CN101363057A - 一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法 - Google Patents
一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，包括以下步骤：1)材料选择：8周龄与40周龄的小鼠脑组织；2)总RNA的提取：3)RT(反转录)－荧光定量PCR；4)DNA定量；5)标准曲线的绘制；6)数据处理：由荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA的拷贝数计算出在RNA提取过程小RNA的损失率及平均损失率，再分别从DNA与RNA水平上表示原始样品中细胞数，即可计算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每个原始细胞中表达量。本发明的有益效果：通过DNA与RNA两个水平计算样品匀浆中的细胞数目，如实地将miRNA的表达量转换为在原始样品中的绝对表达量；弥补了看家基因作为内参照只能反映相对差异的缺点，并且从两个水平上分析更加真实可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种生物样本的检测方法，主要是一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，适用于从生物样本中其他目的基因在单细胞中的绝对表达量的检测。
背景技术
自1993年Lee首次在线虫中发现具有时序调控作用的miRNA以来，miRNA的表达调控作用已得到人们的广泛认可。随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是miRNA检测技术的不断更新，如克隆技术、芯片技术以及实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)技术的迅速发展，越来越多的miRNA被发现。目前miRNA的定量检测以及功能研究已成为该领域的热门。然而要从数据中如实的还原miRNA的原始表达水平，可靠而稳定的均一化方法对于实验数据的分析是至关重要的。
当前传统的均一化方法主要是利用内源性看家基因作为内参照，在定量过程中，一般选择β-actin(β-肌动蛋白)或GADPH(磷酸甘油醛3脱氢酶)等看家基因作为mRNA(信使RNA)的内参，而选择U6(小核RNA)或5S rRNA(核糖体RNA)等非编码RNA作为miRNA的内参，实验数据则用2-ΔΔCT进行均一化处理。然而这种均一化方法只能反应靶基因在不同时期表达的变化情况，但不能反应变化的绝对拷贝数。
miRNA是一类具有时序表达调控功能的小分子RNA，其表达量会随着调控的需要在生物体发育和成熟的不同时期发生变化，而“看家基因”在不同生长时期或经受不同环境胁迫后，其表达量也会发生变化，这就决定了用看家基因作为内参的传统均一化方法只能体现目的基因在不同时期具有相对差异，而不能如实反映目的基因在各个时期的绝对表达量。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，检测生物样本中每个细胞所表达miRNA的绝对拷贝数，同时为miRNA在生物体发育过程的调控功能研究奠定理论基础，整个实验设计严谨缜密，实验过程简单便捷，所得结果真实可靠。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，包括以下步骤：
1)材料选择：8周龄与40周龄的小鼠(C57BL/6)脑组织；
2)总RNA的提取：
150mg小鼠脑组织研磨充分后加入1.5mL细胞裂解液研磨至匀浆，取20μL用于DNA定量，在剩下的匀浆中加入TrizoL，继续研磨后取0.8mL匀浆至1.5mL离心管中，同时在匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA(外源性RNA)，用氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，DEPC水(1‰的焦碳酸二乙酯)溶解后，使用NanoDrop ND-1000(微量紫外分光光度计)检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性凝胶检测总RNA的质量及完整性。
3)RT(反转录)-荧光定量PCR
以总RNA为反转录模板，spike RNA、小鼠脑组织中表达的miRNA为靶基因，在5μL反应体系中加入反应试剂并设置反应参数得到cDNA(反转录产物)，再以此cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，反应结束后在60-95℃间做溶解曲线检测反应特异性，同时取5μL反应液，2.0％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。
4)DNA定量
匀浆样品依次经37℃保温，核糖核酸酶A处理，蛋白酶K处理，TE缓冲液(0.05mol/1三羟甲基氨甲烷缓冲液)稀释后，取5μL稀释液加入至96孔板中，同时加入等体积的荧光染料混合液，λDNA(λ噬菌体DNA)稀释一定梯度作为标准曲线，定量过程在荧光定量PCR仪(ABI7300)中进行，具体参数设置为：30℃ 15分钟；31℃ 5秒；30℃ 30秒，反应最后一步收集荧光信号。
5)标准曲线的绘制
