JP6970205B2 - Dnaおよびrnaの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上 - Google Patents

Dnaおよびrnaの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上 Download PDF

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Description

本発明は、核酸配列決定の分野に関する。より詳細には、本発明は、配列決定のための稀な核酸標的の濃縮の分野に関する。
高スループット配列決定のための試料調製は、典型的には、試料中の標的配列を含有する核酸の非標的核酸に対する比率を増大させる濃縮工程を含む。当該技術で既知の配列ベースの濃縮技法は、ハイブリッド捕捉、PCR増幅、プライマー伸長標的濃縮(PETE)を含む。プライマーベースの標的濃縮法は、1ラウンド以上のコピー鎖の合成を含む。DNA配列決定の一部の臨床適用は、非常に稀な標的、例えば癌の血液中に存在する無細胞腫瘍DNA(ctDNA)を検出することを目的としている。変異により識別される腫瘍DNAは、典型的な血液試料1mLあたり数コピーもの低い濃度で存在する(cappペーパー)。患者からの可能な限り少ない試料材料を利用してそのような稀な標的配列を確実に検出する必要性が、存在する。
一態様において、本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であり、その方法は、以下の工程を含む:標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに相補的な領域を含み;ハイブリダイズした標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼで伸長してプライマー伸長産物を形成し;試料を5’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、5’オーバーハングは、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;アダプターをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;アダプターの一方の鎖をプライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;第2標的特異的プライマーをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第2標的特異的プライマーは標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズするプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。ある態様において、プライマーアニーリングおよび伸長工程またはプライマーアニーリングおよび増幅工程は、同時に実施される。ある態様において、その方法は、さらに標的特異的プライマーまたはアダプターを除去する精製工程を含む。精製は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製および親和性ベースの精製から選択されることができる。
ある態様において、増幅は、ホットスタート能力を有するDNAポリメラーゼによる。
ある態様において、アダプターのより短い鎖の長さは、5’オーバーハングの長さの1.5倍より短いかまたは1.5倍に等しい。ある態様において、アダプターは、3’末端において伸長ブロックを含む。ブロックは、3’または2’ホスフェート基を含むことができる。
ある態様において、増幅は、サブサイクリング(subcycling)熱サイクルプロファイルを含む。
ある態様において、第1および第2標的特異的プライマーの少なくとも一方は、バーコード、例えばユニーク分子バーコード(UID)および試料バーコード(SID)を含む。
ある態様において、工程h)における増幅は、デジタルドロップレット(digital droplet)PCRを含む。
より詳細には、本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む:
a)標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼで伸長してプライマー伸長産物を形成し;
d)試料を5’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、5’オーバーハングは、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
e)アダプターをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
f)アダプターの一方の鎖をプライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
g)第2標的特異的プライマーをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第2標的特異的プライマーは標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
h)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
工程b)およびc)は、同時に実施されることができる。工程g)およびh)は、同時に実施される。その方法は、さらに工程c)の後に標的特異的プライマーを除去する精製工程を含むことができる。精製工程は、工程e)の後にアダプターを除去するために用いられることもできる。精製は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製および親和性ベースの精製から選択されることができる。工程h)における増幅は、ホットスタート能力を有するDNAポリメラーゼにより実行されることができる。
アダプターのより短い鎖の長さは、5’オーバーハングの長さの1.5倍より短いかまたは1.5倍に等しいことができる。アダプターは、3’末端において伸長ブロックを含むことができ、それは、好ましくは3’または2’ホスフェート基である。
増幅工程h)は、サブサイクリング熱サイクルプロファイルを含むことができる。第1および第2標的特異的プライマーの少なくとも一方は、バーコードを含むことができ、それは、ユニーク分子バーコード(UID)または試料バーコード(SID)であることができる。工程h)は、デジタルドロップレットPCRとして実施されることができる。
本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法も提供し、その方法は、以下の工程を含む:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成し;
g)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)アダプターを第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
i)アダプターの一方の鎖を第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
j)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物に、第4プライマーを第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;そして
k)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
第1および第2標的特異的プライマーは、ユニーク分子バーコードを含むことができる。第1標的特異的プライマーは、第2標的特異的プライマーと同じであることができる。あるいは、第1標的特異的プライマーは第2標的特異的プライマーと異なることができるが、同じ遺伝子を標的とする。第3標的特異的プライマーは、第4標的特異的プライマーと同じであることができる。特定の態様において、第1標的特異的プライマーは、第2標的特異的プライマーと同じであるが、第3標的特異的プライマーは、第4標的特異的プライマーと異なる。
その方法は、さらに、工程c)の後にRNA−DNAハイブリッドからRNAを除去する工程を含むことができる。その方法は、さらに、試料を工程g)においてアダプターと接触させる前に試料から未使用のプライマーを除去する工程または工程k)における増幅の前に試料から未使用のプライマーを除去する工程を含むこともできる。その方法は、工程c)およびf)の後に一本鎖核酸を除去する工程を含むこともできる。工程f)におけるDNAポリメラーゼは、ホットスタート能力を有する熱安定性ポリメラーゼであることができる。
本発明は、試料からの標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法も含み、その方法は、以下の工程を含む:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ;
f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成し、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
g)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、第1および第2標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)アダプターを第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
i)アダプターの一方の鎖を第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
j)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物に、第4標的特異的プライマーを第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
