JP6970205B2 - Dnaおよびrnaの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上 - Google Patents
Dnaおよびrnaの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上 Download PDFInfo
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Description
a)標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼで伸長してプライマー伸長産物を形成し;
d)試料を5’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、5’オーバーハングは、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
e)アダプターをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
f)アダプターの一方の鎖をプライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
g)第2標的特異的プライマーをプライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第2標的特異的プライマーは標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
h)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成し;
g)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)アダプターを第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
i)アダプターの一方の鎖を第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
j)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物に、第4プライマーを第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;そして
k)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ;
f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成し、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
g)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、第1および第2標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)アダプターを第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
i)アダプターの一方の鎖を第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
j)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物に、第4標的特異的プライマーを第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
k)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅し;
l)工程k)からの増幅されたライゲーション産物を配列決定する。
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供し;
b)第1標的特異的プライマーを標的ポリヌクレオチドの一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域を含み;
c)ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成し;
d)試料を二本鎖核酸変性条件下に置き;
e)第2標的特異的プライマーを変性したDNAにハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)第3標的特異的プライマーを第1プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
g)ハイブリダイズした第2および第3標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2および第3プライマー伸長産物を形成し;
h)試料をより長い鎖、より短い鎖を含むアダプターと接触させ、ここで、より長い鎖は、標的特異的プライマー中の領域に相補的な領域を含み、より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
i)アダプターを第2および第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ;
j)アダプターの一方の鎖を第2および第3プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成し;
k)第4標的特異的プライマーを第2プライマー伸長産物に、第5プライマーを第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせ、ここで、第4および第5標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;そして
l)ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用してライゲーション産物を増幅する。
別途定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第4版 Cold Spring Harbor Lab Press (2012)を参照。