将5×108拷贝数的spike RNA用DEPC水依次稀释至5×102拷贝数(稀释因子为0.1)共7个浓度浓度。
6)数据处理
由荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA的拷贝数计算出在RNA提取过程小RNA的损失率及平均损失率。再分别从DNA与RNA水平上表示原始样品中细胞数，即可计算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每个原始细胞中表达量。
在步骤2)中，提取总RNA时，在样品匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA。在步骤3)中，使用实时荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA和miRNA的拷贝数。在步骤4)中，从DNA水平上检测miRNA在原始细胞中的表达量。在步骤5)中，以7个拷贝数浓度梯度的spike RNA做标准曲线。在步骤6)中，在单细胞水平上处理实时荧光定量PCR数据。
本发明的有益效果：本技术通过在样品匀浆中加入不同浓度的spike RNA作为标准曲线，将实时荧光定量PCR检测到的miRNA荧光信号值转化为在样品匀浆中的表达量，把miRNA在匀浆过程的损失量精确的计算出来，同时通过DNA与RNA两个水平计算样品匀浆中的细胞数目，如实地将miRNA的表达量转换为在原始样品中的绝对表达量。弥补了看家基因作为内参照只能反映相对差异的缺点，并且从两个水平上分析更加真实可靠。本技术同时还适合于检测其他目的基因在生物样本中的绝对表达量。
附图说明
图1是本发明的实验流程图；
图2是不同年龄小鼠脑组织总RNA变性电泳结果示意图；
图3是Spike RNA，miRNA以及内参照的电泳检测结果示意图；
图4是本发明DNA与RNA水平数据均一化的相关性示意图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细描述：
图2中(1％琼脂糖，37％甲醛变性，1×MOPS缓冲液)，1-2为8周龄小鼠脑组织；3-4为40周龄脑组织；图3中(2％琼脂糖，1×TAE缓冲液)M：50bp DNA ladder；1-3：spike RNA1-3；4-9：let-7a，miR-15a，miR-27a，miR-135b，U6 ncRNA，miR-221；a-j：miR-9，miR-21，miR-26a，miR-122，miR-132，miR-138，miR-141，miR-143，miR-153，5S rRNA；图4中(R＝0.923)。
这种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，包括以下步骤：
1.总RNA的提取
材料选择8周龄与40周龄的小鼠(C57BL/6)脑组织；150mg小鼠脑组织研磨充分后加入1.5mL细胞裂解液继续研磨至匀浆，分别取20μL匀浆至3个0.2mL PCR管中，用于DNA定量；在剩下的匀浆中加入1.46mL TrizoL(RNA裂解液)，继续研磨匀浆3分钟；分别取0.8mL匀浆至1.5mL离心管中，同时在匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA，用氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解后微量分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性。
2.RT(反转录)-荧光定量PCR
以总RNA为反转录模板，spike RNA、小鼠脑组织中表达的miRNA为靶基因，在5μL反应体系中加入0.5μL提取的总RNA溶液，0.75μL DEPC水，70℃保温5分钟，冰上放置3分钟。再依次加入：dNTP(脱氧核糖核苷酸)(各10mM，RNase-free)0.5μL、5×M-MuLV(莫洛尼氏鼠白血病病毒)缓冲液1μL、茎环引物(2μM)0.25μL、RNase(核糖核酸酶)抑制剂(40U/μL)0.25μL、M-MuLV反转录酶(200U/μL)0.25μL、DEPC水0.5μL，反应参数设置为：42℃ 60mim，70℃ 10分钟，冰上放置3分钟。取0.4μL cDNA为模板进行荧光定量PCR，在10μL反应体系中依次加入2×SYBR Green I(DNA结合染料)反应缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶(94kDa耐热的重组DNA聚合酶)(5U/μL)0.1μL，前引物(10μM)0.2μL，后引物(10μM)0.2μL，双蒸水4.1μL，反应参数设置为：94℃ 10分钟；94℃ 15秒，62℃ 30秒，75℃30秒，40个循环，反应结束后在60-95℃间做溶解曲线检测反应特异性，同时取5μL反应液，2.0％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。
3.DNA定量
匀浆样品依次经37℃保温1h，10mg/mL RNase A 37℃处理30分钟，20mg/mL的蛋白酶K55℃处理3h。然后用TE缓冲液将反应液稀释100倍，取5μL稀释液加入至96孔板中，同时加入等体积的荧光染料混合液，λDNA稀释一定梯度作为标准曲线，反应参数设置为：30℃ 15分钟；31℃ 5秒；30℃30秒.反应最后一步收集荧光信号。
4.标准曲线的绘制
