3 ng의 100% 멀티플렉스 I 야생형 cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리)이었고, 동일한 샘플을 세 번 시험하였다. 3840개의 상이한 유전자좌의 오류율(UMI를 사용한 오류 수정 후)이 표시되었다. 가장 높은 오류율은 0.23%, 0.20% 및 0.23%였으며 평균 오류율은 3회 복제에 대해 0.006%, 0.005% 및 0.005%였다.
도 17. 179-플렉스 종합 패널에 대한 돌연변이 정량화 결과. 사용된 샘플은 3회 시험된 0.3% cfDNA 참조 표준(호라이즌 디스커버리의 0.1% 멀티플렉스 I cfDNA 참조 표준 및 1% 멀티플렉스 I cfDNA 참조 표준을 혼합하여 생성)이었다. 6개 돌연변이의 실험적 VAF는 일반적으로 예상된 VAF와 일치하였고, 그 차이는 대부분 돌연변이 분자의 소수(≤9)를 샘플링할 때의 확률성 때문이었다.
본원에서는 중합효소 연쇄 반응에 의해 올리고뉴클레오티드 바코드 서열로 원래의 DNA 샘플에서 표적화된 게놈 유전자좌의 각 가닥을 표지하고 고-처리량 서열 분석을 위해 게놈 영역(들)을 증폭하기 위한 정량적 앰플리콘 서열 분석의 방법이 제공된다. 또한, 본원에서는 각 유전자의 추가적인 복제 빈도를 정량화함으로써 관심 유전자 세트에서 복제수 변이(CNV)의 동시 검출을 가능하게 하는 방법이 제공된다. 다중 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율의 정량화가 또한 개시된 방법에 의해 제공된다. 상기 방법은 종양 샘플에서 관심 유전자(들)에 대한 복제수 변이(CNV)의 검출, 표적 요법의 선택 안내, 암 형성 및 진행의 이해를 돕는 데 적용될 수 있다.
단일 유전자 질병의 산전 진단을 위한 현재의 표준 방법은 침습적이고 위험한 융모막 채취법 또는 양수천자로부터 수득한 태아 유전 물질의 서열을 분석하는 것이다. 단일 유전자 질병의 유전적 비침습적 산전 검사(NIPT)는 모체 혈장에서 태아 유래 무세포 DNA(cfDNA)의 순환을 기초로 한다. 배경 모체 DNA의 존재로 인해, 특히 모체 DNA가 관심 유전자좌에서 이형인 경우 태아 cfDNA에서 발생하는 대립 유전자 비율 변화를 확실하게 검출하는 것이 어려워진다. 질병을 유발하는 돌연변이를 수반하는 돌연변이 대립 유전자 및 NIPT에 대한 야생형 대립 유전자 사이의 대립 유전자 비율을 정량화하기 위해 미세방울 디지털 PCR(ddPCR)이 사용되었지만(Lun et al., 2008), 상기 기술의 정밀도 및 신뢰성으로 인해 실용적인 가능성이 제한된다. QASeq는 원래 입력 분자의 각 가닥에 고유한 분자 식별자를 추가함으로써 DNA 분자의 절대 정량화를 가능하게 하며 NIPT의 대립 유전자 비율 정량화에 적용할 수 있다. 이와 같이, QASeq는 대립 유전자 비율 정량화에도 사용할 수 있다. 대립 유전자 비율 정량화는 상이한 유전적 동일성을 가진 DNA 분자의 비율을 정량화하는 것을 목표로 한다. 정확한 대립 유전자 비율 정량화는 β-지중해 빈혈 및 낭포성 섬유증과 같은 단일 유전자 질환의 NIPT의 핵심이다.
II.
복제수 변이(CNV)의 추가 복제 빈도
게놈 DNA 샘플에서 복제수 변이(CNV)의 추가 복제의 빈도(FEC)는 본원에서 하기와 같이 정의된다:
추가 복제의 빈도(FEC)의 양수 값은 샘플 내 표적 게놈 영역의 증폭을 나타내고, FEC의 음수 값은 샘플 내 표적 게놈 영역의 결실을 나타낸다.
QASeq는 추가 복제의 빈도(FEC)를 정량화하는 데 사용할 수 있지만, 종양 조직 샘플에서 복제수 변이(CNV)를 포함하는 세포의 백분율에 대한 정보를 제공하지 않는다. 예를 들어, 종양 샘플에서 1%의 세포는 4개의 ERBB2 복제를 포함하고 나머지 99%의 세포는 2개의 복제를 포함하는 경우, 추가 복제의 빈도(FEC)는 1%이고, 샘플에서 0.5%의 세포는 6개의 ERBB2 복제를 포함하고 나머지 99.5%의 세포는 2개의 복제를 포함하는 경우 FEC는 여전히 1%이다. 또한, QASeq는 추가 복제의 게놈 위치에 대한 정보를 제공하지 않는다.
III.
다중화 PCR 패널 설계
QASeq 다중 PCR 패널에서, 하나의 표적 유전자는 M (M = 1~1000) 세트의 프라이머를 필요로 하며, 각각은 표적 유전자 영역에서 비중첩 작은 영역(40 nt 내지 500 nt, 일반적으로 ≤200 nt)을 증폭시킨다. 상기 패널에 다중 표적 유전자가 있는 경우, 각 유전자에 사용되는 프라이머 세트의 수는 유사하다( M). 상기 패널은 참조 게놈 영역을 증폭시키는 유사한 수( M)의 프라이머 세트도 포함한다. 참조 유전자좌는 로딩된 게놈 DNA(gDNA)의 양에 대한 내부 표준 역할을 하므로, 샘플 내 DNA 농도의 정확한 정량화가 필요하지 않다. 각 패널에 대해 하나 이상의 참조 프라이머 세트를 사용할 수 있다. 표적 유전자의 입력 분자 또는 유전자좌의 수를 늘리면 무작위 샘플링의 변형을 모두 감소시킬 수 있기 때문에, 유전자당 더 많은 수의 프라이머 세트를 사용하여 더 적은 양의 DNA를 포함하는 샘플 유형의 LoD를 개선할 수 있다. 이 경우, 참조 프라이머 세트의 수를 비례적으로 늘려야 한다.
각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다(도 1을 참조). 특이적 정방향 프라이머(SfP)는 5'에서 3' 방향으로 영역 1, 2, 3 및 4를 포함한다. 영역 4는 주형-결합 영역이고, 영역 3은 UMI이고, 영역 1은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터이고, 영역 2는 UMI의 균일한 증폭을 위해 추가된 선택적 스페이서 영역(일반적으로 0~15nt)이다. 특이적 정방향 프라이머(SfP)는 5'에서 3’ 방향으로 영역 5, 6 및 7을 포함한다. 영역 7은 주형-결합 영역이고, 영역 5는 범용 증폭을 위한 맞춤 어댑터(즉, 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터와 상이하고 인간 게놈에서 찾을 수 없는 서열)이며, 영역 6은 상이한 유전자좌의 균일한 증폭을 위해 추가된 선택적 스페이서 영역(일반적으로 0~15nt)이다. 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)는 5'에서 3’ 방향으로 영역 8, 9 및 10을 포함한다. 영역 10는 주형-결합 영역이고, 이의 3’-말단은 영역 7보다 영역 4에 1 염기만큼 가깝고, 영역 8은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터이며, 영역 9는 상이한 유전자좌의 균일한 증폭을 위해 추가된 선택적 스페이서 영역(일반적으로 0~15nt)이다. 각 QASeq 패널은 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 하나씩만 필요로 한다. 범용 정방향 프라이머(UfP)는 영역 1을 포함하고, 범용 역방향 프라이머(UrP)는 영역 5를 포함하며, 범용 정방향 프라이머(UfP) 또는 정방향 프라이머(UrP)에서 영역 1 또는 영역 5의 5'-말단에 추가 염기가 있을 수 있다. 주형-결합 영역 4, 7 및 10의 용융 온도(Tm)는 PCR 어닐링 온도와 대략 동일하고, 범용 정방향 프라이머(UfP) 또는 정방향 프라이머(UrP)의 Tm은 실험적 PCR 조건에서 영역 4, 7 및 10보다 낮지 않다.
프라이머를 설계할 때, 프라이머 결합 영역에서 유의미한 소수 대립 유전자 빈도(MAF)를 갖는 단일 염기 다형성(SNP)을 피해야 프라이머의 결합 친화도가 상이한 환자 샘플의 뉴클레오티드 서열 변형에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 또한, 프라이머가 비표적 영역의 비특이적 증폭을 잘 일으키지 않도록 전체 인간 게놈 염기 서열을 검색해야 한다.
종양 샘플의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 표본에서 ERBB2의 복제수 변이(CNV)를 표적으로 하는 예시 패널에서, 각각 60 내지 70 nt 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머 10세트가 ERBB2 유전자 영역에서 설계되었다. 또한, 10 세트의 참조 프라이머가 설계되었으며, 각각은 상이한 염색체로부터 상이한 하우스키핑 유전자의 영역을 증폭시킨다(표 1). 프라이머는 상기 언급한 설계 원칙을 충족하면서 프라이머 상호 작용을 최소화하기 위해 매트랩(Matlab) 코드를 사용하여 자동으로 설계되었다. 또한, 군에서 >0.2% MAF를 갖는 비병원성 단일 염기 다형성(SNP)은 피했다. 온라인 도구 프라이머-블라스트(Primer-BLAST)를 사용하여 각 프라이머 세트가 인간 게놈에서 하나의 앰플리콘만 갖도록 하였다. 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다.
앰플리콘 명칭 | 염색체 | 유전자 |
ERBB2 1~10 | Chr. 17 | ERBB2 |
참조 1 | Chr. 1 | PSMB2 |
참조 2 | Chr. 3 | RPL32 |
참조 3 | Chr. 5 | RACK1 |
참조 4 | Chr. 6 | TBP |
참조 5 | Chr. 9 | VCP |
참조 6 | Chr. 11 | HMBS |
참조 7 | Chr. 12 | NACA |
참조 8 | Chr. 15 | B2M |
참조 9 | Chr. 19 | GPI |
참조 10 | Chr. 20 | TOP1 |
명칭 | 서열 | 서열 번호 |
SfP-ERBB2-1 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAATCA TAAAAGCTAACATATAGCCTGGG |
1 |
SfP-ERBB2-2 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCTGACTTGGGGACACAGG | 2 |
SfP-ERBB2-3 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTTGCAAGATGGAGGTTGCA | 3 |
SfP-ERBB2-4 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTGCCCTACCAGCCTCTC | 4 |
SfP-ERBB2-5 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCACAACTGGAATCTGACGC | 5 |
SfP-ERBB2-6 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCTGCGGATTGTGCG | 6 |
SfP-ERBB2-7 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGATATAAGGGCCAAAAGTTACACA | 7 |
SfP-ERBB2-8 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGC | 8 |
SfP-ERBB2-9 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGAATGAAATTAAACAGGGCTTGGC | 9 |
SfP-ERBB2-10 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAAAGAAAAAAAAAAAGAATATGGGTCCAGA | 10 |
SfP-Ref-1 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCACAACATTTTGTCTCCGGAAAATA | 11 |
SfP-Ref-2 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGACAAATGCCCAGAAATGGAACTTA | 12 |
SfP-Ref-3 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHATGCGGTTTCACCATTGGC | 13 |
SfP-Ref-4 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCCAAGGAATTGAGGAAGTTGCT | 14 |
SfP-Ref-5 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACTGGAATGCTGTTCCTTACAATCA | 15 |
SfP-Ref-6 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCCTGGATAGGCAGCTTG | 16 |
SfP-Ref-7 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAACTCAGACTATTCAGGAATACGTTT | 17 |
SfP-Ref-8 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCCATCCGACATTGAAGTTGACTTA | 18 |
SfP-Ref-9 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGAATGAAGCCCTAATCCCTTAAGC | 19 |
SfP-Ref-10 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGGCAGAGGAAATATCGTTGAC | 20 |
SrPA-ERBB2-1 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTATGCATGCAAAACACCACAAAC | 21 |
SrPA-ERBB2-2 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGATCTGGCCCAGCACC | 22 |
SrPA-ERBB2-3 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTGGCAGGCACTCTCG | 23 |
SrPA-ERBB2-4 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTAAGGTCAAATCCTAGGGGG | 24 |
SrPA-ERBB2-5 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGGGGCTCTGGTCATTGC | 25 |
SrPA-ERBB2-6 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCAGCGGGTCTCCATTGTCTA | 26 |
SrPA-ERBB2-7 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGCTTGGTGGTTAAGAGACTGTGG | 27 |
SrPA-ERBB2-8 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCATTTACCCCTCACAACAACCA | SEQ ID NO:28 |
SrPA-ERBB2-9 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGAGTAACAACAGTCACTGCTC | 29 |
SrPA-ERBB2-10 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTATGTTTTTCCATGTTCTAACACCGT | 30 |
SrPA-Ref-1 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGCTCCAGATGGGCAGCAC | 31 |
SrPA-Ref-2 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTGGCAGTCTTTAAGATCCATAGAAATAC | 32 |
SrPA-Ref-3 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACTTTGGAAGGCAGAGGCG | 33 |
SrPA-Ref-4 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGGAACTCGTCTCACTATTCAATTTTT | 34 |
SrPA-Ref-5 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGCTTGTGGATGAGGCCATA | 35 |
SrPA-Ref-6 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGCAGTCACTGTTCCTTTCC | 36 |
SrPA-Ref-7 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTATGCATTTACTTCTGAAACAGTCCTT | SEQ ID NO:37 |
SrPA-Ref-8 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAAGTCTGAATGCTCCACTTTTTCA | 38 |
SrPA-Ref-9 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTCTCATTCTAGAAAGAAGTTAACTCATTATACA | 39 |
SrPA-Ref-10 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGAATCAACAAATGACAAGGCAAAT | 40 |
SrPB-ERBB2-1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGCAAAACACCACAAACAGTTC | 41 |
SrPB-ERBB2-2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATCTGGCCCAGCACCTTAA | 42 |
SrPB-ERBB2-3 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTCGGTGGATCTGCATAACAT | 43 |
SrPB-ERBB2-4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCAAATCCTAGGGGGTAATACGA | 44 |
SrPB-ERBB2-5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGTCATTGCAGAGACCTCT | 45 |
SrPB-ERBB2-6 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCCATTGTCTAGCACGGC | 46 |
SrPB-ERBB2-7 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGACTGTGGAGTCTGAAACTCAG | 47 |
SrPB-ERBB2-8 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCTCACAACAACCAGACG | 48 |
SrPB-ERBB2-9 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCACTGCTCTGTAGAAAGCCT | 49 |
SrPB-ERBB2-10 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGTTCTAACACCGTGATCTGGAT | 50 |
SrPB-Ref-1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGGGCAGCACAGTGGG | 51 |
SrPB-Ref-2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGTCTTTAAGATCCATAGAAATACTCTT | 52 |
SrPB-Ref-3 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGAGGCGAGTGGATCACTT | 53 |
SrPB-Ref-4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTATTCAATTTTTTCCTAGAGCATCTCC | 54 |
SrPB-Ref-5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCCATAGAAAGGGTAGTGTTGAA | 55 |
SrPB-Ref-6 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCCTTTCCTCCTCCTCCCAT | 56 |
SrPB-Ref-7 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATTTACTTCTGAAACAGTCCTTAATG | 57 |
SrPB-Ref-8 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAATGCTCCACTTTTTCAATTCTCTCT | 58 |
SrPB-Ref-9 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTCTAGAAAGAAGTTAACTCATTATACACAGT | 59 |
SrPB-Ref-10 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAAATGACAAGGCAAATGAGACAT | 60 |
UfP | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | 61 |
UrP | CCTATGGTAGTTAAATGTACATTGGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCT | 62 |
명칭 | 프라이머 서열 | 서열 번호 |
UfP | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | 61 |
UrP | CCTATGGTAGTTAAATGTACATTGGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCT | 62 |
fP-ERBB2-1 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCTTAGACAACTACCTTTCTACGGAC | 63 |
fP-ERBB2-10 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGCTTTGGTCTCCCTTTTTGC | 64 |
fP-ERBB2-11 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAAAGAAAAAAAAAAAGAATATGGGTCCAGA | 65 |
fP-ERBB2-12 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCGAGGCGATAGGGTTAAGGG | 66 |
fP-ERBB2-13 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTCTAGTCGCAATTGAAGTACCAC | 67 |
fP-ERBB2-14 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCTCACCCCTTGTCAACTTTTC | 68 |
fP-ERBB2-15 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGTCTGGTGCTTTAGCCCAAAG | 69 |
fP-ERBB2-16 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAAAGCAAAGCTATATTCAAGACCACAT | 70 |
fP-ERBB2-17 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCATTGTCTGCCAGTCCG | 71 |
fP-ERBB2-18 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCCTTTAGCTCGTGGAATCTCAAG | 72 |
fP-ERBB2-19 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTGGGGCATTCCAACTAGAACT | 73 |
fP-ERBB2-2 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHATTCCAGTGGCCATCAAAGTGT | 74 |
fP-ERBB2-20 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGGAAAACCATTATTTGATATTAAAACAAATAGG | 75 |
fP-ERBB2-21 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGGAAGTATAAGAATGAAGTTGTGAAGC | 76 |
fP-ERBB2-22 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTCCCCGCTCCCCTTCA | 77 |
fP-ERBB2-23 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGCCTGGGCCAGGTATACT | 78 |
fP-ERBB2-24 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACTCTGTCCTCTGCAGGAACT | 79 |
fP-ERBB2-25 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGTATGGGTTTTACAAATTGCAGCAAATA | 80 |
fP-ERBB2-26 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAAAGCATGTTTAATTTTCTCGTGGTT | 81 |
fP-ERBB2-27 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCGTGAGGGGCCAGTGT | 82 |
fP-ERBB2-28 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGACACAGGTCATTTTACTGTAGTATTC | 83 |
fP-ERBB2-29 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCACCCGTTCTGACCCTC | 84 |
fP-ERBB2-3 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGGAAGCATACGTGATGGCT | 85 |
fP-ERBB2-30 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACCTGCAGTGTGCAAGGG | 86 |
fP-ERBB2-31 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCGTCTGTGTTTCCGCTAAATC | 87 |
fP-ERBB2-32 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAAGATCTCCAAGTACTGGGGAAC | 88 |
fP-ERBB2-33 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGGCCTTCACCGTCATTGAAA | 89 |
fP-ERBB2-34 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCAGATATAAGGGCCAAAAGTTACAC | 90 |
fP-ERBB2-35 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGCTGGCTCTCACACTGAT | 91 |
fP-ERBB2-36 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCACCCCTGTTCTCCGATG | 92 |
fP-ERBB2-37 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTCCTAAATGTTAGCTTTTATTCTATAGCCT | 93 |
fP-ERBB2-38 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACC | 94 |
fP-ERBB2-39 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCCTTTGGTGGGTGGGG | 95 |
fP-ERBB2-4 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGATGAGCTACCTGGAGGATGTG | 96 |
fP-ERBB2-40 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGCCAGTTCCCTGGTTCA | 97 |
fP-ERBB2-41 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCCTTCAGACTATGAAAAGGTTCTAAG | 98 |
fP-ERBB2-42 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACAGTGCTGGCAATGTTTATCAC | 99 |
fP-ERBB2-43 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGGTGGTTCCCAGAATTGTTG | 100 |
fP-ERBB2-44 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTCAAAGTTCTGGTGTCGGG | 101 |
fP-ERBB2-45 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGACCTGTGGGTGGAAATTTTG | 102 |
fP-ERBB2-46 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGAGGGTTCTGATTGCCTACAAG | 103 |
fP-ERBB2-47 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGGATCCTCATCAAGCGACG | 104 |
fP-ERBB2-48 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCCTTTTACAGTCAAAGTCCAAAGC | 105 |
fP-ERBB2-49 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGC | 106 |
fP-ERBB2-5 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGATGGCGCTGGAGTCCATT | 107 |
fP-ERBB2-50 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACCTGTCCTAAGGAACCTTCCT | 108 |
fP-ERBB2-6 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTTGCAAGATGGAGGTTGCA | 109 |
fP-ERBB2-7 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTGCCCTACCAGCCTCTC | 110 |
fP-ERBB2-8 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCACAACTGGAATCTGACGC | 111 |
fP-ERBB2-9 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCTGCGGATTGTGCG | 112 |
fP-Mut1 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGGACCCACTCCATCGAGA | 113 |
fP-Mut2 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGC | 114 |
fP-Mut4 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCCGCCAGGTCTTGATGTACT | 115 |
fP-Mut5 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTCACCATCGCTATCTGAGCAG | 116 |
fP-Mut6 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCGTCAAGGCACTCTTGCCTA | 117 |
fP-mut10 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTT | 118 |
fP-mut11 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCACACGCAAATTTCCTTCCAC | 119 |
fP-mut12 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCCGCTCATGATCAAACGCTCTAA | 120 |
fP-mut13 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCATGATCAGGTCCACCTTCT | 121 |