用語“バーコード”は、検出および同定されることができる核酸配列を指す。バーコードは、一般に2以上かつ約50までのヌクレオチド長であることができる。バーコードは、集団中の他のバーコードと少なくとも最低限の数の違いを有するように設計されている。バーコードは、試料中のそれぞれの分子に独特であることができ、または試料に独特であり試料中の多数の分子により共有されることができる。
ある態様において、本発明は、中間の精製工程を含む。ある態様において、未使用のDNAおよびRNA一本鎖は、エキソヌクレアーゼにより除去される。ある態様において、未使用のプライマーおよびアダプターは、例えばゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択法により除去される。ある態様において、サイズ選択は、Beckman Coulter(カリフォルニア州ブレア)からの固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization)(SPRI)技術を用いて実施されることができる。
この実施例において、アッセイの感度が、5つの臨床的に関連する融合遺伝子を発現することが知られている3つの細胞株を用いて評価された。24のALK、11のRETおよび15のROS1を含むRNA融合パネルを標的とするプライマー(プローブ)のセットが、設計された(表1)。
エキソヌクレアーゼIは、一本鎖DNAからの3’→5’方向でのヌクレオチドの除去を触媒する酵素である。本開示の文脈において、エキソヌクレアーゼI処理工程は、下流の作業の流れのための調製において過剰な一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを分解するための精製工程として含まれることができる。一側面において、エキソヌクレアーゼI処理は、代替の精製工程(例えば図4の工程108)に加えて、またはその代わりに用いられる。代替の精製法の例は、固相可逆固定化(SPRI)ビーズベースの精製法、カラムベースのクリーンアップ法、エタノール沈殿法等を含むことができる。第1プライマー伸長工程(例えば図4の工程104)後およびアダプターライゲーション工程(例えば図4の工程110)前の過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去のためのエキソヌクレアーゼIの使用は、過剰なプライマーオリゴヌクレオチドの除去に関してSPRIビーズ精製と比較した場合に類似の結果を示すことが実証されている。さらに、エキソヌクレアーゼIの使用は、SPRIビーズ精製工程に頼る作業の流れと比較した場合に実施時間の全体的な長さを低減することにより本開示の方法を単純化することができる。
ある態様において、本開示に従う方法は、第2標的特異的プライマー伸長工程と連続的にそれに続くユニバーサルプライマー増幅工程を含む。図4および5において図説されているように、アダプターライゲーション工程110および関係する反応精製工程の後、方法は、標的特異的プライマーを用いる第2プライマー伸長工程112およびユニバーサルプライマーを用いる増幅工程116を含むことができる。第2プライマー伸長工程112および増幅工程116は、組み合わせられて単一の工程112’になることができる(例えば、2つの工程は、中間のクリーンアップ工程、異なる反応条件等またはそれらの組み合わせを必要とすることなく単一の反応容器中で実施されることができる)。組み合わせられた工程112’が実施される場合、第2精製工程114は、方法100の工程112および工程114の間の中間工程として省略されることができる。図5は、さらに組み合わせられた工程112’を含む図3の方法100の一態様の工程を模式的に図説している。図4および5において図説されている組み合わせられたアプローチを用いて、逆方向標的特異的プライマーはユニバーサルプライマーと組み合わせられることができ、順次のプライマー伸長および増幅工程を含む方法と比較可能な結果を有することが、実証された。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程の1つの利点は、低減した総工程数による単純化された作業の流れに加えた全体の作業の流れの時間における低減である。プライマー伸長およびユニバーサル増幅の組み合わせられた工程に関する熱サイクルプロファイルの一例が、表2において示されている。
本開示に従って、熱的に不安定なポリメラーゼ(例えばBstポリメラーゼ)が、第1プライマー伸長工程(例えば図4の工程104)において用いられる。熱的に不安定なポリメラーゼを用いる場合、ポリメラーゼを反応混合物に変性後のプライマーハイブリダイゼーション工程(例えば図4の工程102)の間に添加することが有用であり得る。他の態様において、熱的に安定なポリメラーゼが、熱的に不安定なポリメラーゼの代わりに用いられる。熱的に安定なポリメラーゼの使用は、ポリメラーゼを増幅または伸長反応混合物に所与の標的核酸二重鎖の変性の前に添加することを可能にすることが実証されている。
本明細書で記載される際、アダプターは、図2において示されており、図6および図7においてより詳細に示されているように、二本鎖領域およびライゲーション部位に相補的な一本鎖オーバーハングを含むことができる。組成物は、5’標的特異的プライマー領域202および3’伸長領域204を有するプライマー伸長産物200を含む。組成物は、さらに二本鎖領域208および一本鎖3’オーバーハング210を有する第1アダプター206ならびに二本鎖領域214および一本鎖5’オーバーハング216を有する第2アダプター212を含む。第2アダプター212の一本鎖5’オーバーハング216の標的特異的プライマー領域202の5’末端へのアニーリングは、結果として第2アダプター212の二本鎖領域214およびプライマー領域202の5’末端の間のギャップ218をもたらす。ギャップ218がニックである場合(すなわち、プライマー領域202の5’末端および隣接する二本鎖領域214の3’末端の間にはゼロヌクレオチド間隔が存在する)、その2つの鎖は、ギャップ218においてDNAリガーゼもしくは別の酵素、またはプライマー領域202の3’−OHおよび第2アダプター212の5’ホスフェートの間の反応を触媒することができる非酵素的試薬によりライゲーションされることができる。第1アダプター206は、同様に伸長された領域204の3’末端にアニーリングし、(例えばニック修復により)ライゲーションされることができる。
