CN103589803B - Rna和dna双外参以及dna内参实时定量荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，包括步骤：选定外参基因和内参基因；制备外参基因mRNA与DNA的预混合液；收集样品及预混合液的总mRNA和DNA；实时定量荧光PCR，检测外参基因和待测基因的mRNA和DNA拷贝数以及内参基因DNA拷贝数，从而同时得到基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量，为基因样本检测及机理研究提供了多层次信息。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法。
背景技术
自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。Northern杂交方法是最早被用来测定基因转录量的方法。后来，结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR(reverse transcription-PCR，即：逆转录-聚合酶链式反应)提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。近年来，实时定量聚合酶链式反应(简称为：qPCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主要方法。上述方法为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常将待测基因的转录水平表示为与一个参考值(内参基因mRNA水平、细胞内总RNA水平)的相对表达量。内参通常为看家基因，如：β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，由于不同组织来源、或同一组织在不同条件下，细胞的总RNA量和／或内参的量并不恒定，因此，基于该前提所进行的基因转录水平检测往往不准确。针对这一问题，我们曾经提出“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”，检测基因在某个时刻、某个细胞状态下的mRNA和DNA的比值，确定该基因每个DNA拷贝的转录水平，并将其命名为表观表达水平[1](专利号：ZL200910049306.5)。这一概念的提出和技术的实现使得任一基因的mRNA水平直接与基因拷贝数建立关联，由此，同一基因的表观表达水平在不同组织之间、同一组织不同条件之间、不同批次实验之间可以进行比较，不同基因的启动子之间也可以进行比较，能够为基因表达调控研究提供最本质的信息。
然而，我们注意到，近年来拷贝数变异(copy number variations，CNVs)引起人们越来越多的关注。CNVs指长度超过1k的片段在基因组上拷贝数的变化，涉及缺失或复制两类事件。CNVs在基因组中分布相当普遍，以人类基因组为例，CNV可能影响到约2％的基因组序列[2]。其中一部分CNVs通过改变基因表达量、生成截断的蛋白产物、影响调控序列等方式造成样本间表型的差异，包括疾病的发生。由于CNV事件的存在，当我们运用“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”检测到某个基因在不同样本间具有相同的表观表达值(每个基因拷贝的表达量)，尽管该方法相对传统qPCR方法检测到了更加精确的表达水平，但仍然不能确定地判断该基因在细胞水平的表达量是否存在样本间差异。因此，如何能同时获得表观表达值和细胞水平表达值，并解析基因表达水平发生改变的机制性原因，成为急待解决的具有现实意义和理论意义的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，从而同时检测得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量。
本发明的目的之一是提供了一种RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，步骤如下：
1)选定外参基因，配制具有一定比例的外参基因mRNA与DNA的预混合液；其中，所述外参基因为待测样品中不存在的序列。
其中，所述外参基因的选定原则与预混液中外参基因mRNA与DNA的比值选择可参考专利.RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)。2)选定内参基因，所述内参基因选自不容易发生拷贝数变异的CNV冷区的DNA序列。
其中，所述内参基因的选定为，收集以往研究公开报道的“CNV冷区”序列信息，即不容易发生拷贝数变异的DNA区域序列数据。以大鼠为例，整条18号染色体均为CNV冷区[3，4]；以人类基因组为例，从数据库-人类基因组为例，从数据库E.DATA，成为急待解决的具(http：／／dgv.tcag.ca／dgv／app／home)[5]中获取了人基因组中目前鉴定到的所有CNV序列信息，从人基因组全序列中扣除这些信息，即得到了CNV冷区序列。
3)将步骤1)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总mRNA和总DNA；