k)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅し;
l)工程k)からの増幅されたライゲーション産物を配列決定する。
ユニバーサルプライマーは、配列決定プライマーとして用いられることができる。あるいは、第3および第4標的特異的プライマーは、さらに配列決定プライマー結合部位を含む。さらにその代わりに、アダプターは、さらに配列決定プライマー結合部位を含む。アダプターは、バーコードを含むこともでき、それは、試料同定バーコードであることができる。
特定の態様において、ユニバーサルプライマーが配列決定プライマーとしても用いられる場合、試料中の遺伝子融合が、検出されることができる。この場合、試料からの標的ポリヌクレオチドは、第1および第2標的特異的プライマーは同じであるが第3および第4標的特異的プライマーは異なるような方式で処理および配列決定される。
本発明は、さらに、試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法を含み、その方法は、以下の工程を含む:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
g)ハイブリダイズした第2および第3標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2および第3プライマー伸長産物を形成し;
h)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
i)アダプターを第2および第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
j)アダプターの一方の鎖を第2および第3プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
k)第4標的特異的プライマーを第2プライマー伸長産物に、第5プライマーを第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第4および第5標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;そして
l)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
本発明は、以下のものを含む、試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するためのキットも提供する:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター(ここで、より長い鎖は、第1および第2標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む);ならびに場合によりユニバーサルプライマーならびにDNAライゲーションおよびDNA増幅のための試薬。キットは、さらに濃縮されたDNAおよびRNA標的を配列決定するための試薬を含むことができる。
本発明は、以下のものを含む、試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するための反応混合物も提供する:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター(ここで、より長い鎖は、第1および第2標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む)。
図1は、本発明の作業の流れの概要の図である。 図2は、DNAおよびRNAの同時濃縮を含む本発明の作業の流れの図である。 図3は、その方法をRNA標的に適用した結果を図説している。 図4は、図2の方法を図説する模式的な流れの図である。 図5は、本開示に従う方法の一態様の模式的表現であり、ここで、第2プライマー伸長工程およびユニバーサルプライマー増幅工程は、組み合わせられて単一の工程になっている。 図6は、プライマー伸長産物にライゲーションされたアダプターの模式的図説である。 図7は、図6のアダプターの態様の一本鎖オーバーハング領域を強調する詳細な図である。 図8は、本開示に従う方法の第1プライマー伸長反応に適用された際のサブサイクリングの標的的中(on−target)パーセントへの影響を図説する棒グラフである。 図9は、その中に組み込まれたUIDおよびMID両方を有するプライマーを含む本開示に従う方法の一態様の模式的表現である。 図10は、本開示に従う方法の一態様の模式的表現であり、ここで、その方法は、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)と共に使用するために改変されている。
定義
別途定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第4版 Cold Spring Harbor Lab Press (2012)を参照。
以下の定義は、本開示の理解を促進するために提供されている。
用語“バーコード”は、検出および同定されることができる核酸配列を指す。バーコードは、一般に2以上かつ約50までのヌクレオチド長であることができる。バーコードは、集団中の他のバーコードと少なくとも最低限の数の違いを有するように設計されている。バーコードは、試料中のそれぞれの分子に独特であることができ、または試料に独特であり試料中の多数の分子により共有されることができる。
用語“多重識別子”、“MID”または“試料バーコード”は、試料または試料の源を同定するバーコードを指す。従って、単一の源または試料からの全てまたは実質的に全てのMIDでバーコードを付けられたポリヌクレオチドは、同じ配列のMIDを共有すると考えられ;一方で異なる源または試料からの全てまたは実質的に全て(例えば少なくとも90%または99%)のMIDでバーコードを付けられたポリヌクレオチドは、異なるMIDバーコード配列を有するであろう。異なるMIDを有する異なる源からのポリヌクレオチドは、MIDバーコード中にコードされた試料情報を維持しながら並行して混合および配列決定されることができる。
用語“ユニーク分子識別子”または“UID”は、それが結合しているポリヌクレオチドを同定するバーコードを指す。典型的には、UIDでバーコードを付けられたポリヌクレオチドの混合物中の全てまたは実質的に全て(例えば少なくとも90%または99%)のUIDバーコードは、独特である。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態両方のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)およびそれらのポリマーを指す。別途限定されない限り、その用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然存在ヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント(例えば縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、SNPおよび相補配列ならびに明示的に示された配列も、暗に包含する。
用語“ポリメラーゼ”は、ポリヌクレオチドの鋳型に方向付けられる合成を実施する酵素を指す。DNAポリメラーゼは、原核生物Pol I、Pol II、Pol III、Pol IVおよびPol V、真核生物DNAポリメラーゼ、古細菌DNAポリメラーゼ、テロメラーゼおよび逆転写酵素を含む。用語“熱安定性ポリメラーゼ”は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、その後のポリヌクレオチド伸長反応を達成するために十分な活性を保持しており、二本鎖核酸の変性を達成するために必要な時間の間高温に晒された際に不可逆的に変性した(不活性化された)状態にならない酵素を指す。ある態様において、以下の熱安定性ポリメラーゼが、用いられることができる:サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(Vent、GenBank:AAA72101)、パイロコッカス・フリオスス(Pyrococcus furiosus)(Pfu、GenBank:D12983、BAA02362)、パイロコッカス・ヴェッセイ(Pyrococcus woesii)、パイロコッカスGB−D(Deep Vent、GenBank:AAA67131)、サーモコッカス・コダカレンシス(Thermococcus kodakaraensis)KODI(KOD、GenBank:BD175553、BAA06142;サーモコッカス属の種KOD株(Pfx、GenBank:AAE68738))、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)(Tgo、Pdb:4699806)、スルフォロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solataricus)(GenBank:NC002754、P26811)、アエロピュルム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)(GenBank:BAA81109)、アルカエオグロブス・フルギダス(Archaeglobus fulgidus)(GenBank:029753)、パイロバキュラム・アエロピュルム(Pyrobaculum aerophilum)(GenBank:AAL63952)、ピュロディクティウム・オカルタム(Pyrodictium occultum)(GenBank:BAA07579、BAA07580)、サーモコッカス9度Nm(Thermococcus 9 degree Nm)(GenBank:AAA88769、Q56366)、サーモコッカス・フミコーランス(Thermococcus fumicolans)(GenBank:CAA93738、P74918)、サーモコッカス・ヒドロサーマリス(Thermococcus hydrothermalis)(GenBank:CAC18555)、サーモコッカス属の種GE8(GenBank:CAC12850)、サーモコッカス属の種JDF−3(GenBank:AX135456;WO0132887)、サーモコッカス属の種TY(GenBank:CAA73475)、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)(GenBank:P77916)、パイロコッカス・グリコボランス(Pyrococcus