fP-mut14 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCACTCTCTCTCTGCGCATTC | 122 |
fP-mut15 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGTAACAAAGGCATGGAGCATCT | 123 |
fP-mut16 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGTGGGGTGAGATTTTTGTCAACTT | 124 |
fP-mut17 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGCAGTATCAGTAGTATGAGCAGC | 125 |
fP-mut18 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTTCTGATGTGCTTTGTTCTGGATTT | 126 |
fP-mut19 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGAGCCAAATGTGTATGGGTGA | 127 |
fP-mut20 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGTTGCACATTCCTCTTCTGCATTT | 128 |
fP-mut21 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGGTGCATTTGTTAACTTCAGCTCTG | 129 |
fP-mut22 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTAGGTTTCTGCTGTGCCTGAC | 130 |
fP-mut23 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGGTGGGCTTAGATTTCTACTGACTACTA | 131 |
fP-mut24 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCTAGGATTCTCTGAGCATGGC | 132 |
fP-mut25 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACTAAATAGGAAAATACCAGCTTCATAGAC | 133 |
fP-mut26 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACACTCTTGTGCTGACTTACCA | 134 |
fP-mut27 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAACATCAGGGAATTCATTTAAAGTAAATAGC | 135 |
fP-mut28 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGGAACCAAATGATACTGATCCATTAGATTC | 136 |
fP-mut29 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGATTCTAAACTGCCAAGTCATGC | 137 |
fP-mut30 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGCCTGTAGTAATCAAGTGTCTCATTT | 138 |
fP-mut31 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCAACCAAAGTCTTTGTTCCACCTT | 139 |
fP-mut32 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGACATCATCTGGATTATACATATTTCGC | 140 |
fP-mut33 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAAAGAGCTAACATACAGTTAGCAGC | 141 |
fP-mut34 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTTCCATTCTAGGACTTGCCCC | 142 |
fP-mut35 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACTGAATTCTCCTCAGATGACTCC | 143 |
fP-mut36 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACAGACACTCCTTGTTCAGCA | 144 |
fP-mut37 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGTGTATATAATTATTTCTTACCCTATTCGAGTC | 145 |
fP-mut38 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTTGCTGTCATTTGGACTGGGAA | 146 |
fP-mut39 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCAAAAAGATACCCACCTTTCCTCCA | 147 |
fP-mut3new | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCT | 148 |
fP-mut40 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGACATTACGGGCTGCCAAATC | 149 |
fP-mut41 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCTCAGACACACACCCAGCAA | 150 |
fP-mut42 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACTTACTTTATAAACCGTTCCAAAAGCA | 151 |
fP-mut43 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGAGTAATGTACTTACTACAATTTTCAGCTT | 152 |
fP-mut44 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGCTGTTGTCAGTAATATAGATGTTTCCTG | 153 |
fP-mut45 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAACTAGGGCAGGCACGC | 154 |
fP-mut46 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGGATAATAAAAGAGAGAAATCACAGACATACAA | 155 |
fP-mut47 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGGCATATCGATCCTCATAAAGTTTTG | 156 |
fP-mut48 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCAGGTTGCCCATGACAAC | 157 |
fP-mut49 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGTGCCAGAAGGAACCCAC | 158 |
fP-mut50 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAAGTGTTACTCAAGAAGCAGAAAGG | 159 |
fP-mut51 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAAAATCCCTTTGGGTTATAAATAGTGCA | 160 |
fP-mut52 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHATGTGTTTTATAATTTAGACTAGTGAATATTTTTCTTTG | 161 |
fP-mut53 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCTGGAAAAATGGCTTTGAATCTTTGG | 162 |
fP-mut54 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGGAAAAGCTCATTAACTTAACTGACAT | 163 |
fP-mut55 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCTTGGGATTACGCTCCCT | 164 |
fP-mut56 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACCCAGTGGAGAAGCTCCC | 165 |
fP-mut57 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC | 166 |
fP-mut58 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGGCAGATGCCCAGCAGG | 167 |
fP-mut59 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCCTCCACCGTGCAGCTCAT | 168 |
fP-mut60 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGCCAGGAACGTACTGGTG | 169 |
fP-mut61 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACAATGTCACCACATTACATACTTACC | 170 |
fP-mut62 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACAGGCTCCCAGACATGACA | 171 |
fP-mut63 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTTCAGATATTTCTTTCCTTAACTAAAGTACTCA | 172 |
fP-mut64 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGTTTGTTTTGTTTTAAGGTTTTTGGATTC | 173 |
fP-mut65 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCTAAGTGCAAAAGATAACTTTATATCACTT | 174 |
fP-mut66 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGTTGCAGCAATTCACTGTAAAGCT | 175 |
fP-mut67 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHCACAAGAGGCCCTAGATTTCTATGG | 176 |
fP-mut68 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTTGAGTTCCCTCAGCCGTTAC | 177 |
fP-mut69 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCTTCATACCAGGACCAGAGGAA | 178 |
fP-mut7 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGTGAGCCCTGCTCCCC | 179 |
fP-mut70 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGCGTGCAGATAATGACAAGGAATATCT | 180 |
fP-mut71 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGGTTTTCATTTTAAATTTTCTTTCTCTAGGTGAA | 181 |
fP-mut72 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCGTGGCCATGAATGAATTCTCTA | 182 |
fP-mut73 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCTACAACAAGCTAACTTTCCAGCT | 183 |
fP-mut74 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGTGATGTTCCTCCCTCATCTCTAA | 184 |
fP-mut75 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHAGCAACATTGATGGATTTGTGAACT | 185 |
fP-mut76 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHACGATTGGCTGAAGTACCAGAC | 186 |
fP-mut77 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGGACACGACAACAACCAGC | 187 |
fP-mut78 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGCAACTTACACGTGGACGAC | 188 |
fP-mut79 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCCTCTTATTGTTCCCTACAGATTG | 189 |
fP-mut8 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHGTGCGCCGGTCTCTCC | 190 |
fP-mut9 | ACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTHHHHHHHHHHHHHHHTGACCTGGAGTCTTCCAGTGT | 191 |
fP-Ref-1 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCTTGTCTAAGGAAAAAACTTGATTATTTTGTAA | 192 |
fP-Ref-10 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGGAAGACGCTTGGTTGGG | 193 |
fP-Ref-11 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGAGACCTATAATGCTAAGGAAATTTCTTTAC | 194 |
fP-Ref-12 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGGAAGCGTTCGTTCCATCC | 195 |
fP-Ref-13 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCTTGGCATCTGTTCTTGCTTTAA | 196 |
fP-Ref-14 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAAAATTCTGCAAAAATAAAGGCCAAGA | 197 |
fP-Ref-15 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTTTATTGCATGTCCTCATCCACAG | 198 |
fP-Ref-16 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHATTGGGGATGTCCAGAATAAATTCAG | 199 |
fP-Ref-17 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAAACAGTTCAGTGACTTGCCC | 200 |
fP-Ref-18 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGGCATCTCACCTCTCTTCC | 201 |
fP-Ref-19 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCATTATTCCAGTATTGTAGAAGAAGAA | 202 |
fP-Ref-2 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTACATTACCAGTAGAACAGAACTAGTCTA | 203 |
fP-Ref-20 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCTAACCGTGCTTTCCTCTTTCAT | 204 |
fP-Ref-21 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCCTAGCAGAAGCCGACCA | 205 |
fP-Ref-22 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAAACCACCACTTATTTCTTTATTTTATCCT | 206 |
fP-Ref-23 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCATTTTGTAGTCATTGTAAAACTCTTATGC | 207 |
fP-Ref-24 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGAGTAGCGACATGCAAATGATCT | 208 |
fP-Ref-25 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCCAGCATTTGTTATATAGGCATCTT | 209 |
fP-Ref-26 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGAGTAGACAGGGAAATATAGAAGCCT | 210 |
fP-Ref-27 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCATCCTTTTTAGTGCTGTCCTCA | 211 |
fP-Ref-28 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCAGCTGGCCTAGCAGTTC | 212 |
fP-Ref-29 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCATAATTTATAATGAAAACAAATACATTCTCACAG | 213 |
fP-Ref-3 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTTATTTGCATTTGTGGCATAATATGAAAC | 214 |
fP-Ref-30 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTAGGGTTAGTCAGGTGGTTCAA | 215 |
fP-Ref-31 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGAAGGGCTCTCACTGGG | 216 |
fP-Ref-32 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCCTTATATTATTCCCTTTGAACCTTACAATAAT | 217 |
fP-Ref-33 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCTGCAGCGGGAGTTTTCA | 218 |
fP-Ref-34 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCGGCGCCACGTGTTCA | 219 |
fP-Ref-35 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGGCCCATTTTAACCTTTTTTTTTTAAAGTA | 220 |
fP-Ref-36 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGTGAACAGCCAGAAGCGAT | 221 |
fP-Ref-37 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCCAGCCCCTGATCCTACCAG | 222 |
fP-Ref-38 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGTAACTGAACGACGAATTCTTTGTAA | 223 |
fP-Ref-39 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCAGCTCCCACCACAGTGC | 224 |
fP-Ref-4 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCACACAGCGGGCTCTCA | 225 |
fP-Ref-40 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCCCTTCTCCTACACTTCCTCC | 226 |
fP-Ref-41 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACTACAGGAGCAACTGCCAC | 227 |
fP-Ref-42 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGAGGTAGGGATTATTAGCCCCAT | 228 |
fP-Ref-43 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGTGTATCCAACAGGAACTCCAAA | 229 |
fP-Ref-44 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCTGGTCTTAAAATGTCCTGGGGA | 230 |
fP-Ref-45 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHACGCCCGGCCATCTCA | 231 |
fP-Ref-46 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTTTTCACTGTTTCCTACAAGAAAATGC | 232 |
fP-Ref-47 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGAAACCTGGATTTTTGAAATCTAGTGTTTAA | 233 |
fP-Ref-48 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGCAAGGACGGAAATAGGTAAATGT | 234 |
fP-Ref-49 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHCGAGGCACTGCGTTTGG | 235 |
fP-Ref-5 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGCAGATGGGTTGAGAGTTGG | 236 |
fP-Ref-50 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTCCAATCTCTATCTGTTAGAAGTCTCC | 237 |
fP-Ref-6 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHGGCTCTGATTTCCGCCCAAT | SEQ ID NO:238 |
fP-Ref-7 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHTGCAAAGATTGTAGGAGCTCTGTA | 239 |
fP-Ref-8 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAATTAGATAAAAAGCATCCACAGAGGAG | 240 |
fP-Ref-9 | ACACGACGCTCTTCCGATCTATCAHHHHHHHHHHHHHHHAGTCTTTAACAATGAGAGTCAAACCATT | 241 |
rPin-ERBB2-1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGCAGGGGGCAGACGA | 242 |
rPin-ERBB2-10 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCTCACAACAACCAGACG | 243 |
rPin-ERBB2-11 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGTTCTAACACCGTGATCTGGAT | 244 |
rPin-ERBB2-12 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGAAAACACTTCAGTTTGCTCATTAA | 245 |
rPin-ERBB2-13 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAAGGTTCTACCCCGCAT | 246 |
rPin-ERBB2-14 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTACTTCTTACTCATTCCAACCC | 247 |
rPin-ERBB2-15 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATCACCAGCTAGTCTGAGTC | 248 |
rPin-ERBB2-16 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCGTTTTATCTGTGACTCTTTG | 249 |
rPin-ERBB2-17 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATCCTCTCTGCATCCCAAATC | 250 |
rPin-ERBB2-18 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCAGGTGTTATCATTCCCCATTT | 251 |
rPin-ERBB2-19 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCCTCCTTATTTTTATGTGCTAAAT | 252 |
rPin-ERBB2-2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGTGGAGGGGCTTACG | 253 |
rPin-ERBB2-20 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCTTGCATCCTACTCCATCC | 254 |
rPin-ERBB2-21 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCCCTGGTTTCTCCGGT | 255 |
rPin-ERBB2-22 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGACCCCGCCAGAAGC | 256 |
rPin-ERBB2-23 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATGCAAAACACCACAAACAGTT | 257 |
rPin-ERBB2-24 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTACCTCCCTCTGTTTATGG | 258 |
rPin-ERBB2-25 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAATATGAAGGAGTTCTGCAAGATTAAAAG | 259 |
rPin-ERBB2-26 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTTCATACAGCAGGAATATGGGTAAT | 260 |
rPin-ERBB2-27 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGACAGGCACAACTACCCT | 261 |
rPin-ERBB2-28 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCAGAAAAGCCAATACTTCCCT | 262 |
rPin-ERBB2-29 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACACCACAGGCTCTACGG | 263 |
rPin-ERBB2-3 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCAGAAGGCGGGAGACATA | 264 |
rPin-ERBB2-30 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGAGAAGCCTGACTGAAG | 265 |
rPin-ERBB2-31 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGACAGGGGACATGATCA | 266 |
rPin-ERBB2-32 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAACACTGCCACCCCC | 267 |
rPin-ERBB2-33 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCCCTGGTTAGCAGTGG | 268 |
rPin-ERBB2-34 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACTCAGCCCCATCACTCAC | 269 |
rPin-ERBB2-35 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAGGGGCATGGCTTACAG | 270 |
rPin-ERBB2-36 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGCTCTGACAATCCTCAGAA | 271 |
rPin-ERBB2-37 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTCTCAAAAACAAAACGAAAGGTAAA | 272 |
rPin-ERBB2-38 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTGACAGGGGATATAGGGACA | 273 |
rPin-ERBB2-39 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTCCTTGTTCACGGATAGCAT | 274 |
rPin-ERBB2-4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTCCGAGCGGCCAAGTC | 275 |
rPin-ERBB2-40 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGCAGGGGACTTTTAGGG | 276 |
rPin-ERBB2-41 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTAGCACAGCCACAGTCACA | 277 |
rPin-ERBB2-42 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATTTAGTTGTCTTTAAATTGAAATGCATGAA | 278 |
rPin-ERBB2-43 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTGTCATCCAGGTCCACA | 279 |
rPin-ERBB2-44 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCTAACTTGACCCCCTTATTCCT | 280 |
rPin-ERBB2-45 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAGGAATGTACACCTGATGATTTTG | 281 |
rPin-ERBB2-46 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGCCTTGGCTCCCCG | 282 |
rPin-ERBB2-47 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTCTCCGCATCGTGTACT | 283 |
rPin-ERBB2-48 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTGCCCAGCTTAATTTTGTACA | 284 |
rPin-ERBB2-49 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGTGTCAAGTACTCGGG | 285 |
rPin-ERBB2-5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACATCACTCTGGTGGGTGAA | 286 |
rPin-ERBB2-50 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGACCCCTTCCAGCCA | 287 |
rPin-ERBB2-6 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTCGGTGGATCTGCATAACAT | 288 |
rPin-ERBB2-7 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCAAATCCTAGGGGGTAATACGA | 289 |
rPin-ERBB2-8 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGTCATTGCAGAGACCTCT | 290 |
rPin-ERBB2-9 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCCATTGTCTAGCACGGC | 291 |
rPin-Mut1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT | 292 |