4)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR，扩增反应后，检测待测基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数、外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数，以及内参基因DNA扩增产物的拷贝数；根据如下公式计算分别得到待测基因的表观表达水平、待测基因的DNA拷贝数相对量、以及待测基因的细胞水平相对表达量：
待测基因的细胞水平相对表达量＝
待测基因的表现表达水平×待测基因的DNA拷贝数相对量。
上述步骤中，外参基因、载体的选择标准，预混合液、cDNA、引物等的制备原则和步骤，以及基因表观表达水平的计算，可参考专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)。
相对现有技术“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”，本发明新增了来自基因组CNV冷区的内参基因，用于标定待测基因的DNA拷贝数，使得基因的DNA拷贝数在样本间可比，从而可以同时得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量，为临床样本检测和机理研究提供不同层次的信息。本发明提供的是一种非诊断目的的检测方法。本发明应用RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR方法并同时检测原有基因表达检测体系中内参基因的DNA拷贝数、基于该值计算所有待测基因的DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量。
本发明还提供了将上述检测方法在同时检测待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量中的应用。
本发明采用RNA和DNA双外参分别跟踪标定样品中的转录产物和基因的拷贝数，使基因的转录水平与基因拷贝数相关联，得到单个基因拷贝的表达水平，即表观表达值；与此同时，用DNA内参标定待测基因的拷贝数，使得基因拷贝数在样本间可比。由此可以同时获得三个层面的信息：基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量。对于待测基因，其细胞水平相对表达量由其表观表达水平和DNA拷贝数相对量共同决定。而在不同组织或状态下，表观表达水平和DNA拷贝数各自对待测基因细胞水平相对表达量变化的影响作用不同。因此，同时考察这三个层面的信息，对于基因表达水平的检测和表达调控机制的研究有着十分重要的意义。
本发明的方法不依赖样本，可以广泛使用，支持跨平台数据比较，能够为临床样本检测、以及基因表达调控和DNA遗传学改变的机理研究提供不同层次的信息。
本发明有关的参考文献包括如下：
1.Zhang，Y.，et al.，Transcription level of messenger RNA per gene copy determined withdual-spike-in strategy.Anal Biochem，2009.394(2)：p.202-8.
2.Cooper，G.M.，D.A.Nickerson，and E.E.Eichler，Mutational and selective effects oncopy-number variants in the human genome.Nat Genet，2007.39(7Suppl)：p.S22-9.
3.Guryev，V.，et al.，Distribution and functional impact of DNA copy number variation inthe rat.Nat Genet，2008.40(5)：p.538-45.
4.Ye，Z.Q.，et al.，Analyses of copy number variation of GK rat reveal new putative type2diabetes susceptibility loci.PLoS One，2010.5(11)：p.e14077.
5.Zhang，J.，et al.，Development of bioinformatics resources for display and analyis ofcopy number and other structural variants in the human genome.Cytogenet Genome Res.2006.115(3-4)：p.205-14.
附图说明
图1质粒pPigT.7的结构示意图。
图2质粒FFa2A3IFP2的结构示意图。
图3bacmidAcA3IFP2的结构示意图。
图4IFP2DNA标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书及等同内容为保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1：本实施例以家蚕为研究对象，使用双外参实时定量PCR方法检测方法同时检测了各待测基因在家蚕中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠抽提物等多种组织中的RNA和DNA拷贝数，以及内参基因A3在这些组织中的DNA拷贝数。首先，基于各待测基因和内参基因在各组织中的DNA拷贝数，计算得到各待测基因在各组织中的DNA拷贝数相对量。基于所得的各待测基因在各组织中的表观表达水平和DNA拷贝数相对量，根据细胞水平相对量的表达公式，计算得到各待测基因在各组织中的细胞水平相对表达量。