glycovorans)(GenBank:CAC12849)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)(GenBank:NP 143776)、パイロコッカス属の種GE23(GenBank:CAA90887)、パイロコッカス属の種ST700(GenBank:CAC 12847)、サーモコッカス・パシフィカス(Thermococcus pacificus)(GenBank:AX411312.1)、サーモコッカス・ジリジイ(Thermococcus zilligii)(GenBank:DQ3366890)、サーモコッカス・アグレガンス(Thermococcus aggregans)、サーモコッカス・バロシイ(Thermococcus barossii)、サーモコッカス・セラー(Thermococcus celer)(GenBank:DD259850.1)、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)(GenBank:E14137)、サーモコッカス・サイクリ(Thermococcus siculi)(GenBank:DD259857.1)、サーモコッカス・チオレドゥセンス(Thermococcus thioreducens)、サーモコッカス・オヌリネウス(Thermococcus onnurineus)NA1、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarium)、スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、パイロバキュラム・カリジフォンティス(Pyrobaculum calidifontis)、パイロバキュラム・イスランディクム(Pyrobaculum islandicum)(GenBank:AAF27815)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methanococcus jannaschii)(GenBank:Q58295)、デスルフロコッカス(Desulforococcus)属の種TOK、デスルフロコッカス属、ピュロロブス属(Pyrolobus)、パイロディクティウム属(Pyrodictium)、スタフィロテルムス属(Staphylothermus)、バルカニサエタ属(Vulcanisaetta)、メタノコッカス属(Methanococcus)(GenBank:P52025)および他の古細菌Bポリメラーゼ、例えばGenBank AAC62712、P956901、BAAA07579))、好熱細菌サーマス属(Thermus)の種(例えば、フラバス(flavus)、ルベル(ruber)、サーモフィルス(thermophilus)、ラクテウス(lacteus)、ルーベンス(rubens)、アクウァーティクス(aquaticus))、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、テルモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、メタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fervidus)、KODポリメラーゼ、TNA1ポリメラーゼ、サーモコッカス属の種9度N−7、T4、T7、phi29、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、P.アビシ、T.ゴルゴナリウス(T.gorgonarius)、T.リトラリス(T.litoralis)、T.ジリギ(T.zilligii)、T属の種GT、P属の種GB−D、KOD、Pfu、T.ゴルゴナリウス、T.ジリギ、T.リトラリスおよびサーモコッカス属の種9N−7ポリメラーゼ。ある場合には、核酸(例えばDNAまたはRNA)ポリメラーゼは、改変された天然存在タイプAポリメラーゼであることができる。本発明のさらなる態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾(例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ(polishing))または増幅反応における改変されたタイプAポリメラーゼがメイオサーマス属(Meiothermus)、サーモトガ属(Thermotoga)またはサーモミクロビウム属(Thermomicrobium)のあらゆる種から選択されることができる方法に関する。本発明の別の態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾(例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ)または増幅反応におけるポリメラーゼがサーマス・アクウァーティクス(Taq)、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・カルドフィラス(Thermus caldophilus)またはサーマス・フィリフォルミス(Thermus filiformis)のいずれかから単離されることができる方法に関係する。本発明のさらなる態様は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾(例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ)または増幅反応における改変されたタイプAポリメラーゼがバシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、スファエロバクター・サーモフィラス(Sphaerobacter thermophilus)、ディクチオグロムス・サーモフィラム(Dictoglomus thermophilum)または大腸菌から単離されることができる方法を包含する。別の態様において、本発明は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾(例えばターミナルトランスフェラーゼ、分解または仕上げ)または増幅反応における改変されたタイプAポリメラーゼが変異体Taq−E507Kポリメラーゼであることができる方法に関する。本発明の別の態様は、一般に、熱安定性ポリメラーゼが標的核酸の増幅を達成するために用いられることができる方法に関係する。
用語“プライマー”は、一本鎖鋳型核酸分子の特定の領域に結合してポリメラーゼに媒介される酵素反応による核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは、約100ヌクレオチド未満を含み、好ましくは約30ヌクレオチド未満を含む。標的特異的プライマーは、ハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーション条件は、約40℃〜約70℃の温度での等温増幅緩衝液(20mMトリス−HCl、10mM (NHSO)、50mM KCl、2mM MgSO、0.1% TWEEN(登録商標)20、25℃においてpH8.8)中でのハイブリダイゼーションを含むことができるが、それに限定されない。標的結合領域に加えて、プライマーは、典型的には5’部分において追加の領域を有することができる。追加の領域は、ユニバーサルプライマー結合部位またはバーコードを含むことができる。
用語“ユニバーサルプライマー”は、ユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズすることができるプライマーを指す。ユニバーサルプライマー結合部位は、典型的には標的配列に非標的特異的様式で付加される天然または人工配列であることができる。
用語“試料”は、核酸分子を含む、典型的にはDNAまたはRNAを含むあらゆる生物学的試料を指す。試料は、組織、細胞もしくはそれらの抽出物であることができ、または核酸分子の精製された試料であることができる。用語“試料”の使用は、試料中に存在する核酸分子中の標的配列の存在を必ずしも暗示しない。
用語“試料”は、標的核酸を含有するかまたは含有すると仮定されるあらゆる組成物を指す。これは、個体から分離された組織または流体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官および腫瘍、ならびに個体から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物の試料(ホルマリン固定されパラフィン包理された組織(FFPET)を含む)およびそれらから単離された核酸を含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞DNA(cfDNA)または循環腫瘍DNA(ctDNA)を含有する無細胞血液画分も含むことができる。
核酸配列決定は、臨床診療へと急速に拡大している。現行の配列決定技術は、単分子配列決定を利用し、極めて稀な標的の検出を可能にする。核酸配列決定の臨床適用の中には、“液体生検”、例えば伝統的な侵襲的生検のかわりに血液試料を用いる悪性腫瘍の検出およびモニタリングがある。腫瘍DNAは、単一ヌクレオチドのバリエーションまたは短い配列のバリエーションならびに遺伝子融合を含め、変異の存在により識別される。Newman, A., et al., (2014) An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage, Nature Medicine doi:10.1038/nm.3519およびF. Mertens, et al. (2015) The emerging complexity of gene fusions in cancer, Nat. Rev. Cancer 15:371を参照。