rPin-Mut2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTCCAG | 293 |
rPin-Mut4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTGACGGGTAGAGTGTGC | 294 |
rPin-Mut5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACATGACGGAGGTTGTGAGG | 295 |
rPin-Mut6 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT | 296 |
rPin-mut10 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAGTTGCAAACCAGACCTCA | 297 |
rPin-mut11 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTCACTGATTGCTCTTAGGTCT | 298 |
rPin-mut12 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAACAAGGCACTGACCATC | 299 |
rPin-mut13 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGCGCCAGACGAGACC | 300 |
rPin-mut14 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGGATATGGTCCTTCTCTTC | 301 |
rPin-mut15 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGGGCGTCCAGCA | 302 |
rPin-mut16 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGTCAATGGAAGAAACCACCA | 303 |
rPin-mut17 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCTTCAACCTCTGCATTGAAAGT | 304 |
rPin-mut18 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAACAGCTACCCTTCCATCATAAGT | 305 |
rPin-mut19 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTTTTTAGCAAAAGCGTCCAG | 306 |
rPin-mut20 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTTTCAAAGCGCCAGTCA | 307 |
rPin-mut21 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTAACAAGCCAAATGAACAGACAAGT | 308 |
rPin-mut22 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGATAAAGA | 309 |
rPin-mut23 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAGCACCTAAAAAGAATAGGCTGAG | 310 |
rPin-mut24 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTAGATCTGAATGCTGATCCC | 311 |
rPin-mut25 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATCTGATTCTTCTGAAGATACCGTTAA | 312 |
rPin-mut26 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATTTATCTGCTCTTCGCGTTGAA | 313 |
rPin-mut27 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTGTTTCATATACTTCATCTTCTAGGACA | 314 |
rPin-mut28 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAGATTTTGTCACTTCCACTCTC | 315 |
rPin-mut29 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGAATTTGACAAAACCATTTCCTCATTT | 316 |
rPin-mut30 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTTCAGGACATCCATTTTATCAAGTTTC | 317 |
rPin-mut31 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTAATATTCCTAACACACTGTTCAACTCT | 318 |
rPin-mut32 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCTAGTCTCTTTTGTTGGGCCT | 319 |
rPin-mut33 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTATCAAAACTGAAAAATTACAATGAAAGGTTT | 320 |
rPin-mut34 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTTATTGCCAGTAAATTGTAACATTCGT | 321 |
rPin-mut35 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAGTTCTTCGTCAGCTATTGAATTACT | 322 |
rPin-mut36 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTCTCTCCACATATGTTTCTCTTATTAA | 323 |
rPin-mut37 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCCCACCTCCCATCTATACTTC | 324 |
rPin-mut38 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTGTGTCTGATGGGCAATCTTTC | 325 |
rPin-mut39 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTGGGCTAGCCAGACTCTTG | 326 |
rPin-mut3new | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAATCTCCATTTTAGCACTTACCTGTG | 327 |
rPin-mut40 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGATATTTTTCAGGGAATGATGTACCTG | 328 |
rPin-mut41 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAATCATGGTATTGCATTTTTTTCTTACAG | 329 |
rPin-mut42 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCACCCAATCAAGCTCAACT | 330 |
rPin-mut43 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCTTCAGCACAATCAACCAGA | 331 |
rPin-mut44 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATCACCTCTCTACAGTTCCAGT | 332 |
rPin-mut45 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGAATGTTAACATTAATGCTTATTTTACC | 333 |
rPin-mut46 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGACTGCTGCCATCGAG | 334 |
rPin-mut47 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTACGTGTTAGTGGCTCTTAATCA | 335 |
rPin-mut48 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATAAACTGAGCTCTCTCTCTGACC | 336 |
rPin-mut49 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAAGCCGGCGACAGG | 337 |
rPin-mut50 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTTCAATTACTTTTAAAAAGGGTTGAAAAAG | 338 |
rPin-mut51 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTTGACTTTACCTTATCAATGTCTCGAA | 339 |
rPin-mut52 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTCTGTGTAATCAAACAAGTTTATATTTCC | 340 |
rPin-mut53 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTAACACCAATAGGGTTCAGCAA | 341 |
rPin-mut54 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAGAGTCTCAAACACAAACTAGAGTC | 342 |
rPin-mut55 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTATTGTATTTGCATAGCACAAATTTTTGTT | 343 |
rPin-mut56 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTGCCGAACGCACC | 344 |
rPin-mut57 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAAGCAGAAACTCACATCGA | 345 |
rPin-mut58 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCAGGAAGCCTACGTGATG | 346 |
rPin-mut59 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGACATAGTCCAGGAGGCAG | 347 |
rPin-mut60 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA | 348 |
rPin-mut61 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCAGATTACAGTGGGACAA | 349 |
rPin-mut62 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATACAGGTCAAGTCTAAGTCGAATC | 350 |
rPin-mut63 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGTATACGCCTTCAAGTCTTTCT | 351 |
rPin-mut64 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAAGCATACAAATAAGAAAACATACTTACAG | 352 |
rPin-mut65 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTGCAATTAAATTTGGCGGTGT | 353 |
rPin-mut66 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGATGTAATAAATATGCACATATCATTACACC | 354 |
rPin-mut67 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGAAGAGGAAAGGAAAAACATCAA | 355 |
rPin-mut68 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATATTTCTCCCAATGAAAGTAAAGTACAAAC | 356 |
rPin-mut69 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGATTTCTTGATCACATAGACTTCCAT | 357 |
rPin-mut7 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCGTGAGCGCTTCG | 358 |
rPin-mut70 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTAAAATTTGGAGAAAAGTATCGGTTGG | 359 |
rPin-mut71 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCCTCTGGATTTGACGGC | 360 |
rPin-mut72 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATGGCAAACTTCCCATCGTAG | 361 |
rPin-mut73 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGACAGCTGGCTACACAA | 362 |
rPin-mut74 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGCCCTGACACAGGATGT | 363 |
rPin-mut75 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCATTGAGGCCGGTGAT | 364 |
rPin-mut76 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGACCATCACCATGTAGACATCA | 365 |
rPin-mut77 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCTGTCTCTCTCCCAGTTCATT | 366 |
rPin-mut78 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCATGGCAAACACCATGAG | 367 |
rPin-mut79 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCATGTGTGACTTGATTAGCAG | 368 |
rPin-mut8 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGTAATCTACTGGGACGGAAC | 369 |
rPin-mut9 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCACTACAACTACATGTGTAACAGTT | 370 |
rPin-Ref-1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTAACAGTAGGTGTTTCAATATGACTTTTATT | 371 |
rPin-Ref-10 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCCCTCCTCCATAGGAACTT | 372 |
rPin-Ref-11 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACATACCAGGTTCTGCGCTT | 373 |
rPin-Ref-12 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCAAGGCACCGCTCTAACTT | 374 |
rPin-Ref-13 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCCCGGTGTGCATTTGAGA | 375 |
rPin-Ref-14 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGCTATGGGGGCTTCCT | 376 |
rPin-Ref-15 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATGTGCCCTGACATCAGAAATATAC | 377 |
rPin-Ref-16 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGTTGATCTGAAGGAACTTCCT | 378 |
rPin-Ref-17 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGGACCATGTTTGGCCAT | 379 |
rPin-Ref-18 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCCATCATTGCTGCTGTCA | 380 |
rPin-Ref-19 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAACACGTGTGATCAATAGTACCAT | 381 |
rPin-Ref-2 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCATATCAGAACTTAAATACATAGCAGTAG | 382 |
rPin-Ref-20 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGAAGGAAGATGTCACATTATGA | 383 |
rPin-Ref-21 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCATGCGCAAGAGCTACCC | 384 |
rPin-Ref-22 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGATAAAATTCTCTTATCTTGAAGGATTGAT | 385 |
rPin-Ref-23 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGTTTCTGATATTGAAAAATTTTAAGTGCT | 386 |
rPin-Ref-24 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTCATCCTTCGCACATGTATACTG | 387 |
rPin-Ref-25 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGAGCAGATGACTCACATTTC | 388 |
rPin-Ref-26 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGGGGCTTGGTCTTTTTTCT | SEQ ID NO:389 |
rPin-Ref-27 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCTTTTTTAACAACCGGATCTAGT | 390 |
rPin-Ref-28 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAGGCCCTGTAATCTGTATTTTAACC | 391 |
rPin-Ref-29 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTAATATCAGACTTCCCAGCCTTC | 392 |
rPin-Ref-3 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAGCTCTGAGACAGGAACC | 393 |
rPin-Ref-30 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGCAAAGCAGAAGACAATAGTAGA | 394 |
rPin-Ref-31 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTTTCAGGGAGTCCTGTACA | 395 |
rPin-Ref-32 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTCGTTACTGTAAAATGGGAATGTTC | 396 |
rPin-Ref-33 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGAACTTTCGGGAAAGG | 397 |
rPin-Ref-34 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCACGTACAAGAGGATTTCAAAGT | 398 |
rPin-Ref-35 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTGTGAATGTACTTAATGACACTTAGC | 399 |
rPin-Ref-36 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGAGGCAGGTGCTCACTT | 400 |
rPin-Ref-37 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGGTGTTCTTTTATACCCATTTTTTCTTTA | 401 |
rPin-Ref-38 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTTGCTCTTGACTCTGAGCT | 402 |
rPin-Ref-39 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTCAGGTCCTTGTGGCTAAC | 403 |
rPin-Ref-4 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGAGCCGTGGGAATCAAAA | 404 |
rPin-Ref-40 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCATGGCAAGGCAACTT | 405 |
rPin-Ref-41 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAGGGACAGAAAATCAGGTCG | 406 |
rPin-Ref-42 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTAATGAGTTGATCTCTCTGAGC | 407 |
rPin-Ref-43 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAAGAAAACAAAGGACATAGATTTTCCC | 408 |
rPin-Ref-44 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAGTGCTCAAACCTTGGGAA | 409 |
rPin-Ref-45 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTATCATGCCATGAAGAATATTCATATATTCATA | 410 |
rPin-Ref-46 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAGAACCCACTTGGGACCA | 411 |
rPin-Ref-47 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCATATTCTTAATTTTTAAAATTCACAGCCA | 412 |
rPin-Ref-48 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCTGTCGTAAGTCAAGTCTTTGTG | 413 |
rPin-Ref-49 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTATCGAATCAGAATGCAAAGCAAATT | 414 |
rPin-Ref-5 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTTTCGGATACTCAGTCTCTGAA | 415 |
rPin-Ref-50 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAAATTACCTAAACTGACTCAAGAAGAA | 416 |
rPin-Ref-6 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCCTTTCGTGAGCGAAG | 417 |
rPin-Ref-7 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAGGTAGTGGAGGTCAAGGT | 418 |
rPin-Ref-8 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGACTTGCGTTCATCTTGTTATTTAAAC | 419 |
rPin-Ref-9 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGAAAAGGTAGGTTGGTGC | 420 |
rPout-ERBB2-1 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCACCTCTTGGTTGTGCAGG | 421 |
rPout-ERBB2-10 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATTTACCCCTCACAACAACCAG | 422 |
rPout-ERBB2-11 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCATGTTCTAACACCGTGATCTG | 423 |
rPout-ERBB2-12 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATGGAAAACACTTCAGTTTGCTC | 424 |
rPout-ERBB2-13 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAGCAAAGGTTCTACCCCG | 425 |
rPout-ERBB2-14 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCAGGCTACTTCTTACTCATTCCAA | 426 |
rPout-ERBB2-15 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACCTCCATCACCAGCTAGTCT | 427 |
rPout-ERBB2-16 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGTGCCCCCGTTTTATCTGT | 428 |
rPout-ERBB2-17 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCAAGCAAACCCATCCTCTCTG | 429 |
rPout-ERBB2-18 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGAGGCAGGTGTTATCATTCC | 430 |
rPout-ERBB2-19 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTATCTGAAATTCAAATTTAACTGGGCC | 431 |
rPout-ERBB2-2 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGAGAGGGTGGAGGGGCT | 432 |
rPout-ERBB2-20 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGGGAGCTTGCATCCTACTC | 433 |
rPout-ERBB2-21 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGCTCCCCTGGTTTCTCC | 434 |
rPout-ERBB2-22 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACACCCGACCCCGCC | 435 |
rPout-ERBB2-23 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGTTCTAGGATTAAAGGAGAATGCATG | 436 |
rPout-ERBB2-24 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCATAGAAGGCTACCTCCCTCT | 437 |
rPout-ERBB2-25 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGAATTAAAATATGAAGGAGTTCTGCAAG | 438 |
rPout-ERBB2-26 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTAAAAGTTAAGACAAGACAGGTTCATACA | 439 |
rPout-ERBB2-27 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCAAGGACAGGCACAACTAC | 440 |
rPout-ERBB2-28 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCACAGCAGAAAAGCCAATACTT | 441 |
rPout-ERBB2-29 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCGATAAACACCACAGGCTCTA | 442 |
rPout-ERBB2-3 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTCAGGCAGATGCCCAGAAG | 443 |
rPout-ERBB2-30 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCCAAGTCATGCCACCTCA | 444 |
rPout-ERBB2-31 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGTGGACAGGGGACATGA | 445 |
rPout-ERBB2-32 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGAAATAGGAACACTGCCACC | 446 |
rPout-ERBB2-33 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAAAGCCTCCCCCTGGTTAG | 447 |
rPout-ERBB2-34 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGTGGAGTCTGAAACTCAGCC | 448 |
rPout-ERBB2-35 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGGGAGGGGCATGGC | 449 |
rPout-ERBB2-36 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGAGACTCACGGCTCTGAC | 450 |
rPout-ERBB2-37 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTAAATTCGGTCTCAAAAACAAAACGAA | 451 |
rPout-ERBB2-38 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCACACTGACAGGGGATATAGG | 452 |
rPout-ERBB2-39 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATACAAGTCCTTGTTCACGGATAG | 453 |
rPout-ERBB2-4 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGACCAGCACGTTCCGAGC | 454 |
rPout-ERBB2-40 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGGACCGCAGGGGAC | 455 |
rPout-ERBB2-41 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCTAGCACAGCCACAGTC | 456 |
rPout-ERBB2-42 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTTCTCATTTAGTTGTCTTTAAATTGAAATGC | 457 |
rPout-ERBB2-43 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGCAGCCCTTGTCATCCAG | 458 |
rPout-ERBB2-44 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCACCCTGACTCTAACTTGACCC | 459 |
rPout-ERBB2-45 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATGGGTACAGGAATGTACACCT | 460 |
rPout-ERBB2-46 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCTAAAACCTGCCTTGGCTCC | 461 |