1.实验蚕的处理：
实验蚕54A的卵由中国农业科学研究院蚕业研究所提供，催青、孵化后用人工饲料在25℃饲养。幼虫长到5龄第3天解剖，取中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠，重蒸水洗3次后-70℃保存。
2.内参基因的选择和确定：
选择和确定内参基因是根据以往研究所报道的“CNV冷区”序列信息，即不容易发生拷贝数变异的DNA区域序列数据。本实施例中选择家蚕中的处于“CNV冷区”的Actin-3基因作为内参基因。
3.RNA和DNA外参的选择与制备：
piggyBac转座子来源于鳞翅目细胞系TN-368，由2个转座臂和一个转座酶IFP2的编码序列组成。由于IFP2不存在于家蚕中，因此被选为本实施例的外参。
将T7-IFP2表达框插入载体pUC19中制得质粒pPigT.7(4983bp，结构见图1)。用限制性内切酶Hind III将质粒pPigT.7线性化，然后用T7RNA聚合酶通过体外转录制备外参RNA，即IFP2RNA。最后用DEPC-H20将IFP2RNA稀释成浓度为1ng／μl(即7.605×108拷贝／μl)的溶液。
为了使外参DNA与被跟踪标定的DNA在各种处理过程(酒精沉淀，RNA的反转录，用于芯片测定时的DNA随机引物延伸等)中行为一致，本实施例选用含IFP2的bacmidAcA3IFP2(～134kb)(结构见图2)作为外参DNA。含IFP2的bacmidAcA3IFP2的制备方法为：将质粒FFa2A3IFP2(将A3-IFP2表达框插入载体pFFa2中制得，结构见图2)转入bacmid AcΔEGT得到bacmid AcA3IFP2(结构见图3)。
通过实时定量PCR方法，以Hind III线性化的pPigT7为标准，检测AcA3IFP2的浓度，检测方法如下：实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃5sec，55℃10sec，72℃10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度77℃。检测结果如图4所示，经过计算可知AcA3IFP2DNA外参的浓度为9.341×106拷贝／μl。
将等体积的外参IFP2RNA和AcA3IFP2混合，2μl混合液中含DNA外参9.341×106拷贝，RNA外参7.605×108拷贝，二者之比为1：81.4。将它们加到100mg家蚕组织匀浆液中。
4.待测样品处理：
依产品说明书用TRNzol-A+Total RNA试剂(Tiangen Biotech Co.，LTD Beijing，China)分别抽提家蚕各组织的总RNA和DNA，步骤如下：
将待检测组织研磨后将1ml抽提液加到100mg组织样品中，同时加2μl IFP2RNA和AcA3IFP2的预混合液，使之充分混合，裂解细胞并且溶解细胞内含物。在12,000rpm的转速下离心15min，分别收集RNA和DNA部分。
总RNA部分用DNase I处理后进行逆转录，合成第一条cDNA链。20μl反应体系：4μl5×反应缓冲液，1μg总RNA，4种dNTP各0.5mM，25单位RNasin(核酸酶抑制剂)，1μl50μM(dN)6，2μl10μM oligo(dT15)及200单位M-MuLV逆转录酶(200U／μl；TaKaRa)。
本实施例中的内参基因为Actin-3，待测基因包括：28s rRNA、IFP-2、GAPDH等。
5.实时定量PCR引物：
为减少由不同引物和扩增片段带来的实验系统误差，本实施例中对同一基因测定其RNA和DNA的拷贝数时采用相同的引物对，并设计在同一外显子中。扩增产物的长度在144bp到152bp之间。
针对各待测基因和内参基因以及外参基因IFP2的引物见表1。
表1实时定量PCR引物
5、实时定量PCR的条件如下：
实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃5sec，55℃10sec，72℃10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度依据扩增产物而定(具体温度参见表1)。
6、实时定量PCR检测的数据处理及实验结果：
实验结果1：表观表达水平
根据以下公式，分别计算内参基因A3、待测基因GAPDH和28S rRNA在家蚕五种组织(中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管、中肠)中的表观表达水平。
以内参基因A3在后部丝腺的表观表达水平为例：
在用实时定量PCR测定了内参基因的RNA和DNA拷贝数后，计算内参基因的RNA与DNA之比，并用实时定量PCR测定的外参基因的RNA与DNA之比进行归一化，再乘以预混合液中外参基因的RNA与DNA之比(81.4)进行归一化。
其中，第一步归一化的目的是用于去除诸如酒精沉淀、逆转录效率和PCR等技术上的问题；第二步归一化的目的是用于去除RNA和DNA样品处理过程带来的差别。通过上述两步归一化，可以准确地计算出某组织中的待测基因在某个条件下，每个拷贝的表达水平。计算公式如下：
PCR扩增时样品中初始拷贝数越高，则荧光信号强度超过阈值(T)时的扩增圈数C(T)就越小；C(T)值与初始拷贝数的对数成线性关系：C(T)=a×lg(copy)+b，a和b分别是直线方程的斜率和截距。根据数学运算lg(copy1／copy2)=(C(T)1-C(T)2)÷a.