これらの難題および他の難題は、本開示に従う単一プローブプライマー伸長による標的濃縮に関する方法により克服されることができる。一側面において、本開示は、単一プローブプライマー伸長ベースの濃縮のための一般的なアプローチならびにそれに関する向上の両方を記載する。本明細書で記載される向上は、代替の精製法、作業の流れの改変(例えば代替の酵素、全工程の数の低減、向上した熱サイクルプロファイル)、代替のアダプター設計、ならびに開示される方法をRNAおよびDNAの同時濃縮ならびにデジタルドロップレットPCRの両方に適用することを可能にするための変更を含むが、それらに限定されない。
一態様において、本発明は、以下の工程を含む、標的配列を増幅する方法である:標的核酸をプライマーおよびポリメラーゼと接触させ、ここで、プライマーは、標的結合部位およびユニーク分子同定タグ(UID)を含み;ポリメラーゼ伸長反応および終結を実施して一本鎖プライマー伸長産物を作製し;アダプターを一本鎖プライマー伸長産物のそれぞれの末端にライゲーションしてライゲーション産物を作製し、ここで、アダプターは、少なくとも1個のユニバーサルプライミング部位を含み;増幅反応中のライゲーション産物を、少なくとも1個のユニバーサルプライミング部位への少なくとも1個のプライマーの結合を利用する増幅反応においてライゲーション産物を増幅して増幅された標的配列を作製する。ある態様において、プライマーおよびアダプターの少なくとも1つは、相互に適合性のユニバーサルライゲーション部位を含む。ある態様において、標的結合部位は、予め設計された標的特異的配列である。ある態様において、標的結合部位は、ランダム配列である。ある態様において、終結は、温度シフト、特異的酵素阻害剤の添加、キレート剤の添加、ウリジン含有塩基の組み込みとその後のウラシル−N−DNAグリコシラーゼによる処理からなるリストから選択される方法により達成される。ある態様において、少なくとも1種類のアダプターは、バーコードを含む。バーコードは、多重試料ID(MID)であることができる。増幅は、線形増幅または指数関数的増幅であることができる。ある態様において、方法は、さらにプライマー伸長およびライゲーションの少なくとも一方の後に精製工程を含む。
他の態様において、本発明は、以下のものを含む、標的配列を増幅するためのキットである:標的結合部位、ユニーク分子同定タグ(UID)およびユニバーサルライゲーション部位を含むプライマー;少なくとも1つのユニバーサルプライミング部位、多重試料ID(MID)およびユニバーサルライゲーション部位を含む少なくとも1種類のアダプター。ある態様において、キットは、異なるユニバーサルプライミング部位を有する2種類のアダプターを含むが、一方のアダプターのみがユニバーサルライゲーション部位およびMIDを含む。ある態様において、キットは、さらに以下の1以上を含む:核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、熱安定性DNAポリメラーゼおよびユニバーサルプライマー。
個々の分子の検出は、典型的には分子バーコード、例えば米国特許第7,393,665号、第8,168,385号、第8,481,292号、第8,685,678号および第8,722,368号において記載されている分子バーコードを必要とする。ユニーク分子バーコードは、典型的にはインビトロ操作の最も早い工程の間に患者の試料中のそれぞれの分子に付加される短い人工配列である。バーコードは、分子およびその子孫に印を付ける。ユニーク分子バーコード(UID)は、多数の用途を有する。バーコードは、試料中のそれぞれの個々の核酸分子を追跡して、例えば生検を用いずに癌を検出およびモニターするために患者の血液中の循環腫瘍DNA(ctDNA)分子の存在および量を評価することを可能にする(Newman, A., et al., (2014) An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage, Nature Medicine doi:10.1038/nm.3519)。
ユニーク分子バーコードは、配列決定エラーの修正のために用いられることもできる。単一の標的分子の全子孫は、同じバーコードで印を付けられており、バーコードを付けられたファミリーを形成する。バーコードを付けられたファミリーの全てのメンバーにより共有されているわけではない配列におけるバリエーションは、人為産物であり真の変異ではないものとして破棄される。ファミリー全体が元の試料中の単一の分子に相当するため、バーコードは、位置的重複排除および標的定量化のために用いられることもできる(Newman, A., et al., (2016) Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA, Nature Biotechnology 34:547)。
ある態様において、本発明は、配列決定のためのバーコードを付けられた核酸分子のライブラリーである。ある態様において、本発明は、核酸分子のバーコードを付けられたライブラリーの作製により核酸を配列決定する方法である。
本発明は、核酸配列決定により試料中の標的核酸を検出することを含む。試料中の全ての核酸を含む多数の核酸が、本明細書で記載される方法および組成物を用いて検出されることができる。ある態様において、試料は、対象または患者から得られる。ある態様において、試料は、対象または患者から例えば生検により得られた固形組織または固形腫瘍の断片を含むことができる。試料は、体液(例えば尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹腔液、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液または糞便試料)を含むこともできる。試料は、正常または腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含むことができる。ある態様において、試料、特に液体試料は、無細胞材料、例えば無細胞腫瘍DNAまたは腫瘍RNAを含む無細胞DNAまたはRNAを含むことができる。ある態様において、試料は、無細胞試料、例えば無細胞腫瘍DNAまたは腫瘍RNAが存在する無細胞血液由来の試料である。他の態様において、試料は、培養物中の細胞由来または培養物中に存在する感染性因子由来の核酸を含有する、または含有することが疑われる培養された試料、例えば培養物または培養上清である。ある態様において、感染性因子は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。
標的核酸は、試料中に存在し得る対象の核酸である。ある態様において、標的核酸は、標的特異的プライマーがハイブリダイズする遺伝子もしくは遺伝子断片または転写産物もしくは転写産物の一部である。ある態様において、多数の遺伝子、遺伝子断片、遺伝子間領域および遺伝子転写産物が、標的核酸を構成する。ある態様において、標的核酸は、遺伝的バリアント、例えば多型(一塩基多型またはバリアント(SNVのSNP)を含む)または結果として例えば遺伝子融合をもたらす遺伝的再編成を含有する。ある態様において、標的核酸は、バイオマーカー、すなわちそのバリアントが疾患または病気と関係している遺伝子を含む。他の態様において、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり、その生物の同定を助け、または病原性生物の特徴(例えば薬剤感受性または薬剤耐性)である。さらに他の態様において、標的核酸は、ヒトの対象の独特の特徴であり、例えば対象の独特のHLAまたはKIR遺伝子型を定めるHLAまたはKIR配列の組み合わせである。
ある態様において、標的核酸は、天然に一本鎖形態で存在する(例えば、mRNA、マイクロRNA、ウイルスRNAを含むRNA;または一本鎖ウイルスDNA)。他の態様において、標的核酸は、天然に二本鎖形態で存在する。当業者は、本発明の方法がRNAおよびDNA形態両方の標的核酸に関して同時に濃縮することができ、試料中に一方または両方の形態どちらで存在していても有効であることを認識しているであろう。より長い標的核酸は、断片化されることができる。ある態様において、標的核酸は、自然に断片化されている(例えば、循環無細胞DNA(cfDNA)または化学分解されたDNA、例えば保存された試料中に見られるDNA)。
本発明は、プライマー伸長産物の末端にライゲーションされる1つのアダプター分子の使用を含む。ある態様において、部分的に一本鎖のアダプターは、一本鎖プライマー伸長産物にハイブリダイズさせられて一方の鎖にニックを有する部分的に二本鎖の分子を作り出す。ニックを有する鎖のライゲーションは、当該技術で周知である(Green M., and Sambrook, J., Molecular Cloning, 2012 CSHL Press参照)。
ある態様において、アダプター分子は、インビトロで合成された人工配列である。他の態様において、アダプター分子は、インビトロで合成された天然存在配列である。さらに他の態様において、アダプター分子は、単離された天然存在分子または単離された非天然存在分子である。
ある態様において、アダプターは、1以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合された(多重化された)場合に試料の源を同定するために用いられる多重試料ID(MID)であることができる。バーコードは、それぞれの元の分子およびその子孫を同定するために用いられるユニーク分子ID(UID)の役目を果たすこともできる。バーコードは、UIDおよびMIDの組み合わせであることもできる。ある態様において、単一のバーコードが、UIDおよびMID両方として用いられる。ある態様において、それぞれのバーコードは、予め定められた配列を含む。他の態様において、バーコードは、ランダム配列を含む。
ある態様において、本発明の方法により生成された増幅された分子は、少なくとも1つの、ある態様において少なくとも2つのバーコードを含む。少なくとも1つのバーコードは、UIDであり、少なくとも2つのバーコードは、UIDおよびMIDを含む。本発明のある態様において、バーコードは、それぞれが同一のバーコードの異なる対を有する96〜384種類の異なるアダプターがヒトゲノム試料に付加されるように、約4〜20塩基長である。当業者は、バーコードの数は試料の複雑さ(すなわち予想される独特の標的分子の数)に依存することを理解していると考えられ、それぞれの実験に関して適切な数のバーコードを作製することができるであろう。