将5×108拷贝数的spike RNA用DEPC水依次稀释至5×102拷贝数(稀释因子为0.1)共7个浓度梯度。
5.数据处理
在RNA提取过程小RNA的损失率可表示为：
sRNA(小RNA)损失率(i)＝(秒i1-秒i2)/秒i1
其中秒i1(i＝1，2，3)为匀浆中加入spike RNA的拷贝数，秒i2(i＝1，2，3)为荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA的拷贝数。
同时RNA的平均损失率为：
sRNA平均损失率＝[sRNA损失率(1)+sRNA损失率(2)+sRNA损失率(3)]/3
原始样品中细胞数可从DNA与RNA水平上表示：
细胞数DNA＝C×L/d；细胞数RNA＝C’×L’/e
其中C为匀浆中DNA的含量(ng/μL)，L为匀浆的体积(μL)，d为每个小鼠细胞基因组DNA的质量(5.0×10-3ng DNA/细胞，在此我们假设一个单倍体细胞具有一套基因组DNA)；C’为提取的总RNA的含量(pg/μL)，L’为总RNA的体积，e为每个细胞所能提取出总RNA的质量(15pg总RNA/细胞)。
小RNA在RNA水平上每个原始细胞中表达量可以表示为：
原始单细胞绝对表达量RNA＝CTR/[(1-sRNA平均损失率)×细胞数RNA]
其中CTR为荧光定量PCR检测到提取的总RNA中小RNA的拷贝数
小RNA在DNA水平上每个原始细胞中的表达量，可通过3条spike RNA作为标准曲线求得miRNA在匀浆中的表达量，再除以匀浆中的细胞数即可。
表1不同年龄小鼠脑中miRNA的绝对表达量
a：40循环后无信号；b：正号表示40周龄小鼠脑中miNRA相对于8周龄表达量为上调；c：负号表示40周龄小鼠脑中miNRA相对于8周龄表达量为下调。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1、一种生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)材料选择：8周龄与40周龄的小鼠脑组织；
2)总RNA的提取：150mg小鼠脑组织研磨充分后加入1.5mL细胞裂解液研磨至匀浆，取20μL用于DNA定量，在剩下的匀浆中加入RNA裂解液1.46mL，继续研磨后取0.8mL匀浆至1.5mL离心管中，同时在匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA，用氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解后微量紫外分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性；
3)RT-荧光定量PCR：以总RNA为反转录模板，外源性RNA、小鼠脑组织中表达的miRNA为靶基因，在5μL反应体系中转录得到cDNA，再以此cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，反应结束后在60-95℃间做溶解曲线检测反应特异性，同时取5μL反应液，2.0％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物；
4)DNA定量：匀浆样品依次经37℃保温，核糖核酸酶A处理，蛋白酶K处理，0.05moL/L三羟甲基氨甲烷缓冲液稀释后，取5μL稀释液加入至96孔板中，同时加入等体积的荧光染料混合液，λ噬菌体DNA稀释一定梯度作为标准曲线，具体参数设置为：30℃ 15min；31℃ 5s；30℃ 30s，反应最后一步收集荧光信号；
5)标准曲线的绘制：将5×108拷贝数的spike RNA用1‰的焦碳酸二乙酯依次稀释至5×102拷贝数，稀释因子为0.1，共7个浓度梯度；
6)数据处理：由荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA的拷贝数计算出在RNA提取过程小RNA的损失率及平均损失率，再分别从DNA与RNA水平上表示原始样品中细胞数，即可计算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每个原始细胞中表达量。
2、根据权利要求1所述的生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：在步骤2)中，提取总RNA时，在样品匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA。
3、根据权利要求1所述的生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：在步骤3)中，使用实时荧光定量PCR检测到提取的总RNA中spike RNA和miRNA的拷贝数。
4、根据权利要求1所述的生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：在步骤4)中，从DNA水平上检测miRNA在原始细胞中的表达量。
5、根据权利要求1所述的生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：在步骤5)中，以7个拷贝数浓度梯度的spike RNA做标准曲线。
6、根据权利要求1所述的生物样本中miRNA绝对表达量的检测方法，其特征在于：在步骤6)中，在单细胞水平上处理实时荧光定量PCR数据。
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