C(T)=a×lg(copy)+b，
C(T)1=a×lg(copy1)+b………………………………………………………………(1)
C(T)2=a×lg(copy2)+b………………………………………………………………(2)
(1)式-(2)式可得：
C(T)1-C(T)2=a×(lgcopy1-lgcopy2)
所以可得：lg(copy1/copy2)=[C(T)1-C(T)2]÷a
即：
第一步归一：
第二步归一：
由于IFP2基因的RNA与IFP2基因的DNA的初始含量之比为81.4，因此经过两步归一步骤后可知，
同时因为：
可得：
A3基因在后部丝腺测定结果计算步骤如下：
三次RNA测定的C(T)值的平均为23.101，
三次DNA测定的C(T)值的平均为31.452，
A3基因PCR扩增反应的a值是-3.120，
lg(A3mRNA／A3DNA)=(23.101-31.452)÷(-3.120)=2.675
(A3mRNA／A3DNA)=102.675=473.15
外参IFP2在后部丝腺测定结果：
四次RNA测定的C(T)值的平均为20.27625，
六次DNA测定的C(T)值的平均为29.6242，
外参IFP2PCR扩增反应的a值是-3.6882，
lg(IFP2RNA／IFP2DNA)=(20.27625-29.6242)÷(-3.6882)=2.535
(IFP2RNA／IFP2DNA)=102.535=342.77
A3基因在后部丝腺的表观表达水平=473.15÷342.77×81.4=112.35
实验数据及结果见下表2。
表2家蚕5种组织中内参基因A3、待测基因GAPDH和28S rRNA的表观表达水平
| 中部丝腺 | 后部丝腺 | 脂肪体 | 马氏管 | 中肠 | |
| A3 | 112.35 | 1207.6 | 522.12 | 400.70 | 9.9050 |
| GAPDH | 10.620 | 166.64 | 11780 | 142.41 | 6.3244 |
| 28S rRNA | 5463.7 | 8849.4 | 95425 | 2872.5 | 2121.2 |
如表2所示，家蚕中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠等组织中内参基因A3的表观转录水平与各组织的能量代谢的能力相关，变化非常大，在后部丝腺中内参基因A3的表观表达水平最高，达到中肠抽提物的上百倍。这一实验结果与申请人在专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)公开的实验结果相符。上述证明，通过本发明方法获得的表观表达水平表现基因在组织中的表达比传统方法中使用内参基因的RNA拷贝数归一化其他基因的表达更能反映出基因在组织中的真实转录状况。
实验结果2：DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量
根据以下公式分别计算待测基因GAPDH、28S rRNA的表观表达水平、DNA拷贝数相对量。
待测基因的细胞水平相对表达量=
待测基因的表观表达水平×待测基因的DNA拷贝数相对量。
以基因GAPDH在后部丝腺的DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量计算为例：
根据实验结果1中所列的PCR扩增反应效率曲线公式，内参基因A3在后部丝腺的DNA拷贝数平均值为8.275，基因GAPDH在后部丝腺(PCR扩增反应的a值是-3.102)，的DNA拷贝数平均值为9.735。则根据待测基因的DNA拷贝数相对量计算公式，基因GAPDH在后部丝腺的DNA拷贝数相对量为1.1764。
基因GAPDH在后部丝腺的表观表达水平计算方法可参见实验结果1中内参基因A3的表观表达水平计算方式，计算可得基因GAPDH在后部丝腺的表观表达水平为166.64。根据待测基因的细胞水平相对表达量计算公式，则基因GAPDH在后部丝腺的细胞水平相对表达量为196.034。
实验数据及结果见下表3-1，表3-2。
表3-1待测基因GAPDH在家蚕5种组织中的表观表达水平、相对内参基因A3的DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量
| 中部丝腺 | 后部丝腺 | 脂肪体 | 马氏管 | 中肠 | |
| 表观表达水平 | 10.620 | 166.64 | 11780 | 142.41 | 6.3244 |
| DNA拷贝数相对量 | 1.1758 | 1.1764 | 1.1759 | 1.1763 | 1.1759 |
| 细胞水平相对表达量 | 12.487 | 196.034 | 13851.719 | 167.515 | 7.437 |
表3-2待测基因28S rRNA在家蚕5种组织中的表观表达水平、相对内参基因A3的DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量