サブサイクリングは、異なるアニーリング温度を有する一連のサイクルの組み合わせを含むPCRに関する熱サイクルの改変された方法である。一側面において、サブサイクリングは、多重PCR法の間にある標的配列の増幅が別の標的配列の増幅を上回るような偏りを制限するために用いられることができる(例えば、Guido N. et al., 2016. PLoS ONE 11(6): e0156478; Liu Q. et al., 1998. Biotechniques 25(6):1022-8参照)。本開示に従う第1プライマー伸長反応において実施された場合、サブサイクリングは、標的的中率(図8)および均一性を向上させることが示されている。標的的中率は、第1プライマー、インサート配列および逆方向標的特異的プライマーを配列決定の読みの長さがそれらをカバーする場合に含む、予想される標的にマッチするクオリティフィルタリングされた読みのパーセントとして定義される。第1プライミング事象および第2プライミング事象に関するサブサイクリング熱サイクルプログラムの例が、それぞれ表3および4において示されている。データの均一性は、平均の0.5倍〜2.0倍に入る標的の百分率を同定することにより決定された。181の異なる標的の中で、130の標的(71.8%)は、平均の0.5倍〜2.0倍の標準化された深度を有していた。アンプリコンのGC含有率の関数として測定された場合、181の異なる標的の中で、146の標的(80.7%)が、平均の0.5倍〜2.0倍の標準化された深度を有していた。
一側面において、ユニバーサルアダプター、インデックス(MID)配列またはそれらの組み合わせを有する遺伝子特異的プライマー(Gene Sp.1、UID、MID、ユニバーサルプライマーA)を生成することが、有用であり得る。図9を参照して、UIDおよびMIDの一方または両方を有するプライマーの使用は、本開示に従う方法の第1プライマー伸長工程の間の第1プライマー伸長産物のインデックス化を可能にし、それにより偽陽性の結果をもたらし得る下流の相互混入の可能性を低減する。
ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、水−油エマルジョン液滴技術に基づくデジタルPCRを実施するための方法である。試料は、数千個の液滴中に分画され、鋳型分子のPCR増幅が、それぞれの個々の液滴中で行われる。図10を参照して、本開示に従う方法は、ddPCRへの適用に適合させられることができる。一側面において、ddPCRに有用なプライマー(例えば逆方向プライマーおよびユニバーサルプライマー)は、第1プライマー伸長産物およびエキソヌクレアーゼIと組み合わせられることができる。注目すべきことに、本開示に従うプライマー伸長による標的濃縮は、次世代配列決定に関する高度に多重化されたアンプリコン生成に関する能力を有する。さらに、その方法は、標的特異的Taqmanプローブと共にddPCRにおいて用いられた場合、標的核酸の計数を可能にするために適用されることができる。
102 プライマーハイブリダイゼーションに関する工程
102’ 工程
104 プライマー伸長の工程
106 伸長停止の工程
108 第1精製工程
108’ 工程
110 アダプターライゲーション工程
112 第2プライマー伸長工程
112’ 工程
114 第2精製工程
116 増幅の工程
118 配列決定の工程
200 プライマー伸長産物
202 5’標的特異的プライマー領域
204 3’伸長領域
206 第1アダプター
208 二本鎖領域
210 一本鎖3’オーバーハング
212 第2アダプター
212a 一般的アダプター
212b アダプター
214 二本鎖領域
214a 二本鎖領域
214b 二本鎖領域
214c 二本鎖領域
216 一本鎖5’オーバーハング
216a 一本鎖5’オーバーハング
216b 一本鎖5’オーバーハング
216c 一本鎖5’オーバーハング
218 ギャップ
Claims (20)
- 試料に含まれるDNAおよびRNA由来の標的ポリヌクレオチドを同時に濃縮する方法であって、該方法が、以下:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼで伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること;
g)該試料を、5’オーバーハングを有するより長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該5’オーバーハングは、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
j)第3標的特異的プライマーを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;
を含む、前記方法。 - 該アダプターのより短い鎖の長さが、該5’オーバーハングの長さの1.5倍より短いかまたは1.5倍に等しい、請求項1に記載の方法。
- 該アダプターが、3’末端において伸長ブロックを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 該伸長ブロックが、3’または2’ホスフェート基である、請求項3に記載の方法。
- 該第1および第2標的特異的プライマーの少なくとも一方が、バーコードを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 該バーコードが、ユニーク分子バーコード(UID)および試料バーコード(SID)である、請求項5に記載の方法。
- 工程k)における増幅が、デジタルドロップレットPCRを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態の両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)該ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること;
g)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
j)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物に、第4プライマーを該第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;
を含む、前記方法。 - 該第1および第2標的特異的プライマーが、ユニーク分子バーコードを含む、請求項8に記載の方法。