rPout-ERBB2-47 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGCAGTCTCCGCATCGT | 462 |
rPout-ERBB2-48 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCACTGTGCCCAGCTTAATTTTGT | 463 |
rPout-ERBB2-49 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCTGGGGTGTCAAGTACTC | 464 |
rPout-ERBB2-5 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATAACTCCACACATCACTCTGGT | 465 |
rPout-ERBB2-50 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGTTCCTCTTCCAACGAGGC | 466 |
rPout-ERBB2-6 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGGCACTCTCGGTGGATC | 467 |
rPout-ERBB2-7 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTAAGGTCAAATCCTAGGGGGTAATA | 468 |
rPout-ERBB2-8 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCGGGGCTCTGGTCATTG | 469 |
rPout-ERBB2-9 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTTCAGCGGGTCTCCATTGT | 470 |
rPout-Mut1 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATT | 471 |
rPout-Mut2 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTG | 472 |
rPout-Mut4 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGAGGGTCTGACGGGTAGAGT | 473 |
rPout-Mut5 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAGCACATGACGGAGGTTG | 474 |
rPout-Mut6 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA | 475 |
rPout-mut10 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGACCCCAGTTGCAAACCAGAC | 476 |
rPout-mut11 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCTGATTCCTCACTGATTGCTCTTAG | 477 |
rPout-mut12 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGGGGGCTCAGCATCCA | 478 |
rPout-mut13 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAAACAGTAGCTTCCCTGGGT | 479 |
rPout-mut14 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGGACTCGGTGGATATGGTC | 480 |
rPout-mut15 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGCGCATGTAGGCGGTG | 481 |
rPout-mut16 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGAGATGTGGTCAATGGAAGAAAC | 482 |
rPout-mut17 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCGTGTTGGCAACATACCATCT | 483 |
rPout-mut18 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTTCTAACAGCTACCCTTCCATCAT | 484 |
rPout-mut19 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGAAAGTTCTGCTGTTTTTAGCAAA | 485 |
rPout-mut20 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCAGTATTTGCAGAATACATTCAAGGT | 486 |
rPout-mut21 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGAAGAGTAACAAGCCAAATGAACAGA | 487 |
rPout-mut22 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTGATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGA | 488 |
rPout-mut23 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAATTCAAAAGCACCTAAAAAGAATAGG | 489 |
rPout-mut24 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAGAAAAAAAGGTAGATCTGAATGCT | 490 |
rPout-mut25 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGATCTGATTCTTCTGAAGATACCG | 491 |
rPout-mut26 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGGATTTATCTGCTCTTCGCGT | 492 |
rPout-mut27 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTATCTACAACTGTTTCATATACTTCATCTTCT | 493 |
rPout-mut28 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGGCCAAAGACGGTACAACT | 494 |
rPout-mut29 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCTTCTTTTTCCAATTCTTGAATTTGACA | 495 |
rPout-mut30 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGCAGTTTCAGGACATCCATTTTATCAA | 496 |
rPout-mut31 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCAAGTTAATATTCCTAACACACTGTTCA | 497 |
rPout-mut32 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAATAAGGCTTCTAGTCTCTTTTGTTGG | 498 |
rPout-mut33 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAAGCACTTATCAAAACTGAAAAATTACAAT | 499 |
rPout-mut34 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGCTTAATAATGTCCTCATTAAGGTCTATC | 500 |
rPout-mut35 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAATGCAAGTTCTTCGTCAGCTA | 501 |
rPout-mut36 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTAAACTATTTCTAACAACGCCTTCTCT | 502 |
rPout-mut37 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCAACATCCCACCTCCCATCTA | 503 |
rPout-mut38 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGAATCATATTTGTGTCTGATGGGCAAT | 504 |
rPout-mut39 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAAACCATGTGAAAATCACAGATTTTGG | 505 |
rPout-mut3new | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAGAGAATCTCCATTTTAGCACTTACC | 506 |
rPout-mut40 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGAATATCATTAAGGAACTTGATATTTTTCAGG | 507 |
rPout-mut41 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAAATTTGAGTTGAAATCATGGTATTGCAT | 508 |
rPout-mut42 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCACAGCACCCAATCAAGCTC | 509 |
rPout-mut43 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGACAACACTCTTCAGCACAATCAA | 510 |
rPout-mut44 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGGCATCACCTCTCTACAGTT | 511 |
rPout-mut45 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTTTGCTGAATGTTAACATTAATGCTTATTT | 512 |
rPout-mut46 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACGGACCTTACGTCAGTGACT | 513 |
rPout-mut47 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGCTACGTGTTAGTGGCTCTTA | 514 |
rPout-mut48 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACGGAGAATAAACTGAGCTCTCTC | 515 |
rPout-mut49 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCAAAAAATGAAGCCGGCGA | 516 |
rPout-mut50 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGCCTACTGGTTCAATTACTTTTAAAAAG | 517 |
rPout-mut51 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATCAGCATTTGACTTTACCTTATCAATG | 518 |
rPout-mut52 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTAGAGTGTCTGTGTAATCAAACAAGTTT | 519 |
rPout-mut53 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGATCCAGTAACACCAATAGGGTTC | 520 |
rPout-mut54 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGTGAAAAGAGTCTCAAACACAAACTAG | 521 |
rPout-mut55 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTTTTCCAGTTTATTGTATTTGCATAGCA | 522 |
rPout-mut56 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTTATACACCGTGCCGAACG | 523 |
rPout-mut57 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCACAGCAAAGCAGAAACTCACA | 524 |
rPout-mut58 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTA | 525 |
rPout-mut59 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCC | 526 |
rPout-mut60 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTC | 527 |
rPout-mut61 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGATGGGCAGATTACAGTGGG | 528 |
rPout-mut62 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGGATACAGGTCAAGTCTAAGTCG | 529 |
rPout-mut63 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAATATTGTTCCTGTATACGCCTTCA | 530 |
rPout-mut64 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTGCAAGCATACAAATAAGAAAACATACTT | 531 |
rPout-mut65 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCATACCTACCTCTGCAATTAAATTTGG | 532 |
rPout-mut66 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCCGATGTAATAAATATGCACATATCA | 533 |
rPout-mut67 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGTTTTCCAATAAATTCTCAGATCCAGG | 534 |
rPout-mut68 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGGATATTTCTCCCAATGAAAGTAAAGTAC | 535 |
rPout-mut69 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGCTATCGATTTCTTGATCACATAGACT | 536 |
rPout-mut7 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGTGGGCGTGAGCGC | 537 |
rPout-mut70 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGACCTTAAAATTTGGAGAAAAGTATCG | 538 |
rPout-mut71 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATCTGGTGTTACAGAAGTTGAACTG | 539 |
rPout-mut72 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGAAGATGGCAAACTTCCCATC | 540 |
rPout-mut73 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCAGACACTTACGGGGACAG | 541 |
rPout-mut74 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGACAGGCCCTGACACAGG | 542 |
rPout-mut75 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTATCTCTAACCCATTGAGGCCG | 543 |
rPout-mut76 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACACTTGACCATCACCATGTAGAC | 544 |
rPout-mut77 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTACAAGCTGTCTCTCTCCCAGT | 545 |
rPout-mut78 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCAGCCCATGGCAAACAC | 546 |
rPout-mut79 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCGCTCACCATGTGTGACTTGAT | SEQ ID NO:547 |
rPout-mut8 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATCTACT | 548 |
rPout-mut9 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCTGACTGTACCACCATCCACT | 549 |
rPout-Ref-1 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGTAACAGTAGGTGTTTCAATATGACTTTT | 550 |
rPout-Ref-10 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCTCCAGGAGCCCACC | 551 |
rPout-Ref-11 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACTGCTACTACATACCAGGTTCTG | 552 |
rPout-Ref-12 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGATCAAGGCACCGCTCTAA | 553 |
rPout-Ref-13 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTCCATCCCGGTGTGCAT | 554 |
rPout-Ref-14 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCAAGGGCTATGGGGGCTT | 555 |
rPout-Ref-15 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGATGTGCCCTGACATCAGAAATA | 556 |
rPout-Ref-16 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCACTTAACCTTCAGTGTTGATCTGA | 557 |
rPout-Ref-17 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGAGTGGGACCATGTTTGG | 558 |
rPout-Ref-18 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCATCGCTCCCATCATTGCT | 559 |
rPout-Ref-19 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTTTCAAACACGTGTGATCAATAGTAC | 560 |
rPout-Ref-2 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATTCTCATATCAGAACTTAAATACATAGCAG | 561 |
rPout-Ref-20 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACAAGTCCATCTTATAGGGGAAGGA | 562 |
rPout-Ref-21 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAAATGCATGAGCATGCGCAA | 563 |
rPout-Ref-22 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCACGATAAAATTCTCTTATCTTGAAGGATT | 564 |
rPout-Ref-23 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGTTCAAAGTGTTTCTGATATTGAAAAATTTTAAGT | SEQ ID NO:565 |
rPout-Ref-24 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTTTTTCATCCTTCGCACATGTATA | 566 |
rPout-Ref-25 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCCTGGAGCAGATGACTCACA | 567 |
rPout-Ref-26 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGCAGGGGGCTTGGT | 568 |
rPout-Ref-27 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCACACCTTTTTTAACAACCGGATCT | 569 |
rPout-Ref-28 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGTGAGGCCCTGTAATCTGTA | 570 |
rPout-Ref-29 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACCTTAATATCAGACTTCCCAGCC | 571 |
rPout-Ref-3 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTTGGGAGCTCTGAGACAGG | 572 |
rPout-Ref-30 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCTGATGGCAAAGCAGAAGACAATA | 573 |
rPout-Ref-31 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGCCCTTTCAGGGAGTCCT | 574 |
rPout-Ref-32 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCTCTTAATCTCAGTTTTCGTTACTGTAAAAT | 575 |
rPout-Ref-33 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCATAGCACCACTCGGTGAACTT | 576 |
rPout-Ref-34 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTAGGAGTGAGAACCCACGTACA | 577 |
rPout-Ref-35 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCAACAGTGTGAATGTACTTAATGACACT | 578 |
rPout-Ref-36 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTCCTGTCCTGTGAGGCAGG | 579 |
rPout-Ref-37 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTGCCCTGCTGGTGTTCTTTTATA | 580 |
rPout-Ref-38 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTCGCTGCTGCTGTTGCT | 581 |
rPout-Ref-39 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGGGTCCTCAGGTCCTTGTG | 582 |
rPout-Ref-4 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTGCGTTGGGAACTTCAACTGG | 583 |
rPout-Ref-40 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTGTAGCCCAGCATGGCAA | 584 |
rPout-Ref-41 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTTTTGCTTTTGAGGGACAGAAAATCA | 585 |
rPout-Ref-42 | GGATATTCCTTTCTACTCTTTGACATCATCTACTTGGCTAATGAGTTGATCTCTCT | 586 |
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I. UMI 설계
차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리 제조 과정에서, PCR 증폭 단계는 정량화 변동을 유의적으로 증가시켜, 원래 분자 수의 작은 변화를 구별하기 어렵게 만들 수 있다. UMI 기술은 PCR 편향성을 줄이고 원래 DNA 분자의 절대 정량화를 달성하는 데 사용할 수 있다. UMI의 개념은 모든 원래 DNA 분자에 상이한 DNA 서열을 "바코드"로서 부여하여, 각 차세대 서열 분석(NGS) 판독물의 출처를 바코드 서열을 기초로 추적할 수 있도록 하는 것이다. 차세대 서열 분석(NGS) 판독물이 충분하면, 차세대 서열 분석(NGS) 출력에서 발견되는 고유한 UMI의 수는 원래 DNA 분자의 수를 반영할 수 있다. 이전에는 UMI 기술이 차세대 서열 분석(NGS) 기반 저주파 돌연변이 검출에서 오류 수정에 주로 사용되었고, 정량화에도 적용되었다. 각각의 원래 분자를 고유하게 표지화하는 것은 다수의 상이한 UMI 서열을 사용하여 달성된다. 예를 들어, 100,000개의 원래 분자에 대해 109개의 상이한 UMI 서열을 사용하면 반복된 UMI를 수반하는 <0.006% 분자를 생성하게 된다.
폴리(N)(즉, 각 위치에서 A, T, C 또는 G의 혼합)과 같은 축퇴 염기를 포함하는 DNA 서열은 종종 UMI 서열로 사용된다. QASeq에서, 폴리(H)(A, T 또는 C)는 시뮬레이션에 의해 지시된 바와 같이(도 2) 폴리(N) 또는 S(C 또는 G) 및 W(A 또는 T) 염기의 혼합에 비해 교차 결합 에너지가 약하기 때문에 UMI로서 사용된다. (H)20은 3.5 × 109개의 서로 상이한 서열을 포함하고, 이는 100,000개의 분자를 입력으로서 사용하기에 충분하며, (H)15는 1.4 × 107개의 상이한 서열을 포함하고 있어 6,000개 분자를 입력으로서 사용하기에 충분하다.
II. PCR 편향성을 줄이기 위한 스페이서
PCR 효율은 서열이 상이한 앰플리콘에 따라 가변된다. UMI는 많은 상이한 서열로 구성되기 때문에, 프라이머 및 가변 UMI 영역 사이의 스페이서를 사용하여 보다 균일한 PCR 효율을 달성할 수 있다.
스페이서가 PCR 편향성에 미치는 영향을 평가하기 위해 차세대 서열 분석(NGS)을 실시하였다(도. 3a). 주형 분자는 증폭을 위해 5’ 및 3' 말단에 2개의 어댑터를 가지며 UMI 영역은 중간에 (D)15로 구성된다. 임의의 스페이서를 포함하지 않거나(세트 1), 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이에 5 nt 스페이서를 포함하거나(세트 2), 또는 정방향 프라이머 및 UMI 사이에 12 nt 스페이서를 포함하고 역방향 프라이머 및 UMI 사이의 11 nt 스페이서를 포함하는(세트 3) 프라이머 3 세트를 사용하여 주형을 개별적으로 증폭시켰다. NGS 분석 전에 PCR을 통해 지수를 추가하였다. (D)15는 1.4 × 107개의 상이한 서열을 포함한다. 입력 주형 분자 번호가 가능한 서열 번호보다 훨씬 낮기 때문에, 각각의 고유한 UMI 서열만이 증폭 전에 1개의 복제를 갖는다. 동일한 UMI를 수반하는 모든 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 아마도 동일한 분자에서 파생된 것이다. 이와 같이, UMI 패밀리 크기(즉, 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수)는 PCR 효율을 나타낸다.
PCR 편향성에 대한 스페이서의 중요성을 평가하기 위해 UMI 패밀리 크기 분포를 비교하였다(도 3b). 프라이머 및 UMI 사이의 스페이서가 길수록 더 균일한 분포가 관찰되었다. 스페이서 길이가 양쪽 말단에서 10 nt보다 긴 프라이머 세트 3에서는, 유의적으로 향상된 분포가 달성되었다.
III. QASeq 워크플로우
QASeq 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리 제조 워크플로우의 개략도가 도 1에 도시되었다. 먼저, DNA 샘플을 모든 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA), DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼와 혼합한다. 모든 표적 유전자좌에 UMI를 추가하기 위해 2회 주기의 긴 연장(약 30분) PCR을 실시한다. 그 후, 한 DNA 분자의 각 가닥은 상이한 UMI를 수반하게 된다. 다음으로, 동일한 원래 분자에 다중 UMI가 첨가되는 것을 방지하면서 분자를 증폭시키기 위해, 어닐링 온도를 약 8ºC 올리고 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 사용하여 적어도 2회 주기(예컨대, 약 7회 주기) 동안 짧은 연장(약 30초)으로 증폭을 실시한다. 반응에 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 추가하는 것은 열순환기의 개방형 튜브 단계이다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용하여 정제한 후, 어댑터 교체를 위해 SrPB 프라이머, DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 버퍼를 PCR 생성물과 혼합하고, 적어도 1회 주기(즉, 2회 주기)의 긴 연장(약 30분) 후에, 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터는 프라이머 이합체 또는 비특이적 생성물이 아닌 올바른 PCR 생성물에만 추가된다. SPRI 자기 비드 또는 컬럼을 사용한 다른 정제 후, 표준 차세대 서열 분석(NGS) 인덱스 PCR이 실시되고. 라이브러리가 정규화되며 일루미나 서열 분석기(illumina sequencer) 상에 로드된다.
모든 유형의 DNA 중합효소 및 PCR 슈퍼믹스를 사용할 수 있다. 사용된 특정 중합효소에 대한 표준 어닐링, 연장 및 변성 온도를(어닐링 온도가 상승하는 범용 PCR 단계를 제외하고) 따라야 한다.
IV. 대체 QASeq 워크플로우
워크플로우는 특이적 정방향 프라이머(SfP) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)를 사용하여 2회 주기의 PCR을 사용하여 UMI를 추가한 다음 인덱스 PCR을 위한 인덱스 프라이머를 직접 추가하여 실시할 수 있다. 이를 시험하기 위해, 20세트의 특이적 정방향 프라이머(SfP) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)가 동일한 반응에 사용되었다. 상기 방법의 실험적 표적 적중률은 매우 낮기 때문에(0.5%), 상기 방법은 진단을 위한 NGS 분석에서 유용하지 않을 수 있다(도 9a). 표적을 벗어난 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 대부분 프라이머 이합체였다. 제2 대체 워크플로우에서, 범용 PCR은 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)를 사용하여 6회 주기의 범용 PCR에 대해 실시되며, 그 다음 정제 단계가 뒤따른다. 상기 추가 단계는 상이한 라이브러리에 대해 표적 적중을 12~28%(평균 표적 적중율 = 20%)로 향상시켰다(도 9b). 제2 대체 워크플로우를 기초로 제3 대체 워크플로우가 시험되었다. 이를 위해, 인덱스 PCR 후에 아가로스 겔을 사용한 크기 선택 단계를 추가하여 프라이머 이합체를 추가로 환원시켰다. 실험적 평균 표적 적중률은 42%로 개선되었지만, 여전히 50%보다 낮다(도 9c). 프라이머 이합체 환원은 범용 PCR 후 어댑터 교체 및 정제를 모두 포함하는 1차 실험 워크플로우를 사용하여 달성되었으며, 결과적으로 66%의 높은 평균 표적 적중율을 나타낸다(도 9d). 상기 언급된 워크플로우에서 프라이머 이합체의 한 출처가 도 9e에 도시되어 있다. 특이적 정방향 프라이머(SfP)의 3' 부분이 특이적 정방향 프라이머 B(SfPB)에 결합하거나, 또는 SfPB의 3' 부분이 SfP에 결합하는 경우, 5' 및 3' 말단 모두에 범용 영역이 있는 이합체 가닥이 생성되어 범용 또는 인덱스 PCR 단계에서 증폭될 수 있다.