| 中部丝腺 | 后部丝腺 | 脂肪体 | 马氏管 | 中肠 | |
| 表观表达水平 | 5463.7 | 8849.4 | 95425 | 2872.5 | 2121.2 |
| DNA拷贝数相对量 | 352.7179 | 352.8012 | 352.8753 | 352.9586 | 352.8693 |
| 细胞水平相对表达量 | 1927144.763 | 3122078.511 | 33673123.4 | 1013873.497 | 748506.311 |
从表3-1中的结果可以看出，基因GAPDH在各组织间的DNA拷贝数相对量基本恒定，且≈1，但其细胞水平相对表达量在各组织间存在很大差异。由于内参基因A3为单拷贝基因，因此基因GAPDH在各待测组织中可视为单拷贝基因，基因GAPDH在各组织间的细胞水平相对表达量差异主要是由其在各组织中的表观表达水平差异导致的。由此可以看出，对于单拷贝的待测基因，本发明方法检测得到的待测基因的细胞水平相对表达量的水平完全由其表观表达水平决定。
如表3-2结果所示，待测基因28S rRNA在各组织间的DNA拷贝数相对量也基本保持恒定，但其在各组织间的细胞水平相对表达量也存在很大差异。由于基因28S rRNA相对于内参基因的DNA拷贝数相对量较高(≈352)，在同一组织中基因28S rRNA的细胞水平相对表达量远大于其表观表达水平。说明对于多拷贝的待测基因，本发明方法检测得到的待测基因的细胞水平相对表达量的水平不仅与其表观表达水平相关，也与其DNA相对表达量相关。同时，这一检测结果与基因28S rRNA的表达反映细胞内蛋白合成活性的事实相符，rRNA的高细胞水平相对表达量保证了蛋白合成系统的功能。
实施例2：本实施例以正常人黏膜细胞为研究对象，正常黏膜细胞经过HPV-18转染后形成的永生化细胞。永生化细胞经低剂量辐射诱导后发生恶性转化，恶性转化细胞在裸鼠体内培养至形成肿瘤组织，去除后经体外培养后形成本实施例中的所用的肿瘤细胞。本实施例中的对照组为正常人胎盘组织细胞。在本实施例中，使用双外参实时定量PCR方法检测方法同时检测了各待测基因在人胎盘组织细胞、永生化和肿瘤细胞中的RNA和DNA拷贝数，以及内参基因beta-actin在这些细胞中的DNA拷贝数。首先，基于各待测基因和内参基因在各类细胞中的DNA拷贝数，计算得到各待测基因在各类细胞中的DNA拷贝数相对量。基于所得的各待测基因在各类细胞中的表观表达水平和DNA拷贝数相对量，根据细胞水平相对量的表达公式，计算得到各待测基因在各类细胞中的细胞水平相对表达量。
1.正常人黏膜的处理：
正常人黏膜细胞经过HPV-18转染形成永生化细胞。永生化细胞经1.5Gy-α粒子照射至发生恶性转化，再接种裸鼠形成肿瘤组织，经体外培养后即可画的本实施例中使用的肿瘤细胞。
2.内参基因的选择和确定：
本实施例中，从数据库-数据库中，择和确定：后平相对量的表达公式，计算得到各待测(http：／／dgv.tcag.ca／dgv／app／home)中获取了人基因组中目前鉴定到的所有CNV序列信息，从人基因组全序列中扣除这些信息，即得到了冷区序列。本实例中，beta-actin基因是一种常用的内参基因，且处于CNV冷区序列中，因此我们选择beta-actin基因作为本实施例中的内参基因。
3.RNA和DNA外参的选择与制备：参见实施例1。
4.待测样品处理：
依产品说明书用TRNzol-A+Total RNA试剂(Tiangen Biotech Co.，LTD Beijing，China)分别抽提正常对照、永生细胞和肿瘤细胞的总RNA和DNA，步骤如下：
每种细胞均采用25cm2培养瓶，以LHC-8无血清培养液在二氧化碳孵箱中37℃培养。
消化收集1×107个培养好的待测细胞，同时加2μl IFP2RNA和AcA3IFP2的预混合液，使之充分混合，加入抽提液裂解细胞并且溶解细胞内含物。在12,000rpm的转速下离心15min，分别收集RNA和DNA部分。
总RNA部分用DNase I处理后进行逆转录，合成第一条cDNA链。20μl反应体系：4μl5×反应缓冲液，1μg总RNA，4种dNTP各0.5mM，25单位RNasin(核酸酶抑制剂)，1μl50μM(dN)6，2μ110μM oligo(dT15)及200单位M-MuLV逆转录酶(200U／μl；TaKaRa)。
5.实时定量PCR引物：
为减少由不同引物和扩增片段带来的实验系统误差，本实施例中对同一基因测定其RNA和DNA的拷贝数时采用相同的引物对，并设计在同一外显子中。
针对各待测基因(PCNA、GADD45A、P53)和内参基因(beta-actin)以及IFP2的引物见表1及表4。
表4实时定量PCR引物
6、实时定量PCR的条件如下：
实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃5sec，55℃10sec，72℃10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度依据扩增产物而定(具体温度参见表1和表4)。