ある態様において、本発明は、標的特異的プライマーを利用する。標的特異的プライマーは、標的に相補的である少なくとも一部を含む。追加の配列が存在する場合、それらは、典型的にはプライマーの5’部分中である。ある態様において、同じプライマーまたは標的特異的プライマーの対が、標的のRNAおよびDNA版のために用いられることができる。他の態様において、1つの標的特異的プライマーのみが共有されており、第2標的特異的プライマーは異なる。さらに他の態様において、標的特異的プライマーは、異なる遺伝子に特異的であり、例えば第2標的特異的プライマーは、遺伝子融合パートナーに特異的である。さらに他の態様において、DNAに関して用いられるプライマーは、RNA標的に関して用いられるプライマーとは異なる遺伝子または座位を標的とする。
アダプターは、さらに少なくとも1つのユニバーサルプライマーに関するプライマー結合部位を含む。当業者は、二本鎖アダプター配列は一方の鎖上にプライマー結合部位を有し、他方の鎖上にプライマーと同一の配列を有するであろうことを認識しているであろう。当業者は、一本鎖プライマー(例えば標的特異的プライマー)はプライマーと同一の5’配列を有し、それが相補鎖中のプライマー結合部位中にコピーされるであろうことも、認識しているであろう。
ある態様において、本発明は、増幅工程を含む。この工程は、線形または指数関数的増幅、例えばPCRを含むことができる。増幅は、等温であることができ、または熱サイクルを含むことができる。ある態様において、増幅は、指数関数的であり、PCRを含む。ユニバーサルプライマーが、用いられ、すなわち、一対のプライマーが、試料中の全ての標的配列上に存在するアダプター中の結合部位にハイブリダイズする。同じアダプターを有するライブラリー中の全ての分子が、同じプライマーのセットを用いて増幅されることができる。ユニバーサルプライマーを用いるPCRは配列バイアスを低減してきたため、増幅サイクルの数は、制限される必要がない。ユニバーサルプライマーが用いられる増幅サイクルの数は、少ないことができるが、その後の工程に必要とされる生成物の量に応じて10、20または約30以上もの多いサイクル数であることもできる。
標的核酸から生成されるアンプリコンは、核酸配列決定を施されることができる。配列決定は、当該技術で既知のあらゆる方法により実施されることができる。高スループット単分子配列決定が、特に好都合である。そのような技術の例は、Illumina HiSeqプラットフォーム(Illuminaカリフォルニア州サンディエゴ)、Ion Torrentプラットフォーム(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド)、SMRTを利用するPacific BioSciencesプラットフォーム(Pacific Biosciences、カリフォルニア州メンローパーク)またはナノポア技術を利用するプラットフォーム、例えばOxford Nanopore Technologies(英国オックスフォード)またはRoche Sequencing Solutions(カリフォルニア州サンタクララ)により製造されたプラットフォームおよび合成による配列決定を含むかまたは含まないあらゆる他の現在存在するかまたは将来のDNA配列決定技術を含む。配列決定工程は、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用することができる。これらのプライマーに関する結合部位は、増幅工程において用いられる増幅プライマーの5’部分中に導入されることができる。プライマー部位がバーコードを付けられた分子のライブラリー中に存在しない場合、そのような結合部位を導入する追加の短い増幅工程が、実施されることができる。
ある態様において、配列決定工程は、配列分析を含む。ある態様において、分析は、配列の整列の工程を含む。ある態様において、整列は、複数の配列、例えば同じバーコード(UID)を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定するために用いられる。ある態様において、バーコード(UID)は、全てが同一のバーコード(UID)を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために用いられる。他の態様において、バーコード(UID)は、人為産物、すなわち同一のバーコード(UID)を有する一部の配列中に存在するが全ての配列中に存在するわけではないバリエーションを排除するために用いられる。PCRエラーまたは配列決定エラーの結果として生じるそのような人為産物は、排除されることができる。
ある態様において、試料中のそれぞれの配列の数は、試料中のそれぞれのバーコード(UID)を有する配列の相対的な数を定量化することにより定量化されることができる。それぞれのUIDは、元の試料中の単一の分子に相当し、それぞれの配列バリアントと関係している異なるUIDの計数は、元の試料中のそれぞれの配列の割合を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列の読みの数を決定することができるであろう。ある態様において、関連する数は、正確な定量結果のために必要なUIDあたりの読み(“配列深度”)である。ある態様において、所望の深度は、UIDあたり5〜50回の読みである。
同じ試料からのRNAおよびDNA物質の同時分析は、診療所において実質的有用性を有する。多くのタイプの試料に関して、核酸の量および質は、限られており、それは、特定の標的の検出を困難にする。DNAおよびRNA両方の使用は、利用可能な標的の量を最大化する一方でそれぞれのタイプの核酸の独特の特性も利用する。例えば、DNAは、一塩基バリアント(SNV)およびコピー数バリエーション(CNV)を含む変異に関する情報を保持している。加えて、DNA由来の情報は、定量的であることができ、すなわち腫瘍試料中の変異のタイプだけでなく変異負荷(mutation burden)も反映することができる。対照的に、変動する発現レベルがゲノム中の変異負荷を不明瞭にするため、RNAは、変異に関する定性的情報を提供する。同時に、遺伝子転写は、稀な変異事象からの信号を増幅し、それを検出するのをより容易にする。RNAの分析は、両方の融合パートナーからの野生型DNA配列の背景において遺伝子融合を検出するために特に有用である。
ある態様において、本発明は、専らRNAに適用されるプライマー伸長標的濃縮(PETE)の方法を含む。一般的に記載すると、その方法は、RNA分子の逆転写とその後のプライマー伸長標的濃縮を含む。プライマー伸長標的濃縮の例は、以前に2016年6月1日に出願された米国仮出願一連番号62/344,330、2016年7月12日に出願された米国仮出願一連番号62/361,426および2016年8月4日に出願された米国出願一連番号15/228,806において本発明者らにより記載されている。
ある態様において、本発明は、RNAおよびDNAの未分離の混合物に適用されるプライマー伸長標的濃縮の方法を含む。ある態様において、混合物は、総RNAおよびゲノムDNA、すなわち試料から最低限の処理で分離された核酸を含む。一般的に記載すると、その方法は、DNA分子が受動的に存在する一方でのRNA分子の逆転写とその後のゲノムDNA分子およびcDNA分子両方に適用されるプライマー伸長標的濃縮を含む。
ある態様において、本発明は、中間の精製工程を含む。ある態様において、未使用のDNAおよびRNA一本鎖は、エキソヌクレアーゼにより除去される。ある態様において、未使用のプライマーおよびアダプターは、例えばゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択法により除去される。ある態様において、サイズ選択は、Beckman Coulter(カリフォルニア州ブレア)からの固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization)(SPRI)技術を用いて実施されることができる。
ある態様において、DNAポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。ある態様において、プライマー伸長工程を実施する同じポリメラーゼが、PCR増幅において用いられることができる。ある態様において、DNAポリメラーゼは、ホットスタート能力を有する。ホットスタート能力は、抗体相互作用、化学修飾またはアプタマー相互作用から選択される機序による周囲温度におけるポリメラーゼの阻害を含む。
本発明は、図1〜2においてより詳細に表されている。図1は、本発明の典型的な作業の流れを描写している。総核酸が、試料から単離される。第1工程において、RNAは、逆転写を施され、一方でDNAは、二本鎖のままである。RNAがRNアーゼHにより除去された後、cDNA鎖のみが残る。変性後、プライマー伸長が、DNA標的上で行われることができる。次に、DNA由来およびRNA由来のプライマー伸長産物両方が、プライマー伸長標的濃縮(PETE)手順および配列決定を施される。
図2は、PETE工程が詳細に示されている本発明の典型的な作業の流れを描写している。まず、逆転写工程が、RNA鎖からcDNAを生成する。次に、UIDを有する標的特異的プライマーが、cDNA鎖および変性したゲノムDNA鎖の両方にアニーリングする。部分的に一本鎖のアダプターは、MID、ユニバーサルプライマー部位および試料中に存在する標的特異的プライマーの5’部分にアニーリングすることができる配列を有する。結果として生じる複合体の一方の鎖は、リガーゼにより塞がれることができるニックを含有する。第2標的特異的プライマーは、第2ユニバーサルプライミング部位を導入するために用いられる。プライマー伸長産物は、ユニバーサルプライマーを用いて増幅されることができる。
ここで図4に移って、単一プローブプライマー伸長による標的濃縮に関する方法100は、プライマーハイブリダイゼーションに関する工程102を含み、ここで、第1プライマーが、試料中に存在する核酸にハイブリダイズさせられる。一側面において、第1プライマーは、標的特異的プライマーである。標的特異的プライマーの一例は、対象の遺伝子(例えばcDNA、ゲノムDNA)に、またはその付近(例えばその上流またはそれに対して5’側)にハイブリダイズするように設計された遺伝子特異的プライマーである。試料中の核酸は、RNA、DNAまたはその組み合わせであることができる。プライマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、修飾核酸(例えばビオチン化、ロックド核酸、イノシン類、Seela塩基等)または当該技術で既知の他の核酸類似体からなるオリゴヌクレオチドプライマーであることができる。