기본 워크플로우는 인덱스 서열 및 서열 분석기의 P5/P7 서열을 앰플리콘 말단에 추가하는 최종 인덱스 PCR 단계를 포함하지만, UMI 추가, 범용 PCR 또는 어댑터 교체 단계 중에 상기에서 언급한 서열을 서열을 추가하는 대체 워크플로우가 있으므로 인덱스 PCR 단계가 필요하지 않다. 도 10a~c는 3가지 예를 도시한다. 먼저, 인덱스 및 P5 서열이 범용 정방향 프라이머(UfP)의 5'에 추가되고, 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다. 어댑터 교체로부터 수득한 앰플리콘은 P5, P7 및 이중 인덱스를 포함하므로, 서열 분석할 준비가 되어 있다(도 10a). 둘째, 인덱스 및 P7 서열을 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가하고, 상기 변형된 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)를 어댑터 교체 단계에서 일반 P5 인덱스 프라이머와 혼합한다(도 10b). 셋째, 인덱스 및 P5 서열을 특이적 정방향 프라이머(SfP)의 5'에 추가되고, P5 서열을 수반하는 프라이머는 범용 PCR 단계에서 범용 정방향 프라이머(UfP)로서 사용된다. 다른 인덱스 및 P7 서열은 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 5'에 추가된다(도 10c).
대체 QASeq 프라이머 설계 및 워크플로우는 도 11에 도시되었다. 각 프라이머 세트는 특이적 정방향 프라이머(SfP), 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA) 및 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)의 3가지 상이한 올리고를 포함한다. 특정 정방향 프라이머(SfP)는 5'에서 3' 방향으로 영역 1, 2, 3 및 4를 포함한다. 영역 4는 주형-결합 영역이고, 영역 3은 UMI이고, 영역 1은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터이고, 영역 2는 UMI의 균일한 증폭을 위해 추가된 선택적 스페이서 영역(0~15nt)이다. 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA)는 영역 5를 포함하고, 이는 주형-결합 영역이다. 특이적 역방향 프라이머 B(SrPB)는 5'에서 3’ 방향으로 영역 6, 7 및 8을 포함한다. 영역 8은 주형-결합 영역이고, 이의 3’-말단은 영역 5보다 영역 4에 1 염기만큼 가깝고, 영역 6은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터이며, 영역 7은 상이한 유전자좌의 균일한 증폭을 위해 추가된 선택적 스페이서 영역(0~15nt)이다. 각 QASeq 패널 만이 영역 1을 포함하는 하나의 범용 정방향 프라이머(UfP)를 필요로 하고, 범용 정방향 프라이머(UfP)에서 영역 1의 5'-말단에 추가 염기가 있을 수 있다. 주형-결합 영역 4, 5 및 8의 용융 온도(Tm)는 PCR 어닐링 온도와 대략 동일하고, 범용 정방향 프라이머(UfP)의 Tm은 실험적 PCR 조건에서 영역 4, 5 및 8보다 낮지 않다. 원래 설계에 비해, 특이적 역방향 프라이머 A(SrPA)는 주형-결합 영역만 필요하고 범용 역방향 프라이머(UrP)는 필요하지 않다. 실험 워크플로우에서, 상기 대체 프라이머 설계의 범용 PCR 단계에서 더 많은 PCR 주기(예컨대, 최소 10회 주기)가 필요하다.
V. 데이터 분석 워크플로우
복제수 변이(CNV) 검출을 위한 데이터 분석 워크플로우의 개략도가 도 4a에 도시되었다. 첫째, 원시 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 앰플리콘 영역에 정렬되고, 정렬 전에 선택적 어댑터 트리밍(adapter trimming)을 실시할 수 있다. 정렬되지 않은 판독물은 폐기되고, 정렬된 판독물은 정렬된 유전자좌에 따라 분류된다.
그런 다음, 동일한 유전자좌에 정렬된 모든 판독물은 UMI 서열에 의해 추가로 분할된다. 즉, 동일한 UMI를 수반하는 판독물은 하나의 UMI 패밀리로 분류된다. UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수이고, 고유 UMI 번호는 한 유전자좌에 있는 상이한 UMI 서열의 총 수이다(도 4b). 다음으로, PCR 또는 차세대 서열 분석(NGS) 오류의 결과일 가능성이 있는 모든 고유 UMI 패밀리는 제거된다. 예를 들어, 설계된 UMI 패턴과 일치하지 않는 UMI 서열(예컨대, 폴리(H) UMI 서열에서 발견되는 G 염기)는 오류이므로 제거해야 한다. 또한, 두 UMI 서열이 1~2 염기 만큼만 상이할 경우, UMI 패밀리 크기가 더 작은 서열은 다른 서열에서 돌연변이될 가능성이 있으므로 선택적으로 제거할 수 있다. UMI 오류를 제거한 후, 패밀이 크기가 <F min인 UMI 패밀리가 또한 제거된다. F min은 UMI 패밀리 크기의 분포에 따라 결정되며, 대부분의 경우 F min = 4가 사용될 수 있다. UMI 제거 후 고유 UMI 번호(N)는 다음 단계에 사용된다.
표적 유전자의 추가 복제의 빈도(FEC)는 하기와 같이 계산될 수 있다:
여기서 은 표적 유전자 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 표적 유전자에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 참조 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 하나의 기준에 대하여 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 기준에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 고려할 기준의 수이고, 은 기준의 전체 수 이하이며; 은 실험 보정에 의해 결정된다. 임상 샘플에서 QASeq 패널을 시험하기 전에, 표적 유전자의 복제수 변이(CNV) 상태가 잘 규명된 DNA 샘플에 대해 보정 실험을 실시하였다. 미세방울 디지털 PCR(ddPCR)로 특징지어지는 CNV 상태의 정상 및 암세포주에서 추출한 gDNA를 보정에 사용할 수 있다. 일반 보정 샘플의 추가 복제의 빈도(FEC)는 0이어야 한다. 분석의 LoD도 보정 실험에 의해 결정되고, LoD는 분석에서 검출할 수 있는 추가 복제의 최소 빈도이다. 임상 샘플을 시험할 때, 관심 유전자에 대한 추가 복제의 빈도(FEC)는 복제수 변이(CNV) 상태를 추론하는 데 사용된다. FEC > LoD인 경우, 상기 샘플은 표적 유전자의 증폭을 포함하는 것으로 추론되고, FEC ≤ LoD인 경우, 상기 샘플은 표적 유전자의 결실을 포함하는 것으로 추론된다.
VI. 대립 유전자 비율 정량화
QASeq는 다중 PCR을 사용하여 1~10,000개의 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율을 정량화하는 데 적용할 수 있다. 표적화된 게놈 유전자좌에 대한 다중 PCR 패널 설계 및 표적화된 게놈 유전자좌의 각 가닥을 PCR에 의해 올리고뉴클레오티드 바코드 서열로 표지화한 후 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 영역의 증폭을 실시하기 위한 실험 워크플로우는 복제수 변이(CNV) 검출과 유사하다.
대립 유전자 비율 정량화를 위한 데이터 분석 워크플로우의 개략도가 도 12a에 도시되었다. 첫째, 원시 차세대 서열 분석(NGS) 판독물이 앰플리콘 영역에 정렬되고, 정렬 전에 선택적 어댑터 트리밍(adapter trimming)을 실시할 수 있다. 정렬되지 않은 판독물은 폐기되고, 정렬된 판독물은 정렬된 유전자좌에 따라 분류된다. 각 유전자좌에서, 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 UMI 서열로 나뉘고, 동일한 UMI 서열을 수반하는 모든 NGS 판독물은 하나의 UMI 패밀리로 분류된다. PCR 또는 차세대 서열 분석(NGS) 오류의 결과일 가능성이 있는 UMI 오류가 있는 고유한 UMI 패밀리는 데이터 분석 워크플로우 섹션에 설명된 대로 제거된다.
나머지 UMI 패밀리 각각에 대한 유전적 동일성(야생형 또는 돌연변이)은 다수결에 따라 검출되고, 동일한 UMI 패밀리의 부재들(판독물) 중 최소 70%로 유전적 동일성이 뒷받침되어야 한다. 도 12b의 예로서, UMI 제품군 크기 = 7인 UMI 패밀리의 경우 7개의 모든 판독물이 동일한 UMI 서열(2D 바코드로 표시됨)을 공유한다. 관심 유전자좌의 유전적 동일성은 6개의 판독물의 경우 'A', 1개의 판독물의 경우 'G'이다. UMI 패밀리의 판독물 중 70% 초과가 'A'를 지원하므로, 상기 UMI 패밀리의 유전적 동일성을 'A'라고 한다. 1개의 판독물은 PCR 또는 차세대 서열 분석(NGS) 오류의 결과인 'G'에 해당한다. 하나의 공통된 유전적 동일성을 뒷받침하는 70% 초과의 판독물이 없는 UMI 패밀리는 폐기된다.
다음으로, 고유한 UMI 번호 N(한 유전자좌에서 상이한 UMI 서열의 총 수)은 표적화된 유전자좌에서 각각 상이한 유전적 동일성에 대해 계산되고, N은 원래 가닥의 수를 나타낸다. 표적 유전자좌에 대한 대립 유전자 비율은 R 대립유전자 = N 1 /N 2으로 정의되고, 여기서 N 1은 제1 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이며, N 2는 제2 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이다.
VII. 정의
본원에 사용된 "증폭"은 뉴클레오티드 서열 또는 서열들의 복제 수를 증가시키기 위한 임의의 시험관내 과정을 지칭한다. 핵산 증폭은 뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA로 통합하는 결과를 가져온다. 본원에 사용된 바와 같이, 하나의 증폭 반응은 여러 차례의 DNA 복제로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 PCR 반응은 변성 및 복제의 30~100회의 "주기"로 구성될 수 있다.
"중합 효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 DNA의 상보적 가닥의 동시 프라이머 연장에 의한 특정 DNA 서열의 시험관내 증폭을 위한 반응을 의미한다. 다시 말해서, PCR은 프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 표적 핵산의 다중 복제 또는 복제물을 만드는 반응이며, 상기 반응은 하기의 단계의 하나 이상의 반복을 포함한다: (i) 표적 핵산을 변성시키고, (ii) 프라이머 결합 부위에 프라이머를 어닐링하고, (iii) 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 핵산 중합효소에 의해 프라이머를 연장하는 단계. 일반적으로, 상기 반응은 열 순환기 기기의 각 단계에 최적화된 상이한 온도들을 통해 순환된다. 특정 온도, 각 단계에서의 지속 시간, 및 단계 간의 변화율은 당업자에게 일반적으로 공지된 많은 요인에 따라, 예컨대 참고문헌에 예시된 바와 같이 달라진다: McPherson et al., editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 and 1995, 각각).
"프라이머"는 폴리뉴클레오티드 주형으로 이중체를 형성할 때 핵산 합성의 개시점으로 작용할 수 있고 상기 주형을 따라 3' 말단으로부터 연장되어 연장된 이중체가 형성될 수 있는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 연장 과정에서 추가되는 뉴클레오티의 서열은 주형 폴리뉴클레오티드의 서열에 의해 결정된다. 일반적으로 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장된다. 프라이머는 일반적으로 프라이머 연장 생성물의 합성에 사용하기에 적합한 길이를 가지며, 일반적으로 길이가 8 내지 100개의 뉴클레오티드 범위, 예컨대 10 내지 75, 15 내지 60, 15 내지 40, 18 내지 30, 20 내지 40, 21 내지 50, 22 내지 45, 25 내지 40 등, 보다 전형적으로 18 내지 40, 20 내지 35, 21 내지 30개의 뉴클레오티드 범위의 길이, 및 명시된 범위 사이의 임의의 길이를 갖는다. 전형적인 프라이머는 10~50개의 뉴클레오티드 범위의 길이, 예컨대 15~45, 18~40, 20~30, 21~25개 등의 뉴클레오티드 범위의 길이, 및 명시된 범위 사이의 임의의 길이를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 프라이머는 일반적으로 약 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본원에서 사용된 "통합하는"은 핵산 중합체의 일부가 되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "외인성 조작의 부재 하에"는 핵산 분자가 변형되는 용액을 변경하지 않고 핵산 분자가 변형되는 것을 지칭한다. 특정 구현예들에서, 이는 사람이 손대지 않는 경우 또는 완충 조건이라고도 하는 용액 조건을 변경하는 기계 장치가 없는 경우에 발생한다. 하지만, 변형 중에 온도 변화가 발생할 수 있다.
"뉴클레오시드"는 염기-당 조합, 즉 인산염이 없는 뉴클레오티드이다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드라는 용어의 사용에 있어 특정한 상호 변경 가능성이 있다는 것이 당업계에서 인식되고 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 데옥시우리딘 삼인산, dUTP는 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산이다. DNA에 결합된 후, 공식적으로 데옥시우리딜산, 즉 dUMP 또는 옥시우리딘 일인산인 DNA 단량체 역할을 한다. 결과로서 생성된 DNA에 dUTP 모이어티가 없더라도 dUTP를 DNA에 통합한다고 말할 수 있다. 유사하게, 단지 기질 분자의 일부일지라도 데옥시우리딘을 DNA에 통합한다고 말할 수 있다.
본원에서 사용된 "뉴클레오티드"는 염기-당-인산의 조합을 나타내는 기술 용어이다. 뉴클레오티드는 핵산 중합체, 즉 DNA 및 RNA의 단량체 단위이다. 상기 용어는 리보뉴클레오티드 삼인산, 예컨대 rATP, rCTP, rGTP 또는 rUTP, 및 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산, 예컨대 dATP, dCTP, dUTP, dGTP 또는 dTTP를 포함한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로 적어도 하나의 핵염기, 예컨대, 예를 들어 DNA(예컨대, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 및 시토신 "C") 또는 RNA(예컨대, A, G, 우라실 "U" 및 C)에서 발견되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 DNA, RNA, DNA-RNA 키메라 또는 이의 유도체 또는 유사체의 적어도 한 분자 또는 가닥을 지칭하게 된다. 용어 "핵산"은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 수반한다. 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 두 가지 기술 용어를 집합적으로 및 상호교환 가능하게 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 별개의 기술 용어이지만, 두 용어 사이에 정확한 구분선이 없으며 본원에서 상호교환가능하게 사용된다는 점에 유의한다. 용어 "어댑터"는 또한 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "어댑터"는 선형 어댑터(단일 가닥 또는 이중 가닥) 또는 스템-루프(stem-loop) 어댑터를 나타낼 수 있다. 상기 정의들은 일반적으로 적어도 하나의 단일 가닥 분자를 지칭하지만, 특정 구현예들에서는 또한 적어도 하나의 단일 가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 적어도 하나의 추가 가닥을 수반할 것이다. 따라서, 핵산은 분자의 가닥을 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보적 가닥(들) 또는 "보체(들)"를 포함하는 하나 이상의 이중 가닥 분자 또는 하나 이상의 삼중 가닥 분자를 수반할 수 있다. 본원에서 사용된 단일 가닥 핵산은 접두사 "ss"로, 이중 가닥 핵산은 접두사 "ds"로, 삼중 가닥 핵산은 접두사 "ts"로 표시할 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "핵산 표적 분자"는 표준 정규 염기, 초변형 염기, 비천연 염기, 또는 이의 염기의 임의의 조합을 포함하는 임의의 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어 제한 없이, 상기 핵산 분자는 4개의 정규 DNA 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민) 및/또는 4개의 정규 RNA 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)를 포함한다. 뉴클레오시드가 2'-데옥시리보스 기를 함유할 때 우라실은 티민으로 대체될 수 있다. 상기 핵산 분자는 RNA에서 DNA로, DNA에서 RNA로 변형될 수 있다. 예를 들어 제한 없이, mRNA는 역전사효소를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)로 생성될 수 있고, DNA는 RNA 중합효소를 사용하여 RNA로 생성될 수 있다. 핵산 분자는 생물학적 또는 합성 기원일 수 있다. 핵산 분자의 예는 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 증폭된 DNA, 기존 핵산 라이브러리 등을 포함한다. 핵산은 인간 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 뺨 찰과상, 생검, 정액, 소변, 대변, 타액, 땀 등으로부터 수득될 수 있다. 핵산 분자는 다양한 처리, 예컨대 복구 처리 및 단편화 처리를 실시할 수 있다. 단편화 처리는 기계적, 음파 및 유체역학적 전단을 포함한다. 복구 처리는 연장 및/또는 결찰을 통한 흠집 복구, 무딘 말단을 생성하기 위한 연마, 손상된 염기의 제거, 예컨대 탈아미노화, 유도체화, 염기성 또는 가교 뉴클레오티드 등을 포함한다. 관심 핵산 분자는 화학적 변형(예컨대,중아황산염 전환, 메틸화/탈메틸화), 연장, 증폭(예컨대, PCR, 등온 등) 등이 실시될 수 있다.