7、实时定量PCR检测的数据处理：
根据以下公式分别测定待测基因p53、GADD45A、PCNA的表观表达水平。
计算方法参见实施例1中实验结果1中的步骤。
实验数据及结果见下表5。
表5各组细胞中待测基因p53、GADD45A、PCNA的表观表达水平：
| 待测基因 | 正常对照 | 永生化细胞 | 肿瘤细胞 |
| p53 | 1424.393 | 12215.5693 | 2240.838533 |
| GADD45A | 32.30397 | 191.619008 | 22.55749889 |
| PCNA | 183.7797 | 221.351814 | 179.1297943 |
根据以下公式分别计算待测基因p53、GADD45A、PCNA的DNA拷贝数相对量。
计算方法参见实施例1计算结果2中的步骤
实验数据及结果见下表6。
表6待测基因的DNA拷贝数相对量：
| 待测基因 | 正常对照 | 永生化细胞 | 肿瘤细胞 |
| p53 | 1.096743 | 1.41908852 | 1.623400103 |
| GADD45A | 27.08114 | 43.3553261 | 83.15323588 |
| PCNA | 2.040086 | 25.4151507 | 10.15402692 |
表7表明待测基因的细胞水平相对表达量
根据以下公式分别计算待测基因p53、GADD45A、PCNA的细胞水平相对表达量，实验数据及结果见下表7。
待测基因的细胞水平相对表达量
=待测基因的表观表达水平×待测基因的DNA拷贝数相对量
计算方法参见实施例1计算结果2中的步骤
表7待测基因的细胞水平相对表达量
| 待测基因 | 正常对照 | 永生化细胞 | 肿瘤细胞 |
| p53 | 1562.193 | 17334.9741 | 3637.777505 |
| GADD45A | 874.8281 | 8307.70457 | 1875.729026 |
| PCNA | 374.9263 | 5625.68971 | 1818.888753 |
以上结果显示，对于基因p53，其DNA拷贝数相对量在三组不同增殖状态细胞中存在一定的变化，但差异相对较小(在永生化细胞和肿瘤细胞中分别为正常对照1.29和1.47倍)。因此，尽管基因p53在肿瘤细胞中DNA拷贝数相对量较其在永生化细胞中高，由于基因p53在在永生化细胞中的表观表达水平远高于其在肿瘤细胞中的表观表达水平(分别为正常对照的8.58和1.57倍)，基因p53在在永生化细胞中的细胞水平相对表达量明显较其在肿瘤细胞中高。提示在三组不同增殖状态细胞中，对于基因p53，其表观表达水平对于细胞水平相对表达量变化的影响大于其DNA拷贝数相对量的影响，也就是说，启动子活力的变化是影响该基因表达水平的主要因素。
对于基因PCNA，其DNA拷贝数相对量在三组不同增殖状态细胞中存在很大差异(在永生化细胞和肿瘤细胞中分别为正常对照12.46和4.98倍)，但其表观表达水平在三组不同增殖状态细胞中的差异却不明显(在永生化细胞和肿瘤细胞中分别为正常对照1.20和0.97倍)。DNA拷贝数相对量的巨大差异使得基因PCNA在永生化细胞和肿瘤细胞中的细胞水平相对表达量显著高于其在正常对照中的表达，分别为正常对照的15.00和4.85倍。提示三组不同增殖状态细胞中，对于基因PCNA，其DNA拷贝数相对量对于细胞水平相对表达量变化的影响大于其表观表达水平的影响，也就是说，DNA拷贝数的变化是影响该基因表达水平的主要因素。
对于基因GADD45A，其DNA拷贝数相对量在三组不同增殖状态细胞中存在一定差异(在永生化细胞和肿瘤细胞中分别为正常对照1.60和3.07倍)，同时其表观表达水平在三组不同增殖状态细胞中也存在差异(在永生化细胞和肿瘤细胞中分别为正常对照5.93和0.70倍)。基因GADD45A在永生化细胞和肿瘤细胞中的细胞水平相对表达量相较于正常对照的变化比较明显，分别为正常对照的9.50和2.14倍。在这个例子中，难以客观判断GADD45ADNA拷贝数相对量和表观表达水平对于其细胞水平相对表达量变化的影响作用的相对强弱，或者说，DNA拷贝数改变和启动子活力的调控都对该基因表达水平的调节有贡献。
基因p53的生物学功能是调节细胞周期(G0-G1)，p53蛋白可以对DNA修复和合成进行调控，诱导细胞凋亡和促进细胞终末分化，在维持基因组的稳定性中发挥主要作用。当细胞DNA受损时，p53基因将发挥G1／S检查站的功能，使细胞阻滞于G1期以得到充分的修复，或者诱导凋亡。而辐射作为一种促癌剂，在其他致癌因素的参与下，受辐射的细胞可以逃逸DNA损伤后的G1／S检测，不进入修复或凋亡而发生恶性转化。本实例中，通过本发明方法检测到，肿瘤细胞中p53基因的DNA拷贝数相对量高于永生化细胞，其表观表达水平以及细胞水平相对表达量均显示p53在肿瘤细胞中转录水平上的表达较永生化细胞中受到了明显的抑制。本发明方法得到的这一检测结果与p53在细胞中的生物学功能机理相符。