引き続き図4を参照して、工程102の後、ポリメラーゼによるプライマー伸長の工程104が行われる。一側面において、第1プライマーの核酸鋳型へのハイブリダイゼーションの後、第1プライマーは、ポリメラーゼにより伸長され、それにより核酸鋳型の逆相補配列を含む3’領域を含む第1プライマー伸長産物を生成する。本明細書で記載されるように、工程102および工程104は、場合により同時に実施され、一方で他の態様において、工程102および工程104は、別々に(例えば順次)実施される。従って、開示される方法のある態様において、工程102および工程104は、組み合わせられて単一の工程102’になる。
方法100は、さらに工程104(または工程102’)において合成された第1プライマー伸長産物の長さを制御するための伸長停止の工程106を含む。注目すべきことに、第1プライマー伸長産物の長さは、工程104において添加されたポリメラーゼの不活性化のような技法により能動的に、または例えば制限反応物質の消費により反応が完了に向かうことを可能にすることによるかもしくは方法100の工程を実施する前の核酸鋳型の断片化により受動的に制御されることができる。
一側面において、方法100は、さらに1以上の精製工程を含むことができる。図説されている態様において、方法100は、第1プライマー伸長工程104および伸長停止工程106の後に第1精製工程108(すなわち精製1)を含む。工程108は、反応構成要素、例えば未使用のプライマー分子、プライマー伸長産物を作製するために用いられた鋳型核酸分子等からの第1プライマー伸長産物の精製に関するあらゆる適切な方法を含むことができる。ある態様において、工程108は、酵素消化、サイズ排除ベースの精製、親和性ベースの精製等またはそれらの組み合わせを含む。
方法100は、さらにアダプターライゲーションの工程110を含む。アダプターは、ホモポリマー尾部、ユニバーサルプライミング部位、試料識別子もしくは分子識別子(MID)、ユニーク識別子(UID)またはバーコード等およびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されないあらゆる適切な組成を有することができる。本明細書で記載されるように、アダプターをライゲーションする正確な方式は、アダプターがプライマー伸長産物と会合した状態になり下記のその後の工程を可能にする限り、重要ではない。一側面において、ユニバーサルプライミング部位を有するアダプターは、当該技術で利用可能なあらゆる一本鎖ライゲーション法により、第1プライマー伸長産物の一方または両方の末端に付加されることができる。
方法100は、さらに任意の第2プライマー伸長工程112を含むことができる。例えば、遊離の3’末端を有するライゲーションされたアダプターは、ポリメラーゼにより第1プライマー伸長産物の5’末端に向かって伸長されて二本鎖核酸生成物を作り出すことができる。第1標的特異的プライマーと比較して逆方向の第2標的特異的プライマーも、用いられることができる(図5)。その後、方法100は、アダプターライゲーション工程110および場合により第2プライマー伸長工程112の後に第2精製工程114(すなわち精製2)を含むことができる。第2精製工程114は、反応構成要素、例えば未使用のアダプター分子等の除去に有用であることができる。従って、工程110のライゲーションしなかったアダプターおよび副産物は、アダプターにライゲーションした第1(または第2)伸長産物からあらゆる適切な精製法により分離される。
方法100は、さらに増幅の工程116を含む。工程116は、線形または指数関数的増幅(例えばPCR)を含むことができる。一般に、工程116は、第1(または第2)のアダプターがライゲーションしたプライマー伸長産物の増幅を含む。ある態様において、プライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位が導入されている一方または両方の鎖の合成を支援することができるユニバーサルプライマーである(すなわち、二本鎖核酸の上および下の鎖両方が増幅反応の鋳型に相当する)。
増幅の工程116の後、方法100は、配列決定の工程118を含むことができる。工程116は、方法100の1以上の産物の核酸配列を決定するためのあらゆる方法を含むことができる。工程116は、さらに配列アラインメント、配列バリエーションの同定、独特のプライマー伸長産物の計数等またはそれらの組み合わせを含むことができる。ある態様において、追加の精製工程が、配列決定118の前に実施される。
実施例1.既知の融合標的の検出
この実施例において、アッセイの感度が、5つの臨床的に関連する融合遺伝子を発現することが知られている3つの細胞株を用いて評価された。24のALK、11のRETおよび15のROS1を含むRNA融合パネルを標的とするプライマー(プローブ)のセットが、設計された(表1)。
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パネルは、逆転写に関して10のプローブおよび第2伸長工程に関して42のプローブを用いて合計で61の標的(49の融合、10の野生型遺伝子および2のハウスキーピング遺伝子)をカバーしている。RNA PETEの作業の流れ(図1および2)を用いて作製されたライブラリーは、Illumina MiSeq機器上で配列決定された。元の細胞株中に存在することが報告された5つの融合の全てが、検出された。(ユニーク分子IDの計数に基づいて計算された)それぞれの融合癌遺伝子の重複排除された深度は、細胞株におけるそれらの発現レベルと相関していた。
この実験(逆転写工程)において、試料核酸は、プライマーと混合され、40℃でインキュベートされた。反応は、製造業者の説明書に従ってさらにdNTP、DTT、RNアーゼ阻害剤およびSuperScript(登録商標)III逆転写酵素(ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム)を含んでいた。試料中のプライマー伸長産物は、AMPureビーズ(Beckman Coulter、カリフォルニア州ブレア)を用いて精製された。アダプターが、T7リガーゼを25℃において5分間用いてライゲーションされた。試料中のライゲーション産物は、AMPureビーズを用いて精製された。DNAプライマー伸長は、Phusion(登録商標)DNAポリメラーゼ(ThermoFisher Scientific)を製造業者の説明書に従って硫酸アンモニウムの存在下で用いて実施された。伸長は、サーモサイクラー中で15サイクル実施された。試料中のプライマー伸長産物は、AMPureビーズを用いて精製された。
最終的なPETE生成物は、Phusion(登録商標)DNAポリメラーゼを用いてユニバーサルプライマーで28サイクルのPCRにより増幅された。増幅産物は、AMPureビーズを用いて精製された。成功したRNA PETEの結果が、図3において示されている。
実施例2:SPRIビーズクリーンアップに関するエキソヌクレアーゼIの代用
エキソヌクレアーゼIは、一本鎖DNAからの3’→5’方向でのヌクレオチドの除去を触媒する酵素である。本開示の文脈において、エキソヌクレアーゼI処理工程は、下流の作業の流れのための調製において過剰な一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを分解するための精製工程として含まれることができる。一側面において、エキソヌクレアーゼI処理は、代替の精製工程(例えば図4の工程108)に加えて、またはその代わりに用いられる。代替の精製法の例は、固相可逆固定化(SPRI)ビーズベースの精製法、カラムベースのクリーンアップ法、エタノール沈殿法等を含むことができる。第1プライマー伸長工程(例えば図4の工程104)後およびアダプターライゲーション工程(例えば図4の工程110)前の過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去のためのエキソヌクレアーゼIの使用は、過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去に関してSPRIビーズ精製と比較した場合に類似の結果を示すことが実証されている。さらに、エキソヌクレアーゼIの使用は、SPRIビーズ精製工程に頼る作業の流れと比較した場合に実施時間の全体的な長さを低減することにより本開示の方法を単純化することができる。
実施例3:単一の反応工程におけるPE2およびユニバーサルプライマー増幅の組み合わせ
ある態様において、本開示に従う方法は、第2標的特異的プライマー伸長工程と連続的にそれに続くユニバーサルプライマー増幅工程を含む。図4および5において図説されているように、アダプターライゲーション工程110および関係する反応精製工程の後、方法は、標的特異的プライマーを用いる第2プライマー伸長工程112およびユニバーサルプライマーを用いる増幅工程116を含むことができる。第2プライマー伸長工程112および増幅工程116は、組み合わせられて単一の工程112’になることができる(例えば、2つの工程は、中間のクリーンアップ工程、異なる反応条件等またはそれらの組み合わせを必要とすることなく単一の反応容器中で実施されることができる)。組み合わせられた工程112’が実施される場合、第2精製工程114は、方法100の工程112および工程114の間の中間工程として省略されることができる。図5は、さらに組み合わせられた工程112’を含む図3の方法100の一態様の工程を模式的に図説している。図4および5において図説されている組み合わせられたアプローチを用いて、逆方向標的特異的プライマーはユニバーサルプライマーと組み合わせられることができ、順次のプライマー伸長および増幅工程を含む方法と比較可能な結果を有することが、実証された。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程の1つの利点は、低減した総工程数による単純化された作業の流れに加えた全体の作業の流れの時間における低減である。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程に関する熱サイクルプロファイルの一例が、表2において示されている。