"상보적" 또는 "보체(들)"인 핵산(들)은 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 결합 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 형성할 수 있는 것들이다. 본원에서 사용된 용어 "상보적" 또는 "보체(들)"은 상기 기재된 동일한 뉴클레오티드 비교에 의해 평가될 수 있는 바와 같이 실질적으로 상보적인 핵산(들)을 지칭할 수 있다. "실질적으로 상보적인"이라는 용어는 연속적인 핵염기의 적어도 하나의 서열을 포함하는 핵산을 지칭하거나, 또는 하나 이상의 핵염기 모이어티가 분자에 존재하지 않는 경우, 모두보다 적은 핵염기가 대응하는 핵염기와 염기쌍을 이루지 않더라도 반연속적인 핵염기는 적어도 하나의 핵산 가닥 또는 이중체에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예들에서, "실질적으로 상보적인" 핵산은 핵염기 서열의 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89 %, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 그 안에서 임의의 범위가 혼성화 중에 적어도 하나의 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자와 염기쌍을 형성할 수 있다. 특정 구현예들에서, 용어 "실질적으로 상보적인"은 엄격한 조건에서 하나 이상의 핵산 가닥 또는 이중체에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 핵산을 지칭한다. 특정 구현예들에서, "부분적으로 상보적인" 핵산은 덜 엄격한 조건에서 적어도 하나의 단일 또는 이중 가닥 핵산에 혼성화될 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 또는 핵염기 서열의 약 70%가 혼성화 중에 하나 이상의 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자와 염기쌍을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
"비상보적"이라는 용어는 특정 수소 결합을 통해 하나 이상의 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 능력이 부족한 핵산 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "축퇴"는 정의된 서열과는 대조적으로, 동일성이 다양한 선택의 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있는 뉴클레오티드 또는 일련의 뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 구현예들에서, 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드로부터 선택이 이루어질 수 있다. 추가적인 특정 구현예들에서, 하나의 특정 위치에서 뉴클레오티드의 선택은 퓨린에서만, 피리미딘에서만, 또는 쌍을 이루지 않는 퓨린 및 피리미딘으로부터의 선택을 포함한다.
"샘플"은 관심 핵산을 포함하는 신선하거나 보존된 생물학적 샘플 또는 합성 생성 출처로부터 수득하거나 분리된 물질을 의미한다. 샘플은 적어도 하나의 세포, 태아 세포, 세포 배양물, 조직 표본, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비물, 땀, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비물, 복막액, 복수액, 대변 물질, 신체 삼출물, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 다세포 배아, 용해물, 추출물, 용액 또는 관심 면역 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 샘플은 또한 비인간 출처, 예컨대 비인간 영장류, 설치류 및 기타 포유동물, 기타 동물, 식물, 진균, 박테리아 및 바이러스를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에서 사용된 "실질적으로 공지된"은 증폭을 포함하여 핵산 분자의 제조를 허용하기에 충분한 서열 정보를 갖는 것을 지칭한다. 이는 일부 구현예들에서 어댑터 서열의 일부가 무작위적이거나 퇴화되지만 일반적으로 약 100%일 것이다. 따라서, 특정 구현예들에서, 실질적으로 공지된 것은 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 97% 내지 약 100%, 약 98% 내지 약 100%, 또는 약 99% 내지 약 100%를 지칭한다.
VIII.
표적 핵산의 추가 처리
A. DNA 증폭
주어진 주형 샘플에 존재하는 핵산을 증폭하기 위해 많은 주형-의존적 과정이 입수 가능하다. 가장 일반적으로 공지된 증폭 방법 중 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCRTM이라고 함)으로, 미국 특허 제 4,683,195호, 4,683,202호, 4,800,159호 및 Innis et al., 1990에 자세히 설명되어 있으며, 각각은 전체가 본원에 원용된다. 간단히 말해서, 증폭될 주형 DNA의 두 영역(각 가닥에 대해 하나씩)에 상보적인 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 과량의 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 및 열안정성 중합효소, 예컨대, 예를 들어 Taq(Thermus Aquaticus) DNA 중합효소의 존재 하에 주형 DNA(순수할 필요 없음)에 추가된다. 일련의 온도 주기(일반적으로 30~35)에서, 표적 DNA는 반복적으로 변성되고(약 90°C), 프라이머(일반적으로 50~60°C) 및 프라이머(72°C)로부터 연장된 딸 가닥에 어닐링된다. 상기 딸 가닥이 생성되면, 후속 주기에서 주형 역할을 한다. 따라서, 두 프라이머 사이의 주형 영역은 선형이 아닌 지수적으로 증폭된다.
B. DNA 서열 분석
어댑터 연결 단편 라이브러리의 서열 분석을 위해 방법들이 또한 제공된다. 당업자에게 공지된 핵산을 서열 분석하기 위한 임의의 기술이 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. DNA 서열 분석 기술은 표지된 종결자 또는 프라이머를 사용한 고전적인 디데옥시 서열 분석 반응(생어(Sanger) 방법) 및 슬래브 또는 모세관에서의 겔 분리, 가역적으로 종결된 표지된 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 서열 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 454 서열 분석, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 라이브러리에 대한 대립 유전자 특이적 혼성화, 결찰이 뒤따르는 표지된 클론 라이브러리에 대한 대립 유전자 특이적 혼성화를 사용한 합성에 의한 서열 분석, 중합 단계 중에 표지된 뉴클레오티드 통합의 실시간 모니터링, 및 SOLiD 서열 분석을 포함한다.
핵산 라이브러리는 일루미나 서열 분석, 예컨대 넥스테라(Nextera)™ DNA 샘플 제조 키트와 호환되는 접근 방식으로 생성될 수 있고, 일루미나 차세대 서열 분석 라이브러리 제제를 생성하기 위한 추가적인 접근 방식은, 예컨대 Oyola et al. (2012)에 설명된다. 다른 구현예들에서, 핵산 라이브러리는 SOLiDTM 또는 이온 토렌트(Ion Torrent) 서열 분석 방법(예컨대, 솔리드(SOLiD)® 단편 라이브러리 구축 키트, 솔리드® 메이트-페어드(Mate-Paired) 라이브러리 구축 키트, 솔리드® ChIP-Seq 키트, 솔리드® 토탈 RNA-Seq 키트, 솔리드® SAGE™ 키트, 암비온(Ambion)® RNA-Seq 라이브러리 구축 키트 등)과 호환되는 방법으로 생성된다. 본 발명의 구현예들과 함께 사용될 수 있는 다양한 라이브러리 구축 방법을 포함한 차세대 서열 분석 방법을 위한 추가적인 방법이, 예컨대 Pareek(2011) 및 Thudi(2012)에 설명되었다.
특정 양태들에서, 본 개시의 방법에 사용되는 서열 분석 기술은 HiSeq™ 시스템(예컨대, HiSeq™ 2000 및 HiSeq™ 1000), NextSeq™ 500, 및 일루미나 사(Illumina, Inc.)의 MiSeq™ 시스템을 포함한다. 상기 HiSeq™ 시스템은 무작위로 단편화된 게놈 DNA를 평면의 광학적으로 투명한 표면에 부착하고 고체상 증폭을 사용하여 수백만 개의 단편에 대한 대규모 병렬 서열 분석을 기초로 하여 각각 평방 cm 당 약 1,000개의 주형 복제를 포함하는 수백만 개의 클러스터로 고밀도 서열 분석 흐름 세포를 생성한다. 상기 주형은 합성에 의한 4색 DNA 서열 분석 기술을 사용하여 서열 분석된다. 상기 MiSeq™ 시스템은 일루미나의 가역적 종결자 기반의 합성에 의한 서열 분석인 TruSeq™를 사용한다.
본 개시의 방법에 사용될 수 있는 DNA 서열 분석 기술의 다른 예는 454 서열 분석(로슈(Roche))(Margulies et al., 2005)이다. 454 서열 분석은 두 단계를 포함한다. 제1 단계에서, DNA는 약 300~800개의 염기쌍의 단편으로 절단되고, 상기 단편은 무딘 말단이다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 단편의 말단에 결찰된다. 상기 어댑터는 상기 단편의 증폭 및 서열 분석을 위한 프라이머 역할을 한다. 상기 단편은, 예컨대 5'-비오틴 태그를 포함하는 어댑터 B를 사용하여 DNA 포획 비드, 예컨대 스트렙타비딘 코팅된 비드에 부착될 수 있다. 상기 비드에 부착된 단편은 오일-물 유제의 액적 내에서 PCR 증폭된다. 결과로서 각 비드 상에 클론 증폭된 DNA 단편의 다수의 복제가 생성된다. 제2 단계에서, 상기 비드는 웰(피코-리터 크기)에 포획된다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing)은 각 DNA 단편 상에 병렬로 실시된다. 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가하면 서열 분석 기기의 CCD 카메라에 의해 기록되는 광 신호가 생성된다. 신호 강도는 통합된 뉴클레오티드의 수에 비례한다.
본 개시의 방법에 사용될 수 있는 DNA 서열 분석 기술의 다른 예는 솔리드(SOLiD) 기술(라이프 테크놀로지스 사(Life Technologies, Inc.))이다. 솔리드 서열 분석에서, 게놈 DNA는 단편으로 절단되고, 어댑터는 단편의 5' 및 3' 말단에 부착되어 단편 라이브러리를 생성한다. 대안적으로, 내부 어댑터는 단편의 5' 및 3' 말단에 어댑터를 결찰하고, 단편을 원형화하고, 원형화된 단편을 분해하여 내부 어댑터를 생성하고, 결과로서 생성된 단편의 5' 및 3' 말단에 어댑터를 부착함으로써 짝으로 쌍을 이루는 라이브러리를 생성함으로써 도입될 수 있다. 다음으로, 클론 비드 군은 비드, 프라이머, 주형 및 PCR 구성 요소를 포함하는 마이크로반응기에서 제조된다. PCR 후, 상기 주형이 변성되고 비드가 농축되어 연장된 주형으로 상기 비드를 분리한다. 선택한 비드의 주형은 유리 슬라이드에 결합할 수 있도록 3' 변형이 실시된다.
본 개시의 방법에 사용될 수 있는 DNA 서열 분석 기술의 다른 예는 이온 토렌트 시스템(라이프 테크놀로지스 사)이다. 이온 토렌트는 고밀도 배열의 미세 가공 웰을 사용하여 상기 생화학 공정을 대규모 병렬 방식으로 실시한다. 각 웰은 상이한 DNA 주형을 유지한다. 상기 웰 아래에는 이온 민감성 층이 있고 상기 아래에는 독점적인 이온 센서가 있다. 예를 들어, C와 같은 뉴클레오티드가 DNA 주형에 추가된 다음, DNA 가닥에 통합되면 수소 이온이 방출된다. 상기 이온의 전하는 독점 이온 센서로 검출할 수 있는 용액의 pH를 변경한다. 서열 분석기는 화학 정보로부터 디지털 정보로 직접 이동하여 염기를 호출한다. 그런 다음, 이온 PGM™(Ion Personal Genome Machine) 서열 분석기는 칩에 차례로 하나의 뉴클레오티드를 플러딩(flooding)한다. 상기 칩을 플러딩하는 다음 뉴클레오티드가 일치하지 않으면, 전압 변화가 기록되지 않고 염기가 호출되지 않는다. DNA 가닥 상에 2개의 동일한 염기가 있으면, 상기 전압이 두 배가 되고 상기 칩은 호출된 2개의 동일한 염기를 기록한다. 스캐닝, 카메라, 조명 없이 직접 검출하기 때문에, 각 뉴클레오티드 통합이 몇 초 만에 기록된다.
본 개시의 방법에 사용될 수 있는 서열 분석 기술의 다른 예는 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences)의 단일 분자, 실시간(single molecule, real-time, SMRT™) 기술을 포함한다. SMRT™에서, 4개의 DNA 염기 각각은 4개의 상이한 형광 염료 중 하나에 부착된다. 상기 염료는 인산 결합되어 있다. 단일 DNA 중합효소는 제로 모드 도파관(ZMW)의 바닥에 있는 주형 단일 가닥 DNA의 단일 분자로 고정된다. 제로 모드 도파관(ZMW)은 ZMW 안팎으로 빠르게 확산되는(마이크로초 단위) 형광 뉴클레오티드를 배경으로 DNA 중합효소에 의한 단일 뉴클레오티드의 통합을 관찰할 수 있는 구속 구조이다. 뉴클레오티드를 성장하는 가닥에 통합하는 데 몇 밀리초가 걸린다. 상기 시간 동안, 형광 표지는 여기되어 형광 신호를 생성하고, 형광 태그는 절단된다. 염료의 해당 형광 검출은 어떤 염기가 포함되었는지 나타낸다. 상기 프로세스가 반복된다.
추가 서열 분석 플랫폼은 CGA 플랫폼(컴플리트 제노믹스(Complete Genomics))를 포함한다. 상기 CGA 기술은 원형 DNA 라이브러리의 제조 및 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA)을 기초로 하여 고체 지지체 상에 배열된 DNA 나노볼을 생성한다(Drmanac et al. 2009). 컴플리트 제노믹스의 CGA 플랫폼은 서열 분석을 위해 cPAL(조합의 프로브 앵커 결찰)이라는 신규 전략을 사용한다. 상기 과정은 앵커 분자 및 고유한 어댑터 중 하나 간의 혼성화로 시작된다. 4개의 축퇴 9-mer 올리고뉴클레오티드는 상기 프로브의 제1 위치에 있는 특정 뉴클레오티드(A, C, G 또는 T)에 해당하는 특정 형광단으로 표지된다. 서열 결정은 정확한 매칭 프로브가 주형에 혼성화되고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기 앵커에 결찰되는 반응에서 발생한다. 결찰된 생성물의 영상화 후, 결찰된 앵커-프로브 분자가 변성된다. n + 1, n + 2, n + 3 및 n + 4 위치에 공지된 염기를 포함하는 형광 표지된 9-mer 프로브의 새로운 세트를 사용하여 혼성화, 결찰, 영상화 및 변성 과정을 5회 반복한다.
IX. 키트
본원의 기술은 DNA 샘플의 복제 수 변이 또는 대립 유전자 빈도를 분석하기 위한 키트를 포함한다. "키트"는 물리적 요소의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 키트는, 예를 들어 하나 이상의 구성요소, 예컨대 핵산 프라이머, 효소, 반응 완충액, 지침 시트, 및 본원에 기재된 기술을 실시하는 데 유용한 기타 요소들을 포함할 수 있다. 상기 물리적 요소는 본 발명을 실시하기에 적합한 임의의 방식으로 배열될 수 있다.
상기 키트의 구성요소는 수성 매체 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 상기 키트의 용기 수단은 일반적으로 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 것이며, 그 안에 성분이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있다(예컨대, 미세역가 플레이트의 웰에 분취됨). 상기 키트에 하나를 초과하는 구성 요소가 있는 경우, 상기 키트는 일반적으로 추가 구성요소가 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 기타 추가 용기를 포함할 것이다. 하지만, 성분들의 다양한 조합이 단일 바이알에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 핵산을 포함하기 위한 수단, 및 상업적 판매를 위해 밀폐된 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 상기 용기는 원하는 바이알이 유지되는 사출 또는 블로우 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트 구성요소를 사용하는 지침뿐만 아니라 상기 키트에 포함되지 않은 다른 시약의 사용에 대한 지침도 포함한다. 지침에는 구현할 수 있는 변형이 포함될 수 있다.
X. 실시예
하기의 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 포함된다. 하기의 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 본 발명자에 의해 잘 기능하는 것으로 확인된 기술을 나타내며, 따라서 본 발명의 실시의 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
예 1 - 보정 결과
ERBB2 QASeq 패널의 예시적인 보정 실험은 ERBB2 증폭을 포함하지 않아야 하는 정상 세포주 gDNA 샘플 NA18562에서 실시되어 정량 가변성 및 잠재적 LoD를 분석하였다. 워크플로우는 "QASeq 워크플로우" 섹션에서 설명된 바와 같다. Taq 중합효소는 모든 PCR 단계에서 사용되었다. 변성은 95ºC에서 실시되고, 어닐링/연장은 60ºC에서 실시되었다(범용 PCR 단계를 제외하고는 어닐링/연장은 68ºC에서 실시되었다). UMI가 부착된 모든 원래 분자는 차세대 서열 분석(NGS) 출력에 존재해야 하기 때문에, 각 분자/UMI에 대해 15개의 판독물이 확보되었다. 2500개의 반수체 게놈 복제 및 20개의 앰플리콘 패널을 입력하는 경우, 필요한 총 판독물은 약 2 × 2500 × 20 × 15 = 1,500,000이다. 한 DNA 이중체의 각 가닥은 상기 워크플로우에서 상이한 UMI를 수반하므로, 2500개의 반수체 게놈 복제 = 5000개의 분자 수 = 8.3 ng gDNA이다. 상기 실험은 일루미나 MiSeq 기기에서 실시되었다.