基因GADD45A一般可作为p53的下游调节因子，可与p53共同作用使一包周期停滞在G1-S或G2-M期，同时激活损伤修复途径，其表达量一般在细胞生长阻滞和DNA损伤时升高。在本实例中肿瘤细胞和永生化细胞中GADD45A基因的DNA拷贝数相对量和表观表达水平均高于正常对照组。但在肿瘤细胞中，由于p53基因表达水平的下降，作为p53-GADD45A凋亡修复通路下游因子的GADD45A基因的表达发生下调。这与通过本发明方法检测得到的GADD45A基因在肿瘤细胞中的表观表达水平以及细胞水平相对表达量较永生化细胞中低的检测结果相符。
基因PCNA编码增殖细胞核抗原，PCNA是一种DNA聚合酶辅助物，可促进DNA复制延伸并参与DNA修复过程，这一抗原只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，因此常被用做评价细胞增殖状态的指标。在肿瘤细胞和永生化细胞中，由于细胞的无限增殖能力，PCHA基因的DNA拷贝数发生了大幅的上升，由于基因剂量效应，下游的RNA表达水平也相应上调。这与通过本发明方法检测到的PCHA基因在肿瘤细胞和永生化细胞中表观表达水平以及细胞水平相对表达量较正常对照组大幅上升的检测结果相符。
综上所述，基因p53、GADD45A和PCNA的生物学功能均与细胞周期与细胞增殖相关，均可作为评价细胞增殖的标志物。通过本发明方法检测得到的待测基因p53、GADD45A和PCNA在正常胎盘组织、永生化细胞和肿瘤细胞中的DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量的变化的检测结果，与该待测基因在上述处于不同增殖状态的细胞中的生物学功能变化相符。而表观表达水平、DNA拷贝数相对量和细胞水平相对表达量的检测有助于解析基因表达调控所发生的层次。由此可见，本发明检测方法可以被应用于有关检测细胞恶性转化和评价细胞增殖状态方面等的科研开发中。
Claims (4)
1.一种非诊断目的的RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，同时检测待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量，其包括如下步骤：
1)选定外参基因，配制外参基因mRNA与DNA的预混合液；所述外参基因为待测样品中不存在的序列；
2)选定内参基因；其中，所述内参基因为不易发生拷贝数变异的CNV冷区的DNA区域；
3)将步骤1)制备的所述预混合液与待测样品混合，分别抽提总mRNA和总DNA；
4)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR扩增，检测待测基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数、外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数，以及内参基因DNA扩增产物的拷贝数，根据如下公式计算同时检测得到待测基因的表观表达水平、DNA拷贝数相对量以及细胞水平相对表达量：
待测基因的细胞水平相对表达量＝
待测基因的表观表达水平×待测基因的DNA拷贝数相对量。
2.如权利要求1所述的非诊断目的的RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述外参基因的DNA为包含外参基因的重组载体；所述外参基因的mRNA是以上述线性化的包含外参基因的重组载体为模板，通过体外转录制得的mRNA。
3.如权利要求2所述的非诊断目的的RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述重组载体为质粒或杆状病毒。
4.如权利要求1所述的非诊断目的的RNA和DNA双外参以及DNA内参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，对同一基因的mRNA与DNA使用相同的引物分别进行实时定量荧光PCR扩增。
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| Transcription level of messenger RNA per gene copy determined with dual-spike-in strategy;Yi Zhang,et al;《Analytical Biochemistry》;20090730;第394卷;202–208 * |
| 关于用定量PCR方法测定基因的转录水平的几个问题;陆长德;《中国细胞生物学学报》;20100831;第32卷(第4期);520-526 * |
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