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実施例4:“ホットスタート”能力を有する熱安定性ポリメラーゼの使用
本開示に従って、熱的に不安定なポリメラーゼ(例えばBstポリメラーゼ)が、第1プライマー伸長工程(例えば図4の工程104)において用いられる。熱的に不安定なポリメラーゼを用いる場合、ポリメラーゼを反応混合物に変性後のプライマーハイブリダイゼーション工程(例えば図4の工程102)の間に添加することが有用であり得る。他の態様において、熱的に安定なポリメラーゼが、熱的に不安定なポリメラーゼの代わりに用いられる。熱的に安定なポリメラーゼの使用は、ポリメラーゼを増幅または伸長反応混合物に所与の標的核酸二重鎖の変性の前に添加することを可能にすることが実証されている。
実施例5:アダプターの改変
本明細書で記載される際、アダプターは、図2において示されており、図6および図7においてより詳細に示されているように、二本鎖領域およびライゲーション部位に相補的な一本鎖オーバーハングを含むことができる。組成物は、5’標的特異的プライマー領域202および3’伸長領域204を有するプライマー伸長産物200を含む。組成物は、さらに二本鎖領域208および一本鎖3’オーバーハング210を有する第1アダプター206ならびに二本鎖領域214および一本鎖5’オーバーハング216を有する第2アダプター212を含む。第2アダプター212の一本鎖5’オーバーハング216の標的特異的プライマー領域202の5’末端へのアニーリングは、結果として第2アダプター212の二本鎖領域214およびプライマー領域202の5’末端の間のギャップ218をもたらす。ギャップ218がニックである場合(すなわち、プライマー領域202の5’末端および隣接する二本鎖領域214の3’末端の間にはゼロヌクレオチド間隔が存在する)、その2つの鎖は、ギャップ218においてDNAリガーゼもしくは別の酵素、またはプライマー領域202の3’−OHおよび第2アダプター212の5’ホスフェートの間の反応を触媒することができる非酵素的試薬によりライゲーションされることができる。第1アダプター206は、同様に伸長された領域204の3’末端にアニーリングし、(例えばニック修復により)ライゲーションされることができる。
本開示によれば、アダプターの二本鎖部分のヌクレオチドにおける全体の長さの減少は下流の増幅反応における望まれない副産物(例えばプライマーダイマー)の形成を低減することができるという発見がなされている。図7においてさらに図説されているように、汎用アダプター212aは、二本鎖領域214aおよびプライマー領域202の5’末端にアニーリングするように設計されている一本鎖5’オーバーハング216aを含む。二本鎖領域214aは、[N]の全ヌクレオチド長を有し、ここでNは、アダプターヌクレオチドであり、iは、二本鎖領域214a中のヌクレオチドの数を表す整数である。類似の設計が、一本鎖領域210および二本鎖領域208を有するアダプター206に関して用いられる。
引き続き図7を参照して、二本鎖領域214bおよび一本鎖5’オーバーハング216bを有するアダプター212bは、N=10であるアダプター212aの一態様を図説している。二本鎖領域214cおよび一本鎖5’オーバーハング216cを有するアダプター212cは、N=15であるアダプター206aの一態様を図説している。本開示によれば、アダプター212bは、一般に、本明細書で開示される方法における使用に関してアダプター212cよりも優先的に選択されるであろう。一側面において、プライマー伸長産物へのライゲーションのためのアダプターは、10ヌクレオチド未満、9ヌクレオチド未満、8ヌクレオチド未満、7ヌクレオチド未満、6ヌクレオチド未満、5ヌクレオチド未満、4ヌクレオチド未満、3ヌクレオチド未満、2ヌクレオチド未満または1ヌクレオチド未満の二本鎖領域を有する。類似の考えが、一本鎖領域210および二本鎖領域208を有するアダプター206に関して用いられる。
別の側面において、アダプターの3’末端のホスフェート基(または別の同様のブロック基)によるブロックは下流の増幅反応において望ましくない副産物(例えばプライマーダイマー)の形成を低減することができるという発見が、なされている。さらに、エキソヌクレアーゼI精製工程およびライゲーション反応工程は、3’ホスフェートブロックがアダプターの一本鎖オーバーハングの設計中に含まれる場合、組み合わせられて単一の反応工程になることができることが、実証された。例えば、図4中の方法100の工程108(エキソヌクレアーゼI処理を含む)および工程110は、組み合わせられて単一の工程108’になることができる。さらに別の側面において、エキソヌクレアーゼIの熱不活性化はエキソヌクレアーゼ処理がアダプターライゲーションの前に実施される場合、必要とされないことが、実証された。例えば、図4中の方法100の場合、精製工程108およびアダプターライゲーション工程110の間におけるエキソヌクレアーゼIの熱不活性化を省略することが、有用である可能性がある。
実施例6:サブサイクリング
サブサイクリングは、異なるアニーリング温度を有する一連のサイクルの組み合わせを含むPCRに関する熱サイクルの改変された方法である。一側面において、サブサイクリングは、多重PCR法の間にある標的配列の増幅が別の標的配列の増幅を上回るような偏りを制限するために用いられることができる(例えば、Guido N. et al., 2016. PLoS ONE 11(6): e0156478; Liu Q. et al., 1998. Biotechniques 25(6):1022-8参照)。本開示に従う第1プライマー伸長反応において実施された場合、サブサイクリングは、標的的中率(図8)および均一性を向上させることが示されている。標的的中率は、第1プライマー、インサート配列および逆方向標的特異的プライマーを配列決定の読みの長さがそれらをカバーする場合に含む、予想される標的にマッチするクオリティフィルタリングされた読みのパーセントとして定義される。第1プライミング事象および第2プライミング事象に関するサブサイクリング熱サイクルプログラムの例が、それぞれ表3および4において示されている。データの均一性は、平均の0.5倍〜2.0倍に入る標的の百分率を同定することにより決定された。181の異なる標的の中で、130の標的(71.8%)は、平均の0.5倍〜2.0倍の標準化された深度を有していた。アンプリコンのGC含有率の関数として測定された場合、181の異なる標的の中で、146の標的(80.7%)が、平均の0.5倍〜2.0倍の標準化された深度を有していた。
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表3において、サブサイクリングは、工程4および5において含まれており、一方で表4において、サブサイクリングは、工程5および6において含まれている。注目すべきことに、表4は、工程5および6の反復が工程2〜7の反復内に入れ子になっている熱サイクルプロファイルを示している。例えば、工程2〜7の単一のサイクルは、以下の工程の配列を順に含むであろう:2、3、4、5、6、5、6、5、6、5、6、7。
実施例7:完全なユニバーサルアダプターを有する遺伝子特異的プライマー
一側面において、ユニバーサルアダプター、インデックス(MID)配列またはそれらの組み合わせを有する遺伝子特異的プライマー(Gene Sp.1、UID、MID、ユニバーサルプライマーA)を生成することが、有用であり得る。図9を参照して、UIDおよびMIDの一方または両方を有するプライマーの使用は、本開示に従う方法の第1プライマー伸長工程の間の第1プライマー伸長産物のインデックス化を可能にし、それにより偽陽性の結果をもたらし得る下流の相互混入の可能性を低減する。
実施例8(仮想例):プライマー伸長標的濃縮のドロップレットデジタルPCR(ddPCR)への適用。
ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、水−油エマルジョン液滴技術に基づくデジタルPCRを実施するための方法である。試料は、数千個の液滴中に分画され、鋳型分子のPCR増幅が、それぞれの個々の液滴中で行われる。図10を参照して、本開示に従う方法は、ddPCRへの適用に適合させられることができる。一側面において、ddPCRに有用なプライマー(例えば逆方向プライマーおよびユニバーサルプライマー)は、第1プライマー伸長産物およびエキソヌクレアーゼIと組み合わせられることができる。注目すべきことに、本開示に従うプライマー伸長による標的濃縮は、次世代配列決定に関する高度に多重化されたアンプリコン生成に関する能力を有する。さらに、その方法は、標的特異的Taqmanプローブと共にddPCRにおいて用いられた場合、標的核酸の計数を可能にするために適用されることができる。
本発明は特定の実施例への参照により詳細に記載されてきたが、当業者には、様々な改変が本発明の範囲内でなされることができることは、明らかであろう。従って、本発明の範囲は、本明細書で記載された実施例によってではなく下記で提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。
100 方法
102 プライマーハイブリダイゼーションに関する工程
102’ 工程
104 プライマー伸長の工程
106 伸長停止の工程
108 第1精製工程
108’ 工程
110 アダプターライゲーション工程
112 第2プライマー伸長工程
112’ 工程
114 第2精製工程
116 増幅の工程
118 配列決定の工程
200 プライマー伸長産物
202 5’標的特異的プライマー領域
204 3’伸長領域
206 第1アダプター
208 二本鎖領域
210 一本鎖3’オーバーハング
212 第2アダプター
212a 一般的アダプター
212b アダプター
214 二本鎖領域
214a 二本鎖領域
214b 二本鎖領域
214c 二本鎖領域
216 一本鎖5’オーバーハング
216a 一本鎖5’オーバーハング
216b 一本鎖5’オーバーハング
216c 一本鎖5’オーバーハング
218 ギャップ

Claims (20)

  1. 試料に含まれるDNAおよびRNA由来の標的ポリヌクレオチドを同時に濃縮する方法であって、該方法が、以下:
    a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