차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 앰플리콘 서열에 정렬하기 위해 정확한 문자열 일치가 사용되었고, 정렬 비율은 상이한 라이브러리에 대해 50%에서 70% 사이였다. 다음으로, UMI 패밀리 크기 및 고유한 UMI 번호를 분석하였다. UMI 패밀리 크기의 분포는 대부분의 유전자좌에 대해 20에서 정점에 달하였다(도 5). 명백한 PCR 오류를 포함하는 UMI 패밀리(즉, 폴리(H) UMI 서열에서 발견되는 G 염기) 및 패밀리 크기가 <4인 UMI는 제거되었다(도 5). UMI 부착률이 완벽하다면, 고유한 UMI 수는 샘플의 원래 분자 수와 같아야 한다. 2500개의 반수체 게놈 복제(5000개 분자)의 입력에 대해, 유전자좌에 따라 632개에서 3065개 사이의 고유한 UMI 수가 수득되었다(도 6).
상기 분석의 LoD를 추정하기 위해, 라이브러리는 4가지 상이한 DNA 입력에 대해 제조되었다: 75, 250, 750 및 2500개의 반수체 게놈 복제; 각 조건은 5번 반복되었다. 상기 샘플의 복제수 변이(CNV) 비율은 "데이터 분석 워크플로우" 섹션에 설명된 대로 계산되었다. 5회 반복에 대한 복제수 변이(CNV) 비율(σCNV비율)의 표준 편차를 사용하여 정량 가변성을 평가하였고, 상기 분석의 LoD는 3σCNV비율로 추정할 수 있다. 이론적인 σCNV비율을 계산하기 위해 시뮬레이션도 실시하였고, 입력 분자 수가 증가하면 σCNV비율 및 LoD가 감소해야 함을 유념한다. 상기 σCNV비율는 이론값보다 높았고(도 7), UMI 부착 편향성 및 증폭 편향성을 제거할 수 없기 때문에 예상한 바와 같았다. 현재 최고의 σCNV비율은 2500개의 반수체 게놈 복제 입력에서 1%이고, 보수적으로 4개의 데이터 포인트 모두를 기초로 하는 선형 근사치가 사용되었고, σCNV비율 = 2%가 수득되어, 예상 LoD는 추가 복제의 약 6%였다. 50,000개의 반수체 게놈 복제 입력에 대한 외삽에 기초하여 잠재적 σCNV비율은 0.3%이고 LoD는 약 1%였다. LoD를 평가하는 또 다른 방법은 추가 복제의 상이한 빈도를 포함하는 일련의 보정 샘플을 시험하는 것이고, 추가 복제의 검출 가능한 가장 낮은 빈도는 LoD이다.
실시예 2 - FFPE 샘플에서 복제수 변이(CNV) 검출 결과
2개의 FFPE 슬라이드는 "다중 PCR 패널 설계" 섹션 및 실시예 1에 설명된 예시 ERBB2 패널을 사용하여 분석하였다. 상기 FFPE 슬라이드(애스터랜드(Asterand)에서 구매)는 ERBB2 복제수 변이(CNV)를 포함하지 않을 것으로 예상되는 동일한 폐암 종양에서 유래하였다. 먼저, QIAamp DNA FFPE 조직 키트(키아겐(Qiagen))를 사용하여 DNA를 추출하고 샘플당 >6 μg의 DNA를 수득하였다. 라이브러리는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 8.3 ng의 추출된 DNA가 각 라이브러리에 사용되었으며, 이는 2500개의 반수체 게놈 복제 및 5000개 분자의 입력에 해당한다. 각 라이브러리에 대해 확보된 차세대 서열 분석(NGS) 판독물 수(1,500,000개 판독물)는 2500개의 반수체 게놈 복제 입력 세포주 gDNA 라이브러리와 동일하였다.
데이터 분석은 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 실시하였다. 세포주 gDNA 라이브러리에 대한 유사한 패턴의 UMI 패밀리 크기 분포가 수득되었다(도 8a). 고유한 UMI 수는 2500개의 반수체 게놈 복제가 입력된 세포주 gDNA 라이브러리보다 작았다. FFPE 샘플의 UMI 부착 수율은 평균적으로 세포주 gDNA의 약 1/4로, 이는 세포주 gDNA 샘플과 동일한 LoD를 달성하기 위해 300% 초과의 FFPE DNA를 로드해야 함을 나타낸다(도 8b).
계산된 FFPE 샘플의 복제수 변이(CNV) 비율을 도 8c에 나타내었다 상기 분석의 추정된 LoD = 15%는 FFPE 라이브러리와 유사한 고유 UMI 수를 갖는 750개의 반수체 게놈 복제 입력 세포주 gDNA에 대한 보정 결과를 기초로 하였다. 현재의 결과에 따르면, 상기 FFPE 슬라이드에서는 ERBB2의 복제수 변이(CNV)가 검출되지 않았다. 입력 분자 수가 증가함에 따라 LoD가 감소하기 때문에, 2500개의 반수체 게놈 복제 입력 세포주 gDNA에 대한 보정 결과를 기초로 6%의 LoD를 달성할 수 있다.
실시예 3 - 급증하는 임상 FFPE 샘플의 복제수 변이(CNV) 정량화 결과
100-플렉스 QASeq 패널을 사용하여 유방암 FFPE 샘플에서 ERBB2의 배수성을 정량화하였다. 50-플렉스는 ERBB2 유전자 영역에 있었고(프라이머 서열은 표 3을 참조, 프라이머 이름에는 "ERBB2"가 있음), 50-플렉스는 참조로서 염색체 17의 단완(short arm)에 있었다(프라이머 서열은 표 3을 참조; 프라이머 이름에는 "Ref"가 있음).
이전에 특성화된 2개의 FFPE DNA 샘플(1개의 "정상" 샘플 및 1개의 "ERBB2 증폭된 비정상" 샘플)을 혼합하여 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플을 생성하였다. "정상" 샘플 DNA는 ERBB2 증폭(FEC = 0%)이 없어야 하는 FFPE 폐암 샘플(애스터랜드에서 구매)에서 추출하였고, “ERBB2 증폭 비정상" 샘플 DNA는 78%의 ERBB2 FEC를 갖는 FFPE 유방암 샘플(오리젠(OriGene)에서 구입)에서 추출하였다. 샘플 입력은 라이브러리당 8.3 ng DNA였다(qPCR에 의해 정량화됨). "정상" 샘플은 각각 8.3 ng DNA 입력을 갖는 개별적으로 제조된 5개의 복제된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리로 시험하였다. 실험적으로 정규화된 추가 복제의 빈도(FEC) 값을 도 13에 나타내었다. 정규화된 추가 복제의 빈도(FEC)는 하기와 같이 계산되었다:
정규화된 FEC샘플 = (1+FEC샘플)/(1+FEC정상샘플) - 1
상기 FEC정상샘플은 5회 복제의 평균이었다. 복제수 변이(CNV) 패널의 LoD는 하기와 같이 추정되었다:
FECLoD = 3 × σ정상샘플 /(1+FEC정상샘플) = 0.85%
여기에서, 상기 σ정상샘플은 5회 복제의 표준 편차였다. 2.5%, 5% 및 10% ERBB2 FEC 샘플에서 복제수 변이(CNV)는 이의 계산된 추가 복제의 빈도(FEC)는 3 표준 편차 범위를 벗어났기 때문에 성공적으로 검출되었다(도 13을 참조). ERBB2의 실험적으로 정규화된 추가 복제의 빈도(FEC)는 예상 값과 높은 상관관계에 있다.
실시예 4 - 돌연변이 및 복제수 변이(CNV) 정량화를 위한 종합 패널
제시된 방법(QASeq)은 복제수 변이(CNV) 정량화뿐만 아니라 차세대 서열 분석(NGS) 오류 수정 및 돌연변이 정량화에도 사용할 수 있다. 각 QASeq 앰플리콘에서, fP의 3' 및 rPin의 3' 사이 영역은 돌연변이 검출 영역(Mutation Detection Region, MDR)이고, 상기 MDR의 임의의 작은 변형(염기 치환, 결실 및 500bp 미만의 삽입 포함)은 0.1%~0.3%의 LoD로 검출할 수 있다. 이는 LoD 1%인 돌연변이 검출을 위한 표준 비-UMI NGS 방법보다 훨씬 우수하다.
179-플렉스 종합 패널이 개발되어 유방암 샘플에서 돌연변이 및 복제수 변이(CNV) 정량화 모두에 대해 시험하였다. 모든 플렉스는 이전 섹션에서 설명한 fP(일명 SfP), rPin(일명 SrPB) 및 rPout(일명 SrPA)의 3가지 프라이머를 포함한다. 95개의 프라이머 세트는 유전자 ERBB2에서 45개, 염색체 17의 단완에서 50개를 참조로서 포함하여 복제수 변이(CNV) 정량화에만 사용하였다. 상기 ERBB2 유전자의 5개 프라이머 세트를 복제수 변이(CNV) 및 돌연변이 정량화 모두에 사용하였다. 다른 79개의 프라이머 세트는 돌연변이 정량화에만 사용하였다. 범용 정방향 프라이머(UfP) 및 범용 역방향 프라이머(UrP)는 범용 증폭에 사용되었다(서열은 표 3을 참조).
복제수 변이(CNV) 정량화는 이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 방식으로 실시하였고, 돌연변이 정량화를 위한 데이터 처리 워크플로우는 도 14에 요약하였다. 선택적 어댑터 트리밍 후, 차세대 서열 분석(NGS) 판독물은 앰플리콘 서열에 정렬하였다. 각 유전자좌에서, 판독물은 UMI 패밀리로 나뉘었고, UMI 서열에 오류가 있는 UMI 패밀리가 제거되었으며, UMI 패밀리 크기가 작은(≤3) UMI 패밀리도 제거되었다. 다음으로, 각 UMI 패밀리의 공통 MDR 서열을 찾았는데, 이는 일반적으로 UMI 패밀리에서 가장 많이 나타나는 MDR 서열이다. 마지막 단계는 공통 서열을 야생형 MDR 서열과 비교하고, 새로운 돌연변이 호출을 실시하는 것이었다. 한 돌연변이의 VAF는 하기와 같이 계산할 수 있다: VAF = 돌연변이가 있는 UMI 패밀리의 수/UMI 패밀리의 총 수.
상기 179-플렉스 패널은 호라이즌 디스커버리의 멀티플레스 I cfDNA 참조 표준 세트에서 시험하였다. 야생형 cfDNA 참조 표준의 3개의 복제된 차세대 서열 분석(NGS) 라이브러리 및 0.3% cfDNA 참조 표준의 3개의 복제물(0.1% cfDNA 참조 표준 및 1% cfDNA 참조 표준을 혼합하여 생성)을 시험하였다. 샘플 입력은 라이브러리당 8.3 ng DNA였다(qPCR에 의해 정량화됨).
전체 표적 적중율은 모든 라이브러리에 대해 50%보다 높았고(즉, 차세대 서열 분석(NGS) 판독물의 >50%가 앰플리콘에 정렬될 수 있음), 전환율(즉, 서열 분석된 입력 분자의 백분율)은 평균 62%이고, 플렉스의 97%는 >10% 전환율을 갖는다(도 15를 참조). UMI 보정 후 오류율은 상이한 클레오티드 위치에 따라 가변되고, 호라이즌 디스커버리 멀티플렉스 I 야생형 cfDNA 참조 표준(Horizon Discovery Multiplex I Wild Type cfDNA Reference Standard)의 3개의 복제 라이브러리에서 가장 높은 오류율은 0.23%, 0.20% 및 0.23%였으며 평균 오류율은 0.006%, 0.005% 및 0.005%였다(도 16을 참조). 돌연변이 정량화 능력은 0.3% cfDNA 참조 표준을 사용하여 검증하였다. 6개 돌연변이의 실험적 VAF는 일반적으로 예상된 VAF와 일치하였고, 그 차이는 대부분 돌연변이 분자의 소수(≤9)를 샘플링할 때의 확률상 때문이었다(도 17을 참조).
* * *
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법은, 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 관해 설명되었지만, 당업자는, 본 발명의 개념, 사상, 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 개시된 방법 및 본원에 개시된 방법의 단계 또는 일련의 단계에 변형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 약제가, 본원에 개시된 약제를 대체할 수 있는 동시에 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 것이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은, 첨부된 청구 범위에 의해 한정되는 본 발명의 사상, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조 문헌
하기의 참조 문헌은 본원에 개시된 것들에 예시적인 절차 또는 기타 상세한 보충을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 구체적으로 포함된다.