- 試料からの標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法が、以下の工程:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること;
f)該ハイブリダイズした第2標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2プライマー伸長産物を形成すること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターとの相補性を有する領域を含み;
g)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
h)該アダプターを該第1および第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
i)該アダプターの一方の鎖を該第1および第2プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
j)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物に、第4標的特異的プライマーを該第2プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第3および第4標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;
k)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること;ならびに
l)工程k)からの該増幅されたライゲーション産物を配列決定すること;
を含む、前記方法。 - ユニバーサルプライマーが、配列決定プライマーとして用いられる、請求項10に記載の方法。
- 該第3および第4標的特異的プライマーが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項10に記載の方法。
- 該アダプターが、さらに配列決定プライマー結合部位を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 該アダプターが、さらにバーコードを含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 該バーコードが、試料同定バーコードである、請求項14に記載の方法。
- 試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するためのキットであって、以下:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含むアダプター(ここで、該より長い鎖は、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含む);を含む、前記キット。
- さらに、ユニバーサルプライマーならびにDNAライゲーションおよびDNA増幅のための試薬を含む、請求項16に記載のキット。
- さらに、該濃縮されたDNAおよびRNA標的を配列決定するための試薬を含む、請求項16または17に記載のキット。
- 試料からのDNAおよびRNA標的を同時に濃縮するための反応混合物であって、以下:標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含む第1標的特異的プライマー、逆転写酵素、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含む第2標的特異的プライマー、第2プライマー伸長産物を形成するためのDNAポリメラーゼ;より長い鎖およびより短い鎖を含む該アダプターを含み、該より長い鎖が、該第1および第2標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖が、ユニバーサルプライミング部位を含む、前記反応混合物。
- 試料からの標的ポリヌクレオチドを濃縮する方法であって、該方法が、以下の工程:
a)一本鎖RNAおよび二本鎖DNA形態両方の該標的ポリヌクレオチドを含む試料を提供すること;
b)第1標的特異的プライマーを該標的ポリヌクレオチドの該一本鎖RNA形態にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域を含み;
c)該ハイブリダイズした第1標的特異的プライマーを逆転写酵素により伸長して、RNA鎖および第1プライマー伸長産物を含む二本鎖RNA−DNAハイブリッドを形成すること;
d)該試料を二本鎖核酸変性条件下に置くこと;
e)第2標的特異的プライマーを、二本鎖DNAに由来する変性したDNAおよびc)で形成した二本鎖RNA−DNAハイブリッドに由来する変性したDNAにハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域およびアダプターに対する相補性を有する領域を含み;
f)第3標的特異的プライマーを該第1プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該プライマーは、標的結合領域および該アダプターに対する相補性を有する領域を含み;
g)該ハイブリダイズした第2および第3標的特異的プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長して第2および第3プライマー伸長産物を形成すること;
h)該試料をより長い鎖、より短い鎖を含む該アダプターと接触させること、ここで、該より長い鎖は、該標的特異的プライマー中の該領域に相補的な領域を含み、該より短い鎖は、ユニバーサルプライミング部位を含み;
i)該アダプターを該第2および第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること;
j)該アダプターの一方の鎖を該第2および第3プライマー伸長産物にライゲーションしてライゲーション産物を形成すること;
k)第4標的特異的プライマーを該第2プライマー伸長産物に、第5プライマーを該第3プライマー伸長産物にハイブリダイズさせること、ここで、該第4および第5標的特異的プライマーは、標的結合部位およびユニバーサルプライミング部位を含み;ならびに
l)該ユニバーサルプライミング部位にハイブリダイズしているプライマーを利用して該ライゲーション産物を増幅すること
を含む、前記方法。
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