    b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
    d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
    e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼで伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること;
    g)該試料を、5’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該5’オーバーハングは、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
    h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
    i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
    j)第3標的特異的プライマーを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
    k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;
    を含む、前記方法。
  2. 該アダプターのより短い鎖の長さが、該5’オーバーハングの長さの1.5倍より短いかまたは1.5倍に等しい、請求項1に記載の方法。
  3. 該アダプターが、3’末端において伸長ブロックを含む、請求項1または2に記載の方法。
  4. 該伸長ブロックが、3’または2’ホスフェート基である、請求項3に記載の方法。
  5. 該第1および第2標的特異的プライマーの少なくとも一方が、バーコードを含む、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  6. 該バーコードが、ユニーク分子バーコード(UID)および試料バーコード(SID)である、請求項5に記載の方法。
  7. 工程k)における増幅が、デジタルドロップレットPCRを含む、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  8. 試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程:
    a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
    b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
    d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
    e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    f)該ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること;
    g)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
    h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
    i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
    j)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物に、第4プライマーを該第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
    k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;
    を含む、前記方法。
  9. 該第1および第2標的特異的プライマーが、ユニーク分子バーコードを含む、請求項に記載の方法。
  10. 試料からの標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法が、以下の工程:
    a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
    b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
    c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
    d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
    e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること;
    f)該ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
    g)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
    h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
    i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
    j)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物に、第4標的特異的プライマーを該第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
    k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;ならびに
    l)工程k)からの該増幅されたライゲーション産物を配列決定すること;
    を含む、前記方法。
  11. ユニバーサルプライマーが、配列決定プライマーとして用いられる、請求項10に記載の方法。
  12. 該第3および第4標的特異的プライマーが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項10に記載の方法。
  13. 該アダプターが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 該アダプターが、さらにバーコードを含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 該バーコードが、試料同定バーコードである、請求項14に記載の方法。
  16. 試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するためのキットであって、以下:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター(ここで、該より長い鎖は、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む);を含む、前記キット。
  17. さらに、ユニバーサルプライマーならびにDNAライゲーションおよびDNA増幅のための試薬を含む、請求項16に記載のキット。
  18. さらに、該濃縮されたDNAおよびRNA標的を配列決定するための試薬を含む、請求項16または17に記載のキット。
  19. 試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するための反応混合物であって、以下:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターを含み、該より長い鎖が、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖が、ユニバーサルプライミング部位を含む、前記反応混合物。
  20. 試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程:
    a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
    b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域を含み;
    c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
    d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
    e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    f)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み;
    g)該ハイブリダイズした第2および第3標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2および第3プライマー伸長産物を形成すること;
    h)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
    i)該アダプターを該第2および第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
    j)該アダプターの一方の鎖を該第2および第3プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
    k)第4標的特異的プライマーを該第2プライマー伸長産物に、第5プライマーを該第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第4および第5標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
    l)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること
    を含む、前記方法。
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