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<400> 43
agacgtgtgc tcttccgatc tctctcggtg gatctgcata acat 44
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 44
agacgtgtgc tcttccgatc tgtcaaatcc tagggggtaa tacga 45
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 45
agacgtgtgc tcttccgatc tctggtcatt gcagagacct ct 42
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 46
agacgtgtgc tcttccgatc ttctccattg tctagcacgg c 41
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 47
agacgtgtgc tcttccgatc tagactgtgg agtctgaaac tcag 44
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 48
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<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 49
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<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 50
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<210> 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 51
agacgtgtgc tcttccgatc tatgggcagc acagtggg 38
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 52
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<210> 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 53
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 55
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 56
agacgtgtgc tcttccgatc tttcctttcc tcctcctccc at 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 57
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<223> Synthetic polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 62
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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cggac 65
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 64
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<210> 65
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 65
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnna aagaaaaaaa aaaagaatat 60
gggtccaga 69
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 66
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc gaggcgatag ggttaaggg 59
<210> 67
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 67
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc ttctagtcgc aattgaagta 60
ccac 64
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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c 61
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 70
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnna aagcaaagct atattcaaga 60
ccacat 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 71
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<210> 72
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 72
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aag 63
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 73
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t 61
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 74
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t 61
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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taaaacaaat agg 73
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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gtgaagc 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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<210> 78
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 80
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gcaaata 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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gtggtt 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 82
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<210> 83
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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agtattc 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 84
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<210> 85
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<211> 57
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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c 61
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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ac 62
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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tacac 65
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<220>
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<220>
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<220>
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tctatagcct 70
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<220>
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<220>
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acc 63
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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g 61
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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tctaag 66
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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ac 62
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnt gacctgtggg tggaaatttt 60
g 61
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnna gagggttctg attgcctaca 60
ag 62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 104
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng ggatcctcat caagcgacg 59
<210> 105
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 105
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc ccttttacag tcaaagtcca 60
aagc 64
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 106
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng ggtcgtcaaa gacgtttttg 60
c 61
<210> 107
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 107
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng atggcgctgg agtccatt 58
<210> 108
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 108
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnna cctgtcctaa ggaaccttcc 60
t 61
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 109
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc tttgcaagat ggaggttgca 60
<210> 110
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 110
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc ttgccctacc agcctctc 58
<210> 111
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 111
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng gctgcggatt gtgcg 55
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng gagtatttca tgaaacaaat 60
gaatgatgc 69
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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g 61
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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acttt 65
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
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aa 62
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnt ccatgatcag gtccaccttc 60
t 61
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<223> Synthetic polynucleotide
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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ct 62
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<221> misc_feature
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<220>
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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<223> Synthetic polynucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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actacta 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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c 61
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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attagattc 69
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<221> misc_feature
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tgc 63
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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ctt 63
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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tatttcgc 68
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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tcc 63
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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ccctattcga gtc 73
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
<400> 146
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a 61
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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tcca 64
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnc aatttctaca cgagatcctc 60
tctct 65
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnng acattacggg ctgccaaatc 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnc tcagacacac acccagcaa 59
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnna cttactttat aaaccgttcc 60
aaaagca 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<400> 152
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ttttcagctt 70
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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gtttcctg 68
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 154
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 155
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnng gataataaaa gagagaaatc 60
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<210> 156
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 156
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gttttg 66
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<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 157
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnt ccaggttgcc catgacaac 59
<210> 158
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 158
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnna gtgccagaag gaacccac 58
<210> 159
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 159
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnna agtgttactc aagaagcaga 60
aagg 64
<210> 160
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 160
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnna aaatcccttt gggttataaa 60
tagtgca 67
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnna tgtgttttat aatttagact 60
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 162
acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnc tggaaaaatg gctttgaatc 60
tttgg 65
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct tcttnnnnnn nnnnnnnnnt ggaaaagctc attaacttaa 60
ctgacat 67
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<223> Synthetic polynucleotide
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<223> n is a, c, or t
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<223> Synthetic polynucleotide
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<223> Synthetic polynucleotide
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tttggattc 69
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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aa 62
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<223> Synthetic polynucleotide
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<223> Synthetic polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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agct 64
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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c 61
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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aatttcttta c 71
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
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taa 63
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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cag 63
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ttcag 65
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, or t
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<221> misc_feature
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cat 63
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 206
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc aaaccaccac ttatttcttt 60
attttatcct 70
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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actcttatgc 70
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
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<222> (25)..(39)
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atctt 65
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<211> 65
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng agtagacagg gaaatataga 60
agcct 65
<210> 211
<211> 63
<212> DNA
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<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
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<400> 211
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc catccttttt agtgctgtcc 60
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<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 212
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnt cagctggcct agcagttc 58
<210> 213
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 213
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng cataatttat aatgaaaaca 60
aatacattct cacag 75
<210> 214
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
<400> 214
acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc ttatttgcat ttgtggcata 60
atatgaaac 69
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<223> Synthetic polynucleotide
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<222> (25)..(39)
<223> n is a, c, or t
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc tagggttagt caggtggttc 60
aa 62
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnng ccttatatta ttccctttga 60
accttacaat aat 73
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acacgacgct cttccgatct atcannnnnn nnnnnnnnnc ctgcagcggg agttttca 58
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ttttaaagta 70
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ttgtaa 66
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c 61
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<221> misc_feature
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aaccatt 67
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 549
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttctgactgt accaccatcc act 53
<210> 550
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 550
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagtaacagt aggtgtttca atatgacttt 60
t 61
<210> 551
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 551
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tccctccagg agcccacc 48
<210> 552
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 552
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tactgctact acataccagg ttctg 55
<210> 553
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 553
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctgatcaag gcaccgctct aa 52
<210> 554
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 554
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctccatccc ggtgtgcat 49
<210> 555
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 555
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttcaagggct atgggggctt 50
<210> 556
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 556
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagatgtgcc ctgacatcag aaata 55
<210> 557
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 557
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttcacttaac cttcagtgtt gatctga 57
<210> 558
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 558
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taggagtggg accatgtttg g 51
<210> 559
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 559
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tccatcgctc ccatcattgc t 51
<210> 560
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 560
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctttcaaac acgtgtgatc aatagtac 58
<210> 561
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 561
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcattctcat atcagaactt aaatacatag 60
cag 63
<210> 562
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 562
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tacaagtcca tcttataggg gaagga 56
<210> 563
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 563
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taaatgcatg agcatgcgca a 51
<210> 564
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 564
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tccacgataa aattctctta tcttgaagga 60
tt 62
<210> 565
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 565
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgttcaaagt gtttctgata ttgaaaaatt 60
ttaagt 66
<210> 566
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 566
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcctttttca tccttcgcac atgtata 57
<210> 567
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 567
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tccctggagc agatgactca ca 52
<210> 568
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 568
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taggcagggg gcttggt 47
<210> 569
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 569
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcacaccttt tttaacaacc ggatct 56
<210> 570
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 570
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taggtgaggc cctgtaatct gta 53
<210> 571
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 571
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taccttaata tcagacttcc cagcc 55
<210> 572
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 572
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tttttgggag ctctgagaca gg 52
<210> 573
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 573
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctgatggca aagcagaaga caata 55
<210> 574
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 574
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagccctttc agggagtcct 50
<210> 575
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 575
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttctcttaat ctcagttttc gttactgtaa 60
aat 63
<210> 576
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 576
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcatagcacc actcggtgaa ctt 53
<210> 577
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 577
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taggagtgag aacccacgta ca 52
<210> 578
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 578
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcaacagtgt gaatgtactt aatgacact 59
<210> 579
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 579
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcctgtcctg tgaggcagg 49
<210> 580
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 580
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttgccctgct ggtgttcttt tata 54
<210> 581
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 581
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttcgctgctg ctgttgct 48
<210> 582
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 582
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgggtcctca ggtccttgtg 50
<210> 583
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 583
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgcgttggga acttcaactg g 51
<210> 584
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 584
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tttgtagccc agcatggcaa 50
<210> 585
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 585
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttttgctttt gagggacaga aaatca 56
<210> 586
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 586
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tacttggcta atgagttgat ctctct 56
<210> 587
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 587
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagttatttt caaaagaaaa caaaggacat 60
agatt 65
<210> 588
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 588
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgcaaagagt gctcaaacct tgg 53
<210> 589
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 589
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgttactaat ttttttggct atcatgcca 59
<210> 590
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 590
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tgtagcagag aacccacttg gg 52
<210> 591
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 591
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagctcaaac catattctta atttttaaaa 60
ttcac 65
<210> 592
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 592
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctcctctgt cgtaagtcaa gtcttt 56
<210> 593
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 593
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tcagtctggt aaagtgctat cgaatc 56
<210> 594
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 594
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tctgaatagt ccgtttcgga tactca 56
<210> 595
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 595
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc taaaaacaca aattacctaa actgactcaa 60
g 61
<210> 596
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 596
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagcgcctcc cggct 45
<210> 597
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 597
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc ttgccagagg tagtggaggt c 51
<210> 598
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 598
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tagtgacttg cgttcatctt gttattta 58
<210> 599
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 599
ggatattcct ttctactctt tgacatcatc tggagcctga aaaggtaggt tgg 53
Claims (57)
- 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA의 표적화된 영역을 제조하는 방법으로서:
(a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계;
(b) 게놈 DNA 샘플의 적어도 일부를 증폭시키는 단계로서:
(i) 5'에서 3’ 방향으로 제1 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제2 영역, 적어도 4개의 축퇴 뉴클레오티드를 포함하는 제3 영역, 및 제1 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제4 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 5'에서 3’ 방향으로 제5 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제6 영역, 및 제2 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제7 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드를 사용한 2회 주기의 PCR을 실시하여 게놈 DNA 샘플의 적어도 일부를 증폭시키는 단계:;
(c) 단계 (b)에서 사용된 어닐링 온도보다 0~10℃ 더 높은 어닐링 온도로 적어도 3회 주기의 PCR을 실시하고:
(i) 상기 제1 영역의 적어도 일부의 역 보체에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 상기 제5 영역의 적어도 일부의 역 보체에 혼성화될 수 있는 서열을 포함하는 제4 올리고뉴클레오티드를 사용하여 단계 (b)의 생성물을 증폭시키는 단계; 및
(d) 5'에서 3’ 방향으로 제8 영역, 0 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제9 영역, 및 제3 표적 게놈 DNA 영역에 상보적인 서열을 포함하는 제10 영역을 포함하는 제 5 올리고뉴클레오티드를 사용한 적어도 1회 주기의 PCR을 실시하여 상기 단계 (c)의 생성물을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 제3 표적 게놈 DNA 영역은 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역보다 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역에 더 가까운 적어도 하나의 뉴클레오티드인 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA의 1 내지 10,000개의 표적화된 영역을 제조하는 방법인 것인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제3 영역은 고유 분자 식별자(UMI)인 것인, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제3 표적 게놈 DNA 영역은 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역보다 상기 제1 표적 게놈 DNA 영역에 더 가까운 1~10개의 염기인 것인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 영역 및 상기 제8 영역은 범용 프라이머 결합 부위인 것인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 영역 및 상기 제8 영역은 전체 또는 부분 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터 서열인 것인, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제5 영역은 인간 게놈에서 발견될 수 없는 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제5 영역은 차세대 서열 분석(NGS) 어댑터 서열과 상이한 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 영역 및 상기 제5 영역의 용융 온도들은 상기 제4 영역 및 상기 제7 영역의 용융 온도들보다 0~10℃ 더 높은 것인, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제3 영역의 축퇴 뉴클레오티드들은 각각 독립적으로 A, T 또는 C 중 하나인 것인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제3 영역의 축퇴 뉴클레오티드들 중 어느 것도 G가 아닌 것인, 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
각각이 고유한 제3 영역을 갖는 제1 올리고뉴클레오티드 군이 존재하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제13항에 있어서,
상기 정제하는 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제15항에 있어서,
상기 정제하는 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
(e) 상기 제1 영역 및 상기 제8 영역에 혼성화되는 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 상기 단계 (d)의 생성물을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 프라이머들은 차세대 서열 분석을 위한 인덱스 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제17항에 있어서,
상기 단계 (e)의 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제18항에 있어서,
상기 정제하는 단계는 SPRI 정제 또는 컬럼 정제를 포함하는 것인, 방법. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
(f) 상기 단계 (e)의 생성물에 대한 고-처리량 DNA 서열 분석을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제20항에 있어서,
상기 고-처리량 DNA 서열 분석은 차세대 서열 분석을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 표적 게놈 DNA 영역 및 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역은 상기 게놈 DNA의 반대 가닥 상에 있는 것인, 방법. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 표적 게놈 DNA 영역 및 상기 제2 표적 게놈 DNA 영역은 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드에 의해 분리되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)는 약 30분의 연장 시간을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)는 약 30초의 연장 시간을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)는 약 30분의 연장 시간을 포함하는 것인, 방법. - 적어도 하나의 표적 유전자의 추가 복제의 빈도(FEC)를 정량화하는 방법으로서:
(a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계;
(b) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA를 제조하는 단계로서, 여기서 제4 영역, 제7 영역 및 제10 영역의 서열들은 적어도 하나의 표적 유전자에 혼성화되는 단계;
(c) 제20항의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 실시하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 서열 분석 정보를 기초로 하나 이상의 표적 유전자에 대한 추가 복제의 빈도(FEC)를 계산하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제27항에 있어서,
상기 방법은 표적 유전자 세트에 대한 추가 복제의 빈도(FEC)를 정량화하는 방법이고, 여기서 상기 표적 유전자 세트는 2 내지 1000개의 표적 유전자를 포함하는 것인, 방법. - 제27항 또는 제28항에있어서,
상기 단계 (b)는 제1 올리고뉴클레오티드 군, 제2 올리고뉴클레오티드 군, 및 제5 올리고뉴클레오티드 군을 사용하여 실시되고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제5 올리고뉴클레오티드들의 군의 각각의 일부는 표적 유전자 세트 중 하나에 상보적인 것인, 방법. - 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제4, 제7, 및 제10 영역들의 각각은 인간 게놈에서 단 한번만 발견되는 서열들을 포함하는, 방법. - 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
하나의 표적 유전자에 혼성화되는 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 유전자에 혼성화되는 제1 올리고뉴클레오티드 서로에 비해 고유한 제3 영역을 갖는, 방법. - 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)는 참조 유전자에 상보적인 제4, 제7 및 제10 영역을 각각 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드, 제2 올리고뉴클레오티드, 및 제5 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시되는, 방법. - 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)는 고-처리량 서열 분석을 위한 각각의 표적 유전자 또는 참조 유전자의 일부를 제조하고, 여기서 상기 부분은 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 방법. - 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)는:
(i) 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 각 표적 유전자의 표적화된 부분들에 정렬하고 상기 NGS 판독물이 정렬되는 유전자좌를 기초로 하위군으로 분류하는 단계;
(ii) 동일한 UMI 서열을 수반하는 모든 차세대 서열 분석(NGS) 판독물이 하나의 UMI 패밀리로 분류되도록 UMI 서열을 기초로 각 유전자좌에서 NGS 판독물을 나누는 단계;
(iii) PCR 오류 또는 차세대 서열 분석(NGS) 오류로 인한 UMI 패밀리들을 제거하는 단계;
(iv) 각 유전자좌에서 고유한 UMI 서열의 수를 세는 단계; 및
(v) 각 표적 유전자 및 참조 유전자의 각 유전자좌에 대한 고유한 UMI 서열의 수를 기초로 추가 복제의 빈도(FEC)를 계산하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제35항에 있어서,
상기 단계 (d)(iii)는 UMI 축퇴 기반 설계를 충족하지 않는 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함하는, 방법. - 제35항 또는 제36항에 있어서,
상기 단계 (d)(iii)는 Fmin보다 작은 UMI 패밀리 크기를 갖는 UMI 패밀리들을 제거하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수이고, Fmin은 2 내지 20 사이인 것인, 방법. - 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)(iv)는 더 큰 패밀리 크기를 갖는 다른 UMI 서열로부터 단지 1 또는 2개의 염기만큼 상이한 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추가 복제의 빈도(FEC) 하기와 같이 정의되고:
,
여기서 은 표적 유전자 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 표적 유전자에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 참조 유전자좌의 전체 또는 일부에 대한 고유한 UMI 수의 합이고, 은 하나의 기준에 대하여 고려할 유전자좌의 수이고, 은 상기 기준에서 유전자좌의 전체 수 이하이고; 은 고려할 기준의 수이고, 은 기준의 전체 수 이하이며; 은 실험 보정에 의해 결정되는 것인, 방법. - 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추가 복제의 빈도(FEC)를 사용하여 상기 표적 유전자의 복제 수 변이(CNV) 상태를 확인하는 것인, 방법. - 적어도 하나의 표적 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전적 동일성의 대립 유전자 비율을 정량화하는 방법으로서:
(a) 게놈 DNA 샘플을 수득하는 단계;
(b) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 위한 게놈 DNA를 제조하는 단계로서, 여기서 상기 제4 영역, 상기 제7 영역 및 상기 제10 영역의 서열들은 적어도 하나의 표적 게놈 유전자좌에 가까운 게놈 DNA에 혼성화되는 단계;
(c) 제20항의 방법에 따른 고-처리량 서열 분석을 실시하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 서열 분석 정보에 대한 적어도 하나의 표적 게놈 유전자좌에 대한 상이한 유전자 동일성의 대립 유전자 비율을 계산하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제41항에 있어서,
상기 방법은 표적 게놈 유전자좌 세트에 대한 상이한 유전자 동일성의 대립 유전자 비율을 정량화하는 방법이고, 여기서 상기 표적 게놈 유전자좌 세트는 2 내지 10,000개의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 것인, 방법. - 제41항 또는 제42항에있어서,
상기 단계 (b)는 제1 올리고뉴클레오티드 군, 제2 올리고뉴클레오티드 군, 및 제5 올리고뉴클레오티드 군을 사용하여 실시되고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제5 올리고뉴클레오티드 군들의 각각의 일부는 상기 표적 게놈 유전자좌 세트 중 적어도 하나에 가까운 게놈 DNA에 상보적인 제4, 제7 및 제10 영역들을 각각 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제4, 제7 및 제10 영역들의 각각은 상기 단계 (b)의 조건하에서 상기 게놈 DNA의 비표적 영역들과 혼성화될 수 없는 서열들을 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
하나의 표적 게놈 유전자좌에 가까운 상기 게놈 DNA에 혼성화되는 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 게놈 유전자좌에 가까운 게놈 DNA에 혼성화되는 제1 올리고뉴클레오티드 서로에 비해 고유한 제3 영역을 갖는 것인, 방법. - 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 표적 게놈 유전자좌는 40개의 뉴클레오티드 내지 500개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인, 방법. - 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)는:
(i) 차세대 서열 분석(NGS) 판독물을 표적화된 게놈 유전자좌에 정렬하고 상기 NGS 판독물이 정렬되는 유전자좌를 기초로 하위군으로 분류하는 단계;
(ii) 동일한 UMI 서열을 수반하는 모든 차세대 서열 분석(NGS) 판독물이 하나의 UMI 패밀리로 분류되도록 UMI 서열을 기초로 각 유전자좌에서 NGS 판독물을 나누는 단계;
(iii) PCR 오류 또는 차세대 서열 분석(NGS) 오류로 인한 UMI 패밀리들을 제거하는 단계;
(iv) 각각의 남은 UMI 패밀리의 유전적 동일성을 호출하는 단계;
(v) 각 유전자좌에서 고유한 UMI 서열의 수를 세는 단계; 및
(vi) 상기 대립 유전자 비율을 계산하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제47항에 있어서,
상기 단계 (d)(iii)는 UMI 축퇴 기반 설계를 충족하지 않는 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제47항 또는 제48항에 있어서,
상기 단계 (d)(iii)는 Fmin보다 작은 UMI 패밀리 크기를 갖는 UMI 패밀리들을 제거하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 UMI 패밀리 크기는 동일한 UMI를 수반하는 판독물의 수이고, Fmin은 2 내지 20 사이인 것인, 방법. - 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)(iii)는 더 큰 패밀리 크기를 갖는 다른 UMI 서열로부터 단지 1 또는 2개의 염기만큼 상이한 UMI 서열들을 제거하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)(iv)는 UMI 패밀리의 판독물의 70% 이상이 관심 유전자좌에서 동일한 경우에만 유전적 동일성을 호출하는 것을 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대립 유전자 비율은 R 대립유전자 = N 1 /N 2으로 정의되고, 여기서 N 1은 제1 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호이며, N 2는 제2 유전적 동일성에 대한 고유한 UMI 번호인 것인, 방법. - 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)(iv)는 각 UMI 패밀리의 공통 서열을 식별하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제53항에 있어서,
상기 공통 서열은 UMI 패밀리에서 가장 많은 수로 출현하는 서열인 것인, 방법. - 제53항 또는 제54항에 있어서,
상기 공통 서열을 해당 유전자좌에 대한 야생형 서열과 비교함으로써 공통 서열에서 돌연변이를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제55항에 있어서,
상기 확인된 돌연변이의 변이 대립 유전자 빈도(VAF)를 계산하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제56항에 있어서,
상기 확인된 돌연변이의 변이 대립 유전자 빈도(VAF)는 돌연변이를 갖는 UMI 패밀리의 수/UMI 패밀리의 전체 수로 정의되는 것인, 방법.
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